CN114591975B - 一种羟基酪醇的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种羟基酪醇的生产方法，属于微生物基因工程技术领域。本发明构建了表达单胺氧化酶(Monoamine oxidase)、葡萄糖脱氢酶(glucose dehydrogenase)、醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase)的重组细胞或者重组细胞的组合，并通过外源添加过氧化氢酶或表达外源过氧化氢酶消除单胺氧化酶催化产生的过氧化氢，达到促进反应进行的目的；本发明还通过组成型表达NAD+合成补救途径中的限速酶烟酸磷酸核糖基转移酶，进一步提高重组细胞或者重组细胞的组合催化多巴胺合成羟基酪醇的效率，具有良好的工业化应用前景。

Description

一种羟基酪醇的生产方法
技术领域
本发明涉及一种羟基酪醇的生产方法，属于微生物基因工程技术领域。
背景技术
羟基酪醇，作为一种天然的抗氧化剂，被认为是已知最有效的天然抗氧化剂之一，主要来源于橄榄油。传统的橄榄油因其具有多种对人替有益的功效，曾被欧洲地区奉为极神圣的食品，后来学者才研究出其功效的主要成分为酪醇和羟基酪醇。且于2012年左右，羟基酪醇被EC法规432/2012批准为“橄榄油健康多酚”的重要组成部分，并规定橄榄油中羟基酪醇及其衍生物的含量要大于5mg/20g。由于其诸多的益处，人们给予羟基酪醇超级营养素的称号。
现有技术中，羟基酪醇的制备主要从橄榄叶中提取、化学合成和生物合成，具体如下：
天然提取主要是从橄榄果、叶片以及在橄榄油制备过程中产生的残渣和废水中进行的，其优点是原始材料便宜且丰富，但缺点是使用强酸性水蒸气，回收率低，且易产生二次污染。
Baraldi等通过过量氢化铝锂的还原作用，将3,4-二羟基苯乙酸还原得到羟基酪醇，但此方法原料难以获得，工艺成本过高，不适宜工业生产(Preparation of3,4-Dihydroxy-1-benzeneethanol:A Reinvestigation.Liebigs Annalen der Chemie 1983,1983(4),684-686.)。Lucia等以酪醇(4-羟基苯乙醇)为原料，在零下25摄氏度的低温下，用2-碘酰基苯甲酸使之氧化并加入硫代硫酸钠溶液还原得到羟基酪醇(Oxidativechemistry of the natural antioxidant hydroxytyrosol:hydrogen peroxide-dependent hydroxylation and hydroxyquinone/o-quinone couplingpathways.Tetrahedron 2006,62(6),1273-1278.)。帝斯曼公司以邻苯二酚为原料，在酸性条件下以Pd/C催化3,4-二羟基扁桃酸，使其脱去苄位的羟基，得到3,4-二羟基苯乙酸，再利用硼氢化钾-氯化锂还原得到羟基酪醇(PROCESS FOR THE PREPARATION OF PHENOLICCOMPOUNDS.2006/07/05/Application date,WO2007009590,2006.)。化学合成的缺点使用基质相对昂贵，并且这些过程需要保护和脱保护步骤，降低总收率；成本高、污染严重、安全性低，不适合应用于食品和药品的添加。
在生物合成领域，大量进行了对羟基酪醇生物合成的研究。中国专利文献CN202110546281.0通过在能够高产酪醇的酿酒酵母中转入来源于铜绿假单胞菌的HpaB和其他特定来源的HpaC，但是由于该酶的催化效率较低，且羟化酶在酵母中的表达效率低下，导致羟基酪醇在酿酒酵母中的产量较低，为1120mg/mL。中国专利文献CN201711054680.5通过在大肠杆菌中过量表达氨基转移酶、酮酸脱羧酶、醇脱氢酶、羟化酶来利用酪氨酸作为底物生产羟基酪醇，由于在该发明中氨基转移酶没有提供足量氨基的受体，且羟化酶的活性太低，且该发明蛋白的可溶性表达较差，导致最终羟基酪醇的产量较低，为1469±56mg/mL。
发明内容
本发明提供了一种可利用多巴胺生产羟基酪醇的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌表达了单胺氧化酶、醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶。
在一种实施方式中，所述单胺氧化酶能将多巴胺转化成3，4-二羟基苯乙醛；所述醇脱氢酶能还原3，4-二羟基苯乙醛得到羟基酪醇。
在一种实施方式中，所述单胺氧化酶来源于Micrococcus luteus，其氨基酸序列如GenBank：BAA31471.1所示；或来源于Escherichia coli str.K-12，其氨基酸序列如GenBank：CP087578.1所示；或来源于Bacillus subtilis，其氨基酸序列如GenBank：WP_136975853.1所示；或来源于Paenarthrobacter aurescens，其氨基酸序列如GenBank：ABM10002.1所示。
在一种实施方式中，所述醇脱氢酶来源于Escherichia coli str.K-12，其氨基酸序列如GenBank：AAC73428.1所示；或来源于Limosilactobacillus reuteri，其氨基酸序列如GenBank：ABQ83830.1所示；或来源于Proteus mirabilis，其氨基酸序列如GenBank：AVK94800.1所示；或来源于Synechocystis sp.PCC 6803，其氨基酸序列如GenBank：ALJ69257.1所示。
在一种实施方式中，所述葡萄糖脱氢酶来源于Bacillus subtilis，其氨基酸序列如GenBank：UHH03386.1所示。
在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌的宿主包括但不限于Escherichia coliBL21(DE3)。
在一种实施方式中，所述单胺氧化酶、醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶可以在宿主中借助载体进行表达融合表达或共表达，或者整合到宿主的基因组上进行表达。
在一种实施方式中，所述单胺氧化酶、醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶借助载体进行表达时，可以选择一个或多个载体表达一种或多种酶。
在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌还通过不同强度的RBS调控酶的表达强度，所述RBS选自SEQ ID NO.1～8任一。
在一种实施方式中，所述调控为(1)～(5)任一种：
(1)采用RBST7调控单胺氧化酶的表达，采用RBS3调控醇脱氢酶的表达，并采用RBS6调控葡萄糖脱氢酶的表达；
(2)采用RBS1调控单胺氧化酶的表达，采用RBS4调控醇脱氢酶的表达，并采用RBS7调控葡萄糖脱氢酶的表达；
(3)采用RBST7调控单胺氧化酶的表达，采用RBS3调控醇脱氢酶的表达，并采用RBS5调控葡萄糖脱氢酶的表达；
(4)采用RBS2调控单胺氧化酶的表达，采用RBS3调控醇脱氢酶的表达，并采用RBS4调控葡萄糖脱氢酶的表达；
(5)采用RBS1调控单胺氧化酶的表达，采用RBS5调控醇脱氢酶的表达，并采用RBS3调控葡萄糖脱氢酶的表达。
在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌还组成型表达来源于ureibacillusthermosphaericus的过氧化氢酶，所述过氧化氢酶的氨基酸序列如GenBank：WP_016837596.1所示。
在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌还组成型表达了NAD+合成补救途径中限速酶烟酸磷酸核糖基转移酶(NAPRTase)；所述烟酸磷酸核糖基转移酶来源于鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，氨基酸序列如GenBank：NP_459979.1所示。
本发明提供了一种可利用多巴胺生产羟基酪醇的重组大肠杆菌组合，所述组合含有表达了单胺氧化酶、醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶中一种或两种酶的重组大肠杆菌细胞。
在一种实施方式中，所述组合含有表达了单胺氧化酶的重组大肠杆菌，和表达醇脱氢酶的重组大肠杆菌，和表达葡萄糖脱氢酶的重组大肠杆菌。
在一种实施方式中，所述组合含有表达了单胺氧化酶和醇脱氢酶的重组大肠杆菌，和表达葡萄糖脱氢酶的重组大肠杆菌。
在一种实施方式中，所述组合含有表达了单胺氧化酶和葡萄糖脱氢酶的重组大肠杆菌，和表达醇脱氢酶的重组大肠杆菌。
在一种实施方式中，所述组合含有表达了醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的重组大肠杆菌，和表达单胺氧化酶的重组大肠杆菌。
本发明还提供了含有所述重组大肠杆菌的细胞催化剂。
在一种实施方式中，所述细胞催化剂是按如下方法制得：将所述重组大肠杆菌接种于LB培养基，于30～37℃培养至细胞OD600达到0.6～0.8后，加入终浓度为0-1.0mM的IPTG，在25℃诱导表达培养15h。
本发明还提供了一种生产羟基酪醇的方法，所述方法以所述重组大肠杆菌或所述重组大肠杆菌组合为细胞催化剂，在含多巴胺的体系中催化生产羟基酪醇。
在一种实施方式中，所述反应体系还含有过氧化氢酶；所述过氧化氢酶的添加量≥20U/mL。
在一种实施方式中，所述反应体系中按终浓度计，含有细胞(湿重)1-200g/L，多巴胺1-200g/L，葡萄糖1-200g/L，过氧化氢酶1-200U/mL、NAD+0-1g/L，pH 5.0-9.0；于15-40℃反应，时间1-48小时。
本发明还提供所述重组大肠杆菌，或所述细胞催化剂，或所述方法在生产含羟基酪醇的产品中的应用。
有益效果：
(1)本发明构建了强化表达单胺氧化酶、醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的基因工程菌，并应用于羟基酪醇的生产；该方法采用的底物为多巴胺，易于获得。
(2)本发明通过合理的表达策略，在表达单胺氧化酶、醇脱氢酶的同时，还表达葡萄糖脱氢酶，利用葡萄糖脱氢酶将NAD+还原成NADH，实现了NAD+辅酶再生。
(3)本发明还通过表达过氧化氢酶或向反应体系中添加过氧化氢酶，消除单胺氧化酶氧化多巴胺产生的过氧化氢，有效地保证了酶催化反应的持续进行。
(4)本发明通过组成型表达NAD+补救途径限速酶烟酸磷酸核糖基转移酶，有效降低成本，同时减少副产物的产生，有利于下游工程进行分离纯化。
附图说明
图1为本发明构建新途径中全细胞催化多巴胺转化为羟基酪醇的路径图。
图2实施例4中合成得到的羟基酪醇的液相图谱。
图3为实施例5不同菌株生产羟基酪醇的能力。
图4为实施例6中过氧化氢酶对全细胞催化过程生产羟基酪醇的效果。
图5为实施例9中诱导剂IPTG添加量对生产菌诱导后生产羟基酪醇的影响。
图6为实施例11中全细胞催化过程中转化多巴胺到羟基酪醇的液相图谱。
具体实施方式
1、本发明所涉及的菌株及质粒
购自Novagen公司的pET-28a(+)质粒和Escherichia coli BL21(DE3)。
2、多基因共表达体系的构建及细胞的培养
目前大肠杆菌多基因共表达的有多种方法(例如：“大肠杆菌多基因共表达策略，中国生物工程杂志，2012，32(4):117-122”这篇文章所记载的方法)，在本发明的实施方式中，采用刘向磊的博士论文(合成生物学技术改造大肠杆菌生产莽草酸及白藜芦醇，2016，上海医药工业研究院)所记载的方法来构建重组大肠杆菌。在本发明的实施方式中，共表达多基因时，每个基因前均包含启动子和RBS结合点。理论上来讲，因为每个基因前都有启动子和RBS，因此，基因的表达强度受基因在质粒上的排列次序的影响不大。将构建好的质粒热转导入大肠杆菌感受态细胞中，并涂布于单抗或混合抗生素固体平板上，筛选得到阳性转化子，即得到重组大肠杆菌。
细胞的培养：根据经典的重组大肠杆菌培养及诱导表达方案，将重组大肠杆菌按体积比为2％的量转接到LB发酵培养基(蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L)中，当细胞OD600达到0.6-0.8后，加入终浓度为0.4mM的IPTG，在25℃诱导表达培养15h。诱导表达结束后，于4℃、8000rpm离心20分钟，收集细胞。
3、相关酶的选择
葡萄糖脱氢酶选择来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的葡萄糖脱氢酶GDH，氨基酸序列如GenBank：UHH03386.1所示。
过氧化氢酶选择来源于热球状尿素芽孢杆菌(Ureibacillus thermosphaericus)的过氧化氢酶CAT，氨基酸序列如GenBank：WP_016837596.1所示。
烟酸磷酸核糖基转移酶来源于鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的PNCB，氨基酸序列如GenBank：NP_459979.1所示。
4、样品的检测分析
羟基酪醇的含量检测方法根据文献测定(Efficient Synthesis ofHydroxytyrosol from l-3,4-Dihydroxyphenylalanine Using Engineered Escherichiacoli Whole Cells.J Agric Food Chem2019,67(24),6867-6873.)。
单胺氧化活力测定方法根据文献测定(Optimizing the preparationconditions and characterization of cross-linked enzyme aggregates of amonoamine oxidase.Food science and biotechnology 2016,25(5),1421-1425.)。
醇脱氢酶酶活力(还原活性)测定方法根据文献测定(Characterisation of fivealcohol dehydrogenases from Lactobacillus reuteri DSM20016[J].ProcessBiochemistry,2019,86:73-79.)。
比酶活(U mL-1)定义每mL菌液所具有的酶活力单位。一个酶活力单位(U)定义为1min生成1μmol产物所需要的菌液量。
实施例1基因的克隆
(1)引物设计
设计用于PCR扩增的引物。
表1引物
注：下划线为限制性核酸内切酶位点
(2)PCR扩增
按照Takara公司Genomic DNA Purification Kit试剂盒的使用说明书，抽提处于对数生长期的野生菌株的基因组DNA，以各对应菌株抽提的基因组为模板，进行PCR扩增。扩增体系为：Prime STARHSDNA Polymerase(2.5U/μL)0.5μL、10×PrimeSTAR Buffer 5μL、dNTP Mixture(2.5mM each)4μL、模板DNA 1μL、Up引物(20μM)1μL、Down引物(20μM)1μL、ddH2O补足到50μL。扩增程序为：94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，2min，共30个循环：72C，5min。PCR产物送测序。
自Micrococcus luteus、Escherichia coli str.K-12、Bacillus subtilis、Paenarthrobacter aurescens分别克隆得到mlmao(GenBank：BAA31471.1)、ecmao(GenBank：CP087578.1)、bsmao(GenBank：WP_136975853.1)、pamao(GenBank：ABM10002.1)。
自Escherichia coli str.K-12、Limosilactobacillus reuteri、Proteusmirabilis分别克隆得到ecadh(GenBank：AAC73428.1)、lradh(GenBank：ABQ83830.1)、pmadh(GenBank：AVK94800.1)，来源于Synechocystis sp.PCC 6803的ssadh(GenBank：ALJ69257.1)交于基因合成公司进行合成基因并连接至pET-28a载体上。
自Bacillus subtilis克隆得到bsgdh(GenBank：UHH03386.1)。
来源于ureibacillus thermosphaericus的utcat(GenBank：WP_016837596.1)交于基因合成公司进行合成基因并连接至pET-28a载体上。
来源于Salmonella typhimurium的pncb(GenBank：NP_459979.1)交于基因合成公司进行合成基因并连接至pET-28a载体上。
(3)pET-28a单基因质粒的构建
将pET-28a载体质粒和步骤(2)获得的mlmao、ecmao、bsmao、pamao、ecadh、lradh、pmadh、bsgdh的PCR产物于37℃水浴下双酶切1h。酶切体系为：10×cut buffer 5μL，DNA 10μL,限制性内切酶SacI和限制性内切酶HindⅢ各1μL，无菌水33μL。
然后分别回收酶切产物，pET-28a分别与mlmao、ecmao、bsmao、pamao、ecadh、lradh、pmadh、bsgdh进行连接。连接体系为：10×NDA ligase buffer 2.5μL，目的基因片段8μL，载体DNA 2μL，T4 DNA ligase 1μL，ddH2O 11.5μL，共25μL，于16℃水浴下连接12-16h。
随后将25μL连接产物转入100μL DH5α感受态细胞中，冰浴30min后，放入预热的42℃水浴锅中，准确计时90s，立即冰浴2-3min。加入1mL SOC培养基，37℃培养1h使菌体复苏。将复苏后的重组质粒的菌体进行涂布在含有卡那霉素的LB平板上，37℃培养12h后挑取单菌落进行菌落PCR验证目的片段大小，确保正确转化子。验证正确的转化子挑取单菌落培养保藏于-80℃冰箱保藏。
实施例2不同来源单胺氧化酶的筛选
将实施例1构建的表达不同来源单胺氧化酶的重组大肠杆菌培养获得种子液，将种子液分别按体积比为2％的量转接到LB发酵培养基(蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl10g/L)中，当细胞OD600达到0.6-0.8后，加入终浓度为0.4mM的IPTG，在25℃诱导表达培养15h。诱导表达结束后，4℃、8000rpm、20分钟离心收集细胞。超声破碎后，4℃、8000rpm、20分钟离心得上清液为粗酶液，测定粗酶液活性。结果如表2所示，来源于Micrococcus luteus的单胺氧化酶用于对多巴胺的脱氨效果更优。
表2表达不同来源单胺氧化酶的重组大肠杆菌单胺氧化酶活性
实施例3不同来源醇脱氢酶的筛选
采用与实施例1同样的方法构建表达来源于Escherichia coli str.K-12、Limosilactobacillus reuteri、Proteus mirabilis、Synechocystis sp.PCC 6803的ecadh、lradh、pmadh、ssadh的重组大肠杆菌。按照实施例2相同方法培养重组大肠杆菌，诱导酶的表达，测定粗酶液活性。结果如表3所示，来源于Limosilactobacillus reuteri的醇脱氢酶效果更优。
表3表达不同来源醇脱氢酶的重组大肠杆菌醇脱氢酶活性
重组菌 活性(U/mL)
E.coli BL21/pET-28a-ecadh 15.1
E.coli BL21/pET-28a-lradh 36.3
E.coli BL21/pET-28a-pmadh 28.2
E.coli BL21/pET-28a-ssadh 13.1
实施例4多酶组合催化
基于实施例2、3筛选出来的单胺氧化酶、醇脱氢酶和如GenBank：UHH03386.1所示的葡萄糖脱氢酶，通过多酶组合级联反应催化产生羟基酪醇。根据实施例2的方法，将构建的E.coli BL21/pET-28a-mlmao、E.coli BL21/pET-28a-bsgdh、E.coli BL21/pET-28a-lradh分别培养，并诱导酶的表达，然后收集菌体，超声破碎得到粗酶液。于100mL反应体系中，按终浓度计，每种粗酶液各加入200U/L，多巴胺20g/L，丙酮酸钠2g/L，NAD+0.5g/L，pH8；于35℃反应，时间1小时。转化结束后液相色谱测定羟基酪醇含量，达到12.54g/L。
实施例5构建对于三个基因不同RBS强度的表达质粒
为便于后续全细胞催化，通过调节RBS强度调整酶蛋白表达量，以实现三酶高效协同催化。
基于mlmao、lradh、bsgdh核酸序列特异性与启动子序列关系，利用salislab网站的RBS LibraryCalculator(https://salislab.net/software/)设计不同强度的RBS序列，将其设计在上游引物中，获得7个不同强度的RBS以及pET-28自带RBST7，相应强度下的表达量基本对应设计的RBS强度大小。
表4 RBS及序列
表5构建的重组大肠杆菌的重组质粒中各基因的RBS
命名 mlmao(RBS) lradh(RBS) bsgdh(RBS)
E.coli R1 RBST7 RBS3 RBS6
E.coli R2 RBS1 RBS4 RBS7
E.coli R3 RBST7 RBS3 RBS5
E.coli R4 RBS2 RBS3 RBS4
E.coli R5 RBS1 RBS5 RBS3
表6引物
注：下划线为限制性核酸内切酶；加粗为RBS位点
以实施例1构建的重组质粒pET-28-mlmao为模板，以表6中引物扩增带有不同RBS强度的基因片段，Xba I与Nde I双酶切mlmao基因片段与pET-28质粒，分别用T4连接酶过夜连接得到pET-28-RBSnmlmao(n表示1～7的整数或T7)；将实施例1构建的重组质粒pET-28a-lradh采用带有BamH I与Sac I的上下游引物扩增模板获取lradh不同RBS强度目的基因片段后，BamH I与Sac I双酶切后连接至pET-28-RBSnmlmao得到pET-28-RBSnmlmao-RBSnlradh，将实施例1构建的质粒pET-28-bsgdh采用带有Hind III与Xho I的上下游引物扩增模板获取bsgdh不同RBS强度目的基因片段后，Hind III与Xho I双酶切后连接至pET-28-RBSnmlmao-RBSnlradh得到pET-28-RBSnmlmao-RBSnlradh-RBSnbsgdh。将获得的重组质粒分别转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中，获得的重组菌分别命名为E.coli R1-R5(表5)。
根据实施例2所述的方法，将构建的E.coli R1-R5分别培养，并诱导酶的表达，然后收集菌体。于100mL反应体系中，按终浓度计细胞湿重为30g/L、多巴胺20g/L，葡萄糖25g/L，NAD+0.5g/L，pH 8；于35℃反应，时间1小时。转化结束后液相色谱测定羟基酪醇含量，结果如图3所示，转化效率最高的E.coli R1菌株反应1小时后，羟基酪醇达10.5g/L。
实施例6向反应体系中引入过氧化氢酶
由于单胺氧化酶将多巴胺氧化成3，4-二羟基苯乙醛时会产生过氧化氢，过氧化氢具有强氧化性，待过氧化氢积累到一定程度能使蛋白质变性，影响反应进一步进行，故而考虑加入过氧化氢酶从而消除过氧化氢，减少过氧化氢对对酶及细胞的损伤。
根据实施例2所述的方法，将E.coli R1诱导表达，然后收集菌体。于100mL反应体系中，细胞湿重为30g/L、多巴胺20g/L，葡萄糖25g/L，NAD+0.5g/L，pH 8，分别向反应体系中加入终浓度20U/mL、40U/mL、60U/mL、80U/mL、100U/mL过氧化氢酶；于35℃反应，时间1小时。转化结束后液相色谱测定羟基酪醇含量，结果图4所示，过氧化氢酶浓度20U/mL的羟基酪醇浓度达11.8g/L，比不添加过氧化氢酶产羟基酪醇增加12.4％过氧化氢酶浓度40U/mL的羟基酪醇浓度达12.7g/L，比不添加过氧化氢酶产羟基酪醇增加20.9％，表明系统增加过氧化氢酶能有效增加羟基酪醇的产量。
实施例7构建组成型表达过氧化氢酶的重组大肠杆菌
由于添加过氧化氢酶需要额外的成本，故向重组大肠杆菌中引入来源于ureibacillus thermosphaericus的utcat，以避免额外添加过氧化氢酶，减少生产成本的支出，且简化生产流程。
以E.coli BL21(DE3)基因组DNA为模板，以表7中ArsR-LA-F和ArsR-LA-R、Promotor-F和Promotor-R、ArsR-RA-F和ArsR-RA-R为引物分别扩增基因ArsR上游和下游区域(约500个碱基)以及gltA-RBS Promotor启动子和RBS，以质粒pKD13为模板，以含有上下游同源臂的FRT-F和FRT-R、Terminator-F和Terminator-R、AmpR-F和AmpR-R为引物，扩增质粒的敲除框及质粒抗性，并以pET-28a-utcat质粒为模版，utcat-F和utcat-R为引物，扩增出需要组成型表达的utcat过氧化氢酶，利用Gibson Assembly连接方法，将这7个片段一次性连接。导入温敏型质粒pCP20，诱导表达FLP重组酶，消除基因组上的抗性片段构建出E.coli BL21(DE3)ΔArsR::FRT gltA-RBS Promotor-utcat-rrnB Terminator，编号为E.coli N1。
表7PCR扩增所使用引物设计
备注：下划线为Gibson Assembly连接用同源序列，加粗部分表示RBS为位点
依据样品检测分析方法，检测野生型E.coli BL21(DE3)和E.coli N1粗酶液中过氧化氢酶活力，以野生型E.coli BL21(DE3)作为对照，结果显示，野生型E.coli BL21(DE3)的酶活为0.121±0.018U/mL，组成型表达来源于ureibacillus thermosphaericus的utcat结果为83±14U/mL，具有显著提升。
实施例8在重组大肠杆菌基因组上整合烟酸磷酸核糖基转移酶基因
将来源于Salmonella typhimurium的烟酸磷酸核糖基转移酶基因pncb整合到E.coli N1的gltS基因上，该菌命名为E.coli N2。具体步骤同实施例7，利用Red同源重组的方法，构建出E.coli BL21(DE3)ΔArsR::FRT gltA-RBS Promotor-utcat-rrnBTerminator；ΔgltS::FRT gltA-RBS Promotor-pncb-rrnB Terminator，编号为E.coliN2。
表8 PCR扩增所使用引物设计
备注：下划线为Gibson Assembly连接用同源序列，加粗部分表示RBS为位点。
实施例9采用不同浓度诱导剂IPTG诱导生产全细胞催化剂
将实施例5构建的E.coli R1中的重组质粒导入实施例8构建的重组菌E.coli N2中，得到菌株E.coli R1N2。
将重组大肠杆菌E.coli R1N2按照实施例2的方法培养，分别于IPTG终浓度0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.5，0.8，1mmol/L诱导15h，收集菌体细胞，用于全细胞催化合成羟基酪醇。于100mL反应体系中(按终浓度计)，细胞30g湿重/L、多巴胺20g/L，葡萄糖25g/L，NAD+0.5g/L，pH 8，于35℃反应，时间1小时。转化结束后液相色谱测定羟基酪醇含量，结果图5所示，IPTG浓度0.4mm时，E.coli R1N2产羟基酪醇浓度最高达13.24g/L，且生长情况良好，被稍微抑制，OD600为不加IPTG的83.3％。
实施例10在不同pH和温度下进行全细胞催化
将重组大肠杆菌E.coli R1N2按照实施例2的方法培养，于IPTG终浓度0.4mmol/L诱导15h，并收集菌体细胞，用于全细胞催化合成羟基酪醇。于100mL反应体系中，细胞湿重为30g/L、多巴胺20g/L，葡萄糖25g/L，NAD+0.5g/L，pH分别为6、7、8、9，于35℃反应1小时。转化结束后液相色谱测定羟基酪醇含量，结果如表9所示，pH＝8，产羟基酪醇浓度最高达13.52g/L。
于100mL反应体系中，细胞湿重为30g/L、多巴胺20g/L，葡萄糖25g/L，NAD+0.5g/L，pH 8，分别于15、25、35℃反应，时间1小时。转化结束后液相色谱测定羟基酪醇含量，结果如表10所示，当温度为25℃，产羟基酪醇浓度可达13.82g/L。
表9在不同pH下进行全细胞催化的结果
pH 羟基酪醇浓度(g/L)
6 8.24
7 10.21
8 13.52
9 11.31
表10在不同温度下进行全细胞催化的结果
温度 羟基酪醇浓度(g/L)
15 10.75
25 13.82
35 13.52
实施例11全细胞催化生产羟基酪醇
将重组大肠杆菌E.coli R1N2按照实施例2的方法培养，诱导并收集菌体细胞，用于全细胞催化合成羟基酪醇。100mL反应体系中，按终浓度计，细胞湿重为200g/L、多巴胺200g/L，葡萄糖200g/L，NAD+1.0g/L，pH 8；于25℃反应，时间48小时。转化结束后液相色谱测定羟基酪醇含量为152g/L，转化率为76％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> BAA220212A
<130> 一种羟基酪醇的生产方法
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aagaaggaga tatacc 16
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cctccatctt ctaagtaggt ccatcg 26
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctggaaattt aaggaggctt ttttaag 27
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccaatagaca cagatagacc taaggagagt ttttttt 37
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cctataacat aatttaagga aggtatttt 29
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cctatagaca ccactgataa ggaggtattt tt 32
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cgtatagaaa tattccaacc atagaataag gaggtataac 40
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
acccaaatac cacatataca tactacggtt tttct 35

Claims (4)

1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，表达了单胺氧化酶、醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶，利用多巴胺生产羟基酪醇；所述单胺氧化酶来源于Micrococcus luteus，其氨基酸序列如GenBank：BAA31471.1所示，通过RBST7调控酶的表达强度；所述醇脱氢酶来源于Limosilactobacillus reuteri，其氨基酸序列如GenBank：ABQ83830.1所示，通过RBS3调控酶的表达强度；所述葡萄糖脱氢酶来源于Bacillus subtilis，其氨基酸序列如GenBank：UHH03386.1所示，通过RBS6调控酶的表达强度；组成型表达来源于Ureibacillus thermosphaericus的过氧化氢酶，所述过氧化氢酶的氨基酸序列如GenBank：WP_016837596.1所示，组成型表达来源于鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的烟酸磷酸核糖基转移酶，氨基酸序列如GenBank：NP_459979.1所示；RBST7序列如SEQ ID NO.1所示，RBS3序列如SEQ ID NO.4所示，RBS6序列如SEQ ID NO.7所示。
2.一种可利用多巴胺生产羟基酪醇的细胞催化剂，其特征在于，含有权利要求1所述的重组大肠杆菌。
3.一种生产羟基酪醇的方法，其特征在于，应用权利要求1所述的重组大肠杆菌或权利要求2所述的细胞催化剂，在含多巴胺的体系中催化生产羟基酪醇。
4.权利要求1所述的重组大肠杆菌，或权利要求2所述的细胞催化剂，或权利要求3任一所述的方法在生产含羟基酪醇的产品中的应用。
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CN112111442A (zh) * 2020-09-28 2020-12-22 江南大学 整合有氨基酸氧化酶和葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌

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