JP5349846B2 - 1α,25−ジヒドロキシビタミンDの製造方法 - Google Patents
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Description
(a)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列において、
73位のアルギニンがバリン、ロイシン又はイソロイシンに、及び84位のアルギニンがアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、グリシン、システイン、グルタミン、アスパラギン、セリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン酸又はグルタミン酸に置換された、改変アミノ酸配列
(b)前記改変アミノ酸配列において、前記73位のアルギニン及び84位のアルギニンの置換の他さらに、1から9個のアミノ酸の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも1種の修飾を有するアミノ酸配列
(c)前記改変アミノ酸配列と70%以上の相同性を有する、前記73位のアルギニン及び84位のアルギニンの置換を含むアミノ酸配列
(d)0.2μM ビタミンD水酸化酵素の存在下で、10μM ビタミンDと1mM NADPHとを30℃、20分間反応させた場合の1α,25−ジヒドロキシビタミンDへの変換率は0.10%以上である
(A)ビタミンD水酸化酵素
ビタミンD水酸化酵素として、例えば、改変アミノ酸配列を有し、かつ0.2μMの該酵素の存在下で、10μM ビタミンDと1mM NADPHとを30℃、20分間反応させた場合の1α,25−ジヒドロキシビタミンDへの変換率が0.10%以上である活性を有するビタミンD水酸化酵素が挙げられる。
ビタミンD水酸化酵素をコードする核酸は、例えば、改変アミノ酸配列をコードする核酸;改変アミノ酸配列において、73位のアルギニン及び84位のアルギニンの置換の他さらに、1から数個のアミノ酸の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも1種の修飾を有するアミノ酸配列をコードする核酸;並びに、改変アミノ酸配列との相同性が高く、改変配列における73位のアルギニン及び84位のアルギニンの置換を含むアミノ酸配列をコードする核酸などが挙げられる。ただし、上記核酸の発現産物は、0.2μMの該酵素の存在下で、10μM ビタミンDと1mM NADPHとを30℃、20分間反応させた場合の1α,25−ジヒドロキシビタミンDへの変換率が0.10%以上である活性を有する。
上記核酸は適当なベクターに挿入して使用することができる。ベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製することが可能なベクター(例えばプラスミド等)でもよいし、又は宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムDNAに組み込まれ、ゲノムDNAと共に複製されるものであってもよい。好ましくは、ベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて上記核酸は、転写に必要な要素(例えば、プロモータ等)が機能的に連結されている。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すDNA配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。
上記核酸又は上記組換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。すなわち、形質転換体は、ビタミンD水酸化酵素をコードする核酸を導入してなる、又はビタミンD水酸化酵素をコードする核酸が挿入された組換えベクターを含有する形質転換体である。
上記形質転換体を常法にしたがって適当な培地に接種し、NADPHなどの還元型補酵素を加えることなく、ビタミンDの存在下、好ましくはビタミンD及び包摂化合物の存在下、より好ましくはビタミンD、包摂化合物及びビタミンD水酸化酵素の発現を誘導する薬剤の存在下で培養することにより、1α,25−ジヒドロキシビタミンDを製造することができる。すなわち、本発明の1α,25−ジヒドロキシビタミンDの製造方法は、反応系が菌体を用いる方法である。したがって、上記した通り、本発明の1α,25−ジヒドロキシビタミンDの製造方法は、NADPHを加えなくてもよく、ビタミンD水酸化反応と同時に触媒である菌体を増殖することができ(生菌体法)、増殖した菌体に対して精製などの処理を施さなくてもよく、菌体の保存が容易であることから菌体を繰り返し反応に使用でき、反応時間を100時間以上とることができ、並びに通常用いられる培地を利用することにより安価に工業的規模で大量生産ができることから、酵素を用いる方法と比較して、圧倒的に簡便かつ効率よく1α,25−ジヒドロキシビタミンDを製造できる。
野生型CYP105A1を大腸菌内で発現させるためのプラスミドは非特許文献12及び13に記載した方法にしたがって構築した。変異体をコードする遺伝子は変異体作成キットQuick ChangeTM(ストラタジェン社)を使用し、それぞれの変異体に応じてプライマーDNA(20mer程度)を用いた。プライマーの塩基配列を配列表の配列番号7〜24に示した(表1を参照)。構築したプラスミドを大腸菌JM109株に導入した。発現系におけるベクターと大腸菌宿主については特に限定されるものではない。
それぞれの変異体を発現する組換え大腸菌は50μg/mlアンピシリンを含むTB培地 (Sugimoto, H.et al., (2008), Biochemistry 47, 4017-4027)において37℃で培養し、菌体濃度(O.D.660nm)が0.5に達した時点でイソプロピル−チオーβ―D―ガラクトピラノシドを終濃度1mMになるまで、及びδ−アミノレブリン酸を終濃度0.5mMになるまで添加した。その後、40〜50時間25℃で培養し、遠心分離により菌体を回収し、超音波破砕装置を用いて菌体を破砕し、遠心分離により細胞質画分を調製した。
野生型および変異体の定量は吸収スペクトルを測定し417nmにおける吸光度を求め、モル分子吸光係数110mM-1cm-1を用いて算出した。変異体の種類により発現量に違いが見られたが、培養液1Lあたりの発現量は1〜5μmolであった。
活性は100mM Tris−HCl(pH7.4)、1mM EDTA緩衝液中で、以下のものを含む再構成系を用いて測定した。基質:ビタミン D3、1α−ヒドロキシビタミンD3(1α(OH)D3)、又は25―ヒドロキシビタミンD3(25(OH)D3)(それぞれ終濃度0.5〜10μM);0.2μM シトクロムP450(野生型あるいは変異体を含む組換え大腸菌細胞質画分);0.1mg/ml ホウレン草由来フェレドキシン(Fdx)、0.1U/ml ホウレン草由来フェレドキシン還元酵素(Fdr)、1U/ml グルコース脱水素酵素;1% グルコース;0.1mg/ml カタラーゼ。
ビタミンD2、1α(OH)D2、又は25(OH)D2を基質として活性を調べたところ、ビタミンD2および1α(OH)D2からは、25位水酸化体及び25位水酸化体にさらに水酸基が一つ導入された代謝物の2種類の代謝物が検出されたと推定され、25(OH)D3からは1種類の代謝物が検出された。これらはいずれも野生型CYP105A1において見られた代謝物(非特許文献4を参照)と考えられるが、活性はR73V/R84Aの方がはるかに高かった。
変異体R73V/R84Aを放線菌内で発現させ、組換え菌体を用いてビタミンD水酸化体を製造することを試みた。CYP105A1遺伝子の下流にはフェレドキシン(FDX1)遺伝子を含んでいるが、フェレドキシン還元酵素遺伝子を含んでいないため、既存の放線菌内発現ベクターpIJ6021のクローニング部位にStreptomyces coelicolor A3株由来のFDR1遺伝子を挿入し、その上流にR73V/R84A+FDX1遺伝子を連結することを試みた。
1% soluble starch、0.5% glucose、0.3% NZ−case、0.2% Difco yeast extract、0.5% Difco Bacto−peptone、0.1% KH2PO4、0.05% MgSO4・7H2O、0.3% CaCO3よりなる培地(滅菌前pH 7.0)を10mLずつ100mL容の試験管に分注し、121℃、20分間滅菌した。この培地にBennett’s寒天培地(0.1% Difco yeast extract、0.1% Meat extract、0.2% NZ−amine、1% maltose、2% agar)に生育させた形質転換体をかき取って接種し、30℃で2日間振盪培養し、種培養液とした。本培養は3種類の培地のいずれかを用いて行なった:(1)種培養液と同様の組成の培地;(2)1.5% glucose、1.5% Difco bacto Soytone、0.5% Corn steep liquor、0.5% NaCl、0.2% CaCO3よりなる培地(滅菌前のpH 7.0);(3)YEME培地(0.3% Difco yeast extract、0.5% Difco Bacto−peptone、0.3% oxoid malt extract、1% glucose、34% sucrose、5mM MgCl2・6H2O。これらの培地をK型フラスコ(500mL容)に100mLずつ分注し、121℃で20分間滅菌し、種培養液をそれぞれ1%接種し、30℃、200回転/分で培養した。
変異体R73V/R84A+FDX1+FDR1遺伝子をpIJ6021ベクターに連結し、放線菌Streptomyces lividans TK23株に組込んだ形質転換体を前記(2)の培地を用いて24時間培養した後、100ml培養液中にチオストレプトンを0.1mg添加し、さらに24時間培養を続けた後、0.2g/mLの2−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン水溶液を1ml添加し、また、4mg/mLのビタミンD3エタノール溶液を0.5ml添加し、67時間培養を続けた。次に、培養液に2倍容のクロロホルム:メタノール=3:1を添加し、激しく攪拌した後、クロロホルム層を回収し、減圧乾固し、アセトニトリルに溶解した。この溶液を上記4と同じ条件で分析した結果、25(OH)D3および1α,25(OH)2D3のピークが検出され、変換率はそれぞれ2.9%および1.6%であった(図3を参照)。図3に見られるように、放線菌の菌体を用いた場合は25(OH)D3および1α,25(OH)2D3への変換率がそれぞれ2.9%、および1.6%と、酵素を用いた場合(下記比較例1の表5を参照)に比べ、1α,25(OH)2D3の割合がきわめて高くなっている。これは疎水性が極めて高いビタミンD3に比べ25(OH)D3の方が菌体に取り込まれやすいことに依ると考えられる。
シトクロムP450として、R73A/R84A、R73V/R84A又はR73V/R84Fを、基質であるビタミンD3(最終濃度 6μM)に20分間作用させて、1α,25−ジヒドロキシビタミンD3の変換率を比較した。結果を表5に示した。なお、表中の「N.D.」は、検出下限である0.10%未満であることを示す。R73V/R84AおよびR73V/R84Fにおける1α,25(OH)2D3への変換率はR73A/R84Aよりも有意に高かった。
Claims (6)
- 下記(a)のアミノ酸配列を有し、かつ下記(b)の活性を有するビタミンD水酸化酵素、フェレドキシン及びフェレドキシン還元酵素を発現する放線菌の形質転換体を、ビタミンDの存在下で培養して、1α,25−ジヒドロキシビタミンDを得ることを特徴とする、1α,25−ジヒドロキシビタミンDの製造方法。
(a)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列において、
73位のアルギニンがバリン、ロイシン又はイソロイシンに、及び84位のアルギニンがアラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、又はグルタミンに置換された、改変アミノ酸配列
(b)0.2μM ビタミンD水酸化酵素の存在下で、10μM ビタミンDと1mM NADPHとを30℃、20分間反応させた場合の1α,25−ジヒドロキシビタミンDへの変換率は0.10%以上である - 前記培養が、ビタミンD及び包摂化合物の存在下で実施される、請求項1に記載の製造方法。
- 前記包摂化合物が、シクロデキストリン、ゼオライト、フラーレン、クラウンエーテル又はカリックスアレーンである、請求項2に記載の製造方法。
- 前記改変アミノ酸配列が、73位のアルギニンがバリンに、及び84位のアルギニンがアラニン又はフェニルアラニンに置換された配列である、請求項1〜3のいずれか1項に 記載の製造方法。
- 前記ビタミンDが、ビタミンD2又はビタミンD3である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記放線菌形質転換体が、放線菌を、放線菌Streptomyces griseolus由来のFDX1遺伝子及びStreptomyces coelicolor由来のFDR1遺伝子を前記ビタミンD水酸化酵素核酸の遺伝子の下流に連結したベクターを用いて形質転換したものである、請求項1〜5のいずれか1項に記載の製造方法。
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