DE3688864T2

DE3688864T2 - L-Phenylalanindehydrogenase und deren Verwendung.

Info

Publication number: DE3688864T2
Application number: DE86302830T
Authority: DE
Inventors: Yasuhisa Asano; Kaori Endo; Kenji Hirai; Kiyosi Kondo; Akiko Nakazawa; Naganori Numao; Shiro Terashima
Original assignee: Sagami Chemical Research Institute
Current assignee: Sagami Chemical Research Institute
Priority date: 1985-04-17
Filing date: 1986-04-16
Publication date: 1994-03-10
Anticipated expiration: 2006-04-17
Also published as: US4849345A; EP0206460B1; EP0206460A3; DE3688864D1; EP0206460A2; EP0513872A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Enzyme, nämlich L-Phenylalanin-Dehydrogenasen, Verfahren zu deren Herstellung, Mikroorganismen, die das neue Enzym herstellen, und Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung des Enzyms. Die Enzyme sind gemäß der vorliegenden Erfindung erhältlich aus Sporosarcina-Arten. Eine Teilanmeldung hiervon betrifft Enzyme von Bacillus spp.
Versuche sind bereits unternommen worden, um L-Aminosäuren unter der Verwendung von α-Ketocarbonsäure als Substrat herzustellen. Beispielsweise sind ein Verfahren zum Herstellen von L-Glutaminsäure durch Zufügen von α-Ketoglutarat und verschiedenen Arten von Aminosäuren zu mikrobiellen Zellen (Katagiri et al. Amino Acid and Nucleic Acid, 2, 18, 1960), ein Verfahren zum Erhalten von L-Phenylalanin durch Zufügen von L-Glutaminsäure oder L-Asparaginsäure zu einer Reaktionsmischung, die Phenylpyruvat enthält (Asai et al., Amino Acid and Nucleic Acid, 2, 114 (1960) und ein Verfahren zum Synthetisieren von L-Tryptophan durch Zufügen von L-Glutaminsäure oder L-Asparaginsäure zu einer Reaktionsmischung, die Indolpyruvat enthält (Aida et al., Journal of General and Applied Microbiology, 4, 200, 1958), beschrieben worden.
Die japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 60-164493 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin durch entweder Kultivieren einer aus verschiedenen Arten von Mikroorganismen mit Phenylpyruvat und einem Aminogruppendonor oder Inkubieren von Zellen dieses Mikroorganismus oder eines behandelten Produkts der Zellen mit Phenylpyruvat und einem Aminogruppendonor. Diese Beschreibung offenbart jedoch nicht welche Art Enzyme an der Reaktion teilnehmen. Weiterhin verwenden solche Verfahren Aminosäuren, welche ein teurer Aminogruppendonor sind.
Alle vorstehend erwähnten Verfahren verwenden als Aminogruppendonor einer gewünschten Aminosäure eine andere Aminosäure und sind grundsätzlich verschieden von dem erfindungsgemäßen Verfahren, welches ein Ammoniumion als Aminogruppendonor, der nicht so teuer ist, verwendet. Kurz, die Verfahren des Standes der Technik sind teurer als das vorliegende Verfahren. Weiterhin sind die Enzyme, die in dem Verfahren des Standes der Technik eine Rolle spielen, verschieden von denjenigen des vorliegenden Verfahrens.
Die japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 60-43391 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren, worin ein zu einer Umwandlung einer α-Ketosäure zu einer entsprechenden L-Aminosäure fähiger Mikroorganismus kultiviert wird, und während des Kultivierens die α-Ketosäure in das Kulturmedium eingespeist wird, um die α-Ketosäure zu der L-Aminosäure zu überführen. Gemäß dem in der Beschreibung vorgeschlagenen Reaktionsmechanismus wird als Aminogruppendonor zur Bildung einer gewünschten L-Aminosäure aus einer entsprechenden α-Ketosäure L-Glutamat verwendet, was bedeutet, daß die Reaktion durch eine Aminotransferase ausgeführt wird. Weiterhin offenbart die Anmeldung nur Brevibacterium. Corynebacterium und Escherichia coli als beteiligte Mikroorganismen.
Die japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 59-198972 beschreibt L-Phenylalanin-Dehydrogenase und ein Verfahren zur Herstellung von L-α-Aminocarbonsäure unter Verwendung dieses Enzyms. Die darin beschriebene L-Phenylalanin-Dehydrogenase stammt jedoch aus Brevibacterium. und die Beschreibung legt nicht nahe, daß Sporosarcina und Bacillus ein ähnliches Enzym herstellen. Weiterhin hat die offenbarte L-Phenylalanin- Dehydrogenase ein Molekulargewicht von 130000 +/- 10000 und besteht aus Untereinheiten mit einem Molekulargewicht von 66000 +/- 5000 und ist daher verschieden von der vorliegenden L-Phenylalanin-Dehydrogenase.
Die japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung 60-160890 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin durch entweder Kultivieren einer von verschiedenen Mikroorganismenarten mit Phenylpyruvat im Vorhandensein einer Energiequelle, einer anorganischen Ammoniumverbindung oder Harnstoff und Sauerstoff oder durch Inkubieren eines kultivierten Produkts des Mikroorganismus oder behandelten Produkts davon mit Phenylpyruvat im Vorhandensein einer Energiequelle, einer anorganischen Ammoniumverbindung oder Harnstoff und Sauerstoff. Die Beschreibung legt jedoch nicht die Art der in dem Verfahren beteiligten Enzyme nahe und das Verfahren ist im wesentlichen ein Fermentationsverfahren aufgrund der Notwendigkeit des Vorhandenseins von Sauerstoff. Weiterhin bezieht sich die Beschreibung nicht auf Sporosarcina.
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues Enzym L-Phenylalanin-Dehydrogenase zur Verfügung, d. h. L-Phenylalanin-Dehydrogenase, dadurch gekennzeichnet, daß es
(1) eine Reaktion, worin L-Phenylalanin, NAD&spplus; und H&sub2;O zu Phenylpyruvat, NADH und einem Ammoniumion reagiert und eine Rückreaktion davon katalysiert;
(2) ein Molekulargewicht von ungefähr 290 000, bestimmt durch Hochleistungsflüssigchromatographie und ein Molekulargewicht von ungefähr 305 000, bestimmt durch eine Sedimentationsgleichgewichtsmethode besitzt, und eine Untereinheit mit einem Molekulargewicht von ungefähr 38 000 bis 39 000, bestimmt durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese aufweist; und
(3) bezüglich der oxidativen Desaminierung auf L-Phenylalanin eine starke Wirkung und auf L-Tryptophan, L-Tyrosin und L-Methionin eine sehr schwache Wirkung hat; und
(4) von einem zur Gattung Sporosarcina gehörendem Mikroorganismus erhältlich ist.
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen neuen Mikroorganismus bereit, der fähig zur Herstellung der vorstehend erwähnten Enzyme ist und zur Gattung Sporosarcina gehört.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung der vorstehend erwähnten Enzyme bereit, umfassend das Kultivieren des vorstehend erwähnten Mikroorganismus.
Die vorliegende Erfindung stellt auch neue Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren aus der entsprechenden α-Ketocarbonsäure bereit, gekennzeichnet durch Reagierenlassen einer α-Ketocarbonsäure oder eines Salzes davon, eines Ammoniumions und NAD&spplus; im Vorhandensein von L-Phenylalanin-Dehydrogenase, die aus einem zur Gattung Sporosarcina gehörenden Mikroorganismus stammt, um die L-Aminosäure zu bilden und Gewinnen der L-Aminosäure; oder Reagierenlassen einer α-Ketocarbonsäure oder eines Salzes davon und eines Ammoniumions im Vorhandensein eines kultivierten Mediums, lebender Zellen oder Zellen, die in einer Weise behandelt sind, wodurch die zur Umwandlung von α-Ketocarbonsäure in eine entsprechende L-Aminosäure benötigten Enzymsysteme verbleiben, die aus einem zur Gattung Sporosarcina gehörenden Mikroorganismus stammen und fähig zur Herstellung von L-Phenylalanin-Dehydrogenase sind und im Vorhandensein einer Energiequelle, um die L-Aminosäure zu bilden, und Gewinnen der L-Aminosäure.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 stellt eine elektronenmikroskopische Aufnahme von Zellen von Sporosarcina ureae CSRC-R04 dar.
Fig. 2 enthält Diagramme, die das Verhältnis zwischen pH und Reaktionsrate für durch Sporosarcina ureae SCRC-R04 hergestellte L-Phenylalanin-Dehydrogenase zeigen, worin A oxidative Desaminierung und B reduktive Aminierung betreffen.
Fig. 3 ist ein Diagramm, das die pH-Stabilität für durch Sporosarcina ureae SCRC-R04 hergestellte L-Phenylalanin-Dehydrogenase zeigt.
Fig. 4 ist ein Diagramm, das das Verhältnis zwischen Temperatur und Reaktionsrate für durch Sporosarcina ureae SCRC-R04 hergestellte L-Phenylalanin-Dehydrogenase hinsichtlich der oxidativen Desaminierung zeigt.
Fig. 5 ist ein Diagramm, das die Temperaturstabilität für durch Sporosarcina ureae SCRC-R04 hergestellte L-Phenylalanin-Dehydrogenase zeigt.
Fig. 6 stellt ein UV-Spektrum für durch Sporosarcina ureae SCRC-R04 hergestellte L-Phenylalanin-Dehydrogenase dar.
Fig. 7 ist eine Photographie, die die Homogenität der durch Sporosarcina ureae SCRC-R04 hergestellten L-Phenylalanin-Dehydrogenase zeigt, worin A ein Ergebnis der Polyacrylamid-Gelelektrophorese (7,5% Gel, pH 8,4) und B ein Ergebnis der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (10,0% Gel, pH 7,2) bedeuten.
Fig. 8 stellt eine mikroskopische Aufnahme von Kristallen der durch Sporosarcina ureae SCRC-R04 hergestellten L-Phenylalanin-Dehydrogenase dar.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

1. Mikroorganismus

Mikroorganismen, die für die vorliegende Erfindung verwendet werden können, sind solche, die zu der Gattung Sporosarcina gehören und fähig zum Herstellen von L-Phenylalanin-Dehydrogenase sind. Solche Mikroorganismen können aus hinterlegten Banken selektiert oder aus natürlichen Quellen isoliert werden.
Die zur Gattung Sporosarcina gehörenden Mikroorganismen umfassen Sporosarcina ureae. Solche Arten umfassen z. B. die Stämme Sporosarcina ureae IFO 12698 und Sporosarcina ureae IFO 12699 (ATCC 6473) als Arten, die aus einer hinterlegten Bank selektiert wurden, und Sporosarcina ureae SCRC-R04, zuerst vom Erfinder isoliert. Die ersteren Stämme können vom Institut für Fermentation Osaka (IFO), 17-85 Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka 532, Japan oder von der American Type Culture Collection (ATCC), 12301, Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U.S.A erhalten werden; und der letztere Stamm, Sporosarcina ureae SCRC-R04 wurde am 16.04.1985 beim Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (FRI), 1-1-3 Yatabe-cho Higashi, Tsukuba-gun, Ibaraki-ken, Japan als FERM P-8178 hinterlegt und zur internationalen Hinterlegung entsprechend dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren (Budapester Vertrag) am 03.04.1986 als FERM BP-1012 überführt.
Die vorstehend erwähnten neuen zu Sporosarcina gehörenden Stämme wurden wie folgt isoliert:
Das Kulturmedium mit der folgenden Zusammensetzung wurde hergestellt.

Tabelle 1

L-Phenylalanin 1%
Pepton 1%
Hefeextrakt 0,5%
K&sub2;HPO&sub4; 0,2%
NaCl 0,1%
MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,02%
Leitungswasser entsprechend
pH eingestellt auf 7,0
Jeweils 5 ml Medium wurden in Teströhrchen (Durchmesser 18 mm) gefüllt, die danach für 15 Minuten bei 120ºC sterilisiert wurden. Zu jedem der Teströhrchen wurde eine kleine Menge einer Bodenprobe zugefügt, und die Teströhrchen wurden für 3 Tage bei 30ºC unter Schütteln inkubiert. Ein Tropfen des kultivierten Mediums wurde danach in ein neues Medium, das wie vorstehend beschrieben hergestellt wurde, überimpft und die Kultivierung wurde für 3 Tage bei 30ºC unter Schütteln durchgeführt. Das zweite kultivierte Medium wurde auf Agarplatten, die das vorstehend erwähnte, mit 2% Agar ergänzte Medium sind, in Streifen ausgestrichen und die Agarplatten wurden bei 30ºC für mehrere Tage, bis sich Kolonien der Mikroorganismen bildeten, inkubiert. Die Kolonien wurden danach abgenommen und auf Schrägagarmedien ausgestrichen. Wie vorstehend erwähnt, wurden viele Stämme isoliert.
Als nächstes wurden jeweils 200 ml Medium mit der in Tabelle 1 aufgeführten Zusammensetzung in 500 ml-Erlenmeyer-Kolben gefüllt und wie vorstehend sterilisiert. Die wie vorstehend erhaltenen Stämme wurden in dem Kolben für 24 Stunden bei 30ºC unter Schütteln kultiviert, um kultivierte Zellen zu erhalten. Die Zellen wurden gewaschen und danach durch Ultraschallbehandlung aufgebrochen. Die behandelten Produkte wurden zentrifugiert, um Überstände zu erhalten. Die Überstände wurden gegen 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,0), enthaltend 0,1 mM EDTA und 5 mM 2-Mercaptoethanol, dialysiert. Die dialysierten Überstände wurden wie nachstehend beschrieben auf L-Phenylalanin-Dehydrogenaseaktivität getestet. Als Ergebnis wurde ein Stamm erhalten, der bemerkenswerterweise L-Phenylalanin-Dehydrogenase produziert. Der Stamm wird SCRC-R04 bezeichnet. Der Ursprung der Analysenprobe war: Sagmihara, Kanagawa, Japan.
Der Stamm hat die in Tabelle 2 aufgeführten bakteriologischen Merkmale.

Tabelle 2

Beobachtung SCRC-R04
a) Morphologie
1 Zellform 2 bis 4 Kokken Größe 1,0 1,1 um
2 Polymorphismus keiner
3 Beweglichkeit + Flagellen polar
4 Sporulation + Sporongienform rund Sporangienlokalisierung zentral
5 Gramfärbung +
6 Säureresistenz -

Tabelle 2 (Forts.)

b) Wachstumseigenschaften
1 Nähragarplatte (bei 30ºC für 3 Tage) Koloniegröße 4 mm Kolonieform rund und flach Kolonieoberfläche glatt Kolonierand voll Koloniefarbe braun oder hellgelb Kolonietransparenz opak Kolonieglanz matt Bildung von löslichem Pigment -
2 Schrägnähragar (bei 30ºC, für 3 Tage) Wachstum reichlich Kolonieglanz matt
3 Flüssignährmedium (bei 30ºC, für 7 Tage) Wachstum an der Oberfläche keines Trübung leicht trüb Präzipitation kompakt Gasbildung keine
4 Gelatinenährboden (bei 30ºC, für 7 Tage) Gelatineverflüssigung keine Lackmusmilch keine pH-Änderung keine Verflüssigung keine Koagulation
c) Physiologische Eigenschaften
1 Nitratreduktion +
2 Denitrifizierung -
3 Methylrot-Test -
4 Voges-Proskauer-Test -
5 Indol-Bildung -
6 Schwefelwasserstoffbildung -
7 Amyloseabbau -
8 Zitronensäureverwertung Koser - Simmons + Christensen +

Tabelle 2 (Forts.)

9 Nitratverwertung -
10 Pigmentbildung King A Medium - King B Medium -
11 Urease +
12 Oxidase -
13 Katalase +
14 Wachstumsbereich pH 6 10 Temperatur 5 32ºC
15 Sauerstoffbedarf aerob
16 O-F Test (Glucose) keine Wirkung auf Glucose
17 Säure/Gas-Bildung aus Zucker Säure Gas
1. L-Arabinose - -
2. D-Xylose - -
3. D-Glucose - -
4. D-Mannose - -
5. D-Fructose - -
6. D-Galactose - -
7. Maltose - -
8. Sucrose - -
9. Lactose - -
10. Trehalose - -
11. D-Sorbitol - -
12. D-Mannitol - -
13. Glycerin - -
14. Stärke - -
15. Raffinose - -
16. Inulin - -
17. D-Ribose - -
18. Sorbose - -
19. Carboxymethylcellulose - -
20. Glycogen - -
Andere Eigenschaften
Phosphatase +
Tyrosinase -
DNase -
Argininabbau -
Gelatineverflüssigung -
Vitaminbedarf Biotin
Beobachtung SCRC-R04
Salzresistenz 5% +
7% +
10% -
Lipase -
Lecitinase -
Eiweißgerinnung
Sensitivität gegenüber Antibiotika
Penicillin G +
Streptomycin +
Chloramphenicol +
Tetracyclin +
Novobiocin -
Polymyxin B +
Erythromyc in +
Auf der Grundlage der oben erwähnten bakteriologischen Eigenschaften und gemäß der in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Auflage, 1974, beschriebenen Klassifikation wurde der Stamm wie folgt identifiziert.
SCRC-R04 ist aerob, beweglich, zur Sporenbildung fähig, Gram-positiv und 2 bis 4 Kokken-bildend. Daher gehört der Stamm zur Gattung Sporosarcina. Da Sporosarcina Sporosarcina ureae als einzige Art umfaßt, und die vorstehend erwähnten Eigenschaften von SCRC-R04 fast konsistent sind mit denjenigen, die in der Literatur beschrieben sind, ist der Stamm SCRC-R04 als Sporosarcina ureae identifiziert. Eine elektronenmikroskopische Aufnahme der Zellen des Stammes SCRC-R04 ist in Fig. 1 gezeigt.
Der vorstehend erwähnte, erfindungsgemäße Stamm kann gemäß konventioneller Mutation und Selektion zu Stämmen mit einer Enzymproduktivität, die höher ist als diejenige der ursprünglichen Stämme, konvertiert werden. Weiterhin kann ein Gen, das für L-Phenylalanin-Dehydrdogenase codiert, ausgeschnitten und in einen geeigneten Vektor, wie ein Plasmid, eingesetzt werden, der dann verwendet werden kann, um einen heterologen Wirt, wie Escherichia coli oder einen homologen Wirt, wie Bacillus artifiziell zu transformieren, um Stämme zu erzeugen, die eine höhere Produktivität hinsichtlich R-Phenylalanin-Dehydrogenase ausüben.
Die in der vorliegenden Anmeldung verwendeten Mikroorganismen können gemäß einem konventionellen Verfahren konserviert werden, wie auf Schrägagarmedium oder durch Lyophilisierung. Als Schrägagarmedium kann ein konventionelles Medium für die Konservierung eines zur Gattung Sporosarcina gehörenden Mikroorganismus, wie z. B. das vorstehend erwähnte Medium, verwendet werden. Lyophilisierung kann ebenso gemäß einem konventionellen Verfahren durchgeführt werden.

2. Enzym L-Phenylalanin-Dehydrogenase

(1) Herstellung von L-Phenylalanin-Dehydrogenase

Für die Kultivierung des vorstehend erwähnten Mikroorganismus zum Zweck der Herstellung von L-Phenylalanin-Dehydrogenase kann jedes Medium verwendet werden, in dem der vorliegende Mikroorganismus wächst. Das Medium enthält als Stickstoffquelle z. B. Hefeextrakt, Pepton oder Fleischextrakt, oder eine Mischung davon. Weiterhin kann das Medium als Kohlenstoffquelle Glucose, Stärke oder Glycerin etc. enthalten. Vorzugsweise enthält das Medium Mineralien, wie Kaliumphosphate, Natriumchlorid und Magnesiumsulfat.
Um die Herstellung von L-Phenylalanin-Dehydrogenase zu stimulieren, wird vorzugsweise eine geringe Menge L-Phenylalanin als Induktor zum Medium zugefügt. Die Menge an L-Phenylalanin als Induktor variiert abhängig von der Zusammensetzung des verwendeten Mediums, von der Natur des kultivierten Mikroorganismus etc. und beträgt im allgemeinen 0,01 bis 10 Gew.%, vorzugsweise 0,1 bis 1 Gew.% bezogen auf das Medium.
Das Medium kann ein festes Medium oder ein Flüssigmedium sein, jedoch wird zum Zweck einer großen Produktionsmenge des Enzyms der Mikroorganismus in einem Flüssigmedium unter aerober Bedingung, die durch Schütteln des Mediums oder durch Rühren und Belüften des Mediums erreicht wird, kultiviert. Der Mikroorganismus wird bei jeder Temperatur kultiviert, bei der der Mikroorganismus wachsen und L-Phenylalanin-Dehydrogenase herstellen kann. Diese Temperatur ist vorzugsweise 25ºC bis 45ºC. Der pH-Wert des Mediums liegt zwischen 6 und 9, vorzugsweise zwischen 7 und 10. Die Kultivierung wird im allgemeinen für 6 bis 48 Stunden durchgeführt.
L-Phenylalanin wird aus dem Kulturmedium gemäß einer Kombination konventioneller Verfahren, die für die Reinigung eines Enzyms verwendet werden, gewonnen und gereinigt. Z.B. wird das Kulturmedium zentrifugiert, um bakterielle Zellen zu sammeln. Die Zellen werden dann durch eine konventionelle Methode, wie Ultraschall oder Dynomill-Behandlung, aufgebrochen und die Zelltrümmer werden durch eine konventionelle Methode, wie Zentrifugation oder Filtration, entfernt, um einen Überstand oder ein Filtrat zu erhalten, enthaltend das gewünschte Enzym. Zur weiteren Reinigung kann z. B. eine Protaminsulfat-Behandlung, Streptomycinsulfat-Behandlung, Aussalzen, Präzipitation mit einem organischen Lösungsmittel, Absorptionschromatographie Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie und Kristallisierung unter Verwendung von z. B. Ammoniumsulfat oder Polyethylenglykol verwendet werden. Verfahren zur Reinigung für die Kristallisierung des vorliegenden Enyzms L-Phenylalanin-Dehydrogenase sind in den Beispielen 1 bis 3 dargestellt.

(2) Verfahren zur Aktivitätsbestimmung von L-Phenylalanin-Dehydrogenase

Die Aktivität von L-Phenylalanin-Dehydrogenase wird gemäß den folgenden Verfahren bestimmt.

Oxidative Desaminierung

100 uMol Glycin-KCl-KOH-Puffer (pH 10,5), 2,5 uMol NAD&spplus;, 10 uMol L-Phenylalanin und eine geeignete Menge an Analysenprobe werden in einem Gesamtvolumen von 1 ml gemischt, um die Komponenten reagieren zu lassen, und der Anstieg der Menge an NADH wird über den Anstieg der Absorption bei 340 nm gemessen. Die Menge an Enzym, die die Menge an NADH um 1 uMol pro 1 Minute ansteigen läßt, wird als eine Einheit definiert.

Reduktive Animierung

100 uMol Puffer, 10 uMol Natriumphenylpyruvat und eine geeignete Menge an Analysenprobe werden in einem Gesamtvolumen von 1 ml gemischt, um die Komponenten reagieren zu lassen, und die Verminderung der Menge an NADH wird über die Verminderung der Absorption bei 340 nm bestimmt. Die Menge an Enzym, die die Menge an NADH um 1 uMol pro Minute vermindert, wird als eine Einheit definiert.
Die Rate der reduktiven Aminierung von Phenylpyruvat ist bei optimalem pH ungefähr 5,5 mal höher als diejenige der oxidativen Desaminierung von L-Phenylalanin. Daher ist für dieselbe Probe der durch die reduktive Aminierungsmethode bestimmte Einheiten-Wert ungefähr 5,5 mal höher als der durch die oxidative Desaminierungsmethode bestimmte Einheiten-Wert.

(3) Eigenschaften der L-Phenylalanin-Dehydrogenase

Die erfindungsgemäße L-Phenylalanin-Dehydrogenase hat die folgenden Eigenschaften.
L-Phenylalanin-Dehydrogenase, von Sporosarcina ureae SCRC-R04 produziert:

(1) Enzymwirkung

Das Enzym katalysiert die folgende Reaktion:
L-Phenylalanin + NAD&spplus; + H&sub2;O
Phenylpryuvat + NADH + NH&sub3; + H&spplus;

(2) Substratspezifität

Hinsichtlich der oxidativen Desaminierung wirkt das Enzym nicht oder nur geringfügig aufandere L-Aminosäuren als L-Phenylalanin, wie in Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 3

Aminosäure Aktivität %
L-Phenylalanin 100
L-Tryptophan 6,8
L-Tyrosin (1,4 mM) 5,4
L-Methionin 4,1
L-Ethionin 7,0
L-Valin 3,1
L-Leucin 2,3
L-Isoleucin 0,54
L-α-Amino-n-buttersäure 1, 6
L-Norvalin 6,3
L-Norleucin 15
Die Substratkonzentration beträgt 10 mM, außer für die L-Tyrosinkonzentration, die 1,4 mM beträgt.
D-Phenylalanin, L-Alanin, L-Histidin, L-Arginin, L-Lysin, L-Ornithin, L-Asparagin, L-Asparaginsäure, L-Glutamin, L-Glutaminsäure, L-Prolin, L-Serin, L-Threonin, L-Cystein und DL-Phenylglycin können nicht als Substrat dienen.
NAD&spplus; wird als Coenzym benötigt und NADP&spplus; übt im Vergleich zu NAD&spplus; nur ungefähr 3,9% Aktivität aus.

(3) pH-Optimum

Für die oxidative Desaminierung beträgt das pH-Optimum ungefähr 10,5 und für die reduktive Aminierung beträgt das pH-Optimum ungefähr 9,0, wie in Fig. 2 gezeigt.

(4) pH-Stabilität

Nach Inkubation bei 30ºC für 1 Stunde wurde die Restaktivität bezüglich der oxidativen Desaminierung bestimmt. Wie in Fig. 3 gezeigt (Aktivität vor der Behandlung beträgt 100 %), ist das Enzym bei ungefähr pH 9 am stabilsten.

(5) Temperaturoptimum

Das Enzym übt die höchste Aktivität bei ungefähr 40ºC aus, wie in Fig. 4 gezeigt.

(6) Temperaturstabilität

Nach Erhitzen des Enzyms für 10 Minuten auf jede Temperatur in einem 0,1 M Glycin-NaOH-Puffer (pH 9,0) wird dessen Restaktivität hinsichtlich der oxidativen Desaminierung bestimmt. Die Hälfte der anfänglichen Aktivität wird bei 42ºC verloren, wie in Fig. 5 gezeigt.

(7) Absorptionsspektrum

Das Absorptionsmaximum liegt bei 278 nm und eine Schulter erscheint bei 283 nm. Absorption im Bereich des sichtbaren Lichts wird nicht beobachtet. Das Absorptionsprofil ist in Fig. 6 gezeigt.

(8) Wirkung von Metallionen und Inhibitoren

Die Enzymaktivität wird durch Metallkationen, wie Silberkation, Quecksilberkation etc., inhibiert, und SH-Inhibitoren, wie PCMB, N-Ethylmaleinid, 5,5'-Dithio-bis(2-nitrobenzoesäure) wirken wie in Tabelle 4 gezeigt.

Tabelle 4

Metallkation relative Aktivität
Li&spplus; 96%
Na&spplus; 92
Ag&spplus; 0
Mg²&spplus; 90
Ca²&spplus; 100
Cu²&spplus; 91
Mn²&spplus; 129
Zn²&spplus; 99
Ni²&spplus; 100
Fe²&spplus; 127
Ba²&spplus; 106
Cd²&spplus; 70
Pb²&spplus; 81
Sn²&spplus; (0,5mM) 123
Hg²&spplus; (0,01 mM) 0
Al³&spplus; 153
Fe³&spplus; 161
nicht zugefügt 100

Tabelle 4 (Forts.)

Inhibitor relative Aktivität
NaN&sub3; 100%
Hydroxylamin (10 mM) 173
KCN (0,5 mM) 102
σ-Phenanthrol in 103
α,α'-Dipyridyl 124
R-Oxychinolin 101
EDTA 119
PCMB (0,2 mM) 0
5,5,-Dithio-bis(2-nitrobenzoesäure) 0
N-Ethylmaleimid 21
Jodessigsäure 91
nicht zugefügt 100
Falls nicht anders angegeben, beträgt die Konzentration der Metallkationen 1 mM.

(9) Isoelektrischer Punkt

Der isoelektrische Punkt liegt bei 5,3 bis 5,4, gemessen durch isoelektrische Fokussierung unter Verwendung von Ampholine.

(10) Molekulargewicht

Dieses beträgt ungefähr 290000, gemessen durch Hochleistungsflüssigchromatographie (TSK 3000 SW) und ungefähr 305000, gemessen durch die Sedimentationsgleichgewichtsmethode.

(11) Molekulargewicht der Untereinheit

Dieses beträgt ungefähr 38000 bis 39000, gemessen durch SDS-Polyacrylamid-Plattenelekrophorese.

(12) Homogenität

Polyacrylamid-Gelelektrophorese (7,5% Gel, pH 8,4) erzeugt eine einzelne Bande, wie in Fig. 11A gezeigt, und SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (10,0% Gel, pH 7,2) erzeugt auch eine einzelne Bande, wie in Fig. 7B gezeigt.

(13) Kristallform

Flach, wie in Fig. 8 gezeigt.
Auf der Grundlage der vorstehend erwähnten enzymologischen Eigenschaften gilt die L-Phenylalanin-Dehydrogenase als neu.

3. Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren

Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäure aus α-Ketocarbonsäure unter Beteiligung der L-Phenylalanin-Dehydrogenase bereit.
Die Ausgangs-α-Ketocarbonsäuren sind durch die folgende allgemeine Formel (II) dargestellt:
worin R&sub1; Wasserstoff oder eine niedrige Alkylgruppe, wie Methyl, bedeutet; und R&sub2; ein lineares oder verzweigtes, wahlweise substituiertes Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder eine wahlweise substituierte aromatische Gruppe bedeutet.
Substituenten für die Alkylgruppe umfassen z. B. Hydroxyl, Methylthio, Methyl und Mercapto. Die aromatischen Gruppen sind insbesondere die Phenyl- und Naphthylgruppen. Substituenten für die aromatische Gruppe umfassen z. B. Hydroxyl, Halogen, wie Fluor, Chlor, Brom oder Jod, Vinyl, Methoxy, Nitro, eine niedrige Alkylthio- und eine niedrige Alkylgruppe. Diese Substituenten sind wahlweise wieder substituiert.
Aus der vorstehend erwähnten α-Ketocarbonsäure werden entsprechende L-Aminosäuren, dargestellt durch die folgende allgemeine Formel (I):
gebildet, worin R&sub1; und R&sub2; die gleiche Bedeutung haben, wie vorstehend definiert.
Als Beispiele der Ausgangs-α-Ketocarbonsäuren werden die folgenden erwähnt: Phenylbrenztraubensäure,
4-Hydroxybrenztraubensäure, 2-Fluorphenylbrenztraubensäure,
3-Fluorphenylbrenztraubensäure,
4-Fluorphenylbrenztraubensäure,
3,4-Difluorphenylbrenztraubensäure,
2-Chlorphenylbrenztraubensäure,
3-Chlorphenylbrenztraubensäure,
4-Chlorphenylbrenztraubensäure,
3,4-Dichlorphenylbrenztraubensäure,
4-Methylphenylbrenztraubensäure,
4-Vinylphenylbrenztraubensäure,
4-Methoxyphenylbrenztraubensäure,
3,4-Dimethoxyphenylbrenztraubensäure,
2,3,4-Trimethoxyphenylbrenztraubensäure,
4-Nitrophenylbrenztraubensäure,
4-Di-(2-chlorethyl)aminophenylbrenztraubensäure,
Indolbrenztraubensäure, α-Keto-γ-methylthiobuttersäure,
α-Keto-γ-ethylthiobuttersäure, α-Ketocapronsäure,
α-Ketoisocapronsäure, DL-α-Keto-β-methylvalerinsäure,
α-Ketovalerinsäure, α-Ketoisovalerinsäure,
α-Ketobuttersäure, 3-(β-Naphthyl)brenztraubensäure,
3,4-Dimethylphenylbrenztraubensäure,
3-Methoxyphenylbrenztraubensäure, und
α-Keto-γ-trifluormethylbuttersäure.
Aus den vorstehend erwähnten Ausgangs-α-Ketocarbonsäuren werden die folgenden L-Aminosäuren hergestellt:
L-Phenylalanin, L-Tyrosin, 2-Fluor-L-phenylalanin,
3-Fluor-L-phenylalanin, 4-Fluor-L-phenylalanin,
3,4-Difluor-L-phenylalanin, 2-Chlor-L-phenylalanin,
3-Chlor-L-phenylalanin, 4-Chlor-L-phenylalanin,
3,4-Dichlor-L-phenylalanin, 4-Methyl-L-phenylalanin,
4-Vinyl-L-phenylalanin, 4-Methoxy-L-phenylalanin,
3,4-Dimethoxy-L-phenylalanin,
2,3,4-Trimethoxy-L-phenylalanin, 4-Nitro-L-phenylalanin,
4-Di-(2-chlorethyl)amino-L-phenylalanin, L-Tryptophan,
L-Methionin, L-Ethionin, L-Norleucin, L-Leucin, L-Isoleucin,
L-Norvalin, L-Valin, α-Amino-L-buttersäure,
3-(β-Naphthyl)-L-alanin, 3,4-Dimethyl-L-phenylalanin,
3-Methoxy-L-phenylalanin, und
α-Amino-γ-trifluormethylbuttersäure.
Gemäß einer Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens werden eine α-Ketocarbonsäure, NADH und ein Ammoniumion unter Vorhandensein von L-Phenylalanin-Dehydrogenase reagieren gelassen, um eine entsprechende L-Aminosäure zu bilden, und die L-Aminosäure wird gewonnen.
Die Formen der Enzympräparationen der L-Phenylalanin-Dehydrogenase sind nicht beschränkt. Die Präparationen umfassen z. B. ein vollständig gereinigtes Enzym; Zellen enthaltendes Kulturmedium; lebende Zellen; getrocknete Zellpulver, die durch Behandeln der Zellen mit z. B. Aceton oder Ethanol hergestellt werden; aufgebrochene Zellen; partiell gereinigte Enzympräparationen, die zu verschiedenen Reinigungsstadien gereinigt sind. Weiterhin können Präparationen von immobilisiertem Enzym, wie immobilisiertes Enzym und Produkte, die immobilisiertes Enzym enthalten und gemäß konventionellen Verfahren hergestellt werden, verwendet werden.
Die Menge an L-Phenylalanin-Dehydrogenase, die von der vorstehend erwähnten Enzympräparation stammt, im Reaktionsmedium ist nicht kritisch, liegt jedoch gewöhnlich im Bereich von ungefähr 10 bis 10 000 Einheiten pro Liter, abhängig von der Natur und Menge des Substrats α-Ketocarbonsäure und anderen Bedingungen.
Als Substrat kann sowohl eine α-Ketocarbonsäure als auch deren Salz verwendet werden. Die Salze umfassen z. B. Natriumsalz, Kaliumsalz, Lithiumsalz und Calciumsalz etc.
Die Menge an α-Ketocarbonsäure oder deren Salz im Reaktionsmedium ist nicht kritisch, liegt jedoch gewöhnlich im Bereich von 1 bis 500 g pro Liter, abhängig von der Konzentration des Enzyms. Wenn das Substrat in einer niedrigeren Konzentration verwendet wird, kann es als freie Säure verwendet werden und wenn dies in einer relativ hohen Konzentration verwendet wird, kann es vorzugsweise als Salz verwendet werden, um den pH des Reaktionsmediums einfach einzustellen. Das Natriumsalz verschiedener α-Ketocarbonsäuren ist in hoher Konzentration nicht löslich. Das Vorhandensein eines ungelösten Salzes im Reaktionsmedium ist jedoch nicht unvorteilhaft. Wenn ein Ammoniumsalz einer α-Ketocarbonsäure verwendet wird, kann das Ammoniumsalz als Quelle sowohl des Ammoniumions als auch als Quelle der α-Ketocarbonsäure dienen. In der Eintopfreaktion können die α-Ketocarbonsäure oder deren Salz zur gleichen Zeit am Beginn der Reaktion zugefügt werden oder in Portionen oder kontinuierlich während der Reaktion. Salze der α-Ketocarbonsäure können solche sein, die kommerziell erhältlich sind oder solche, die durch Neutralisierung einer entsprechenden α-Ketocarbonsäure mit einer entsprechenden Base, wie Natriumhydroxid oder Ammoniak, hergestellt werden.
Als Quelle des Ammoniumions kann ein Ammoniumsalz, wie Ammoniumchlorid oder Ammoniumsulfat verwendet werden. Weiterhin können Ammoniakgas oder wäßriges Ammoniumhydroxid in das Reaktionsmedium eingeführt werden, um den pH-Wert innerhalb eines vorbestimmten Bereichs zu halten. Wie vorstehend beschrieben, dient, wenn ein Ammoniumsalz der α-Ketocarbonsäure als Substrat verwendet wird, das Salz ebenso als Quelle des Ammoniumions. Die Menge des verwendeten Ammoniumions ist stöchiometrisch oder höher im Verhältnis zur Molmenge der verwendeten α-Ketocarbonsäure und spezifischer ungefähr 1 bis 100 Molmengen im Verhältnis zur Molmenge der verwendeten α-Ketocarbonsäure. Durch Anheben der Menge des verwendeten Ammoniumsalzes wird das Gleichgewicht der betreffenden Enzymreaktion zur Seite der L-Aminosäurebildung verschoben, wodurch sich ein Anstieg der Ausbeute an L-Aminosäure im Verhältnis zur α-Ketocarbonsäure ergibt.
NADH kann in einer zur α-Ketocarbonsäure äquivalenten Menge verwendet werden. Da NADH sehr teuer ist, wird vorzugsweise jedoch vom industriellen Standpunkt her zusätzlich zum Reaktionssystem, worin α-Ketocarbonsäure mit NH&sub4;&spplus; und NADH reduktiv aminiert wird, um L-Aminosäure und NAD&spplus; zu bilden, ein NADH-regenerierendes System verwendet, worin das gebildete NAD&spplus; zu NADH rückreduziert wird. Als solch ein NADH-regenerierendes System kann eine Kombination aus einem Enzym, das NAD&spplus; zu NADH umwandelt und ein Substrat für die Reaktion verwendet werden, z. B. eine Kombination von Formiat-Dehydrogenase (EC 1.2.1.2) und Formiat, L-Glutamat-Dehydrogenase (EC 1.4.1.2) und L-Glutamat, Alkoholdehydrogenase (EC 1.1.1.1) und Ethanol, Aldehyddehydrogenase (EC 1.2.1.3) und Acetaldehyd oder eine Kombination aus Glucose-6-phosphat-dehydrogenase (EC 1.1.1.49) und Glucose-6-phosphat. Weiterhin kann die Reduktion von NAD&spplus; zu NADH mit Hydrogenase (EC 1.18.3.1) unter Verwendung von molekularem Wasserstoff als Elektronendonor oder die Reduktion von NAD&spplus; zu NADH, die von der Oxidation von Methylbiologen oder Dihydrolipoamid mit Diaphorase (EC, 1.6.4.3) begleitet wird, verwendet werden. Wo Formiat-Dehydrogenase und Formiat verwendet werden, wird gleichzeitig mit der Reaktion von NAD&spplus; zu NADH Ameisensäure zu Kohlendioxidgas oxidiert, das leicht aus dem Reaktionssystem entfernt wird, wodurch sich ergibt, daß das Gleichgewicht der Reaktion in die gewünschte Richtung verschoben wird. Daher ist als NADH-regenerierendes Enzym die Kombination von Formiat-Dehydrogenase und Formiat besonders bevorzugt.
Formiat-Dehydrogenase ist kommerziell erhältlich oder wird aus Candida boidinii Nr. 2201 (AKU 4705) oder Hansenula polymorpha ATCC 26012 nach einem bekannten Verfahren, das von Kato et al., Agricultural and Biological Chemistry, 38, 111-116 (1974) beschrieben ist, hergestellt. Wo Formiat-Dehydrogenase in der Form von Zellen, die diese enthalten, verwendet wird, kann die Behandlung der Zellen nach einem bekannten Verfahren, das von Izumi et al. in Journal of Fermentation Technology, 61, 135-142 (1983) beschrieben ist, ausgeführt werden.
Die Enzymkonzentration in dem NADH-regenerierenden System variiert abhängig von der Konzentration der L-Phenylalanin-Dehydrogenase etc., und ist im allgemeinen eine Konzentration, bei der NAD&spplus; zu NADH zu einer Rate reduziert wird, die einer Rate entspricht, zu der eine (α-Ketocarbonsäure reduktiv aminiert wird, d. h. NAD&spplus; gebildet wird. Wenn beispielsweise Formiat-Dehydrogenase als Enzym für das NADH-regenerierende System in Kombination mit 10 bis 10000 Einheiten/l L-Phenylalanin-Dehydrogenase verwendet wird, beträgt die Konzentration der Formiat-Dehydrogenase vorzugsweise ungefähr 10 bis 10000 Einheiten/l. Als Substrat für die Formiat-Dehydrogenase wird geeigneterweise ein Salz der Ameisensäure, wie Natriumformiat, Kaliumformiat oder Ammoniumformiat verwendet. Die Menge an Formiat ist vorzugsweise die 1- bis 2-fache äquivalente Menge des verwendeten α-Ketocarboxylats. Wo das NADH-regenerierende System verwendet wird, kann NAD&spplus; oder NADH zu 0,1 bis 10 mM zugefügt werden, welches eine gewöhnliche, physiologische Konzentration ist.
Als Reaktionsmedium können Wasser oder verschiedene Arten einer wäßrigen Lösung, z. B. eine wäßrige Pufferlösung oder eine wäßrige Lösung, die ein organisches Lösungsmittel, wie Aceton, Acetonitril, Dimethylsulfoxid oder Dimethylformamid enthält, verwendet werden. Die Pufferlösungen umfassen Tris-HCl-Puffer, Glycin-NaOH-Puffer etc.
Wenn das NADH-regenerierende System nicht verwendet wird, wird die Reaktion bei einem, für die reduktive Aminierung der α-Ketocarbonsäure durch die verwendete L-Phenylalanin-Dehydrogenase geeigneten pH ausgeführt. L-Phenylalanin-Dehydrogenase, die aus Sporosarcina stammt, wird bei pH 8 bis 10, vorzugsweise ungefähr bei pH 9, verwendet. Wenn das NADH-regenerierende System in Kombination mit der reduktiven Aminierung der α-Ketocarbonsäure verwendet wird, wird der pH-Wert des Reaktionsmediums aus einem Bereich gewählt, in dem sowohl die reduktive Aminierung der α-Ketocarbonsäure als auch die Reduktion von NAD&spplus; zu NADH zufriedenstellend voranschreitet, gewählt. Ein solcher pH-Bereich ist gewöhnlich pH 7,5 bis 9,5, vorzugsweise pH 8,0 bis 9,0, wenn eine Kombination aus L-Phenylalanin-Dehydrogenase von Sporosarcina und Formiat-Dehydrogenase von Candida boidinii verwendet wird.
Die Reaktionstemperatur wird nach denselben Überlegungen wie für die Auswahl des pH-Bereichs ausgewählt. Die Reaktionstemperatur beträgt gewöhnlich 20ºC bis 50ºC, vorzugsweise 25ºC bis 40ºC.
Die Reaktionszeit ist nicht kritisch und wird so ausgewählt, daß eine Substrat-α-Ketocarbonsäure in eine Produkt-L-Aminosäure mit einer zufriedenstellenden Konversionsrate, abhängig von der Konzentration des Substrats und der im Reaktionsmedium vorhandenen Enzymmenge, umgewandelt wird.
Die Reaktion kann im Eintopfverfahren oder kontinuierlich ausgeführt werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens wird eine Substrat-α-Ketocarbonsäure in ein Produkt, d. h. die entsprechende L-Aminosäure im Vorhandensein einer wachsenden Kultur, wie ein lebende Zellen enthaltendes Medium, lebende Zellen, die aus dem kultivierten Medium abgetrennt worden sind, Zellen, die in einem Maße behandelt worden sind, wodurch das für die Konversion einer α-Ketocarbonsäure zu einer L-Aminosäure benötigte Enzymsystem nicht zerstört wird, und im Vorhandensein einer Energiequelle ohne die artifizielle Zugabe von NADH, NAD&spplus; und des NADH-regenerierenden Systems umgewandelt. Die Energiequelle wird zum Reaktionsmedium zugefügt. Die Energiequelle kann als Elektronendonor für die reduktive Aminierung eines α-Ketocarboxylats dienen. Die Energiequellen umfassen z. B. Zucker, wie Arabinose, Ribose, Ribulose, Xylose, Fucose, Rhamnose, Fructose, Galactose, Gluconat, Trehalose, Glucose, Mannitol, Mannose, Sorbitol, Sorbose, Inositol, Lactose, Maltose, Sucrose, Raffinose, Glycerin, Stärke, Inulin, Glycogen, Carboxymethylzellulose und ähnliche. Weiterhin umfassen Energiequellen Alkohole, wie Ethanol und Methanol, organische Säuren, wie Propionsäure, Essigsäure, Ameisensäure, Zitronensäure, Brenztraubensäure, Bernsteinsäure, Äpfelsäure, α-Keto-Glutarsäure und ähnliche.
Für die zweite Ausführungsform werden das Reaktionsmedium, Reaktions-pH, Reaktionstemperatur und andere Bedingungen wie für die erste Ausführungsform beschrieben, ausgewählt. Die zweite Ausführungsform benötigt ebenso keine aerobe Bedingung.
Die so gebildete L-Aminosäure wird gewonnen und nach irgendeinem konventionellen Verfahren gereinigt. Beispielsweise wird zur Reaktionsmischung Trichloressigsäure zugefügt, um Proteine zu präzipitieren und sowohl das Präzipitat, wenn vorhanden, als auch die Zellen werden durch Filtration oder Zentrifugation entfernt, um ein Filtrat oder einen Überstand, enthaltend die Produkt-L-Aminosäure, zu erhalten. Das Produkt im Filtrat oder Überstand wird danach durch beispielsweise Ionenaustauschharz gereinigt und letztendlich kristallisiert.
Die quantitative Analyse der L-Aminosäuren wird durch einen Bioassay unter Verwendung von beispielsweise Leuconostoc mesenteroides ATCC 8042 oder durch Papierchromatographie durchgeführt, wobei eine die L-Aminosäure enthaltende Analysenprobe auf Filterpapier getrennt wird, ein L-Aminosäurefleck mit Ninhydrin entwickelt wird, und der entwickelte Fleck zum Zweck der spektralphotometrischen Analyse eluiert wird.

Beispiele

Die vorliegende Erfindung wird nun weiter durch die folgenden Beispiele verdeutlicht, wobei sie jedoch in keinster Weise darauf beschränkt ist.

Beispiel 1.

Reinigung der L-Phenylalanin-Dehydrogenase aus Sporosarcina urea SCRC-R04

30 l Medium, enthaltend 0,2% L-Phenylalanin, 0,5% Hefeextrakt, 1,0% Pepton, 0,2% H&sub2;HPO&sub4;, 0,1% NaCl und 0,02% MgSO&sub4;·7H&sub2;O (pH 7,0) wurde für 15 Minuten bei 120ºC sterilisiert und nach Abkühlen mit Sporosarcina ureae SCRC-R04 (FERM P-8178, FERM BP-1012) angeimpft, und das Kultivieren wurde aerob für 24 Stunden bei 30ºC durchgeführt. Nach dem Kultivieren wurde das kultivierte Medium zentrifugiert, um ungefähr 380 g Naßzellen zu erhalten. Die Zellen wurden einmal mit 0,85% Saline gewaschen und in 1 l Phosphatpuffer pH 7,0, enthaltend 0,1 mM EDTA und 5 mM 2-Mercaptoethanol, suspendiert und die Suspension wurde einer Ultraschallbehandlung bei 9 KHz für 10 Stunden ausgesetzt, um die Zellen aufzubrechen. Die behandelte Mischung wurde bei 14000 X g für 20 Minuten zentrifugiert, um einen zellfreien Rohextrakt zu erhalten, der L-Phenylalanin-Dehydrogenase ohne Zelltrümmer enthält. Zum zellfreien Extrakt wurde 5% Protaminsulfat zu einer Menge von 0,1 g Protaminsulfat pro 1 g Protein zugefügt, und es wurde für 30 Minuten gerührt, um ein Präzipitat zu bilden. Die das Präzipitat enthaltende Mischung wurde bei 14000 X g für 20 Minuten zentrifugiert, um das Präzipitat zu entfernen. Der das Enzym enthaltende Überstand wurde gegen 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,0), enthaltend 0,1 M EDTA und 5 mM 2-Mercaptoethanol, dialysiert. Zu 1990 ml Dialysat wurden 412 g festes Ammoniumsulfat zugefügt, um eine 30%-Sättigung zu erreichen. Die Aussalzungsmischung wurde für 30 Minuten gerührt und bei 14000 X g für 20 Minuten zentrifugiert, um 2100 ml Überstand zu erhalten.
Zum Überstand wurden 416 g festes Ammoniumsulfat zugefügt, um eine 60%-Sättigung zu erreichen. Die Aussalzungsmischung wurde bei 14000 X g für 20 Minuten zentrifugiert, um ein Präzipitat mit Enzymaktivität zu erhalten, das danach in einer kleinen Menge 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,0) gelöst wurde, und die Lösung wurde gegen 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,0), enthaltend 0,1 mM EDTA und 5 mM 2-Mercaptoethanol, dialysiert. Das Dialysat wurde auf eine DEAE-Toyopearl 650 M-Säule, die vorher mit 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,0), enthaltend 0,1 mM EDTA und 5 mM 2-Mercaptoethanol, äquilibriert worden war, aufgetragen, und die Säule wurde mit 0,1 M Phosphatpuffer (ph 7,0), enthaltend 0,1 mM EDTA und 5 mM 2-Mercaptoethanol, eluiert, um aktive Fraktionen zu erhalten.
Diese Fraktionen wurden vereinigt und die vereinigten aktiven Fraktionen wurden gegen 0,01 M Phosphatpuffer, enthaltend 0,01 mM EDTA und 5 mM 2-Mercaptoethanol, dialysiert, und das Dialysat wurde auf eine Hydroxyapatit-Säule, die zuvor mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden war, aufgetragen. Das adsorbierte Enzym wurde durch einen linearen Elutionsgradienten unter Verwendung von 0,01 M bis 0,15 M Phosphatpuffer (pH 7,0), enthaltend 0,1 mM EDTA und 5 mM 2-Mercaptoethanol, eluiert. Die vereinigte aktive Fraktion wurde durch eine Sephadex G200-Säule, äquilibriert mit 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7,0), enthaltend 0,1 mM EDTA, 5 mM 2-Mercaptoetehanol und 0,01 M NaCl, gelfiltriert. Die so erhaltene Enzymlösung wurde durch Ultrafiltration konzentriert und zu der konzentrierten Enzymlösung wurde Ammoniumsulfat zugefügt, um das Enzym L-Phenylalanin-Dehydrogenase zu kristallisieren. Eine mikroskopische Aufnahme der Kristalle ist in Fig. 8 gezeigt. Die Reinigungsschritte ausgehend vom zellfreien Extrakt zur letztendlichen Kristallisierung sind in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5 Reinigungsschritt Gesamtaktivität (Einheiten) Gesamtprotein (mg) Spezifische Aktivität (Einheiten/mg) Ausbeute (%) 1. zellfreier Extrakt 2. Nach Protanin-Sulfat-Behandlung 3. Ammoniumsulfat-Aussalzungs-Fraktion 4. Nach DEAE-Toyopearl-Säule 5. Nach Hydroxyapatit-Säule 6. Nach Sephadex G-200 Säule 7. Kristall

Beispiel 2

Herstellung von L-Phenylalanin unter Verwendung einer Rohpräparation von L-Phenylalanin-Dehydrogenase aus Sporosarcina urea SCRC-R04

300 ml einer Reaktionsmischung, enthaltend 5 g (22 mMol) Natriumphenylpyruvat, 3 g (49 mMol Ammoniumformiat, 0,21 g (0,29 mMol) NAD&spplus;, 18 mMol Tris-HCl-Puffer (pH 8,5), 43,2 Einheiten L-Phenylalanin-Dehydrogenase (als eine Rohpräparation entsprechend der Ammoniumsulfat-Fraktion im dritten Schritt in Tabelle 5 in Beispiel 1) und 49,0 Einheiten Formiat-Dehydrogenase (als eine aus Candida bodinii Nr. 2201 partiell gereinigte Rohpräparation, pH 8,5) wurde 24 Stunden bei 300 C inkubiert. Die im Reaktionsmedium gebildete Menge an L-Phenylalanin wurde zu 1,91 g (11,6 mMol, 52,7% Ausbeute) nach einem Bioassay unter Verwendung von Leuconostoc mesenteroides bestimmt.
Die Reaktionsmischung wurde mit 30 ml einer 20%-igen wäßrigen Trichloressigsäurelösung ergänzt und zentrifugiert, um Protein zu entfernen. Der Überstand wurde auf eine Kationenaustauscher-Amberlite IR-120 (H&spplus;-Form)-Säule aufgetragen, und die Säule wurde mit 1 M wäßrigen Ammoniak eluiert, um L-Phenylalanin-enthaltende Fraktionen zu erhalten. Diese Fraktionen wurden vereinigt und die vereinigte Fraktion wurde konzentriert, und das Konzentrat wurde auf eine Anionenaustauscher-Amberlite IRA-400 (OH&supmin;-Form) -Säule aufgetragen, und die Säule wurde mit 1 M Ameisensäure eluiert, um L-Phenylalanin-enthaltende Fraktionen zu erhalten, die vereinigt und bis zur Trockenheit konzentriert wurden. Der Rest wurde in einer kleinen Menge warmen Wassers gelöst, und die Lösung wurde mit Ethanol zu einer 50%-igen Ethanolkonzentration ergänzt, und das Kristallisieren von L-Phenylalanin wurde bei 4ºC erlaubt. Die Kristalle wurden auf dieselbe Weise umkristallisiert, um 0,458 g eines wasserhellen Feststoffs zu erhalten. Die Elementaranalyse der so erhaltenen Reparation brachte die folgenden Ergebnisse.
Ermittelt (%) Berechnet (%)
Schmelzpunkt = 270ºC (Zersetzung). [α]²&sup5; = -35,5º (c = 0,48, H&sub2;O), L-Form, optisch rein. Das Massenspektrum, NMR-Spektrum und IR-Spektrum zeigen, daß das Produkt L-Phenylalanin ist.

Beispiel 3

Synthese von L-Phenylalanin in hoher Konzentration unter Verwendung von, aus Sporosarcina urea SCRC-R04 partiell gereinigter L-Phenylalanin-Dehydrogenase

5 ml Reaktionsmischung, enthaltend 3,57 mMol Natriumphenylpyruvat, 100 uMol NAD&spplus;, 5 mMol NH&sub4;Cl, 272 umMol Tris-HCl-Puffer (pH 8,5), 7,84 mMol Natriumformiat, 35 Einheiten L-Phenylalanin-Dehydrogenase (als partiell gereinigte Präparation, behandelt mit der DEAE-Toyopearl-Säule im vierten Schritt in Tabelle 5 in Beispiel 1) und 10,2 Einheiten Formiat-Dehydrogenase (als eine aus Candida boidinii Nr. 2201 partiell gereinigte Präparation, pH 8,5) wurden für 24 Stunden bei 30ºC inkubiert.
Der Bioassay der Reaktionsmischung zeigte die Bildung von 580 mg (3,51 mMol, 98,5% Ausbeute) L-Phenylalanin.

Beispiel 4

13,0 ml einer Reaktionsmischung, enthaltend 200 uMol Natriumphenylpyruvat, 20 uMol NAD&spplus;, 200 uMol Natriumformiat, 600 uMol Tris-HCl-Puffer (pH 8,5), 11,9 Einheiten Formiat-Dehydrogenase (als zellfreier Extrakt von Candida boidinii, pH 8,5) und 13,2 Einheiten L-Phenylalanin-Dehydrogenase (als rohe Enzymfraktion, präzipitiert innerhalb 30 bis 60%-iger Ammoniumsulfatsättigung im dritten Schritt in Tabelle 5 im Beispiel 1) wurden für 15 Stunden bei 30ºC inkubiert. Der Bioassay der Reaktionsmischung zeigte die Bildung von 32,8 mg (198,8 uMol, 98,4% Ausbeute) L-Phenylalanin.

Beispiel 5

Allgemeines Verfahren

Verschiedene Arten der in Tabelle 5 aufgeführten α-Ketocarbonsäuren wurden zu den entsprechenden L-Aminosäuren konvertiert. In Tabelle 5, die die L-Phenylalanin-Dehydrogenase-Präparation betrifft, bedeutet "Rohenzym" eine Präparation, die durch Ammoniumsulfat-Fraktionierung eines zellfreien Extraktes hergestellt wurde, und "partiell gereinigtes Enzym" bedeutet eine Enzympräparation, die mit einer DEAE-Toyopearl-Säule behandelt wurde. NAD&spplus; oder NADH wurde zu 1 bis 20 mM der Endkonzentration zugefügt. Das Ammoniumion wurde in der Form von Ammoniumchlorid, Ammoniumformiat oder NH&sub4;OH-NH&sub4;Cl-Puffer (pH 9,0) zu 0,05 M bis 0,5 M der Endkonzentration ergänzt. Formiat wurde in der Form von Natriumformiat oder Ammoniumformiat zu einer Menge von 1 bis 30 Äquivalenten, bezogen auf die α-Ketocarbonsäure, ergänzt. Der pH der Reaktionsmischung wurde auf 8,5 bis 9 unter Verwendung von Tris-HCl-Puffer (pH 8,5) oder NH&sub4;OH-NH&sub4;Cl-Puffer (pH 9,0) in einer Konzentration von 0,05 M bis 0,5 M eingestellt. Die Reaktion wurde bei 30ºC durchgeführt.

Spezielle Reaktionsbedingungen

Reaktion Nr. 1

50 ml einer Reaktionsmischung, enthaltend 0,61 g (3 mMol) Natriumphenylpyruvat, 0,54 g (3 mMol) D-Fructose und Zellen von Sporosarcina urea SCRC-R04 (hergestellt durch Zentrifugieren von 200 ml kultiviertem Medium, um Zellen zu erhalten und einmaliges Waschen der Zellen mit physiologischer Kochsalzlösung) wurden für 28 Stunden bei 30ºC stehengelassen. Der Bioassay der Reaktionsmischung ergab die Bildung von 0,34 g (2,07 mMol, 69% Ausbeute) L-Phenylalanin.
Eine ähnliche Reaktionsbedingung wurde für die Reaktionen Nr. 2 und 8 angewendet.

Reaktion Nr. 3

5 ml einer Reaktionsmischung, enthaltend 20,4 mg (100 uMol) Natriumphenylpyruvat, 2,5 umMol NAD&spplus;, 250 uMol Tris-HCl-Puffer (pH 8,5), 2 mMol Ammoniumformiat, 5 mg getrocknete Zellen von Candida boidinii, Naßzellen von Sporosarcina ureae SCRC-R04 (gewaschene Zellen, die aus 25 ml kultiviertem Medium erhalten wurden) wurden für 24 Stunden bei 30ºC inkubiert. Der Bioassay der Reaktionsmischung ergab die Bildung von 11,7 mg (71 4Mol, 71% Ausbeute) L-Phenylalanin.
Eine ähnliche Reaktionsbedingung wurde bei der Reaktion Nr. 9 angewendet.

Reaktion Nr. 5

5 ml einer Reaktionsmischung, enthaltend 17,02 mg (100 uMol) Natrium-α-Keto-γ-methylthiobutyrat 76,3 mg (100 uMol) NADH, 250 uMol Tris-HCl-Puffer (pH 8,5), 107 mg (2 mMol) Ammoniumchlorid, 0,5 Einheiten L-Phenylalanin-Dehydrogenase (eine Fraktion, die zwischen 30% bis 60%-iger Ammoniumsulfatsättigung präzipitiert wurde) für 24 Stunden bei 30ºC inkubiert.
Der Bioassay der Reaktionsmischung ergab die Bildung von 10,02 mg (67 uMol) L-Methionin.

Reaktion Nr. 7

5 ml einer Reaktionsmischung, enthaltend 17,02 mg (100 uMol) Natrium-α-keto-γ-methylthiobutyrat, 50 mg (800 uMol) Ammoniumformiat, 3,6 mg (5 uMol) NAD&spplus;, 250 uMol Tris-HCl-Puffer (pH 8,5), 2,5 Einheiten L-Phenylalanin-Dehydrogenase (eine Präparation des aus Sporosarcina ureae SCRC-R04 stammenden homogen gereinigten Enzyms) und 0,5 Einheiten Formiat-Dehydrogenase (eine partiell gereinigte Präparation aus Candida boidinii Nr. 2201) wurden für 24 Stunden bei 33ºC inkubiert. Der Bioassay der Reaktionsmischung ergab die Bildung von 13,05 mg (87 umMol) L-Methionin.
Eine ähnliche Reaktionsbedingung wurde bei den Reaktionen Nr. 4, 6, 10, 11 und 12 angewendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefaßt. Tabelle 5 Herstellung von L-Aminosäure zur Verwendung bei Sporosarcina urea SCRC-R04 Reaktion Nr. α-Ketocarbonsäure Menge an α-Ketocarboxylat Reaktionsvolumen L-Phenylalanin-Dehydrogenase Präparationsform Einheiten Coenzyme NADH Regenerierungssystem Präparationsform Einheiten Reaktionszeit Produkt Ausbeute Natriumphenylpyruvat gewaschene Zellen aus 200 ml kultiviertem Medium enthalten in Zellen. 3,000 uMol Fructose zugefügt als Elektronendonor L-Phenylatanin 4-Hydroxyphenylbrenztraubensäure rohes Enzym NAD Formiat-Dehydrogenase L-Tyrosin Natrium-α-keto- -methylthiobutyrat L-Methionin Tabelle 5 (Fortsetzung) Reaktion Nr. Ketocarbonsäure Menge an α-Ketocarboxylat Reaktionsvolumen L-Phenylalanin-Dehydrogenase Präparationsform Einheiten NADH Regenerierungssystem Präparationsform Einheiten Reaktionszeit Produkt Ausbeute Natrium-α-ketoisovalerat homogen gereinigtes Enzym NAD Formiat-Dehydrogenase L-Valanin NatriumDL-α-keto-β-methyl-n-valerat L-Isoleucin Natriumα-keto-iso-capronat L-Leucin

Claims

1. Enzym L-Phenylalanin-Dehydrogenase, dadurch gekennzeichnet, daß es

(1) eine Reaktion, worin L-Phenylalanin, NAD&spplus; und H&sub2;O zu Phenylpyruvat, NADH und einem Ammoniumion reagiert, und eine Rückreaktion davon katalysiert;

(2) ein Molekulargewicht von ungefähr 290 000, bestimmt durch Hochleistungsflüssigchromatographie und ein Molekulargewicht von ungefähr 305 000, bestimmt durch eine Sedimentationsgleichgewichtsmethode besitzt, und eine Untereinheit mit einem Molekulargewicht von ungefähr 38 000 bis 39 000, bestimmt durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese aufweist; und

(3) bezüglich der oxidativen Desaminierung auf L-Phenylalanin eine starke Wirkung und auf L-Tryptophan, L-Tyrosin und L-Methionin eine sehr schwache Wirkung hat; und

(4) von einem zur Gattung Sporosarcina gehörenden Mikroorganismus erhältlich ist.

2. Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin-Dehydrogenase, gekennzeichnet durch

(1) Kultivieren eines Mikroorganismus, der zu der Gattung Sporosarcina gehört und fähig zum Herstellen der L-Phenylalanin-Dehydrogenase ist, um L-Phenylalanin-Dehydrogenase zu bilden; und

(2) Gewinnen der L-Phenylalanin-Dehydrogenase.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin der Mikroorganismus Sporosarcina ureae ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin Sporosarcina urea ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Sporosarcina urea SCRC-R04, FERM P-8178, FERM BP-1012; Sporosarcina ureae IFO 12698; und Sporosarcina ureae IFO 12699, ATCC 6473.

5. Mikroorganismus, der fähig zum Herstellen von L-Phenylalanin-Dehydrogenase ist, wobei der Mikroorganismus Sporosarcina ureae SCRC-R04, FERM P-8178 oder FERN BP-1012 ist.

6. Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure mit der allgemeinen Formel (I):

worin R&sub1; Wasserstoff oder Methyl bedeutet; und R&sub2; ein lineares oder verzweigtes, wahlweise substituiertes, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder eine wahlweise substituierte aromatische Gruppe bedeutet, gekennzeichnet durch Reagierenlassen einer α-Ketocarbonsäure mit der allgemeinen Formel (II):

worin R&sub1; und R&sub2; die vorstehende Bedeutung haben, oder eines Salzes davon, eines Ammoniumions und NADH im Vorhandensein von L-Phenylalanin-Dehydrogenase, die von einem zur Gattung Sporosarcina gehörenden Mikroorganismus erhältlich ist, um die L-Aminosäure zu bilden, und

Gewinnen der L-Aminosäure.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin Phenylalanin-Dehydrogenase in einer Form, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem gereinigten Enzym, einer partiell gereinigten Enzympräparation, zerstörten Zellen, das Enzym enthaltende getrocknete Zellen, lebende Zellen, kultiviertes Medium und einer Präparation mit immobilisiertem Enzym vorhanden ist.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder Anspruch 7, worin ein weiteres NADH-regenerierendes System beteiligt ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin das NADH-regenerierende System ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer Kombination aus Formiat-Dehydrogenase und Ameisensäure oder einem Salz davon, einer Kombination aus L-Glutamat-Dehydrogenase und L-Glutaminsäure oder einem Salz davon, einer Kombination aus Alkohol-Dehydrogenase und Ethanol, einer Kombination aus Aldehyd-Dehydrdogenase und Acetaldehyd, und einer Kombination aus Glucose-6- phosphat-Dehydrogenase und Glucose-6-phosphat.

10. Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure mit der allgemeinen Formel (I):

worin R&sub1; und R&sub2; die vorstehende Bedeutung haben, oder eines Salzes davon, und eines Ammoniumions im Vorhandensein von kultiviertem Medium, lebenden Zellen oder Zellen, die in einer Weise behandelt wurden, daß die für die Konversion einer α-Ketocarbonsäure zu der entsprechenden L-Aminosäure benötigten Enzymsysteme verbleiben, und abgeleitet sind von einem Mikroorganismus, der zu der Gattung Sporosarcina gehört und zum Herstellen der L-Phenylalanin-Dehydrogenase fähig ist, und im Vorhandensein einer Energiequelle, um die L-Aminosäure zu bilden, und

Gewinnen der L-Aminosäure.

11. Verfahren nach Anspruch 10, worin die Energiequelle ausgewählt wird aus Zuckern, Alkoholen, organischen Säuren oder Salzen davon, und einer Kombination davon.

12. Verfahren nach Anspruch 11, worin die Energiequelle ausgewählt ist aus Arabinose, Ribose, Ribulose, Xylose, Fucose, Rhamnose, Fructose, Galactose, Gluconat, Trehalose, Glucose, Mannitol, Mannose, Sorbitol, Sorbose, Inositol, Lactose, Maltose, Sucrose, Raffinose, Glycerin, Stärke, Inulin, Glycogen, Carboxymethylcellulose, Ethanol, Methanol, Propionsäure, Essigsäure, Ameisensäure, Zitronensäure, Brenztraubensäure, Bernsteinsäure, Äpfelsäure, und α-Ketoglutarsäure.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, worin der Mikroorganismus Sporosarcina ureae ist.

14. Verfahren nach Anspruch 13, worin Sporosarcina ureae ausgewählt ist aus Sporosarcina urea SCRC-R04, FERN P-8178, FERN BP-1012; Sporosarcina ureae IFO 12698; und Sporosarcina ureae IFO 12699, ATCC 6473.