JP4775258B2 - L−フクロースの製造方法およびl−フコースの製造方法 - Google Patents
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Description
〔2〕前記微生物が酢酸菌である、上記〔1〕に記載のL−フクロースの製造方法。
〔3〕L−フシトールからL−フクロースを生成し、L―フクロース生成量をL−フシトール酸化物中の50wt%以上にする能力を有する微生物、当該微生物の培養物および当該微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる1種または2種以上の存在下で、L−フシトールからL−フクロースを生成せしめる、L−フクロースの製造方法。
〔4〕グルコノバクター・キシリナス・サブスピーシーズ・キシリナスおよびグルコノバクター・オキシダンスのうちの少なくとも一方の微生物、当該微生物の培養物、並びに当該微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる1種または2種以上の存在下で、L−フシトールからL−フクロースを生成せしめる、L−フクロースの製造方法。
〔5〕L−フシトールからL−フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を有し、かつ、L−フシトールからL−フクロース以外のケトヘキソースを生成する能力を実質的に有しない非遺伝子操作微生物、当該非遺伝子操作微生物の培養物および当該非遺伝子操作微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる1種または2種以上の存在下で、L−フシトールからL−フクロースを生成せしめる、L−フクロースの製造方法。〔6〕L−フシトールからL−フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有する微生物由来の第1のタンパク質を有し、かつ、L−フシトールからL−フクロース以外のケトヘキソースを生成する活性を有する第2のタンパク質をコードする遺伝子が破壊された微生物、当該微生物の培養物および当該微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる1種または2種以上の存在下で、L−フシトールからL−フクロースを生成せしめる、L−フクロースの製造方法。
〔7〕L−フシトールからL−フクロース以外のケトヘキソースを生成する能力を実質的に有せず、L−フシトールからL−フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有する微生物由来の第1のタンパク質を発現可能に形質転換された微生物、当該微生物の培養物および当該微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる1種または2種以上の存在下で、L−フシトールからL−フクロースを生成せしめる、L−フクロースの製造方法。
〔8〕前記微生物が、L−フシトールからL−フクロース以外のケトヘキソースを生成する活性を有する第2のタンパク質をコードする遺伝子が破壊された微生物である、上記〔7〕に記載のL−フクロースの製造方法。
〔9〕L−フシトールからL−フクロース以外のケトヘキソースの生成が抑制される反応条件下で、L−フシトールからL−フクロースを生成せしめる、上記〔1〕から〔4〕のいずれか一項に記載のL−フクロースの製造方法。
〔10〕L−フシトールからL−フクロース以外のケトヘキソースの生成が抑制されるpH条件下で、L−フシトールからL−フクロースを生成せしめる、上記〔1〕から〔4〕のいずれか一項に記載のL−フクロースの製造方法。
〔11〕2価イオンキレート剤が共存し、L−フシトールからL−フクロース以外のケトヘキソースの生成が抑制される条件下で、L−フシトールからL−フクロースを生成せしめる、請求項1から4のいずれか一項に記載のL−フクロースの製造方法。
〔12〕NADHからNADを生成する活性を有するタンパク質の存在下で、L−フシトールからL−フクロースを生成せしめる、上記〔1〕から〔8〕のいずれか一項に記載のL−フクロースの製造方法。
〔13〕L−フシトールからL−フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有する微生物由来タンパク質の存在下で、L−フシトールからL−フクロースを生成せしめるL−フクロース生成工程と、
L−フクロースからL−フコースを生成する活性を有するタンパク質の存在下で、L−フクロースからL−フコースを生成せしめるL−フコース生成工程と、
を含む、L−フコースの製造方法。
〔14〕L−フシトールからL−フクロースを生成し、L―フクロース生成量をL−フシトール酸化物中の50wt%以上にする能力を有する微生物、当該微生物の培養物および当該微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる1種または2種以上の存在下で、L−フシトールからL−フクロースを生成せしめるL−フクロース生成工程と、
L−フクロースからL−フコースを生成する活性を有するタンパク質の存在下で、L−フクロースからL−フコースを生成せしめるL−フコース生成工程と、
を含む、L−フコースの製造方法。
〔15〕L−フシトールからL−フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を有し、かつ、L−フシトールからL−フクロース以外のケトヘキソースを生成する能力を実質的に有しない非遺伝子操作微生物、当該非遺伝子操作微生物の培養物および当該非遺伝子操作微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる1種または2種以上の存在下で、L−フシトールからL−フクロースを生成せしめる、L−フシトールからL−フクロースを生成せしめるL−フクロース生成工程と、
L−フクロースからL−フコースを生成する活性を有するタンパク質の存在下で、L−フクロースからL−フコースを生成せしめるL−フコース生成工程と、
を含む、L−フコースの製造方法。
〔16〕L−フシトールからL−フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を有し、かつ、L−フシトールからL−フクロース以外のケトヘキソースを生成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が破壊された微生物、当該微生物の培養物および当該微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる1種または2種以上の存在下で、L−フシトールからL−フクロースを生成せしめる、L−フシトールからL−フクロースを生成せしめるL−フクロース生成工程と、
L−フクロースからL−フコースを生成する活性を有するタンパク質の存在下で、L−フクロースからL−フコースを生成せしめるL−フコース生成工程と、
を含む、L−フコースの製造方法。
〔17〕L−フシトールからL−フクロース以外のケトヘキソースを生成する能力を実質的に有せず、L−フシトールからL−フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有する微生物由来タンパク質を発現可能に形質転換された微生物、当該微生物の培養物および当該微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる1種または2種以上の存在下で、L−フシトールからL−フクロースを生成せしめる、L−フシトールからL−フクロースを生成せしめるL−フクロース生成工程と、
L−フクロースからL−フコースを生成する活性を有するタンパク質の存在下で、L−フクロースからL−フコースを生成せしめるL−フコース生成工程と、
を含む、L−フコースの製造方法。
〔18〕L−フシトールからL−フクロース以外のケトヘキソースを生成する能力を実質的に有せず、L−フシトールからL−フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有する微生物由来タンパク質およびL−フクロースからL−フコースを生成する活性を有するタンパク質を発現可能に形質転換された微生物、当該微生物の培養物ならびに当該微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる1種または2種以上の存在下で、L−フシトールからL−フコースを生成せしめる、L−フコースの製造方法。
〔19〕下記(A)または(B)のタンパク質。
(A)配列番号16に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(B)配列番号16に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、L−フシトールからL−フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
〔20〕上記〔19〕に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔21〕下記(a)または(b)に示すポリヌクレオチド。
(a)配列番号15に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(b)配列番号15に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつL−フシトールからL−フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド〔22〕下記(C)または(D)のタンパク質。
(C)配列番号18に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(D)配列番号18に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、NADHオキシダーゼ活性を有するタンパク質
〔23〕上記〔22〕に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔24〕下記(c)または(d)に示すポリヌクレオチド。
(c)配列番号17に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(d)配列番号17に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつNADHからNADを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
〔25〕上記〔20〕に記載のポリヌクレオチドが組み込まれた組換えポリヌクレオチド。
〔26〕上記〔23〕に記載のポリヌクレオチドが組み込まれた組換えポリヌクレオチド。
〔27〕上記〔20〕に記載のポリヌクレオチドおよび請求項23に記載のポリヌクレオチドが組み込まれた組換えポリヌクレオチド。
〔28〕上記〔25〕に記載の組換えポリヌクレオチドが導入され、L−フシトールからL−フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を発現する、形質転換体。
〔29〕上記〔28〕に記載された形質転換体が微生物であり、当該微生物を培地中で培養し、培地中および/または微生物中に、L−フシトールからL−フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させることを特徴とする、タンパク質の製造方法。
〔30〕上記〔28〕に記載された形質転換体が微生物であり、
当該微生物、当該微生物の培養物および当該微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる1種または2種以上を、L−フシトールを含む反応系に添加し、L−フシトールからL−フクロースを生成せしめる、L−フクロースの製造方法。
〔31〕上記〔28〕に記載された形質転換体が微生物であり、当該微生物、当該微生物の培養物および当該微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる1種または2種以上を、L−フシトールを含む反応系に添加し、L−フシトールからL−フクロースを生成せしめる、L−フクロース生成工程と、
L−フクロースからL−フコースを生成する活性を有するタンパク質の存在下で、L−フクロースからL−フコースを生成せしめるL−フコース生成工程と、
を含む、L−フコースの製造方法。
〔32〕上記〔25〕に記載の組換えポリヌクレオチドおよび請求項26に記載の組換えポリヌクレオチドが導入され、L−フシトールからL−フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質およびNADHからNADを生成する活性を有するタンパク質を発現する、形質転換体。
〔33〕上記〔26〕に記載の組換えポリヌクレオチドが導入され、NADHからNADを生成する活性を有するタンパク質を発現する形質転換微生物を培地中で培養し、培地中および/または微生物中に、NADHからNADを生成する活性を有するタンパク質を蓄積させることを特徴とする、タンパク質の製造方法。
〔34〕上記〔32〕に記載された形質転換体が微生物であり、
当該微生物、当該微生物の培養物および当該微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる1種または2種以上を、L−フシトールを含む反応系に添加し、L−フシトールからL−フクロースを生成せしめる、L−フクロースの製造方法。
〔35〕上記〔32〕に記載された形質転換体が微生物であり、当該微生物、当該微生物の培養物および当該微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる1種または2種以上を、L−フシトールを含む反応系に添加し、L−フシトールからL−フクロースを生成せしめる、L−フクロース生成工程と、
L−フクロースからL−フコースを生成する活性を有するタンパク質の存在下で、L−フクロースからL−フコースを生成せしめるL−フコース生成工程と、
を含む、L−フコースの製造方法。
〔36〕上記〔27〕に記載の組換えポリヌクレオチドが導入され、L−フシトールからL−フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質およびNADHからNADを生成する活性を有するタンパク質を発現する、形質転換体。
〔37〕上記〔36〕に記載された形質転換体が微生物であり、当該微生物を培地中で培養し、培地中および/または微生物中に、L−フシトールからL−フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質およびNADHからNADを生成する活性を有するタンパク質を蓄積させることを特徴とする、タンパク質の製造方法。
〔38〕上記〔36〕に記載された形質転換体が微生物であり、
当該微生物、当該微生物の培養物および当該微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる1種または2種以上を、L−フシトールを含む反応系に添加し、L−フシトールからL−フクロースを生成せしめる、L−フクロースの製造方法。
〔39〕上記〔36〕に記載された形質転換体が微生物であり、当該微生物、当該微生物の培養物および当該微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる1種または2種以上を、L−フシトールを含む反応系に添加し、L−フシトールからL−フクロースを生成せしめる、L−フクロース生成工程と、
L−フクロースからL−フコースを生成する活性を有するタンパク質の存在下で、L−フクロースからL−フコースを生成せしめるL−フコース生成工程と、
を含む、L−フコースの製造方法。
1−1 微生物由来タンパク質を用いる形態
本発明のフクロースの製造方法では、L−フシトールからL−フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有する微生物由来タンパク質を用いてL−フシトールからL−フクロースを生成する。下記実施例において詳説されるが、本発明者らは、微生物において、L−フシトールからL−フクロースを生成する活性を有するタンパク質と、L−フシトールからL−フクロース以外のケトヘキソースを生成する活性を有するタンパク質とが別個に存在することを見出した。したがって、L−フクロースからL−フクロースを生成する活性を有するタンパク質を、所定の微生物から得ることにより、L−フクロース以外の副産物の生成を低減またはなくすことができる。また、微生物由来のタンパク質であるため、植物、動物などの細胞に由来するタンパク質より、単離、精製等の取り扱いが簡便であり、酵素の大量生産を行うための微生物での異種組換え大量発現を考える際でも、宿主との相性の点で有利である。また微生物を培養することは、植物、動物細胞の培養より容易であり、工業的生産を行うために要する量を十分に得ることも容易である。
なお、下記に別途詳説するが、本発明者らは、Gluconobacter oxydansから単離されたタンパク質に基づき、そのアミノ酸配列および塩基配列を特定した。
melanogenus)、グルコノバクター・スクレロイデウス(Gluconobacter scleroideus)、グルコノバクター・サブオキシダンス(Gluconobacter suboxydans)等が例示される。より具体的には、例えば、下記表1に記載の各種菌株から、上記タンパク質を得ることができる。
次に、微生物、微生物の培養物または微生物の菌体処理物を用いた方法について説明する。上記のような微生物由来タンパク質を用いてL−フクロースを生成する形態として、上記のような微生物由来タンパク質を有する微生物、その培養物または微生物の菌体処理物を用いることもできる。しかし、微生物そのものを用いる場合、その微生物がL−フクロース以外のケトヘキソース(以下、副産物ともいう)を生成する能力も有する場合があるため、微生物そのものを用いる場合には、副産物の生成が少ないものを用いることが好ましい。すなわち、用いられる微生物の特徴として、(i)L−フシトールからL−フクロースを生成する能力を有すること、(ii)さらにL―フクロース生成量として、L−フシトールを酸化して得られる酸化物中の、好ましくは50wt%以上、より好ましくは70%以上、さらに好ましくは90%以上をL−フクロースがしめるように、L−フクロースを生成する能力を有することの少なくとも2つの性質を兼ね備えた微生物が用いられることが好ましい。
本発明の他の実施形態として、L−フクロース生成活性を有する第1のタンパク質を有する一方で、副産物を生成する活性を有する第2のタンパク質をコードする遺伝子が破壊された微生物を用いる形態が提供される。本来は副産物を生成してしまう微生物であっても、副産物を生成する原因となる酵素遺伝子等を破壊することにより、L−フクロースの製造に適した微生物とすることができ、副産物の生成が実質的になく効率のよいL−フクロース生産を行うことができる。
L―フシトールからL―フクロース以外の副産物を生成してしまう微生物等を用いた場合であっても、副産物の生成を抑制する条件下でL―フシトールの酸化反応を行うことにより、工業的な生産方法として耐えうるL―フクロースの製法とすることができる。副産物の生成を抑制するためには、例えば、pH条件を調整する、副産物生成を司る酵素を選択的に阻害する阻害剤を加えるなどの手法をとり得る。
下記実施例に示されるように、L―フシトールからL−フクロースを生成する活性を有するタンパク質は、NAD依存性を有することが示された。この場合、NADは生成するL−フクロースとモル数で等量必要となるが、NADは高価であり、工業的生産を考える場合、等量のNADの添加はその生産価格の点で不利である。係る知見に基づき、L−フクロース生成の際にNADから変換生成するNADHから、NADを再生成する活性を有するタンパク質の存在下で、L−フシトールからL−フクロースを生成せしめる、L−フクロースの製造方法が提供される。NADが供給される反応系とすることにより、連続的に効率よくL―フクロースの生産が可能であり、工業生産として極めて有利である。
次に、本発明のL―フコースの製造方法について説明する。本発明のL―フコースの製造方法は、上記本発明のL―フクロースの製造方法に従い、L―フクロースを生成するL―フクロース生成工程と、L―フクロースからL―フコースを生成する、L―フコース生成工程とを含むものである。上記各行程は、別個の反応系において行っても、同一反応系において行ってもよい。L―フクロースの原料となるL―フシトールは、上記で説明したとおり、D―ガラクトースという安価な材料から容易に得られ、また本発明の方法は簡便であることから、本発明のL―フコースの製造方法は、簡便で、コストを低減することができる工業的優れた方法である。
L−フシトールからL−フクロース以外のケトヘキソースを生成する能力を実質的に有せず、かつL−フシトールからL−フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質として具体的には下記(A)または(B)のタンパク質が挙げられる。
(A)配列番号16に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(B)配列番号16に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、L−フシトールからL−フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
(A)配列番号16に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(B)配列番号16に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、L−フシトールからL−フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を有するタンパク質
(a)配列番号15に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(b)配列番号15に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつL−フシトールからL−フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
chain reaction、White,T.J. et al ;Trends Genet., 5, 185(1989)参照)またはハイブリダイゼーションによって取得することができる。PCRに用いるプライマーは、例えばペプチド生成活性を有する精製タンパク質に基づいて決定された内部アミノ酸配列に基づいて設計することができる。PCR用のプライマーとして、5'非翻訳領域及び3'非翻訳領域に対応する配列を有するプライマーを用いると、本タンパク質のコード領域全長を増幅することができる。
上記のように、本発明のフクロースの製造方法の好ましい形態一形態としてはNADHオキシダーゼを反応系内に添加する形態が挙げられる。ここで用いられるNADHオキシダーゼの具体例としては下記(C)または(D)のタンパク質が例示される。
(C)配列番号18に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(D)配列番号18に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、NADHオキシダーゼ活性を有するタンパク質
(C)配列番号18に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(D)配列番号18に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、NADHデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
(c)配列番号17に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(d)配列番号17に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつNADHデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
YPG寒天培地(10 g/l glycerol, 0.3 g/l yeast extract, 0.3 g/l peptone, 20 g/l agar, pH 6.5)で30℃、18〜66時間培養することによりリフレッシュした酢酸菌菌株を、120℃、20分のオートクレーブにより滅菌した10 g/l (61 mM) L−フシトール, 10 g/l glycerol, 3 g/l yeast extract, 3 g/l peptone, 20 g/l CaCO3, pH 6.5からなる液体培地0.5 mlに1白金耳シードし、30℃で42時間振盪培養した。培養は1ウェルあたり2 ml容の96穴マイクロプレートを用いた。培養液から遠心操作により菌体を除去し、遠心上清を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)解析にて分析し、生成したL−フクロース濃度を定量した。HPLC分析条件は、
カラム:Shodex製 Sugar SC1011、直径10 mm、長さ300 mm
カラム温度:75℃
移動相:50 ppm Ca-EDTA in H2O
流速:1.2 ml/min
検出:示差屈折(RI)検出器
である。
L−フシトールに構造の類似したズルシトール(dulcitol)によるL−フシトール酸化酵素の発現誘導を試みる意味で、YP-dulcitol寒天培地(10 g/l dulcitol, 0.3 g/l yeast extract, 0.3 g/l peptone, 20 g/l agar, pH 6.5)で30℃、18〜66時間培養することによりリフレッシュした酢酸菌の菌株を、120℃、20分のオートクレーブにより滅菌した10 g/l L−フシトール, 3 g/l yeast extract, 3 g/l peptone, pH 6.5からなる液体培地0.5 mlに1白金耳シードし、30℃で42時間振盪培養した。この培養液を実施例1と同様に分析を行った。分析結果を表2に示す。
HPLC解析でL−フクロースと想定された物質の同定を行うため、L−フコースイソメラーゼ(L-fucose isomerase)を用いたバイオアッセイを検討した。
(pH 7.0), 2 mM 2-mercaptoethanol, 0.2 mM MnCl2, 0.4 mg/ml FucIH6溶液を加え(終濃度は各2分の1)、37℃で2時間反応させた。この際、FucIH6を加えない実験区も同時に作成し、コントロールとした。
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実施例3において、酢酸菌によるL−フシトールからのL−フクロースの生成と、FucIを用いたL−フクロースのL−フコースへの変換が可能であることが示された。L−フシトールを原料とするL−フコースの生産を考えた場合、実施例3のようにL−フシトールからのL−フクロースの生産と、L−フクロースからのL−フコースへの生産を分離して行うことも可能であるが、同反応が同時に行えることは実生産を考えた場合、工程を簡略化できる点で有利である。特に、酢酸菌自体にL−フクロースからL−フコースへの変換能を保持させることができれば、単一の菌株によってL−フシトールからL−フコースの生産が可能となり、有利な方法であると考えられた。
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GTTCAGGCCCTGCAGCCGGAGCGACCGGGC
L−フシトールを原料とするL−フクロース生産における問題点であるBPの生成を抑制する目的で、反応pHの検討を行った。
L−フシトールを原料とするL−フクロース生産における問題点であるBPの生成を抑制する目的で、反応液中へのEDTAの添加効果を検討した。
実施例5、6で示した方法は、L−フシトールを原料とするL−フクロース生産時のBPの生成抑制に効果的であることが示された。
Chemistry 45: 741-744 (1967)(非特許文献3)がある。これらの中では、酢酸菌よってL−フシトールが酸化され、結果、L−フクロースと1−デオキシ−D−グリセロ−3−ヘクスロース(1-deoxy-D-glycero-3-hexulose)が生成すると記載されている。我々が行った結果においてもL−フクロースと未同定物質(BP)が酢酸菌によるL−フシトール酸化物として検出されたことから、未同定物質(BP)は、先行文献に記載の1−デオキシ−D−グリセロ−3−ヘクスロース(1-deoxy-D-glycero-3-hexulose)である可能性が強く示唆される。先行文献の中でも、これら物質を生成する酵素は独立して存在している可能性が議論されているが、独立存在の証明、あるいはそれぞれの反応を司る酵素の同定はなされていない。
Inc.製)にサブクローニングした。このプラスミドで形質転換したE. coli JM109株を作成し、培養後、プラスミドを抽出、精製し、BamHI、BglIIにて消化後、精製した。ここに、Kmrを含むpHSG298よりPCRにて調製したフラグメントをライゲーションし、新規プラスミドを得た。このプラスミドによりE. coli JM109株を形質転換し、培養後プラスミドを抽出、精製し、更にKpnI、PstIにて消化、精製することにより、Kmr遺伝子挿入sldA部分配列フラグメントを得た。IFO3255株とIFO3171株のそれぞれに由来するKmr遺伝子挿入sldA部分配列フラグメントをエレクトロポレーション(電極間隔0.5 mm、14.0 kV/cm)にて、それぞれIFO3255株、IFO3171株に導入し、カナマイシン含有プレート上に生育可能な株を選抜することにより、G. oxydans IFO3255 sldA:Kmr株、G. oxydans IFO3171 sldA:Kmr株を得た。
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L−フシトールからL−フクロースを生成する酵素がSldA以外に存在することが実施例7において示されたため、本活性を触媒する酵素活性を探索することとした。
酢酸菌の無細胞抽出液中にL−フシトール酸化活性が存在することから、本活性を用いたL−フシトール変換反応を試みることとした。
実施例9において酢酸菌無細胞抽出液中におけるNADHオキシダーゼ活性(NADH酸化活性)の存在が示唆されたため、本酵素活性の検出を試みた。
L−フクロース産生型L−フシトールデヒドロゲナーゼ (FcDH)の単離精製に向け、酵素源菌株およびその培養条件の検討を行った。
培地:10 g/l 炭素源、5 g/l yeast extract、5 g/l peptone (pH 6.5)
炭素源:グリセロール(glycerol)、D−マンニトール(D-mannitol)、D−アラビトール(D-arabitol)、キシリトール(xylitol)
培養温度:30℃
培養時間:20時間または66時間
保存菌株を、20 g/l 寒天を含むYPG培地(3 g/l peptone, 3 g/l yeast extract, 1 g/l glycerol, pH 6.5)を用いて30℃で2晩培養することによりリフレッシュした。このリフレッシュ菌体を、オートクレーブしたそれぞれの培地を3 ml含む試験管に接種し、30℃で24あるいは66時間振盪培養した。培養終了後、3 mlの培養液から遠心操作により集菌し、25 mM Tris-HCl (pH 8.0)で菌体を洗浄後、0.3 mlの同緩衝液を加え懸濁した。これを超音波破砕装置に供し菌体を破砕後、200,000xg、30分minの遠心操作により得た遠心上清を得、これを酵素活性測定用サンプルとした。
測定結果を表7に示す。単位タンパク質量当たりのFcDH比活性および、単位培養液量から得られる活性量の両者を指標にして、FcDH生産菌株としてG. oxydans IFO 3255、その培養条件として、培地:10 g/l D-mannitol、5 g/l yeast extract、5 g/l peptone (pH 6.5)、培養時間として24時間を採択することとした。
G. oxydans IFO 3255保存菌株をYPG寒天培地を用いて30℃で2晩培養することによりリフレッシュした。このリフレッシュ菌体を、オートクレーブしたそれぞれの培地を3 ml含む試験管に接種し、30℃で18時間振盪培養した。これを更に、オートクレーブした同培地100 mlを含む500 ml容の坂口フラスコに1% (v/v)シードし、30℃で24時間培養した。培養終了後、遠心操作により集菌し、25 mM Tris-HCl (pH 8.0)で菌体を洗浄後、培養液の25分の1容の同緩衝液を加え懸濁した。これを超音波破砕装置に供し菌体を破砕後、200,000xg、30 minの遠心操作により得た遠心上清を得た(粗抽出液:Crude extract)。およそ3 lの培養液より得た粗抽出液中に934 mgのタンパク質を得た。
G. oxydans IFO 3255保存菌株をYPG寒天培地を用いて30℃で2晩培養することによりリフレッシュした。このリフレッシュ菌体を、オートクレーブしたそれぞれの培地を3 ml含む試験管に接種し、30℃で18時間振盪培養した。これを更に、オートクレーブした同培地100 mlを含む500 ml容の坂口フラスコに1% (v/v)シードし、30℃で24時間培養した。培養終了後、遠心操作により集菌し、25 mM Tris-HCl (pH 8.0)で菌体を洗浄後、培養液の25分の1容の同緩衝液を加え懸濁した。これを超音波破砕装置に供し菌体を破砕後、200,000xg、30 minの遠心操作により得た遠心上清を得た(粗抽出液)。およそ4 lの培養液より得た粗抽出液中に1253 mgのタンパク質を得た。
実施例12の精製したFcDH標品を酵素源として、その諸性質を調べた。
4−1)反応至適pH
0.1 M pH buffer, 1 mM MgCl2, 10 mM L−フシトール, 1 mM NADおよび1.1 μg/ml 精製FcDHからなる溶液にて30℃で反応を行い、NADHの生成をA340の測定値から見積もった。用いたpH bufferとして、酢酸ナトリウム(pH 4.8, 5.7)、リン酸カリウム (pH 6.4, 7.2)、Tris-HCl (pH 6.7, 7.6, 8.5)、CAPS-NaOH(Sodium cyclohexylaminopropanesulfonate)(pH 8.3, 9.5)、および炭酸ナトリウム(pH 10.1, 10.7, 11.2)を用いた。測定から得た各pHにおけるFcDHの比活性を、最大比活性を示したpH 9.5での比活性に対する百分率として図8に示した。
0.1 M pH buffer, 80 μg/ml 精製FcDHを含む溶液を氷上30分静置した後、FcDHが終濃度で1.6 μg/mlとなるよう希釈し、標準条件で反応を行い、残存するFcDH活性を測定した。用いたpH bufferとして、クエン酸ナトリウム(pH 2.6, 3.7, 5.1)、酢酸ナトリウム(pH 4.7, 5.8)、リン酸カリウム (pH 6.1, 7.2)、Tris-HCl (pH 7.0, 7.8, 8.8)、CAPS-NaOH(pH 8.8, 9.5)、および炭酸ナトリウム (pH 10.1, 10.6, 11.2)を用いた。測定から得た各pHにおけるFcDHの残存活性を、最大安定性を示したpH 7.2での残存活性に対する百分率として図9に示した。pHおよそ5から10で80%以上の残存活性が認められた。
Gly-NaOH (pH 9.5), MgCl2, Fucitolおよび精製FcDHからなる溶液を各反応温度(25, 30, 37, 45, 55および65℃)にて3分間のプレインキュベーションを行った後、別途各温度でプレインキュベーションを行ったNADを添加し、反応を開始した。反応液中の終濃度は、標準活性測定条件となるように調製し、FcDH終濃度は1.6 μg/mlとした。測定から得た各温度におけるFcDHの比活性を、最大比活性を示した37℃での比活性に対する百分率として図10に示した。
0.1 M Gly-NaOH (pH 9.5), 80 μg/ml 精製FcDHを含む溶液を0, 25, 30, 37, 50および60℃で30 min静置した後、FcDHが終濃度で1.6 μg/mlとなるよう希釈し、標準条件で反応を行い、残存するFcDH活性を測定した。測定から得た各温度におけるFcDHの残存活性を、0℃での静置時の残存活性に対する百分率として図11に示した。30℃まで、80%以上の残存活性が認められた。
L−フシトールを含む各種糖アルコールに対するFcDHの反応性を測定した。さまざまな基質濃度下において反応初速度を測定し、この結果をLineweaver-Burkプロットすることにより、それぞれの基質に対するkcatおよびKm値を求めた。結果を表10に示す。結果、FcDHには、L−フシトールの他種々糖アルコール酸化活性が認められ、kcat/Km値はD−アラビトール > L−フシトール > キシリトール > D−ソルビトール > D−マンニトール > リビトール(Ribitol) > ズシトール(Dulcitol) > グリセロールの順であった。
FcDHの活性発現には2価イオンの添加が必要であることが認められたため、FcDHの各種2価金属イオン利用性を測定した。測定は、Gly-NaOH (pH 9.5), 精製FcDHおよび各種2価金属イオン(あるいはEDTA)からなる溶液を氷上30 min静置した後、L−フシトールおよびNADを添加して反応を開始した。反応液中の2価金属イオンまたはEDTA終濃度は5 mM、FcDH濃度は1.6 μg/ml、その他は標準活性測定条件となるように調製した。測定から得たFcDHの各比活性を、最大比活性を示したMnCl2添加時の比活性に対する百分率として表11に示す。結果、FcDHに対する賦活化効果は、Mn2+、Mg2+、Ca2+イオンにほぼ同程度認められ、Ni2+、Co2+イオンには効果がなく、Zn2+、Cu2+イオンには逆に阻害効果が認められた。EDTAで2価金属イオンをキレートした場合、FcDHの活性はほぼ消失した。
FcDHはNADを補酵素とすることが認められたため、NADおよびNADPの利用性を測定した。活性測定は、標準条件下、さまざまな濃度のNADあるいはNADP添加の下行った。この結果をLineweaver-Burkプロットすることにより(図14(B))、それぞれの補酵素に対するKm値を求めた。結果、図14に示すように、NADに対するKm値は0.20mMと見積もられた。一方、NADPを補酵素とした場合には、有意な活性は認められなかった(不図示)。
実施例13において精製したNOX標品を酵素源として、その諸性質を調べた。
15−1)反応至適pH
0.1 M pH buffer, 30 μM FAD, 5 mM EDTA, 2 mM DTT, 0.2 mM NADHおよび0.055 μg/ml 精製NOXからなる溶液にて30℃で反応を行い、NADHの減少をA340の測定値から見積もった。用いたpH bufferとして、クエン酸ナトリウム (pH 3.6, 4.7, 5.7)、酢酸ナトリウム (pH 4.8, 5.7)、リン酸カリウム (pH 6.4, 7.2)、Tris-HCl (pH 6.7, 7.6, 8.5)およびCAPS-NaOH (pH 8.3, 9.5)を用いた。測定から得た各pHにおけるNOXの比活性を、最大比活性を示したpH 5.7での比活性に対する百分率として図15に示した。
0.1 M pH buffer, 30 μM FAD, 5 mM EDTA, 2 mM DTT, 100 μg/ml 精製NOXを含む溶液を氷上30 min静置した後、NOXが終濃度で0.055 μg/mlとなるよう希釈し、標準条件で反応を行い、残存するNOX活性を測定した。用いたpH bufferとして、クエン酸ナトリウム (pH 2.6, 3.7, 5.1)、酢酸ナトリウム (pH 4.7, 5.8)、リン酸カリウム (pH 6.1, 7.2)、Tris-HCl (pH 7.0, 7.8, 8.8)、CAPS-NaOH (pH 8.8, 9.5)、および炭酸ナトリウム (pH 10.1, 10.6, 11.2)を用いた。測定から得た各pHにおけるNOXの残存活性を、最大安定性を示したpH 8.8での残存活性に対する百分率として図16に示した。pHおよそ6から11で80%以上の残存活性が認められた。
Tris−HCl(pH 8.0), FAD, EDTA, DTTおよび精製NOXからなる溶液を各反応温度(25,30,37,45,55および65℃)にて3分間のプレインキュベーションを行った後、別途各温度でプレインキュベーションを行ったNADHを添加し、反応を開始した。反応液中の終濃度は、標準活性測定条件となるように調整し、NOX終濃度は0.055μg/mlとした。測定から得た各温度におけるNOXの比活性を、最大比活性を示した37℃での比活性に対する百分率として図17に示した。
0.1 M Tris-HCl (pH 8.0), 30 μM FAD, 5 mM EDTA, 2 mM DTT, 100 μg/ml 精製NOXを含む溶液を0, 25, 30, 37, 50および60℃で30 min静置した後、NOXが終濃度で0.055 μg/mlとなるよう希釈し、標準条件で反応を行い、残存するNOX活性を測定した。測定から得た各温度におけるNOXの残存活性を、0℃での静置時の残存活性に対する百分率として図18に示した。50℃まで、80%以上の残存活性が認められた。
NOXの活性発現にはフラビン補酵素の添加が必要であることが認められたため、NOXの各種フラビン補酵素利用性を測定した。測定は、Tris-HCl (pH 8.0), FAD, EDTA, DTTおよび精製NOXからなる溶液をTris-HCl (pH 8.0), 精製NOXおよび各種フラビン補酵素からなる溶液を氷上30 min静置した後、NADHを添加して反応を開始した。反応液中のフラビン濃度は0 − 300 μMとし、その他は標準活性測定条件となるように調製した。結果を図19に示す。結果、用いたFAD、Riboflavin、FMNのいずれにもNOX賦活化効果が認められたが、その効果はFADとRiboflavinではほぼ同程度で、FMNでは相対的に弱かった。
NOXにNADH酸化活性が認められたため、NADHおよびNADPHに対する基質特異性を測定した。標準条件下、基質濃度を変化させて活性測定を行い、結果をLineweaver-Burkプロットすることにより、基質に対するKm値を求めた。結果、NADHに対するKm値は29 μMと見積もられた(図20)。一方、NADPHを基質とした場合には、有意な活性は認められなかった(不図示)。
精製したFcDHおよびNOXを材料にその部分アミノ酸配列の決定を行った。両酵素をSDS-PAGEに供し、バンドの認められる位置のゲルを切り出し、ここに含まれるタンパク質を試料とし、常法に従いトリプシン処理によるフラグメント化と逆相HPLCによる分離を経て、得られた分画の内、幾つかをプロテインシーケンサーに供した。得られた配列を、配列番号11から14に示す。
FcDH、NOXをコードする遺伝子クローニングのため、実施例16で得られたペプチド配列から、それらに相当するDNAミックスプライマーを合成した。G. oxydans IFO 3255から常法により調製したゲノミックDNAを鋳型とし、PCR反応を行った。得られたフラグメントを精製の後、DNAシーケンサーでその塩基配列を解析した結果、得られたPCR産物中に、実施例16で得られたペプチド配列をコードするDNA配列が認められた。
FcDH発現のため、G. oxydans IFO 3255株のゲノミックDNAをテンプレートとし、配列番号19および20に示す合成プライマーを用いてPCRを行い、fcdh遺伝子を含む858 bpの断片を得た。得られたPCR産物をEcoRI、PstIで消化後、プラスミドpUC18(Takara Bio Inc.社)の相当する位置に挿入し、FcDH発現用プラスミドpFEX3052を作成した。
(19−1) 無細胞抽出液の調製
洗浄菌体を25 mM Tris-HCl (pH 8.0)に再懸濁し、超音波処理(200W, 10分)にて破砕し、14,000 gで15分遠心した上清を得、これを無細胞抽出液として各種実験に用いた。E.
coli/pUC18、E. coli/pIEX11、E. coli/pFEX3052、E. coli/pFNEX4105およびE. coli/pFNIEX5706よりそれぞれ得た無細胞抽出液のSDS-PAGE解析結果を図21に示す。E. coli/pIEX11ではFucIが、E. coli/pFEX3052ではFcDHが、E. coli/pFNEX4105ではFcDHとNOXが、そしてE. coli/pFNIEX5706ではFucI、FcDHおよびNOXがそれぞれ生産され、相当する分子量の位置にバンドが観察された。発現タンパク質を精製する場合、この無細胞抽出液を、さらに200,000 gで30 minの超遠心操作にかけ、得られた上清を材料とした。
E. coli/pFEX3052の無細胞抽出液の超遠心上清より精製した。粗酵素溶液を50 mM リン酸カリウム (pH 6.0)に対して透析した後、同緩衝液にて平衡化したQ-Sepharose 16/10に供し、緩衝液中のNaCl濃度を0 Mから0.5 Mに増加させることにより、担体に吸着したタンパク質を溶出させた。FcDH活性を含む分画画分を回収し、濃縮後、50 mM リン酸カリウム
(pH 6.0)で平衡化したSuperdex 200 16/60に供した。FcDH活性を含む画分を回収し、濃縮後、SDS-PAGEにてその純度を確認した結果、rFcDHは分子量約27 kDaと見積もられる単一バンドとして認められた(図22)。
E. coli/pFEX4105の無細胞抽出液の超遠心上清より精製した。粗酵素溶液を、50 mM Tris-HCl (pH 8.0)で平衡化したFAD-agarose resin に供し、非吸着タンパク質を同緩衝液で十分に洗浄後、50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM FADからなる緩衝液にて吸着タンパク質を溶出させた。この操作により、NOXは特異的にresinに吸着後、FADを含む緩衝液の添加により溶出した。NOX活性を含む画分を回収し、濃縮後、50 mM Tris-HCl (pH 8.0)で平衡化したSuperdex 200 16/60に供し、NOX活性を含む画分を回収した。これを濃縮後、SDS-PAGEにてその純度を確認した結果、rNOXは分子量約15 kDaと見積もられる単一バンドとして認められた(図23)。
E. coli/pUC18、E. coli/pIEX11、E. coli/pFEX3052、E. coli/pFNEX4105およびE. coli/pFNIEX5706よりそれぞれ得た無細胞抽出液中のFcDH、NOXおよびFucI活性を測定した(表12)。また上記のように精製したrFcDHおよびrNOX精製標品についても活性測定を行い、rFcDHの比活性は11.1 U/mg、rNOXの比活性は175 U/mgであった。この値はG. oxydansより調製した精製FcDHの比活性7.8 U/mg、精製NOXの比活性196 U/mgとそれぞれほぼ同程度とみなせた。
coli由来の活性と考えられた。
(20−1) G. oxydans IFO3255より調製した精製酵素による変換
G. oxydansより調製した精製FcDHおよびNOXを用いて、L−フシトールからL−フクロースあるいはL−フコースへの変換を試みた。L−フクロースからL−フコースへの酵素変換には、L−フコースイソメラーゼが必要であるため、これにはE. coli/pQE30FucIH6より調製したFucIH6を用いた。また、NOX活性を有する酵素には、H2O生成型とH2O2生成型が報告されており、H2O2生成方の場合、NADHの酸化に伴いH2O2が生成し、一般にH2O2は多くの酵素活性を阻害する性質があるため、これを回避する目的でH2O2をH2Oに変換する酵素カタラーゼの添加も併せて行った。カタラーゼは市販酵素標品(Nacalai Tesque製、Bovine Liver由来)を用いた。標準反応条件として、62 mM L−フシトール, 0.1 M Gly-NaOH (pH 9.5), 2 mM NAD, 30 μM FAD, 1 mM MgCl2, 0.1 U/ml 精製FcDH, 0.1 U/ml 精製NOX, 0.2 mg/ml 精製FucIH6, 0.1 mg/ml カタラーゼからなる反応液を30℃で振盪反応し、適宜サンプリングを行い、L−フシトール、L−フクロースおよびL−フコースをHPLCにて定量した。実験区および反応48時間後の解析結果を以下表13に示す。各実験区における変換時間経過は図24に示す。
E. coliで組換え発現の後に精製したrFcDHおよびrNOXを用いて、20−1と同様にL−フシトールの酵素的変換を試みた。標準反応条件として、120 mM L−フシトール, 0.1 M
Gly-NaOH (pH 9.5), 2 mM NAD, 30 μM FAD, 1 mM MgCl2, 1 U/ml 精製rFcDH, 1 U/ml 精製rNOX, 0.2 mg/ml 精製FucIH6, 0.1 mg/ml カタラーゼからなる反応液を30℃で振盪反応し、適宜サンプリングを行い、L−フシトール、L−フクロースおよびL−フコースをHPLCにて定量した。実験区および反応40時間後の解析結果を以下表14に示す。各実験区における変換時間経過は図25に示す。
生産された酵素を菌体から取り出すことなく、インタクトセルによるL−フシトールの変換を目的として実験を行った。用いた菌株は、E. coli/pUC18、E. coli/pIEX11、E. coli/pFEX3052、E. coli/pFNEX4105およびE. coli/pFNIEX5706で、単独、あるいは組み合わせて行った。標準反応条件として、120 mM L−フシトール, 0.2 M Gly-NaOH (pH 9.5), 50 μM Riboflavin, 1 mM MgCl2および洗浄菌体(反応液中の終濃度が、A610=5.0となるように調製)からなる反応液を30℃で振盪反応し、適宜サンプリングを行い、L−フシトール、L−フクロースおよびL−フコースをHPLCにて定量した。1種類の菌体での反応には、E. coli/pUC18、E. coli/pFEX3052、E. coli/pFNEX4105およびE. coli/pFNIEX5706を用い、E. coli/pIEX11は2種類目の添加菌体としてのみ利用し、この場合、1種類目の菌体の終濃度はA610=5.0とし、E. coli//pIEX11は終濃度A610=2.5となるように調製した。実験区および反応40時間後の解析結果を以下表15に示す。各実験区における変換時間経過は図26に示す。
NOX活性に由来すると思われるH2O2生成が、L-Fucitolの変換を阻害することが酵素反応の結果から認められ、また、カタラーゼの添加によりその阻害を除去することが可能であったため、FcDH+NOX+FucI共発現菌に、更にカタラーゼをも共発現する菌株を作成した。カタラーゼはE.coli由来カタラーゼであるKatEタンパク質を用いることとした。本酵素をコードする遺伝子はNational Center for Biotechnology InformationのデータベースにAccession number M55161として登録されている。本酵素をE. coliに大量発現させる目的で、下記のPCRプライマー(配列番号28、配列番号29)を作成し、常法により得たE. coli W3110株由来のゲノミックDNAをテンプレートとしたPCRを行い、約2.5 kbp長のフラグメントを得た。得られたPCR産物をSalI、PstIで消化後、プラスミドpSTV28(Takara Bio Inc.製)の相当する位置に挿入し、KatE発現用プラスミドpKEX5804を作成した。更に本プラスミドでE.coli/pFNIEX5706株を形質転換し、pFNIEX5706およびpCEX8401両プラスミドを保持する菌株E.coli/FNIC7001株を作成した。
GGCTTCACTAGTCGACTATTAAAAATCAGAAAAAC
配列29:KatE取得用3'プライマー
ATGTAAATCCTGCAGGCGGCGCAATTGCGCGCTCC
TB培地を用い、30℃あるいは37℃で培養した後、集菌、洗浄した菌体を25 mM Tris-HCl
(pH 8.0)に再懸濁し、超音波処理(200W, 10 min)にて破砕し、14,000 gで15 min遠心した上清を得、これを無細胞抽出液として、酵素活性測定の酵素源とした。対照としてE.coli/pFNIEX5706株も用いた。
TB/Amp+Cm培地を用いて、27、30、33、あるいは37℃で培養したE.coli/FNIC7001株の洗浄インタクトセルによるL−フシトールの変換実験を行った。反応は、380 mM L-Fucitol, 0.2 M Gly-NaOH (pH 9.5), 50 μM リボフラビン, 1 mM MnCl2, 0.1 mg/ml Amp, 0.03mg/ml Cmおよび洗浄菌体(反応液中の終濃度が、A610=10.0となるように調製)からなる反応液を30℃で振盪反応することにより行い、適宜サンプリングを行い、L−フシトール、L−フクロースおよびL−フコースをHPLCにて定量した。実験区および反応45時間後の解析結果を以下表17に、各実験区における変換時間経過は図27に示す。また、各培養温度より得た菌体から調製した無細胞抽出液中の酵素活性を表18に示す。
配列番号2;fucI遺伝子取得用3’プライマー
配列番号3;E. coli由来fucI遺伝子塩基配列
配列番号4;E. coli由来FucIアミノ酸配列
配列番号5;fucI遺伝子取得用PCRプライマー
配列番号6;fucI遺伝子取得用PCRプライマー
配列番号7;sldA遺伝子取得用5’プライマー
配列番号8;sldA遺伝子取得用3’プライマー
配列番号9;Kmr遺伝子取得用5’プライマー
配列番号10;Kmr遺伝子取得用3’プライマ
配列番号11;FcDH由来ペプチドフラグメントF1のアミノ酸配列
配列番号12;FcDH由来ペプチドフラグメントF2のアミノ酸配列
配列番号13;NOX由来ペプチドフラグメントN1のアミノ酸配列
配列番号14;NOX由来ペプチドフラグメントN2のアミノ酸配列
配列番号15;FcDHコード遺伝子fcdhの塩基配列
配列番号16;FcDHアミノ酸配列
配列番号17;NOXコード遺伝子noxの塩基配列
配列番号18;NOXアミノ酸配列
配列番号19:fcdh取得用5'プライマー
配列番号20:fcdh取得用3'プライマー
配列番号21:nox取得用5'プライマー
配列番号22:nox取得用3'プライマー
配列番号23:fcdh+nox取得用3'プライマー
配列番号24:fucI取得用5'プライマー
配列番号25:fucI取得用3'プライマー
配列番号26:fucI取得(単独発現用)5'プライマー
配列番号27:fucI取得(単独発現用)3'プライマー
配列番号28:KatE取得用5'プライマー
配列番号29:KatE取得用3'プライマー
Claims (23)
- グルコノバクター・キシリナス・サブスピーシーズ・キシリナスおよびグルコノバクター・オキシダンスのうちの少なくとも一方の微生物、当該微生物の培養物、並びに当該微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる1種または2種以上の存在下で、L−フシトールからL−フクロースを生成せしめる、L−フクロースの製造方法。
- L−フシトールからL−フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有する微生物由来タンパク質の存在下で、L−フシトールからL−フクロースを生成せしめるL−フクロース生成工程と、
L−フクロースからL−フコースを生成する活性を有するタンパク質の存在下で、L−フクロースからL−フコースを生成せしめるL−フコース生成工程とを含み、
前記L−フクロース生成工程における微生物が、グルコノバクター・キシリナス・サブスピーシーズ・キシリナスおよび/またはグルコノバクター・オキシダンスである、
L−フコースの製造方法。 - 下記(A)または(B)のタンパク質。
(A)配列番号16に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(B)配列番号16に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、L−フシトールからL−フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質 - 請求項3に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 下記(a)または(b)に示すポリヌクレオチド。
(a)配列番号15に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(b)配列番号15に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつL−フシトールからL−フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド - 下記(C)または(D)のタンパク質。
(C)配列番号18に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(D)配列番号18に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、NADHオキシダーゼ活性を有するタンパク質 - 請求項6に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 下記(c)または(d)に示すポリヌクレオチド。
(c)配列番号17に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(d)配列番号17に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつNADHからNADを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド - 請求項4に記載のポリヌクレオチドが組み込まれた組換えポリヌクレオチド。
- 請求項7に記載のポリヌクレオチドが組み込まれた組換えポリヌクレオチド。
- 請求項4に記載のポリヌクレオチドおよび請求項7に記載のポリヌクレオチドが組み込まれた組換えポリヌクレオチド。
- 請求項9に記載の組換えポリヌクレオチドが導入され、L−フシトールからL−フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を発現する、形質転換体。
- 請求項12に記載された形質転換体が微生物であり、当該微生物を培地中で培養し、培地中および/または微生物中に、L−フシトールからL−フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させることを特徴とする、タンパク質の製造方法。
- 請求項12に記載された形質転換体が微生物であり、
当該微生物、当該微生物の培養物および当該微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる1種または2種以上を、L−フシトールを含む反応系に添加し、L−フシトールからL−フクロースを生成せしめる、L−フクロースの製造方法。 - 請求項12に記載された形質転換体が微生物であり、当該微生物、当該微生物の培養物および当該微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる1種または2種以上を、L−フシトールを含む反応系に添加し、L−フシトールからL−フクロースを生成せしめる、L−フクロース生成工程と、
L−フクロースからL−フコースを生成する活性を有するタンパク質の存在下で、L−フクロースからL−フコースを生成せしめるL−フコース生成工程と、
を含む、L−フコースの製造方法。 - 請求項9に記載の組換えポリヌクレオチドおよび請求項10に記載の組換えポリヌクレオチドが導入され、L−フシトールからL−フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質およびNADHからNADを生成する活性を有するタンパク質を発現する、形質転換体。
- 請求項10に記載の組換えポリヌクレオチドが導入され、NADHからNADを生成する活性を有するタンパク質を発現する形質転換微生物を培地中で培養し、培地中および/または微生物中に、NADHからNADを生成する活性を有するタンパク質を蓄積させることを特徴とする、タンパク質の製造方法。
- 請求項16に記載された形質転換体が微生物であり、
当該微生物、当該微生物の培養物および当該微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる1種または2種以上を、L−フシトールを含む反応系に添加し、L−フシトールからL−フクロースを生成せしめる、L−フクロースの製造方法。 - 請求項16に記載された形質転換体が微生物であり、当該微生物、当該微生物の培養物および当該微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる1種または2種以上を、L−フシトールを含む反応系に添加し、L−フシトールからL−フクロースを生成せしめる、L−フクロース生成工程と、
L−フクロースからL−フコースを生成する活性を有するタンパク質の存在下で、L−フクロースからL−フコースを生成せしめるL−フコース生成工程と、
を含む、L−フコースの製造方法。 - 請求項11に記載の組換えポリヌクレオチドが導入され、L−フシトールからL−フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質およびNADHからNADを生成する活性を有するタンパク質を発現する、形質転換体。
- 請求項20に記載された形質転換体が微生物であり、当該微生物を培地中で培養し、培地中および/または微生物中に、L−フシトールからL−フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質およびNADHからNADを生成する活性を有するタンパク質を蓄積させることを特徴とする、タンパク質の製造方法。
- 請求項20に記載された形質転換体が微生物であり、
当該微生物、当該微生物の培養物および当該微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる1種または2種以上を、L−フシトールを含む反応系に添加し、L−フシトールからL−フクロースを生成せしめる、L−フクロースの製造方法。 - 請求項20に記載された形質転換体が微生物であり、当該微生物、当該微生物の培養物および当該微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる1種または2種以上を、L−フシトールを含む反応系に添加し、L−フシトールからL−フクロースを生成せしめる、L−フクロース生成工程と、
L−フクロースからL−フコースを生成する活性を有するタンパク質の存在下で、L−フクロースからL−フコースを生成せしめるL−フコース生成工程と、
を含む、L−フコースの製造方法。
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