JP6470534B2

JP6470534B2 - １α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２の製造方法

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Publication number: JP6470534B2
Application number: JP2014193073A
Authority: JP
Inventors: 利之榊; 真一生城; 佳織戸田
Original assignee: Toyama Prefecture
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Priority date: 2014-09-22
Filing date: 2014-09-22
Publication date: 2019-02-13
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Description

本発明は、新規な１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２の製造方法に関する。さらに本発明は、前記製造方法に用いる形質転換体および前記形質転換体において発現されるビタミンＤ_２水酸化酵素に関する。

１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₂あるいは１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃は、くる病、骨粗鬆症、乾癬の治療薬として使われるとともに、近年、癌の治療薬としても注目を浴びている、きわめて有用性の高い物質である。しかし、有機合成法によりこれらを製造することは、極めて困難であった。

生物学的にビタミンＤ（ビタミンD₂およびビタミンD₃の総称とする）を水酸化する方法の一つとして、微生物変換による方法が知られている。本方法によれば、ビタミンＤから１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤを製造することができる（特許文献１並びに非特許文献１及び２を参照）。しかし、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤの生産性が悪いことから、本方法によって１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤを工業的規模で効率よく生産することができなかった。

生物学的にビタミンＤを水酸化する他の方法として、ビタミンＤを水酸化するビタミンＤ水酸化酵素を用いる方法がある。ビタミンＤ水酸化酵素として、哺乳動物内で生理的に重要なものは４種類存在する：肝臓に存在するＣＹＰ２７Ａ１（２５位水酸化酵素；非特許文献３及び４を参照）、腎臓に存在するＣＹＰ２７Ｂ１（１α位水酸化酵素；非特許文献５及び６を参照）、腎臓に存在するＣＹＰ２４Ａ１（２４位水酸化酵素；非特許文献７及び８を参照）；及び、ミクロソーム型ＣＹＰ２Ｒ１（２５位水酸化酵素；非特許文献９及び１０を参照）。

ビタミンＤにＣＹＰ２７Ｂ１及びＣＹＰ２７Ａ１若しくはＣＹＰ２Ｒ１を作用させることにより、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤを製造することができる。１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤはＣＹＰ２４Ａ１により不活化される。ＣＹＰ２７Ｂ１、ＣＹＰ２７Ａ１及びＣＹＰ２４Ａ１の３種は、ミトコンドリア型Ｐ４５０であり、いずれもミトコンドリア内膜に存在する。本発明者らは、近年、これらの哺乳動物由来のビタミンＤ水酸化酵素を、大腸菌又は酵母内で発現させ、構造と機能に関する研究を重ねてきた（非特許文献１１を参照）。微生物由来のビタミンＤ水酸化酵素としては、２５位水酸化活性を持つＣＹＰ１０５Ａ２が知られている（非特許文献１２を参照）。

しかし、ビタミンＤから１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤを製造する際には、１α位水酸化活性を有する酵素と２５位水酸化活性を有する酵素の少なくとも２種を併用しなければならない。これに対して、本発明者らは、ビタミンＤ₃の１α位及び２５位をともに水酸化する活性を有する酵素である、放線菌由来のＣＹＰ１０５Ａ１を取得することに成功した（非特許文献１３を参照）。さらに、本発明者らは、ＣＹＰ１０５Ａ１の結晶を構造解析することによって活性中心を突き止め、ＣＹＰ１０５Ａ１のアミノ酸配列における７３位のアルギニン及び８４位のアルギニンをそれぞれアラニンに置換したＣＹＰ１０５Ａ１変異体を作製した（非特許文献１４）。該ＣＹＰ１０５Ａ１変異体は、野生型と比べて、１α位水酸化活性のｋｃａｔ値［ｍｉｎ^−１］が約２０倍、及び２５位水酸化活性のｋｃａｔ値が約２００倍であった。

特公平４−６４６７８号公報特開２００９−２９１１７１号公報特開２０１３−１６５６５９号公報

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特許文献２に記載の方法は、２５位水酸化活性を有し、かつ高度な１α位水酸化活性を有するビタミンＤ水酸化酵素を用いることで、効率よくビタミンＤ₃から１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃を製造することができ、さらには、２５位水酸化活性を有し、かつ高度な１α位水酸化活性を有するビタミンＤ水酸化酵素を発現する形質転換体を用いることで、工業的規模で大量にビタミンＤから１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃を製造できる極めて有利な方法である。

しかし、より詳細に検討すると、特許文献２に記載の形質転換体では、ビタミンＤ_２については、ビタミンＤ_２または２５−ヒドロキシビタミンＤ_２からの１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２の生成効率が低いことが判明した。１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２は、活性型ビタミンＤ_３と呼ばれている１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３と同程度のＶＤＲ結合能を示すことが知られており、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２を効率よくビタミンＤ_２または２５−ヒドロキシビタミンＤ_２から製造することができる方法の提供が望まれている。

したがって、本発明は、従来の野生型酵素および特許文献２に記載の組み換え酵素を用いる方法と比べて、ビタミンＤ_２または２５−ヒドロキシビタミンＤ_２から効率よく１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２を製造し得る組み換え酵素、この組み換え酵素を発現する形質転換体、さらにこの形質転換体の存在下で、ビタミンＤ_２または２５−ヒドロキシビタミンＤ_２から１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２を工業的規模で大量に製造し得る方法を提供することを解決すべき課題（目的）とした。

本発明者らは種々検討したところ、ＣＹＰ１０５Ａ１のアミノ酸配列の２３９位のメチオニンを、アラニン等の特定のアミノ酸で置換した変異体（組み換え酵素）が、野生型のＣＹＰ１０５Ａ１またはＣＹＰ１０５Ａ１の７３位及び／または８４位のアルギニンをバリン等及び／またはアラニン等で置換した変異体と比べて、優れた１α位水酸化活性を有し、このビタミンＤ_２水酸化酵素変異体を発現する形質転換体を用いることにより、高効率でビタミンＤ_２または２５−ヒドロキシビタミンＤ_２から１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２を製造することを見いだして本発明を完成させた。

本発明は、下記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有するビタミンＤ_２水酸化酵素に関する。さらに本発明は、下記（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列を有し、かつ下記（ｅ）の活性を有するビタミンＤ_２水酸化酵素に関する。さらに本発明は、前記ビタミンＤ_２水酸化酵素を発現する形質転換体に関する。さらに本発明は前記形質転換体を、２５−ビタミンＤ_２の存在下で培養して、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２を得ることを特徴とする、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２の製造方法に関する。
（ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、
２３９位のメチオニンがアラニン、セリン、グリシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、又はロイシンに置換された、改変アミノ酸配列
（ｂ）前記（ａ）の改変アミノ酸配列において、７３位のアルギニンがアラニン、バリン、ロイシン又はイソロイシンに、及び／又は８４位のアルギニンがアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、グリシン、システイン、グルタミン、アスパラギン、セリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン酸又はグルタミン酸に置換された、改変アミノ酸配列
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）の改変アミノ酸配列において、前記２３９位のメチオニン、７３位のアルギニン及び８４位のアルギニンの置換の他さらに、１から９個のアミノ酸の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の修飾を有するアミノ酸配列
（ｄ）前記（ａ）または（ｂ）の改変アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有する、前記２３９位のメチオニンのアルギニンの置換、又は前記２３９位のメチオニン、７３位のアルギニン及び／若しくは８４位のアルギニンの置換を含むアミノ酸配列
（ｅ）０．２５μＭのビタミンＤ_２水酸化酵素の存在下で、１０μＭ２５−ヒドロキシビタミンＤ_２と１ｍＭＮＡＤＰＨとを３０℃、２０分間反応させた場合の１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２への変換率は０．３０％以上である。

本発明のビタミンＤ_２水酸化酵素、形質転換体およびこの形質転換体を用いる製造方法の一態様は、前記（ａ）の改変アミノ酸配列が、２３９位のメチオニンがアラニン、セリン、またはグリシンに置換されたアミノ酸配列である。

本発明のビタミンＤ_２水酸化酵素、形質転換体およびこの形質転換体を用いる製造方法の一態様は、前記（ｂ）の改変アミノ酸配列が、７３位のアルギニンがアラニン、バリン、ロイシン又はイソロイシンに、及び８４位のアルギニンがアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、グリシン又はシステインに置換されたアミノ酸配列である。

本発明の形質転換体およびこの形質転換体を用いる製造方法の一態様は、前記形質転換体の宿主が、大腸菌又は放線菌である。

本発明の製造方法の一態様は、前記培養が、２５−ビタミンＤ_２及び包摂化合物の存在下で実施される。

本発明の製造方法の一態様は、前記包摂化合物が、シクロデキストリン、ゼオライト、フラーレン、クラウンエーテル又はカリックスアレーンである。

本発明のビタミンＤ_２水酸化酵素、形質転換体およびこの形質転換体を用いる製造方法によれば、２５−ヒドロキシビタミンＤ_２から、従来の方法に比べて高い効率で１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２を生産することができる。特に本発明の製造方法では、精製酵素を用いずに形質転換体を用いることで、ＮＡＤＰＨを加えることなく、２５−ビタミンＤ_２から、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２を製造することができる。

さらに、本発明のビタミンＤ_２水酸化酵素、形質転換体およびこの形質転換体を用いる製造方法によれば、ビタミンＤ_２から２５−ヒドロキシビタミンＤ_２を調製できる酵素またはこの酵素を発現できる形質転換体（例えば、非特許文献１４、１５、特許文献２、３に記載の組み換え酵素および形質転換体）を組み合わせることで、ビタミンＤ_２から１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２を製造することができる。

１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２は活性型ビタミンＤ_３と呼ばれている１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３と同程度のＶＤＲ結合能を示すことが知られていることから、本発明によって製造された１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２により、骨粗鬆症、くる病などのビタミンＤ代謝異常による諸症状、副甲状腺機能亢進症、乾癬などを治療するための新規な治療薬若しくは医薬中間体、又はこれらの症状を緩和するための食品添加物の生産及び開発がより容易になる。

ＣＹＰ１０５Ａ１の三重変異体（Ｒ７３Ａ／Ｒ８４Ａ／Ｍ２３９Ａ）による２５（ＯＨ）Ｄ_２の代謝ＨＰＬＣクロマトグラム。ＣＹＰ１０５Ａ１の二重変異体（Ｒ７３Ａ／Ｒ８４Ａ）による２５（ＯＨ）Ｄ_２の代謝ＨＰＬＣクロマトグラム。ＣＹＰ１０５Ａ１変異体主要代謝物の順相ＨＰＬＣクロマトグラム。ＣＹＰ１０５Ａ１三重変異体代謝物（Ｍ１−ｂ）のＬＣ／ＭＳスペクトル。１α，２５（ＯＨ）_２Ｄ_２標品のＬＣ／ＭＳスペクトル。ＣＹＰ１０５Ａ１主要代謝物（Ｍ１−ａ、Ｍ１−ｂ）および活性型ビタミンＤ_３のＶＤＲ結合能比較結果。Ｒ７３Ａ／Ｒ８４Ａ／Ｍ２３９Ａ発現ロドコッカス菌体を用いた２５（ＯＨ）Ｄ_２の代謝ＨＰＬＣクロマトグラム。 Streptomyces griseolusのＣＹＰ１０５Ａ１電子伝達系の概略図を示す。

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
（Ａ）ビタミンＤ_２水酸化酵素
ビタミンＤ_２水酸化酵素として、改変アミノ酸配列（ａ）を有する２５−ヒドロキシビタミンＤ_２水酸化酵素が挙げられる。改変アミノ酸配列（ａ）を有するビタミンＤ_２水酸化酵素は、２３９位のメチオニンを置換したアミノ酸の種類によって異なるが、０．２５μＭのビタミンＤ_２水酸化酵素の存在下で、１０μＭ２５−ヒドロキシビタミンＤ_２と１ｍＭＮＡＤＰＨとを３０℃、２０分間反応させた場合の１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２への変換率は０．３０％以上である活性を有する。上記条件での１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２への変換率は、２３９位のメチオニンを置換したアミノ酸の種類によって異なるが、好ましくは１．０％以上である。

本明細書にいう「２５−ヒドロキシビタミンＤ_２」は、天然型ビタミンであるビタミンＤ_２および人工的に作られたビタミンＤ_２の誘導体の２５位が水酸化したヒドロキシビタミンＤ_２及びその誘導体が包含される。尚、本明細書において、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２は１α，２５（ＯＨ）_２Ｄ_２と表記することがあり、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３は１α，２５（ＯＨ）_２Ｄ_３と表記することがある。

改変アミノ酸配列（ａ）は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、２３９位のメチオニンがアラニン、セリン、グリシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、又はロイシンに置換された、アミノ酸配列である。２５−ヒドロキシビタミンＤ_２に対する１α水酸化活性が高い、２３９位のメチオニンがアラニン、セリン、またはグリシンに置換された、アミノ酸配列であることが好ましい。２３９位のメチオニンを置換するアミノ酸はメチオニンより嵩の小さいアミノ酸であることで、置換前に比べて、２５−ヒドロキシビタミンＤ_２に対する１α水酸化活性を高くすることができる。尚、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列は、Streptomyces griseolus由来のＣＹＰ１０５Ａ１のアミノ酸配列である。上記ビタミンＤ_２水酸化酵素は、ＣＹＰ１０５Ａ１のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸の修飾が加わったＣＹＰ１０５Ａ１変異体である。

本発明で用いる、２３９位のメチオニンがアラニンなどに置換されているアミノ酸配列を有する上記ビタミンＤ水酸化酵素は、実施例で示されている通り、２５−ヒドロキシビタミンＤ_２を特異的に１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２に水酸化する活性が強く、そのため、２５−ヒドロキシビタミンＤ_２を１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２に選択的に変換すると考えられる。

一般にビタミンＤ_２の水酸化は、ビタミンＤ_２→１α−ヒドロキシビタミンＤ_２→１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２という過程と、ビタミンＤ_２→２５−ヒドロキシビタミンＤ_２→１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２という過程の二通りが想定される。本発明のビタミンＤ_２水酸化酵素を用いる方法は、後者のビタミンＤ_２→２５−ヒドロキシビタミンＤ_２→１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２という過程の２段階目を実現するものである。原料として２５−ヒドロキシビタミンＤ_２を用いれば、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２を調製することができ、また原料としてビタミンＤ_２を用いる場合には、ビタミンＤ_２を２５−ヒドロキシビタミンＤ_２に水酸化できる酵素やそのような酵素を発現する菌体（例えば、非特許文献１４、１５や特許文献２、３に記載の形質転換体）と組み合わせれば、ビタミンＤ_２から１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２を調製することもできる。ビタミンＤ_２を２５−ヒドロキシビタミンＤ_２に水酸化できる酵素やそのような酵素を発現する菌体との組み合わせは、ワンポット（同時並行）で行っても、逐次行っても良い。

２５−ビタミンＤ_２水酸化酵素の活性は、実施例に記載の方法により測定することができる。ただし、上記活性測定法では、上記ビタミンＤ_２水酸化酵素へ電子を供与する電子供与体として、ホウレン草由来のフェレドキシンおよびフェレドキシン還元酵素を用いているが、これらの代わりに、例えば、放線菌由来のフェレドキシン及びフェレドキシン還元酵素、シュードモナスプチダ由来のプチダレドキシン及びプチダレドキシン還元酵素などを用いることもできる。さらに、上記活性測定法では、反応が進むにつれて消費されるＮＡＤＰＨを再生し反応を持続させるために、グルコース脱水素酵素およびグルコースを添加するが、ＮＡＤＰＨを再生することができる系であればこれらに代えて使用することができる。上記測定法におけるカタラーゼは、反応の副産物として生じる過酸化水素を分解して反応を持続させるために、及びＮＡＤＰＨを再生させるために添加している。したがって、カタラーゼの添加は、ＮＤＡＰＨ再生系の長時間反応を持続させることができる。

上記ビタミンＤ_２水酸化酵素による、２５−ヒドロキシビタミンＤ_２の水酸化反応は、例えば、菌体を用いる方法を挙げることができ、実施例に記載の方法によりすることができる。菌体を用いる方法では、培養液の組成は限定されないが、増殖中の菌体培養液に直接基質を添加して培養を続ける方法（生菌体法）と、菌体を緩衝液に懸濁し、増殖させずにグルコースを添加して反応を進行させる方法（休止菌体法）がある。休止菌体法では、グルコースが菌体内に取り込まれるとＮＡＤＰＨが生成され、菌体内で２５−ヒドロキシビタミンＤ_２の水酸化反応が進行する。酵素を用いる方法は、ＮＡＤＰＨを反応系に加えなければならない、酵素が失活した場合は反応系に新たな酵素を追加しなければならない、精製酵素を使用することが望ましい、酵素の保存が困難であることから反応の都度新しい酵素を使用しなければならない、酵素が不安定であることから反応時間は長くても１時間程度である、酵素の製造コストが増大するために工業的規模での生産は困難である、などの特徴がある。それに対して、菌体を用いる方法は、ＮＡＤＰＨを加えなくてもよい、２５−ヒドロキシビタミンＤ_２水酸化反応と同時に触媒である菌体を増殖することができる（生菌体法）、増殖した菌体に対して精製などの処理を施さなくてもよい、菌体の保存が容易であることから菌体を繰り返し反応に使用できる、反応時間を１００時間以上とることができる、通常用いられる培地を利用することにより安価に工業的規模で１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２水酸化体を大量生産ができる、などの特徴があり、酵素を用いる方法と比較すると、２５−ヒドロキシビタミンＤ_２水酸化反応を圧倒的に簡便かつ効率よく実施できる。反応終了後にクロロホルムあるいは酢酸エチル等の有機溶媒を添加し、抽出する。抽出物の分析は公知のビタミンＤ類の分析法に準じて行えばよく、逆相系あるいは順相系の高速液体クロマトグラフィーを用いて分析することができる。上記ビタミンＤ_２水酸化酵素による２５−ビタミンＤ_２からの１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２への変換率は、反応後の高速液体クロマトグラフィーによる分析結果を基に、反応液に加えた２５−ヒドロキシビタミンＤ_２のモル数当たりの１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２のモル数により求めることができる。

改変アミノ酸配列を取得する方法は、特に制限されるものではなく、物理化学的に合成してもよいし、後述する通りに生物学的に改変アミノ酸配列をコードする核酸から作成してもよいし、通常知られる手段を用いた各種スクリーニング法により取得してもよい。

ビタミンＤ_２水酸化酵素の第二の態様として、２３９位のメチオニンの置換を有する改変アミノ酸配列（ａ）において、７３位のアルギニン及び／または８４位のアルギニンの置換をしたアミノ酸配列で（改変アミノ酸配列（ｂ））ある２５−ビタミンＤ_２水酸化酵素を挙げることもできる。この２５−ビタミンＤ_２水酸化酵素は、２３９位のメチオニンを置換したアミノ酸の種類並びに７３位のアルギニン及び／または８４位のアルギニンの置換をしたアミノ酸によって異なるが、０．２５μＭのビタミンＤ_２水酸化酵素の存在下で、１０μＭ２５−ヒドロキシビタミンＤ_２と１ｍＭＮＡＤＰＨとを３０℃、２０分間反応させた場合の１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２への変換率は０．３０％以上である活性を有す。上記条件での１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２への変換率は、２３９位のメチオニンを置換したアミノ酸の種類並びに７３位のアルギニン及び／または８４位のアルギニンの置換をしたアミノ酸によって異なるが、好ましくは１．０％以上である。

改変アミノ酸配列（ｂ）は、例えば、改変アミノ酸配列（ａ）において、７３位のアルギニンがアラニン、バリン、ロイシン又はイソロイシンに置換されており、かつ８４位のアルギニンが非極性側鎖を有するアミノ酸、酸性側鎖を有するアミノ酸、又は電荷を持たない極性側鎖を有するアミノ酸に置換されていることが好ましく、７３位のアルギニンがバリン、ロイシン又はイソロイシンに置換されており、かつ８４位のアルギニンが非極性側鎖を有するアミノ酸が特に好ましい。非極性側鎖を有するアミノ酸とは、例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、グリシン、システインなどが挙げられる。酸性側鎖を有するアミノ酸とは、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。電荷を持たない極性側鎖を有するアミノ酸とは、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシンなどが挙げられる。

改変アミノ酸配列（ｂ）の具体例として、改変アミノ酸配列（ａ）において、７３位のアルギニンがアラニン又はバリンに置換されており、かつ８４位のアルギニンがアラニン又はフェニルアラニンに置換されているアミノ酸配列が挙げられ、特に、改変アミノ酸配列（ａ）において、７３位のアルギニンがアラニンに置換されており、かつ８４位のアルギニンがアラニンに置換されているアミノ酸配列が挙げられる。

ビタミンＤ_２水酸化酵素の第三の態様として、改変アミノ酸配列（ａ）において、２３９位のメチオニンの置換、改変アミノ酸配列（ｂ）において、２３９位のメチオニンの置換、ならびに７３位のアルギニン及び／または８４位のアルギニンの置換に加えて、さらに、１から数個のアミノ酸の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の修飾を有するアミノ酸配列を有し、あり、かつ０．２５μＭのビタミンＤ_２水酸化酵素の存在下で、１０μＭ２５−ヒドロキシビタミンＤ_２と１ｍＭＮＡＤＰＨとを３０℃、２０分間反応させた場合の１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２への変換率は０．３０％以上である活性を有する２５−ビタミンＤ_２水酸化酵素を挙げることもできるが挙げられる。上記条件での１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２への変換率は、好ましくは１．０％以上である。即ち、２３９位のメチオニンの置換、７３位のアルギニンの置換、及び８４位のアルギニンの置換に用いられるアミノ酸の種類、さらに、これらのアミノ酸以外の修飾は、前記変換率が１．０％以上になるように選択することが好ましい。

上記ビタミンＤ水酸化酵素の第三の態様においては、アミノ酸配列は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列おける２３９位、７３位のアルギニン及び／または８４位のアルギニンがそれぞれ別のアミノ酸に置換されており、さらにこれら以外に１から数個のアミノ酸の欠失等の修飾を１以上有するアミノ酸配列を意味する。

上記ビタミンＤ水酸化酵素の第三の態様において、２３９位のメチオニン、７３位のアルギニン及び８４位のアルギニンの置換の他さらに生じた修飾の個数は、０．２５μＭのビタミンＤ_２水酸化酵素の存在下で、１０μＭ２５−ヒドロキシビタミンＤ_２と１ｍＭＮＡＤＰＨとを３０℃、２０分間反応させた場合の１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２への変換率は０．３０％以上である活性を有するのであれば特に限定されないが、１から２０個が好ましく、１、２、３、４、５、６、７、８、９のいずれかの数がより好ましい。

アミノ酸の修飾について、アミノ酸の欠失は配列中のアミノ酸残基の欠落もしくは消失を、アミノ酸の置換は配列中のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置き換えられていることを、アミノ酸の逆位は隣り合う２以上のアミノ酸残基の位置が逆になっていることを、アミノ酸の付加はアミノ酸残基が付け加えられていることを、アミノ酸の挿入は配列中のアミノ酸残基の間に別のアミノ酸残基が挿し入れられていることをそれぞれ意味する。アミノ酸の修飾は、同じ修飾態様が１又は２以上生じる場合もあるし、異なる修飾態様が２以上生じる場合もある。

上記ビタミンＤ_２水酸化酵素の第四の態様として、例えば、改変アミノ酸配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ）とのアミノ酸配列の同一性が高く、これら改変配列における２３９位のメチオニン、７３位のアルギニン及び／または８４位のアルギニンの置換を含むアミノ酸配列を有し、かつ０．２５μＭのビタミンＤ_２水酸化酵素の存在下で、１０μＭ２５−ヒドロキシビタミンＤ_２と１ｍＭＮＡＤＰＨとを３０℃、２０分間反応させた場合の１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２への変換率は０．３０％以上である活性を有するビタミンＤ_２水酸化酵素が挙げられる。上記条件での１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２への変換率は、好ましくは１．０％以上である。

上記ビタミンＤ_２水酸化酵素の第四の態様において、同一性は、０．２５μＭのビタミンＤ_２水酸化酵素の存在下で、１０μＭ２５−ヒドロキシビタミンＤ_２と１ｍＭＮＡＤＰＨとを３０℃、２０分間反応させた場合の１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２への変換率は０．３０％以上である活性を有するのであれば特に制限されないが、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、より一層好ましくは９８％以上、さらに一層好ましくは９９％以上である。ただし、ビタミンＤ水酸化酵素の第三の態様のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列おける２３９位のメチオニン、７３位のアルギニン及び／または８４位のアルギニンが改変アミノ酸配列と同様に置換されている。

上記ビタミンＤ水酸化酵素の第二、第三および第四の態様の取得方法は、改変アミノ酸配列の取得方法と同様に、特に制限されるものではなく、物理化学的に合成してもよいし、後述する通りに生物学的に改変アミノ酸配列をコードする核酸から作成してもよいし、通常知られる手段を用いた各種スクリーニング法により取得してもよい。上記ビタミンＤ水酸化酵素は、その取得を容易にするなどのために、ヒスタグ（His-tag）やシグナルペプチド等をＮ末端側又はＣ末端側に適宜付加することができる。

上記ビタミンＤ_２水酸化酵素は、２５−ヒドロキシビタミンＤ_２から１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２を製造するために使用することができる。

（Ｂ）ビタミンＤ_２水酸化酵素をコードする核酸
ビタミンＤ_２水酸化酵素をコードする核酸は、例えば、改変アミノ酸配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）のいずれかをコードする核酸が挙げられる。ただし、改変アミノ酸配列（ａ）または（ｂ）をコードする核酸の発現産物は、０．２５μＭのビタミンＤ_２水酸化酵素の存在下で、１０μＭ２５−ヒドロキシビタミンＤ_２と１ｍＭＮＡＤＰＨとを３０℃、２０分間反応させた場合の１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２への変換率は０．３０％以上、好ましくは１．０％以上である活性を有することが好ましい。また、改変アミノ酸配列（ｃ）または（ｄ）をコードする核酸は、上記条件での１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２への変換率が０．３０％以上である活性を有するものであり、上記条件での１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２への変換率が１．０％以上である活性を有するものが好ましい。

ビタミンＤ_２水酸化酵素をコードする核酸の具体例としては、例えば、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有する核酸が挙げられる。配列表の配列番号２に記載の核酸は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、２３９位のメチオニンがアラニンに置換されており、７３位のアルギニンがアラニンに置換されており、かつ８４位のアルギニンがアラニンに置換されているアミノ酸配列をコードする。改変アミノ酸配列（ｂ）をコードする核酸の一例である。

上記核酸の取得方法は特に限定されない。例えば、上記核酸は、改変アミノ酸配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）のいずれかをコードする核酸、例えば、配列番号２に記載の塩基配列の情報に基づいて、ＣＹＰ１０５Ａ１遺伝子（配列表の配列番号３）から部位特異的変異誘発法によって得ることができ、サチュレーション変異法並びにモレキュラークローニング第２版及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の方法に準じて行うことができる。より詳しくは、上記核酸は、例えば、２１７〜２１９塩基付近の塩基配列を含むプライマーであって２１７〜２１９塩基が改変アミノ酸配列の７３位のアミノ酸をコードする塩基に置換したプライマーと該プライマーに相補的なプライマーとの第一のプライマーセットを用いて、ＣＹＰ１０５Ａ１をコードする塩基配列を含む核酸をＰＣＲによって増幅して第一のＰＣＲ産物を得る。次いで、２５０〜２５２塩基付近の塩基配列を含むプライマーであって２５０〜２５２塩基を改変アミノ酸配列の８４位のアミノ酸をコードする塩基に置換したプライマーと該プライマーに相補的なプライマーとの第二のプライマーセットを用いて、第一のＰＣＲ産物を鋳型としてＰＣＲによって増幅することにより、第二のＰＣＲ産物を取得する。さらに、７１５〜７１７塩基付近の塩基配列を含むプライマーであって７１５〜７１７塩基を改変アミノ酸配列の２３９位のアミノ酸をコードする塩基に置換したプライマーと該プライマーに相補的なプライマーとの第三のプライマーセットを用いて、第二のＰＣＲ産物を鋳型としてＰＣＲによって増幅することにより、第三のＰＣＲ産物を取得する。ここで、第一のプライマーセットを使用するＰＣＲ、第二のプライマーセットを使用するＰＣＲ、第三のプライマーセットを使用するＰＣＲの順序は適宜変更できる。ビタミンＤ_２水酸化酵素をコードする核酸の取得方法の具体例は実施例に記載する。

さらに上記核酸は、例えば、配列表の配列番号１に記載したアミノ酸配列、又は配列番号２に記載の塩基配列の情報に基づいて適当なプローブやプライマーを調製し、それらを用いてStreptomyces griseolus由来の染色体ＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより上記核酸を単離することができる。染色体ＤＮＡライブラリーは、ＣＹＰ１０５Ａ１を発現しているStreptomyces griseolus由来のＣＹＰ１０５Ａ１遺伝子に、通常知られる方法によって変異を導入して作製することができる。

上記したプライマー及びプローブの調製、ＰＣＲ、染色体ＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングなどの操作は当業者に知られており、例えば、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の方法に準じて行うことができる。

さらに、上記核酸は、ＣＹＰ１０５Ａ１遺伝子（配列表の配列番号３）から、例えば、配列表の配列番号２に記載の塩基配列の情報に基づいて化学合成法により得ることができ、さらにＣＹＰ１０５Ａ１遺伝子あるいはＣＹＰ１０５Ａ１遺伝子に変異を導入した遺伝子に対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法や紫外線を照射する方法により突然変異を誘発するなどの当業者に通常知られる任意の方法で作製することができる。

（Ｃ）組換えベクター
上記核酸は適当なベクターに挿入して使用することができる。ベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製することが可能なベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、又は宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれ、ゲノムＤＮＡと共に複製されるものであってもよい。好ましくは、ベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて上記核酸は、転写に必要な要素（例えば、プロモータ等）が機能的に連結されている。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。

自立的に複製することが可能なベクターの具体例としては、ｐｋｋ２２３−３、ｐＲＳＥＴＡ、ｐＣＲ８、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）、ｐＵＣ１８、ｐＣＲ２．１、ｐＩＪ６０２１、ＳＣＰ２、ｐＨＪＬ１９０、ｐＨＪＬ１９１、ｐＩＪ１０１、ｐＩＪ７０２、ｐＳＫＮ０１、ｐＳＫ０４、ｐＬＲ５９１、ｐＵＬＪＡ３０等のプラスミドベクターやλｇｔ１１、λＺＡＰ等のファージベクターが挙げられるが、大腸菌で発現させるには、ｐｋｋ２２３−３、ｐＵＣ１９、ｐＲＳＥＴＡ、ｐＣＲ８、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）、ｐＵＣ１８、およびｐＣＲ２．１が好ましく、枯草菌で発現させるにはｐＩＪ６０２１、ｐＩＪ６０２１、ＳＣＰ２、ｐＨＪＬ１９０、ｐＨＪＬ１９１、ｐＩＪ１０１、ｐＩＪ７０２、ｐＳＫＮ０１、ｐＳＫ０４、ｐＬＲ５９１、ｐＵＬＪＡ３０が好ましい。上記組換えベクターに用いられるベクターは、後述する形質転換体の宿主細胞と相性がよく、安定して上記ビタミンＤ水酸化酵素を発現することができるものであれば、特に制限されるものではない。なお、細菌細胞で作動可能なプロモータとしては、大腸菌のｌａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃプロモータ、放線菌のｔｉｐＡ、ｅｒｍＥプロモータなどが挙げられる。

上記組換えベクターは選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）又はシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、又はアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ヒグロマイシンなどの薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。

上記組換えベクターは、放線菌を形質転換する場合、活性上昇を目的として、例えば、放線菌Streptomyces griseolus由来のＦＤＸ１（Omer, C.A. et al, (1990), J Bacteriol., 172, 3335-3345）及びStreptomyces coelicolor由来のＦＤＲ１遺伝子（Chun YJ et al., (2007), J Biol Chem. 282, 17486-17500）を上記核酸の下流に連結することができるが、これらに限定されるものではなく、上記した電子伝達系に関与する酵素の遺伝子を用いてもよい。したがって、上記核酸はプロモータ、ターミネータ、エンハンサー、分泌シグナル配列、電子伝達系酵素遺伝子などと連結されて適切なベクターに挿入されるが、これらの方法は当業者に通常知られる方法である。

（Ｄ）形質転換体
上記核酸又は上記組換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。すなわち、形質転換体は、ビタミンＤ_２水酸化酵素をコードする核酸を導入してなる、又はビタミンＤ水酸化酵素をコードする核酸が挿入された組換えベクターを含有する形質転換体である。

上記核酸を導入してなる形質転換体は、バクテリオファージなどによって、上記核酸を宿主細胞へ導入された、好ましくは、上記核酸が宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれた形質転換体である。

上記核酸又は組換えベクターが導入される宿主細胞は、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。細菌細胞の例としては、放線菌、枯草菌等のグラム陽性菌または大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられ、好ましくは放線菌又は大腸菌である。この中で、放線菌として好ましいのは、Streptomyces lividans TK23株であり、大腸菌として好ましいのはＪＭ１０９株であるが、これらに限定されるものではない。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、カルシウムイオンを用いる方法等により行うことができる。哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞、ＣＨＯ細胞等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換するためには、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。

酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）またはサッカロマイセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）等が挙げられる。酵母宿主への組換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。

他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞を挙げることができる。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、通常知られる方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。

（Ｅ）１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２の製造方法
上記形質転換体を常法にしたがって適当な培地に接種し、ＮＡＤＰＨなどの還元型補酵素を加えることなく、２５−ヒドロキシビタミンＤ_２の存在下、好ましくは２５−ヒドロキシビタミンＤ_２及び包摂化合物の存在下、より好ましくは２５−ヒドロキシビタミンＤ_２、包摂化合物及びビタミンＤ_２水酸化酵素の発現を誘導する薬剤の存在下で培養することにより、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤを製造することができる。本発明の１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２の製造方法は、反応系に菌体を用いる方法であるため、反応系にＮＡＤＰＨを加えずに実施することができ、ビタミンＤ水酸化反応と同時に触媒である菌体を増殖することができ（生菌体法）、増殖した菌体に対して精製などの処理を施さなくてもよく、菌体の保存が容易であることから菌体を繰り返し反応に使用でき、反応時間を例えば、１００時間以上としても実施可能であり、並びに通常用いられる培地を利用することにより安価に工業的規模で大量生産ができることから、酵素を用いる方法と比較して、圧倒的に簡便かつ効率よく、２５−ヒドロキシビタミンＤ_２から１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２を製造できる。

２５−ヒドロキシビタミンＤ_２としては２５−ヒドロキシビタミンＤ_２又は２５−ヒドロキシビタミンＤ_２含有物（例えば、シイタケ抽出液や魚類肝臓抽出液の水酸化体含有物）を用いることができる。休止菌体を用いる場合、反応に使用する水性媒体としては水、緩衝液等が挙げられる。緩衝液としては酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、ＥＤＴＡ緩衝液等を用いることができる。

１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２の製造において使用する包摂化合物は、シクロデキストリン、ゼオライト（Ｎａ₁₂・Ａｌ₁₂Ｓｉ₁₂Ｏ₄₈）、フラーレン（Ｃ₆₀、Ｃ₇₀等）、クラウンエーテル又はカリックスアレーンが好ましく、シクロデキストリンがより好ましく、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンが特に好ましい。包摂化合物の濃度は、形質転換体がビタミンＤを１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤに変換することができる濃度であれば特に制限されないが、例えば、包摂化合物が２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである場合、終濃度は１０〜３０００ｍｇ／ｌが好ましく、１００〜２０００ｍｇ／ｍｌがより好ましい。生菌体法及び休止菌体法のいずれの場合もビタミンＤ_２の濃度は、包摂化合物の濃度に比例して高めることができ、例えば、２０〜２０００ｍｇ／ｌに設定することができる。Streptomyces griseolusのＣＹＰ１０５Ａ１の電子伝達系は図６で示した通りである。休止菌体法の場合、一般的にグルコースを含む緩衝液を用いて菌体内でNADPHを生産するが、菌体内にNADPHが生産され、電子伝達系が正常に機能するのであればよく、グルコース以外の化合物を使用することもできる。

上記形質転換体の培養に用いる栄養培地としては、炭素源、窒素源、無機物、および必要に応じ使用菌株の必要とする微量栄養素を程よく含有するものであれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。

上記形質転換体の培養に用いる栄養培地の炭素源としては、該形質転換体が資化しうる物であればよく、例えば、グルコース、マルトース、フラクトース、マンノース、トレハロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、デンプン、デキストリン、糖蜜などの糖質、またはクエン酸、コハク酸などの有機酸、またはグリセリンや脂肪酸も使用することができる。

上記形質転換体の培養に用いる栄養培地の窒素源としては、各種有機および無機の窒素化合物、さらに培地は各種の無機塩を含むことができる。たとえば、コーンスティープリカー、大豆粕、あるいは各種ペプトン類等の有機窒素源、及び塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、リン酸アンモニウム等の無機窒素源などの化合物が使用可能である。また、グルタミン酸などのアミノ酸および尿素などの有機窒素源が炭素源にもなることはいうまでもない。さらに、ペプトン、ポリペプトン、バクトペプトン、バクトソイトン、オキソイドマルトエキス、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、大豆粉、大豆粕、乾燥酵母、カザミノ酸、ソリュブルベジタブルプロテイン等の窒素含有天然物も窒素源として使用できる。

上記形質転換体の培養に用いる栄養培地の無機物としては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩などが適宜用いられる。具体的には、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等が用いられる。上記形質転換体の培養に用いる栄養培地のタンパク質成分としては、例えば、ＮＺ−ｃａｓｅやＮＺ−ａｍｉｎｅなどのカゼイン分解物が挙げられる。さらに、必要に応じて、アミノ酸ならびにビオチンおよびチアミンなどの微量栄養素ビタミンなども適宜用いられる。

培養法としては液体培養法（振とう培養法もしくは通気攪拌培養法）がよく、工業的には通気攪拌培養法が好ましい。培養温度とｐＨは、使用する形質転換体の増殖に適し、かつビタミンＤ水酸化酵素の活性が高くかつ安定した条件を選べばよい。たとえば、上記形質転換体が微生物の場合の培養は、通常、２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃、より好ましくは３０℃であり、ｐＨは５〜９、好ましくは６〜８から選ばれる条件で好気的に行われる。培養時間は微生物が増殖し始める時間以上の時間であればよく、好ましくは８〜１２０時間であり、さらに好ましくは上記ビタミンＤ水酸化酵素が最大に生成している時間帯である。微生物の増殖を確認する方法は特に制限はないが、たとえば、培養物を採取して顕微鏡で観察してもよいし、吸光度で観察してもよい。また、培養液の溶存酸素濃度には特に制限はないが、通常は、０．５〜２０ｐｐｍが好ましい。そのために、通気量を調節したり、撹拌したり、通気に酸素を追加したりすればよい。培養方式は、回分培養、流加培養、連続培養または灌流培養のいずれでもよい。

上記形質転換体の培養において、組換えベクターに選択マーカーを含有させている場合などでは、選択マーカーに対応した抗生物質を栄養培地とともに加える。たとえば、選択マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子を含有する場合は、適当な濃度に調製したカナマイシン溶液を加える。

上記形質転換体を培養した後、培養物（液体分と形質転換体や不溶成分等の固形分とが混合したもの）に上記ビタミンＤ水酸化酵素の発現を誘導する薬剤を加える。発現を誘導する薬剤とは、例えば、チオストレプトンやイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）などを用いる。

上記ビタミンＤ水酸化酵素は、上記形質転換体の細胞内に蓄積される。上記形質転換体を培養して得た培養物をビタミンＤ水酸化酵素の粗酵素として用いることができる。さらに、該培養物を遠心分離法、ろ過法等の操作によって固形分と培養上清に分離して得られた固形分をビタミンＤ水酸化酵素の粗酵素とすることもできる。さらに、上記固形分や固形分中の菌体を適当な担体に包括、吸着あるいは化学的に結合させた菌体固定化担体などを１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２の製造に使用することができる。

製造された１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２は、例えば、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２を溶解することができる溶媒を用いて回収することができるが、活性炭処理、イオン交換樹脂処理等の単離・精製手段を適宜組み合わせても回収することができる。具体例として、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２は、培養液に２〜６倍容、好ましくは４倍容のクロロホルム−メタノール混合液を添加し、激しく攪拌することにより回収することができる。クロロホルム−メタノール混合液におけるクロロホルムとメタノールの混合比は、例えば、３：１に設定することができる。回収された１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２は、例えば、下記条件により高速液体クロマトグラフィーにより分析できる：カラム：ＹＭＣ社製ＹＭＣ−ＰａｃｋＯＤＳ−ＡＭ（内径４．６ｍｍ×長さ３００ｍｍ）；検出波長：２６５ｎｍ；流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ；カラム温度：４０^ｏＣ、溶出条件：水／アセトニトリル系；７０−１００％アセトニトリル直線濃度勾配（１５分間）の後、１００％アセトニトリル（２５分間）。

以下の実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

１．ＣＹＰ１０５Ａ１三重変異体発現プラスミドの構築
ＣＹＰ１０５Ａ１二重変異体（Ｒ７３Ａ／Ｒ７３Ａ）を大腸菌内で発現させるためのプラスミド（ｐＫＳＮｄｌ−Ｒ７３Ａ／Ｒ７３Ａ）は、後述する参考文献（１）及びに記載した方法にしたがって構築した。三重変異体をコードする遺伝子は、ｐＫＳＮｄｌ−Ｒ７３Ａ／Ｒ７３Ａを鋳型に表１に示したプライマーを利用し作製した。それぞれの変異体作製に使用したプライマーの塩基配列を表１に示した。構築したプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９株に導入した。発現系におけるベクターと大腸菌宿主については特に限定されるものではない。

２．組換え大腸菌の培養及び細胞質画分の調製
それぞれの変異体を発現する組換え大腸菌は５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＴＢ培地（非特許文献１）において３７℃で培養し、菌体濃度（Ｏ．Ｄ．_660nm）が０．５に達した時点でイソプロピル−チオーβ−Ｄ−ガラクトピラノシドを終濃度１ｍＭになるまで、及びδ−アミノレブリン酸を終濃度５ｍＭになるまで添加した。その後、４０〜５０時間１３℃で培養し、遠心分離により菌体を回収し、超音波破砕装置を用いて菌体を破砕し、遠心分離により細胞質画分を調製した。

３．変異体の定量
野生型および変異体の定量は吸収スペクトルを測定し４１７ｎｍにおける吸光度を求め、モル分子吸光係数１１０ｍＭ^-1ｃｍ^-1を用いて算出した。

４．活性測定
活性は１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭＥＤＴＡ緩衝液中で、以下のものを含む再構成系を用いて測定した。１０μＭ２５―ヒドロキシビタミンＤ₂（２５（ＯＨ）Ｄ₂）；０．２５μＭシトクロムＰ４５０（二重変異体あるいは三重変異体を含む組換え大腸菌細胞質画分）；０．１ｍｇ／ｍｌホウレン草由来フェレドキシン（Ｆｄｘ）、０．１Ｕ／ｍｌホウレン草由来フェレドキシン還元酵素（Ｆｄｒ）、１Ｕ／ｍｌグルコース脱水素酵素；１％グルコース；０．１ｍｇ／ｍｌカタラーゼ（活性測定条件Ａ）。

反応は終濃度１ｍＭになるまでＮＡＤＰＨを添加して３０^oＣで反応を開始し、２０〜１２０分反応させた。反応液の四倍容のクロロホルム：メタノール＝３：１を添加し、激しく攪拌した後、代謝物を高速液体クロマトグラフィーにより分析した。分析条件はＨＰＬＣ分析条件Ａに示したとおりである。

ＨＰＬＣ分析条件Ａ
カラム：ＹＭＣ社製ＹＭＣ−ＰａｃｋＯＤＳ−ＡＭ（内径４．６ｍｍ×長さ３００ｍｍ）；検出波長：２６５ｎｍ；流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ；カラム温度：４０^oＣ、溶出条件：水／アセトニトリル系；２０−１００％アセトニトリル直線濃度勾配（２５分間）の後、１００％アセトニトリル（１０分間）

５．三重変異体（Ｒ７３Ａ／Ｒ８４Ａ／Ｍ２３９Ａ）と二重変異体（Ｒ７３Ａ／Ｒ８４Ａ）との活性比較
三重変異体（Ｒ７３Ａ／Ｒ８４Ａ／Ｍ２３９Ａ）および二重変異体（Ｒ７３Ａ／Ｒ８４Ａ）について、上記の活性測定法（活性測定条件Ａ）により、反応０分、および１２０分間反応させ、得られた代謝物のＨＰＬＣクロマトグラムを図１ａおよびｂに示す。

三重変異体（Ｒ７３Ａ／Ｒ８４Ａ／Ｍ２３９Ａ）では、二重変異体（Ｒ７３Ａ／Ｒ８４Ａ）の場合と異なり、多数の代謝物が確認された。両変異体ともに、検出時間２５．０〜２５．９分に主要代謝物と考えられるピークが検出された。１α，２５（ＯＨ）_２Ｄ_２標品は同条件で、検出時間２５．２分にピークが検出された。

各変異体の主要代謝物（Ｍ１およびＭ２）を分取し、順相ＨＰＬＣにより分析を行った。分析条件を下記のＨＰＬＣ分析条件Ｂに示す。

ＨＰＬＣ分析条件Ｂ
カラム：ＦｉｎｅｐａｋＳＬＬ−５（日本分光）；検出波長：２６５ｎｍ；流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ；カラム温度：４０℃、溶出条件：ヘキサン／イソプロパノール；８０：２０

その結果、Ｍ１、Ｍ２ともに、検出時間１２．２分のピーク（Ｍ１−ａ）と１６．４分のピーク（Ｍ１−ｂ）が検出された。１α，２５（ＯＨ）_２Ｄ_２標品は同条件で、検出時間１６．４分にピークが検出された。Ｍ１−ａとＭ１−ｂの面積値の比は三重変異体（Ｒ７３Ａ／Ｒ８４Ａ／Ｍ２３９Ａ）と二重変異体（Ｒ７３Ａ／Ｒ８４Ａ）とで大きく異なり、Ｍ１−ａ：Ｍ１−ｂは、Ｒ７３Ａ／Ｒ８４Ａ／Ｍ２３９Ａの場合２．７：１、Ｒ７３Ａ／Ｒ８４Ａの場合９１：１となった。

Ｍ１−ｂのピークを分取し、ＬＣ−ＭＳ分析を行った。得られた結果を１α，２５（ＯＨ）_２Ｄ_２標品と比較したところ、図３ａおよびｂに示すとおり、両者は同じマススペクトルパターンを示した。

Ｍ１−ａ、Ｍ１−ｂのピークを分取し、ビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）結合能を測定した。ＶＤＲ結合能は、ＥｎＢｉｏＲＣＡＳｆｏｒＶＤＲキット（コスモバイオ社製）を用いた。図４に代謝物Ｍ１−ａ、Ｍ１−ｂもしくは活性型ビタミンＤ_３（１α，２５（ＯＨ）_２Ｄ_３）各濃度におけるＶＤＲ結合能を示した。縦軸の値は、活性型ビタミンＤ_３１００ｎＭ存在下における値を１．０とした場合の結合能を示す。

Ｍ１−ａは、ＶＤＲ結合能が非常に弱かったのに対し、Ｍ１−ｂは活性型ビタミンＤ_３と呼ばれている１α，２５（ＯＨ）_２Ｄ_３と同程度のＶＤＲ結合能を示した。１α，２５（ＯＨ）_２Ｄ_２は１α，２５（ＯＨ）_２Ｄ_３とほぼ同程度のＶＤＲ結合能を持つことが知られている。

以上、図１〜４に示す結果から、Ｍ１−ｂは１α，２５（ＯＨ）_２Ｄ_２であると推定される。

二重変異体（Ｒ７３Ａ／Ｒ８４Ａ）では１α，２５（ＯＨ）_２Ｄ_２（Ｍ１−ｂ）はほとんど生成されなかったことから、２３９番目のＭｅｔをＡｌａにすることによって、２５（ＯＨ）Ｄ_２に対して１α位水酸化活性が著しく上昇したと考えられる。

６．各変異体の活性測定比較
各変異体を用いて、活性測定条件Ａにて反応を行った。反応２０分後の代謝物を前述の方法により逆相ＨＰＬＣにアプライし、Ｍ１（Ｍ１−ａとＭ１−ｂの混合物）を分取後、さらに順相ＨＰＬＣ分析を行うことによって、Ｍ１−ａとＭ１−ｂの面積値を算出した。得られた面積値から、Ｍ１中におけるＭ１−ｂ（１α，２５（ＯＨ）_２Ｄ_２）の割合を算出した（表２）。また、20分後の１α，２５（ＯＨ）_２Ｄ_２への変換率と1分あたりの酵素活性（代謝回転数）を表2に示した。

これらの結果から、Ｍｅｔ２３９をＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒのようなかさの小さいアミノ酸へ変えることによって、１α位水酸化に対する部位特異性が上昇すると考えられる。Ｍｅｔ２３９をＡｌａへ置換された変異体では、酵素当たりの１α，２５（ＯＨ）_２Ｄ_２変換活性が、Ｍｅｔ２３９の場合の２０倍以上高く、２５（ＯＨ）Ｄ_２から１α，２５（ＯＨ）_２Ｄ_２をより効率よく生成することがわかった。

７．ＣＹＰ１０５Ａ１変異体の放線菌内での発現
三重変異体Ｒ７３Ａ／Ｒ８４Ａ／Ｍ２３９Ａを放線菌内で発現させ、組換え菌体を用いて、２５（ＯＨ）Ｄ_２の１α位水酸化体を製造することを試みた。大腸菌発現用のプラスミドであるｐＫＳＮｄｌ−Ｒ７３Ａ／Ｒ７３Ａ／Ｍ２３９ＡのＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を切り出すことによって、ＣＹＰ１０５Ａ１変異体およびその下流にフェレドキシン（ＦＤＸ１）遺伝子を含む断片を得た。得られた断片を、ＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ処理を行ったロドコッカス属放線菌用プラスミドｐＴｉｐＱＴ２ベクター（後述参考文献（２））に連結した（ｐＴｉｐＱＴ２−Ｒ７３Ａ／Ｒ７３Ａ／Ｍ２３９Ａ）。得られたプラスミドをロドコッカス・エリスロポリスＪＣＭ３２０１株に導入した。形質転換の方法は以下のとおりである。

コンピテントセルセルを次のとおり作製した。１００ｍＬのＬＢ培地にて３０℃、２００ｒｐｍでロドコッカス・エリスロポリスＪＣＭ３２０１株を培養し、菌体濃度（Ｏ．Ｄ．６００ｎｍ）が０．６−０．８程度になるまで培養し、得られた菌体懸濁液を遠心した。上清を除去した後、１００ｍＬの１５％グリセロール溶液に懸濁、さらに遠心し、同じ操作を２回繰り返した。遠心後に得られた菌体を４ｍＬの１５％グリセロール溶液で懸濁することによりコンピテントセルを得た。得られたコンピテントセル１００μＬに、プラスミド０．３−１μｇを添加し、遺伝子導入装置ジーンパルサーIIを用いて、１．９５ｋＶ２００オーム２５μＦＤにて電気パルスを与えた。回復培養液としてＩＳＰ−１培地（０．５％ｔｒｙｐｔｏｎ、０．３％ｙｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔ、０．２％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）を１ｍＬ加え、３０℃で２−４時間培養した。その後、遠心して得られた菌体を１０μｇ/ｍＬテトラサイクリン含有ＩＳＰ−２寒天培地（０．４％ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ、１％ｍａｌｔｏｅｘｔｒａｃｔ、０．４％ｇｌｕｃｏｓｅ、２％Ａｇａｒ）に塗布、３０℃で３日間培養し、得られたコロニーを用いて以下の実験を行った。

尚、発現系におけるベクターと宿主については特に限定されるものではない。

８．ＣＹＰ１０５Ａ１変異体発現放線菌を用いた１α，２５（ＯＨ） _２Ｄ _２の製造
ｐＴｉｐＱＴ２−Ｒ７３Ａ／Ｒ８４Ａ／Ｍ２３９Ａをロドコッカス・エリスロポリスＪＣＭ３２０１株に導入、生えてきたコロニーを１０ μｇ／ｍＬテトラサイクリン含有ＬＢ培地植菌し、３０℃で２４時間培養した。得られた培養液を同濃度のテトラサイクリンを含むＬＢ培地に初期菌体濃度（Ｏ．Ｄ．６００ｎｍ）が０．０５になるように添加し、菌体濃度（Ｏ．Ｄ．６００ｎｍ）が０．６−０．８になるまで３０℃で培養した。その後、終濃度が１μｇ/ｍＬになるようにチオストレプトンを添加し、３０℃で２４時間誘導した。その後、菌体懸濁液に、２５―ヒドロキシビタミンＤ₂（２５（ＯＨ）Ｄ₂）（終濃度５０μＭ）および３−ヒドロキシプロピル−β-シクロデキストリン（終濃度０．２％）を添加し、２００μＬずつ９６穴ディープウェルに移して０−２４時間反応させた。反応させた培養液にそれぞれ８００μＬのクロロホルム：メタノール=３：１混合液を加え、激しく攪拌した後、クロロホルム層を回収、減圧乾固し、アセトニトリルに溶解した。この溶液を逆相ＨＰＬＣにより分析条件Ａで分析した。基質添加６時間後の菌体懸濁液から得られた代謝物のＨＰＬＣクロマトグラムを図５に示す。

図１の大腸菌発現酵素液を用いた場合と同様に代謝物が検出され、Ｍ１が変換率２６．６％で検出された。上述したとおり、Ｍ１のうち、３３％が１α，２５（ＯＨ）_２Ｄ_２であることから、生成された１α，２５（ＯＨ）_２Ｄ_２量は４．４μＭ（１．８ｍｇ／Ｌ）と算出される。Ｒ７３Ａ／Ｒ８４Ａ／Ｍ２３９Ａを発現させたロドコッカス菌体を用いて、簡便に１α，２５（ＯＨ）_２Ｄ_２を生成されることが明らかになった。

参考文献
(1) Sugimoto, H.et al., (2008), Biochemistry 47, 4017-4027
(2) Nakashima, et al., (2004), Applied and Environmental Microbiology 70, 5557-5567

本発明の１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２の製造方法によれば、精製酵素を用いず、ＮＡＤＰＨを加えることなく、高効率に、ビタミンＤ_２から１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２を生産することができる。１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２はカルシウムの吸収促進や代謝促進、細胞分化誘導、免疫調節作用などの多岐にわたる生理作用を有し、骨粗鬆症、くる病などのビタミンＤ代謝異常による諸症状、副甲状腺機能亢進症、乾癬などを治療するための治療薬若しくは医薬中間体、又はこれらの症状を緩和するための食品添加物として使用される。骨粗鬆症の患者数は予備軍を含めると国内で約２０００万人、乾癬の患者数は世界で約１億２５００万人いると言われている。したがって、本発明によれば簡易かつ高効率に上記症状を治療又は緩和させる１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２を製造することができることから、本発明は医薬分野及び食品分野に多大な貢献をすることができる。

Claims

下記（ａ）若しくは（ｂ）のアミノ酸配列からなるか、または下記（ｃ）若しくは（ｄ）のアミノ酸配列からなり、かつ下記（ｅ）の活性を有するビタミンＤ₂水酸化酵素。
（ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、
２３９位のメチオニンがアラニン、セリン、グリシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、又はロイシンに置換された、改変アミノ酸配列
（ｂ）前記（ａ）の改変アミノ酸配列において、７３位のアルギニンがアラニン、バリン、ロイシン又はイソロイシンに、及び／又は８４位のアルギニンがアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、又はグルタミンに置換された、改変アミノ酸配列
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）の改変アミノ酸配列において、（ａ）に記載の２３９位のメチオニンのアラニン、セリン、グリシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、又はロイシンへの置換、（ｂ）に記載の７３位のアルギニンのアラニン、バリン、ロイシン又はイソロイシンへの置換及び（ｂ）に記載の８４位のアルギニンのアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、又はグルタミンへの置換に加えて、１から９個のアミノ酸の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の修飾を有するアミノ酸配列
（ｄ）前記（ａ）または（ｂ）の改変アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、かつ（ａ）に記載の２３９位のメチオニンのアラニンへの置換、又は（ａ）に記載の２３９位のメチオニンのアラニンへの置換、（ｂ）に記載の７３位のアルギニンのアラニンへの置換及び／若しくは（ｂ）に記載の８４位のアルギニンのアラニンへの置換を含むアミノ酸配列
（ｅ）０．２５μＭのビタミンＤ₂水酸化酵素の存在下で、１０μＭ２５−ヒドロキシビタミンＤ₂と１ｍＭＮＡＤＰＨとを３０℃、２０分間反応させた場合の１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₂への変換率は０．３０％以上である。
前記（ａ）の改変アミノ酸配列が、２３９位のメチオニンがアラニン、セリン、又はグリシンに置換された配列である、請求項１に記載の酵素。
前記（ｂ）の改変アミノ酸配列が、７３位のアルギニンがバリン、ロイシン又はイソロイシンに、及び８４位のアルギニンがアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、又はフェニルアラニンに置換された配列である、請求項１または２に記載の酵素。
請求項１〜３のいずれか１項に記載のビタミンＤ₂水酸化酵素を発現する形質転換体。
前記形質転換体の宿主が、大腸菌又は放線菌である、請求項４に記載の形質転換体。
請求項４または５に記載の形質転換体を、２５−ヒドロキシビタミンＤ₂の存在下で培養して、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₂を調製することを含む、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₂の製造方法。
前記培養が、２５−ヒドロキシビタミンＤ₂及び包摂化合物の存在下で実施される、請求項６に記載の製造方法。
前記包摂化合物が、シクロデキストリン、ゼオライト、フラーレン、クラウンエーテル又はカリックスアレーンである、請求項７に記載の製造方法。