CN110616180B - 一种生产羟基酪醇的工程菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生产羟基酪醇的工程菌及其应用，属于生物工程技术领域。本发明的基因工程菌导入了L‑苯丙氨酶脱氢酶、α‑酮酸脱羧酶、醇脱氢酶的基因，可应用于生物合成羟基酪醇。本发明还公开了重组大肠杆菌基因工程菌的构建方法和应用。利用本发明的重组菌转化生产羟基酪醇的方法，具有操作简单，成本低，产物合成效率高的特点，具有良好的产业化前景。

Description

一种生产羟基酪醇的工程菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种生产羟基酪醇的工程菌及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
羟基酪醇(3,4-二羟基苯乙醇，Hydroxytyrosol，3,4-Dihydroxyphenylethanol，2-(3,4-Dihydroxyphenyl)ethanol)，是一种天然的多酚类化合物，具有很强的抗氧化活性，主要以酯类的形式存在于橄榄的果实和枝叶中。羟基酪醇苯环上连接有两个羟基，是其主要的抗氧化活性基团，因其固有的抗氧化活性可预防多种疾病的发生。除此之外，羟基酪醇还可消除体内自由基，恢复人体脏腑器官的健康状态，防止脑衰，延缓衰老。
近几年的研究表明，羟基酪醇对多种疾病有明显的作用，羟基酪醇在糖脂代谢调节、防治肿瘤、抗血栓、缓解动脉硬化、抑制病原微生物、防治视网膜黄斑变性、保护软骨和防治骨质疏松等方面都具有良好的生物活性。随着人们对羟基酪醇生物学活性及体内代谢特征的不断研究，越来越多的生物活性被开发出来，这些研究也受到国内外研究者的广泛关注。
目前羟基酪醇的工业化生产还不成熟，且大都处于实验室阶段。其小量制备主要有以下两种方式：1)通过酸解或酶解橄榄厂的废水、橄榄叶、原生橄榄油中的橄榄苦苷，再进一步获得羟基酪醇；2)利用化学合成的方法制备羟基酪醇。利用生产橄榄油产生的废水制备羟基酪醇，既能进行废物利用，又能减少对环境的污染。但是此方法需要大量的溶剂，并且羟基酪醇的回收率不高。通过化学合成的方法虽然能成功合成羟基酪醇(CN201110357075.1、CN201210342015.7)，但由于原料和试剂成本昂贵，反应过程中产生许多副产物，并且合成步骤较长，反应剧烈不易控制等缺点，使得化学合成方法不适合工业化生产。除此之外，由于羟基酪醇是重要的食品、药物、保健品的原材料，因此通过化学方法得到的产品不受人们欢迎。目前市场上的这一类物质主要从植物中提到得到，例如，中国发明专利CN201610883391.5公开了一种橄榄叶羟基酪醇的提取工艺；中国发明专利CN201710195462.7从橄榄叶中提取羟基酪醇的方法。由于植物资源及其含量的限制，并且提取过程繁琐、复杂，使得这些产品价格昂贵，因此通过微生物法生产受到了广泛的关注。
2012年，Yasuharu Satoh等人提出以酪氨酸为底物，在酪氨酸羟化酶的作用下生成L-多巴，L-多巴在L-多巴脱羧酶作用下生成多巴胺，接着在酪胺氧化酶作用下生成3,4-二羟基苯乙醛，再在醇脱氢酶作用下生成羟基酪醇，(Engineering of l-tyrosineoxidation in Escherichia coli and microbial production of hydroxytyrosol,Metab.Eng.14(6)603-610(2012))。通过构建含有不同基因的大肠宿主得到一株菌，分别以1mM酪氨酸为底物生成0.19±0.0056mM羟基酪醇，以1mM L-多巴生成0.74±0.088mM羟基酪醇。国际发明专利WO2017US39329(HOST CELLS AND METHODS FOR PRODUCINGHYDROXYTYROSOL)也公开了两株宿主细胞共同培养发酵酪氨酸产羟基酪醇的方法，首先在第一个宿主细胞的作用下产生L-多巴，进一步在产生羟基酪醇。这一种制备羟基酪醇的方法大多采用来源于人或小鼠的基因，致使基因在大肠宿主或其他异源宿主中的表达不兼容。
中国发明专利CN201510242626.8公开了一种大肠杆菌中过表达来源于大肠杆菌的单加氧酶基因簇HpaBC，以葡萄糖为底物从头开始合成羟基酪醇；该方案的不足之处在于羟基酪醇对菌体有毒性，还有就是外源蛋白HpaBC表达量较低；因此生产羟基酪醇的效率较难提高。中国发明专利CN201610158902.7公开了一种大肠杆菌宿主表达基因ARO10、HpaBC和UGT生产羟基酪醇的方法，该方法不仅生成羟基酪醇，还能够生成羟基酪醇-3-O-β-D-葡萄糖苷和羟基酪醇-4-O-β-D-葡萄糖苷，致使羟基酪醇的产量降低，而且使后期分离纯化步骤变得繁琐。Chung等人通过在大肠杆菌过表达来源于植物的芳香醛合成酶(aromaticaldehyde synthases)，将L-酪氨酸一步变成对羟基苯乙醛，再由大肠杆菌内部的还原系统生成酪醇，另外在HpaBC的作用下产生羟基酪醇，由于植物基因的在大肠杆菌内的表达不兼容，因此影响了全细胞转化效率(Production of Three Phenylethanoids,Tyrosol,Hydroxytyrosol,and Salidroside,Using Plant Genes Expressing in EscherichiaColi.Scientific Reports,2017,7(2578))。
中国发明专利CN201711054680.5公开了异源代谢途径生产酪醇及羟基酪醇的方法。该方案在宿主中表达了氨基转移酶(Aminotransferase)，酮酸脱羧酶(Ketoaciddecarboxylase)，醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase)来生产酪醇，再在4-羟基苯乙酸羟化酶的作用下来生产羟基酪醇。该方案的缺点是需要外加许多昂贵的辅酶磷酸吡哆醛(PLP)和还原型辅酶Ⅰ(NADH)，而且在苯环上加羟基的效率明显降低，致使羟基酪醇的得率很低。
目前采用多酶串联表达构建的全细胞催化简单前体，生成相应的高副加值产物已经被广泛应用(Constructing Biocatalytic Cascades:In Vitro and in VivoApproaches to de Novo Multi-Enzyme Pathways,ACS Catal.,2017,7(1),710–724)，而且全细胞的获取更加简单方便，并实现对廉价底物的转化，有时比葡萄糖的从头合成更加经济有效。据文献(Metabolic Engineering of Saccharomyces cerevisiae for theProduction of 2-Phenylethanol Via Ehrlich Pathway,Biotechnology andBioengineering,2014,111(1),115-124.)报道，在以酿酒酵母为宿主构建的基因工程菌，以L-苯丙氨酸为原料，催化生成2-苯乙醇，产量达到6.1g/L，产率为82.5％。在以克雷酵母为宿主的研究中，以20g/L葡萄糖为原料，在不加L-苯丙氨酸的前提，下，获得苯乙醇的产量为1.3g/L，其得率远远小于以产物前体为原料，(Biosynthesis of 2-phenylethanol fromglucose with genetically engineered Kluyveromyces marxianus,Enzyme andMicrobial Technology,2014,61–62,44–47)。然而，现有的方法需要使用葡萄糖或其它供氢体，增加了工业应用的成本，提高了催化反应的复杂性。
发明内容
基于目前各种方法的缺陷，本发明提供了一种羟基酪醇的生产方法，并构建了以大肠杆菌为宿主的共表达工程菌，实现了廉价底物L-多巴到羟基酪醇的生产。同时本发明要解决该菌株的构建和应用的技术问题。
本发明的第一个目的是提供一种L-苯丙氨酸脱氢酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示。
本发明的第二个目的是提供一种重组大肠杆菌，共表达L-苯丙氨酸脱氢酶、α-酮酸脱羧酶、醇脱氢酶。
在一种实施方式中，所述L-苯丙氨酸脱氢酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示。
在一种实施方式中，编码所述突变体的核苷酸序列是SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5。
在一种实施方式中，所述α-酮酸脱羧酶来自Proteus vulgaris ATCC 49132或Providencia alcalifaciens DSM 30120。
在一种实施方式中，所述α-酮酸脱羧酶，其氨基酸序列为NCBI上accession NO.为KGA60648.1、ATG16423.1的序列。
在一种实施方式中，所述α-酮酸脱羧酶，其核苷酸序列是NCBI上accession NO.为JPIX01000001REGION:1259773..1261422、CP023536REGION:complement(1924726..1926384)的序列。
在一种实施方式中，所述醇脱氢酶来自E.coli BL21(DE3)。
在一种实施方式中，所述醇脱氢酶，其氨基酸序列是NCBI上accession NO.为WP_001318460.1、WP_000692754.1的序列。
在一种实施方式中，所述醇脱氢酶，其核苷酸序列是NCBI上accession NO.为NC_012892REGION:4406777..4407796、NC_012892REGION:312506..313555的序列。
在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌，是采用双质粒或单质粒表达编码L-苯丙氨酸脱氢酶基因、α-酮酸脱羧酶基因和醇脱氢酶基因。
本发明的第二个目的是提供一种构建所述基因工程菌的方法，所述方法是将编码L-苯丙氨酸脱氢酶、α-酮酸脱羧酶、醇脱氢酶的基因与1个或2个质粒连接，然后转化至宿主细胞中，得到重组工程菌。
在一种实施方式中，所述质粒可选用pETDuet-1、pACYCDue-1、pCOLADuet-1、pRSFDuet-和pET系列质粒。
本发明的第三个目的是提供一种生产羟基酪醇的方法，所述方法是利用上述任一所述的重组大肠杆菌为细胞催化剂，以L-多巴为底物生产羟基酪醇；所述大肠杆菌重组菌同时表达3种酶，分别为L-苯丙氨酸脱氢酶、α-酮酸脱羧酶、醇脱氢酶。
在一种实施方式中，所述生产羟基酪醇化合物，是进行全细胞转化生产。
在一种实施方式中，所述细胞进行了固定化。
在一种实施方式中，所述全细胞转化生产的体系中，含有新鲜细胞1-200g/L(按湿重计)，左旋多巴1-200g/L，NAD 0-1g/L。
在一种实施方式中，所述全细胞转化生产的体系中，pH 6.0-9.0。
在一种实施方式中，所述全细胞转化生产的体系的温度为15-40℃。
在一种实施方式中，所述全细胞转化生产的体系的反应时间为1-48小时。
本发明还要求保护所述重组大肠杆菌在制备含羟基酪醇及衍生物，及羟基酪醇下游产品方面的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种生产羟基酪醇的方法，利用一种大肠杆菌重组菌以L-多巴为底物生产羟基酪醇。该大肠杆菌重组菌同时表达3种酶，分别为L-苯丙氨酸脱氢酶、α-酮酸脱羧酶、醇脱氢酶。利用本发明的重组菌转化生产羟基酪醇的方法，过程简单且原料易得价格低廉，具有良好的工业化应用前景。
具体实施方案
本发明的重组菌的功能核心在于可以同时表达3种酶，分别为L-苯丙氨酸脱氢酶、α-酮酸脱羧酶、醇脱氢酶。其原理为：在工程菌全细胞内，L-苯丙氨酸脱氢酶以NAD为辅酶将L-多巴脱氢生成3,4-二羟基苯丙酮酸和NADH；随后经由α-酮酸脱羧酶作用生成3,4-二羟基苯乙醛；醇脱氢酶利用L-苯丙氨酸脱氢酶脱氢过程生成的NADH将3,4-二羟基苯乙醛还成羟基酪醇，同时实现了辅酶NAD的再生。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
1、本发明所涉及的菌株及质粒
购自美国菌种保藏中心ATCC的Lactobacillus plantarum ATCC 14917、Lactobacillus paracasei ATCC 334、Rhodobacter sphaeroides ATCC BAA-808、Clostridium symbiosum ATCC 14940、Proteus vulgaris ATCC 49132。购自Novagen公司的pETDuet-1、pACYCDue-1、pCOLADuet-1、pRSFDuet-和pET28a质粒、Escherichia coliBL21(DE3)、Escherichia coli BL21 DH5α。Providencia alcalifaciens DSM 30120购自德国菌种保藏中心。
2、酶的选择
(1)L-苯丙氨酸脱氢酶的选择
含有L-苯丙氨酸脱氢酶基因的菌株不多，并且报道均不能以左旋多巴为底物脱氢，本发明以来源于Bacillus sphaericus的L-苯丙氨酸脱氢酶(NCBI上氨基酸序列的accession NO为BAA08816.1，Phenylalanine dehydrogenase of Bacillus badiusPurification,characterization and gene cloning，Eur.J.Biochem.168,153-159(1987))为基础，其DNA进行根据大肠杆菌宿主优化并全合成获得基因bspde，并进行随机突变，获得可以将左旋多巴脱氢生成3,4-二羟基苯丙酮酸的3个最佳的突变酶，其基因为bspde1,bspde2,bspde3。编码这3个突变体的基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3所示。
(2)α-酮酸脱羧酶的选择
根据文献报道选择细菌来源于的，对芳香族酮酸具有明显活性的α-酮酸脱羧酶，较其它专利中酵母或植物来源的相比具有更好地在大肠杆菌中表达的特性(Characterisation of a thiamine diphosphate-dependent alpha-keto aciddecarboxylase from Proteus mirabilis JN458,Food Chem.,2017,232,19-24)。本发明分别从Proteus vulgaris ATCC 49132或Providencia alcalifaciens DSM 30120中分别克隆得到α-酮酸脱羧酶基因pvkdc和pakdc，其氨基酸序列是NCBI上accession NO.为KGA60648.1、ATG16423.1的序列，其核苷酸序列是NCBI上accession NO.为JPIX01000001REGION:1259773..1261422、CP023536REGION:complement(1924726..1926384)的序列。
(3)醇脱氢酶的选择
醇脱氢酶广泛存在于各类细菌中，根据文献报道大肠杆菌本身也含有多种底物广泛的醇脱氢酶(Production of aromatic compounds by metabolically engineeredEscherichia coli with an expanded shikimate pathway,Appl.Environ.Microbiol.2012,78(17),6203-6216)，因此直接从Escherichia coli BL21(DE3)克隆得到两个醇脱氢酶基因ecadh1和ecadh2，所述醇脱氢酶，其氨基酸序列是NCBI上accession NO.为WP_001318460.1、WP_000692754.1的序列，其核苷酸序列是NCBI上accession NO.为NC_012892REGION:4406777..4407796、NC_012892REGION:312506..313555的序列，从而更有利于醇脱氢酶在大肠杆菌中的过表达。
3.苯丙氨酸脱氢酶的随机突变高通量筛选
按照生产商提供的使用说明书，用GeneMorph II Random Mutagenesis试剂盒对目标片段进行易错PCR随机突变。扩增体系为：10×Mutazyme II reaction buffer 5μl、模板DNA 1μL、sample primers(125ng/μl of each primer)1μL、40mM dNTP mix(200μM eachfinal)1μL、Mutazyme II DNA polymerase(2.5U/μl)1μL、ddH2O 41μL。扩增程序为：95℃，2min；95℃，30sec；55℃，30sec；72℃，2min，共30个循环；72℃，10min。
将产生的PCR产物和质粒pET28a质粒进行双酶切。酶切体系为：10×cut buffer 5μL,DNA 10μL，限性内切酶1和限制性内切酶2各1μL，无菌水33μL。将pET28a质粒和PCR产物于37℃水浴下双酶切1h。
然后分别回收酶切产物，并于16℃水浴下连接12h-16h，连接体系为：10×DNAligase buffer 2.5μL，DNA片段8μL，载体DNA 2μL，T4 DNA ligase 1μL，无菌水11.5μL共25μL。随后在连接体系中加入100μL BL21感受态细菌，轻混匀，冰浴30min。放入预热的42℃水浴中，放置90s进行热休克处理。立即冰浴2min。加入1mL不含抗生素的LB培养液，37℃培养1h使菌体复苏。最后将菌体均匀涂布在含氨苄青霉素的LB平板上，培养24h。
将平板上所有转化子挑到每孔含1ml LB液体培养基(100μg/ml氨苄青霉和0.2mmol/L IPTG)的96深孔板中，放置于多孔板震荡培养箱中，37℃，900r/min培养10小时，从而完成整个突变库的构建。
诱导表达结束后，在96孔板中加入20mg/mL蜗牛酶10μL，37℃保温1h。然后取0.5mL破壁液重新放于96孔板中，添加50μl 28g/L的3,4-二羟基苯丙酮酸，辅酶NADH 0.8mM，检测还原型辅酶NAD在340nm下的数值降低斜率，斜率越大酶活越高。整个过程在Enspire多标记检测系统酶标仪中自动完成。
经过粗筛后将活性高的酶表达并纯化，采用纯酶测定其活性。苯丙氨酸脱氢酶活力测定：3ml反应体积中左旋多巴1mM、NAD 0.12mM、pH8、温度35℃，340nm测定NADH的增加速率。比酶活(U mg-1)定义为每mg酶所具有的酶活力单位，一个酶活力单位(U)定义为1min生成1μmol NADH所需的酶量。
4、三酶共表达体系的构建及细胞的培养
将以上选择的L-苯丙氨酸脱氢酶、α-酮酸脱羧酶、醇脱氢酶酶中每类任选一个酶，进行三酶组合共表达。目前大肠杆菌多基因共表达的有多种方法(大肠杆菌多基因共表达策略，中国生物工程杂志，2012，32(4):117-122)，本发明采用刘向磊(合成生物学技术改造大肠杆菌生产莽草酸及白藜芦醇，2016，上海医药工业研究院，博士论文)所述方法构建，每个基因前均包含T7启动子和RBS结合点，理论上来讲因为每个基因前都有T7和RBS，因此基因的表达强度受排列次序的影响不大。本发明采用双质粒或单质粒共表达三基因，构建好共表达重组质粒后，将质粒转入大肠杆菌Escherichia coli BL21感受态细胞中，利用抗性平板筛选得到阳性转化子，即得到重组大肠杆菌。
细胞的培养：根据经典的重组大肠杆菌培养及诱导表达方案，将重组大肠杆菌按体积比为2％的量转接到LB发酵培养基(蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L)中，当细胞OD600达到0.6-0.8后，加入终浓度为0.4mM的IPTG，在20℃诱导表达培养8h。诱导表达结束后，20℃、8000rpm、20分钟离心收集细胞。
5、全细胞转化左旋多巴合成羟基酪醇
全细胞转化体系为：左旋多巴浓度为1-200g/L，NAD 0-1g/L，调节pH在6.0-9.0之间,新鲜湿菌体量为1-200g/L。然后于15-40℃，转化1-48小时。转化结束后液相色谱测定羟基酪醇的产量。左旋多巴溶解度较低，高浓度情况下是含有不溶物的混悬液。
6、样品的检测分析
羟基酪醇定量分析：转化液采用PerkinElmer Series 200高效液相色谱仪检测分析，色谱条件为：流动相是甲醇-0.1％甲酸水(40:60)、采用汉邦Megres C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流速1ml/min、柱温30℃、进样量20μl、检测波长280nm。
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行详细的说明。应当说明的是，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
L-苯丙氨酸脱氢酶的筛选：按照前述酶的随机突变高通量筛选方法，采用易错PCR及高通量筛选平台得到三个多巴脱氢的最佳的突变体bspde1、bspde2、bspde3，并进行测序。bspde1、bspde2、bspde3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6所示，编码这3个突变体的基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:5所示。
测得L-苯丙氨脱氢酶三个突变体对左旋多巴脱氢的比酶活(即以左旋多巴脱氢为底物转化生成3,4-二羟基苯丙酮酸)分别为20.2、18.9、6.4U/mg。以NCBI上氨基酸序列的accession NO为BAA08816.1的L-苯丙氨酸脱氢酶为对照，在相同条件下测定，对照酶对左旋多巴脱氢的比酶活为0。
实施例2
重组大肠杆菌构建：首先将编码L-苯丙氨酸脱氢酶、α-酮酸脱羧酶、醇脱氢酶的基因，连接到质粒上。得到三基因共表达重组质粒，将质粒转化大肠杆菌Escherichia coliBL21(DE3)，利用抗生素平板筛选得到阳性转化子，即得到重组大肠杆菌。
将重组大肠杆菌诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体系中，细胞终浓度为200g/L，NAD浓度为1g/L、左旋多巴浓度为200g/L，pH 8.5，于35℃反应，摇床转速50转/分钟，时间36小时。转化结束后液相色谱测定羟基酪醇产量。
表1各种重组菌的比较
Figure GDA0002781294040000081
实施例3
实验过程中发现bspde的突变体具有对其它氨基酸进行脱氢的能力，因此测试了几种工程菌对部分天然氨基酸的转化，结果如表2所示，表中所有氨基酸均为L型。
如实施例2构建重组大肠杆菌，将重组大肠杆菌诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体积中，细胞湿重为1g/L，NAD 0.5g/L、底物浓度为10g/L(相关底物如表2所示，酪氨酸溶解度很小，可以边溶解边反转化)，pH 8.5，于35℃反应，摇床转速50转/分钟，时间48小时。转化结束后液相色谱测定丹参素产量及构型。
表2其它底物的转化结果
菌株 底物 产物 产量g/L
E.coli BL21(DE3)/(pRSFDuet-ecadh1-pvkdc,pETDuet-bspde) 苯丙氨酸 苯乙醇 7.1
E.coli BL21(DE3)/(pRSFDuet-bspde3-pvkdc,pETDuet-ecadh2) 酪氨酸 酪醇 6.3
E.coli BL21(DE3)/(pRSFDuet-bspde1-pvkdc,pET28a-ecadh1) 蛋氨酸 蛋醇 5.3
E.coli BL21(DE3)/(pRSFDuet-bspde2-pvkdc,pETDuet-ecadh2) 色氨酸 色醇 6.9
实施例4
根据实施例2所述诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/(pRSFDuet-bspde3-pvkdc,pETDuet-ecadh2)诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体系中，细胞湿重1g/L，左旋多巴1g/L，pH 6.0，温度为15℃，摇床转速250转/分钟；转化时间48小时。测定结果，羟基酪醇浓度为621mg/L。
实施例5
根据实施例2所述诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pETDuet-bspde2-pakdc-ecadh1诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体系中，细胞湿重100g/L，左旋多巴20g/L，NAD 0.1g/L，pH 9.0，温度为40℃，摇床转速250转/分钟；转化时间6小时。测定结果，羟基酪醇浓度为12.1g/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种高效生产羟基酪醇的工程菌及其应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1140
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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Claims (12)

1.一种基因工程菌，其特征在于，共表达L-苯丙氨酸脱氢酶、α-酮酸脱羧酶和醇脱氢酶；所述L-苯丙氨酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述α-酮酸脱羧酶来自Proteusvulgaris ATCC 49132或Providencia alcalifaciens DSM 30120。
3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述α-酮酸脱羧酶为NCBI上登录号为KGA60648.1、ATG16423.1的酶，或核苷酸序列是NCBI登录号为JPIX01000001REGION:1259773..1261422、CP023536REGION:complement 1924726..1926384的基因编码的酶。
4.根据权利要求1～3任一所述的基因工程菌，其特征在于，所述醇脱氢酶的氨基酸序列是NCBI上登录号为WP_001318460.1、WP_000692754.1的酶，或核苷酸序列是NCBI上accession NO.为NC_012892REGION:4406777..4407796、NC_012892REGION:312506..313555的基因编码的酶。
5.根据权利要求1～3任一所述的基因工程菌，其特征在于，采用双质粒或单质粒表达编码L-苯丙氨酸脱氢酶基因、α-酮酸脱羧酶基因和醇脱氢酶基因。
6.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，采用双质粒或单质粒表达编码L-苯丙氨酸脱氢酶基因、α-酮酸脱羧酶基因和醇脱氢酶基因。
7.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述质粒包括pETDuet-1、pACYCDue-1、pCOLADuet-1、pRSFDuet-或pET系列质粒中的至少一种。
8.根据权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，所述质粒包括pETDuet-1、pACYCDue-1、pCOLADuet-1、pRSFDuet-或pET系列质粒中的至少一种。
9.一种构建权利要求1～8任一所述基因工程菌的方法，其特征在于，将编码L-苯丙氨酸脱氢酶、α-酮酸脱羧酶、醇脱氢酶的基因与1个或2个质粒连接，然后转化至宿主细胞中，得到基因工程菌。
10.一种生产羟基酪醇的方法，其特征在于，以权利要求1～8任一所述的基因工程菌为细胞催化剂，以L-多巴为底物生产羟基酪醇。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述方法是以权利要求1～8任一所述的基因工程菌为细胞催化剂进行全细胞转化；所述全细胞转化生产的体系中，含有按湿重计1-200g/L新鲜细胞，左旋多巴1-200g/L，NAD 0-1g/L；所述全细胞转化生产的体系的温度为15-40℃，反应时间为1-48小时。
12.权利要求1～8任一所述的基因工程菌在制备含羟基酪醇的产品方面的应用。
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