JP5517118B2

JP5517118B2 - １α，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤの製造方法

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Publication number: JP5517118B2
Application number: JP2009144232A
Authority: JP
Inventors: 利之榊; 真一生城; 恵子林; 佳織安田
Original assignee: Toyama Prefecture
Current assignee: Toyama Prefecture
Priority date: 2009-06-17
Filing date: 2009-06-17
Publication date: 2014-06-11
Anticipated expiration: 2029-06-17
Also published as: JP2011000018A

Description

本発明は、新規な１α，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤの製造方法に関する。

ビタミンＤ水酸化体およびその誘導体は、くる病、骨粗鬆症、乾癬の治療薬として使われている。さらにこれらの化合物は、近年、癌の治療薬としても注目を浴びており、きわめて有用性の高い物質である。しかし、所望のビタミンＤ水酸化体を得るために、有機合成法により位置特異的および立体特異的にビタミンＤを水酸化することは、極めて困難であった。

生物学的にビタミンＤを水酸化する方法の一つとして、微生物変換による方法が知られている。本方法によれば、ビタミンＤから１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤを製造することができる（特許文献１並びに非特許文献１及び２を参照）。しかし、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤの生産性が悪いことから、本方法によって１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤを工業的規模で効率よく生産することができなかった。

生物学的にビタミンＤを水酸化する他の方法として、ビタミンＤを水酸化するビタミンＤ水酸化酵素を用いる酵素変換による方法がある。ビタミンＤ水酸化酵素として、哺乳動物内で生理的に重要なものは４種類存在する：肝臓に存在するＣＹＰ２７Ａ１（２５位水酸化酵素；非特許文献３及び４を参照）、腎臓に存在するＣＹＰ２７Ｂ１（１α位水酸化酵素；非特許文献５及び６を参照）、腎臓に存在するＣＹＰ２４Ａ１（２４位水酸化酵素；非特許文献７及び８を参照）；及び、ミクロソーム型ＣＹＰ２Ｒ１（２５位水酸化酵素；非特許文献９及び１０を参照）。

本発明者らは、近年、これらの哺乳動物由来のビタミンＤ水酸化酵素を、大腸菌又は酵母内で発現させ、構造と機能に関する研究を重ねてきた（非特許文献１１及び１２を参照）。さらに本発明者らは、ビタミンＤの１α位及び２５位をともに水酸化する活性を有する酵素である、放線菌由来のＣＹＰ１０５Ａ１を取得することに成功した（非特許文献１３及び１４を参照）。本発明者らは、２５位水酸化活性を有し、かつ高度な１α位水酸化活性を有するビタミンＤ水酸化酵素を正常に発現する形質転換体を用いた１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤの製造方法について特許出願した（特願２００８−１５０９３５号）。

１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃をさらに水酸化した、１、２５、２６−トリヒドロキシビタミンＤ₃は、ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）に対する結合能を保持しながらもカルシウム作用が弱いこと（非特許文献１５及び１６を参照）、及び癌細胞の増殖を抑制する作用が強いこと（非特許文献１７を参照）が知られている。

特許出願公告平４−６４６７８号公報

Sasaki, J., Mikami, A., Mizoue, K., and Omura, S., (1991), Appl Environ Microbiol. 57, 2841-2846 Sasaki, J., Miyazaki, A., Saito, M., Adachi, T., Mizoue, K., Hanada, K., and Omura, S., (1992), Appl Microbiol Biotechnol. 38, 152-157 Usui E, Noshiro M, Okuda K, (1990), FEBS Lett., 262, 135-138 Sawada N, Sakaki T, Ohta M, et al, (2000), Biochem Biophys Res Commun 273: 977-984 Takeyama, K., Kitanaka, S., Sato, T., Kobori, M., Yanagisawa, J., and Kato, S., (1997), Science 277, 1827-1830 Sakaki T, Sawada N, Takeyama K, et al., (1999), Eur J Biochem, 259: 731-738 Ohyama Y, Noshiro M, Okuda K., (1991), FEBS Lett. 1991 278, 195-198 Akiyoshi-Shibata M, Sakaki T, Ohyama Y, Noshiro M, Okuda K,Yabusaki Y., (1994), Eur J Biochem. , 224(2):335-343 Cheng, J. B., Levine, M. A., Bell, N. H., Mangelsdorf, D. J., and Russell, D. W., (2004), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7711-7715 Shinkyo R, Sakaki, T, Kamakura M, Ohta, M., Inouye, K., (2004), Biochem Biophys Res Commun 324: 451-457 Sakaki, T., Kagawa, N., Yamamoto, K., and Inouye, K., (2005), Frontiesr in Bioscience 10, 119-134 (2005) Kawauchi, H., Sasaki, J., Adachi, T., Hanada, K., Beppu, T., and Horinouchi, S., (1994), Biochim Biophys Acta. 1219, 179-183 Sawada, N., Sakaki, T., Yoneda, S., Kusudo, T., Shinkyo, R., Ohta, M., and Inouye, K., (2004), Biochem Biophys Res Commun. 320, 156-164 林恵子, 杉本宏, 新京楽, 山田雅人, 生城真一, 鎌倉昌樹, 城宜嗣, 榊利之, (2007), 放線菌学会要旨集、P-23 Tanaka Y, Schnones HK, Smith CM, DeLuka HF., (1981), Arch. Biochem. Biophys. 210, 104-109 Zhou LX, Nemere I, Norman AW., (1992), J Bone Miner Res. 7, 457-463. Richard J. Frampton et al., (1983), Cancer Research, 43, 4443-4447

上記の通り、ビタミンＤを１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤへと変換する反応を触媒するビタミンＤ水酸化酵素があり、該ビタミンＤ水酸化酵素を発現する形質転換体を用いてビタミンＤから１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤを製造する試みは成功している。

しかし、ビタミンＤを１α，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤへと変換する反応を触媒する酵素及びこのような酵素を発現する微生物の存在はこれまでに知られておらず、酵素変換又は微生物変換によってビタミンＤから１α，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤを製造する方法もまた知られていない。

そこで、本発明は、酵素変換又は微生物変換により、ビタミンＤから１α，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤを製造する方法を提供することを、発明が解決しようとする課題とした。

本発明者らは、鋭意研究を積み重ねた結果、ビタミンＤ水酸化酵素を構成する配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列における７３位及び８４位のアルギニンを所定のアミノ酸に置換した変異体又は該変異体を発現する形質転換体を用いることにより、ビタミンＤから１α，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤを製造することに成功し、本発明を完成させた。

したがって、本発明によれば、ビタミンＤ及びビタミンＤ水酸化体からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物を含む基質溶液に、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれか１種のアミノ酸配列を有し、かつ下記（ｄ）の活性を有するビタミンＤ水酸化酵素を作用させて、１α，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤを主成分として含む１α，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤ分離物を得ることを特徴とする、１α，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤの製造方法が提供される。
（ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、
７３位のアルギニンがアラニン、バリン、ロイシン又はイソロイシンに、及び８４位のアルギニンがアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、グリシン、システイン、グルタミン、アスパラギン、セリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン酸又はグルタミン酸に置換された、改変アミノ酸配列
（ｂ）前記改変アミノ酸配列において、前記７３位のアルギニン及び８４位のアルギニンの置換の他さらに、１から９個のアミノ酸の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の修飾を有するアミノ酸配列
（ｃ）前記改変アミノ酸配列と７０％以上の相同性を有する、前記７３位のアルギニン及び８４位のアルギニンの置換を含むアミノ酸配列
（ｄ）０．２μＭビタミンＤ水酸化酵素を、０．１ｍｇ／ｍｌフェレドキシン、０．１Ｕ／ｍｌフェレドキシン還元酵素、１Ｕ／ｍｌグルコース脱水素酵素、１％グルコース、０．１ｍｇ／ｍｌカタラーゼ及び１ｍＭＮＡＤＰＨを含む１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）−１ｍＭＥＤＴＡ緩衝液中の１０μＭ１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃に、３０℃、３０分間作用させた場合の１α，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤ₃への変換率は０．１％以上である

好ましくは、前記１α，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤ分離物が、クロロホルム−メタノール混合液に溶解された後、下記条件のＨＰＬＣに供して、リテンションタイム５．５〜５．９分の溶出分画に含まれる化合物として得られる。
カラム：ＯＤＳカラム；
検出波長：２６５ｎｍ；
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ；
カラム温度：４０℃；
溶出条件：７０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液からアセトニトリルまでのアセトニトリル直線濃度勾配（１５分間）

好ましくは、前記ビタミンＤ水酸化酵素が、形質転換体内で発現するビタミンＤ水酸化酵素である。

好ましくは、前記形質転換体の宿主が、大腸菌又は放線菌である。

好ましくは、前記基質溶液が、電子供与体及び該電子供与体を還元するための酵素をさらに含む。

好ましくは、前記電子供与体及び前記電子供与体を還元するための酵素が、それぞれ、フェレドキシン及びフェレドキシン還元酵素、又はプチダレドキシン及びプチダレドキシン還元酵素である。

好ましくは、前記改変アミノ酸配列が、
７３位のアルギニンがバリン、ロイシン又はイソロイシンに、及び８４位のアルギニンがアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、グリシン又はシステインに置換された配列である。

好ましくは、前記ビタミンＤがビタミンＤ₂又はビタミンＤ₃であり、かつ前記ビタミンＤ水酸化体がビタミンＤ₂水酸化体又はビタミンＤ₃水酸化体である。

好ましくは、前記ビタミンＤ水酸化体が、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤである。

好ましくは、前記ビタミンＤ水酸化体が、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃である。

好ましくは、前記基質溶液が、包摂化合物をさらに含む。

好ましくは、前記包摂化合物が、シクロデキストリン、ゼオライト、フラーレン、クラウンエーテル又はカリックスアレーンである。

本発明の製造方法によれば、酵素変換又は微生物変換によって、ビタミンＤから１α，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤを製造することができる。微生物変換による方法は、酵素を精製する工程を要しないという点において、酵素変換による方法と比べて有利である。さらに、微生物変換に用いる微生物がフェレドキシン及びフェレドキシン還元酵素を発現する場合は、これらのタンパク質を加えることを要しないため、この点においても、酵素変換による方法と比べて有利である。ただし、酵素変換による方法は、ビタミンＤ水酸化酵素、フェレドキシン及びフェレドキシン還元酵素が得られれば、微生物変換による方法に比べて、微生物制御固有のパラメーター（溶存酸素、炭素源濃度など）を設定する必要がなく、より短時間で反応を終了させることができるという有利な点を有する。

本発明の製造方法によって製造された１α，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤを用いることによって、骨粗鬆症、くる病などのビタミンＤ代謝異常による諸症状だけでなく、癌や乾癬などを治療するための副作用の小さい新規な治療薬若しくは医薬中間体、又はこれらの症状を緩和するための食品添加物の生産及び開発が可能となる。

Ｒ７３Ｖ／Ｒ８４Ａ発現放線菌培養２４時間後のビタミンＤ₃代謝物のＨＰＬＣ分析結果を示した図である。代謝物Ｍ３の質量分析結果を示した図である。基質添加後の３種の代謝物：２５（ＯＨ）Ｄ₃、１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃、及び１α，２５，２６（ＯＨ）₃Ｄ₃の経時変化を示した図である。ＣＹＰ１０５Ａ１変異体Ｒ７３Ｖ／Ｒ８４Ａによる１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃代謝物のＨＰＬＣ分析結果を示した図である。

以下、本発明の詳細について説明する。
（Ａ）ビタミンＤ水酸化酵素
本発明の製造方法において使用するビタミンＤ水酸化酵素は、改変アミノ酸配列を有し、かつ該ビタミンＤ水酸化酵素０．２μＭを、０．１ｍｇ／ｍｌフェレドキシン、０．１Ｕ／ｍｌフェレドキシン還元酵素、１Ｕ／ｍｌグルコース脱水素酵素、１％グルコース、０．１ｍｇ／ｍｌカタラーゼ及び１ｍＭＮＡＤＰＨを含む１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）−１ｍＭＥＤＴＡ緩衝液中の１０μＭ１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃に、３０℃、３０分間作用させた場合の１α，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤ₃への変換率は０．１％以上である活性（以下、この活性を「ビタミンＤ水酸化活性」とよぶ）を有する。ビタミンＤ水酸化酵素は、ビタミンＤ水酸化活性を有する限り、改変アミノ酸配列そのものであってもよく、または改変アミノ酸配列を一部として含むものであってもよい。

本明細書にいう「ビタミンＤ」には、天然型ビタミンであるビタミンＤ₂、Ｄ₃、Ｄ₄、Ｄ₅、Ｄ₆及びＤ₇だけでなく、人工的に作られたこれらの誘導体が包含される。したがって、１α，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤには、１α位、２５位及び２６位が水酸化されたビタミンＤ₂、Ｄ₃、Ｄ₄、Ｄ₅、Ｄ₆及びＤ₇、並びにこれらの誘導体が包含される。

改変アミノ酸配列は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、７３位のアルギニンおよび８４位のアルギニンがそれぞれ別のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列である。配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列は、Streptomyces griseolus由来のＣＹＰ１０５Ａ１のアミノ酸配列である。すなわち、上記ビタミンＤ水酸化酵素は、ＣＹＰ１０５Ａ１のアミノ酸配列において２以上のアミノ酸の修飾が加わったＣＹＰ１０５Ａ１変異体である。

改変アミノ酸配列は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、７３位のアルギニンがアラニン、バリン、ロイシン又はイソロイシンに置換されており、かつ８４位のアルギニンが非極性側鎖を有するアミノ酸、酸性側鎖を有するアミノ酸、又は電荷を持たない極性側鎖を有するアミノ酸に置換されたものである。改変アミノ酸配列の好ましい態様は、７３位のアルギニンがアラニン、バリン、ロイシン又はイソロイシンに置換されており、かつ８４位のアルギニンが非極性側鎖を有するアミノ酸に置換されたものである。

非極性側鎖を有するアミノ酸とは、例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、グリシン、システインなどが挙げられる。酸性側鎖を有するアミノ酸とは、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。電荷を持たない極性側鎖を有するアミノ酸とは、例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシンなどが挙げられる。

改変アミノ酸配列の具体例として、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、７３位のアルギニンがアラニン又はバリンに置換されており、かつ８４位のアルギニンがアラニン又はフェニルアラニンに置換されているアミノ酸配列が挙げられる。これらの改変アミノ酸配列の一部は、配列表の配列番号５及び６に記載されている。

ビタミンＤ水酸化酵素は、例えば、改変アミノ酸配列において、７３位のアルギニン及び８４位のアルギニンの置換の他さらに、１から数個のアミノ酸の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の修飾を有するアミノ酸配列を有してもよい。この場合、タミンＤ水酸化酵素のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列おける７３位のアルギニン及び８４位のアルギニンがそれぞれ別のアミノ酸に置換されており、さらにこれら以外に１から数個のアミノ酸の欠失等の修飾を１個以上有する。

ビタミンＤ水酸化酵素において、７３位のアルギニン及び８４位のアルギニンの置換の他さらに生じた修飾の個数は、ビタミンＤ水酸化活性を有するのであれば特に限定されないが、１から２０個が好ましく、１、２、３、４、５、６、７、８、または９個がより好ましい。

アミノ酸の修飾について、アミノ酸の欠失は配列中のアミノ酸残基の欠落もしくは消失を、アミノ酸の置換は配列中のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置き換えられていることを、アミノ酸の逆位は隣り合う２個以上のアミノ酸残基の位置が逆になっていることを、アミノ酸の付加はアミノ酸残基が付け加えられていることを、アミノ酸の挿入は配列中のアミノ酸残基の間に別のアミノ酸残基が挿し入れられていることをそれぞれ意味する。アミノ酸の修飾は、同じ修飾態様が１個又は２個以上生じる場合もあるし、異なる修飾態様がそれぞれ２個以上生じる場合もある。

ビタミンＤ水酸化酵素は、例えば、改変アミノ酸配列との相同性（アミノ酸配列の同一性）が高く、改変アミノ酸配列における７３位のアルギニン及び８４位のアルギニンの置換を含むアミノ酸配列を有し、かつビタミンＤ水酸化活性を有するビタミンＤ水酸化酵素であってもよい。この場合、改変アミノ酸配列との相同性は、ビタミンＤ水酸化活性を示すタンパク質を構成するものであれば特に制限されないが、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。ただし、この場合のビタミンＤ水酸化酵素のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列おける７３位のアルギニン及び８４位のアルギニンが改変アミノ酸配列と同様に置換されている。

ビタミンＤ水酸化酵素の水酸化活性は、該ビタミンＤ水酸化酵素０．２μＭを、０．１ｍｇ／ｍｌフェレドキシン、０．１Ｕ／ｍｌフェレドキシン還元酵素、１Ｕ／ｍｌグルコース脱水素酵素、１％グルコース、０．１ｍｇ／ｍｌカタラーゼ及び１ｍＭＮＡＤＰＨを含む１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）−１ｍＭＥＤＴＡ緩衝液中の１０μＭ１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃に、３０℃、３０分間作用させた場合の１α，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤ₃への変換率が０．１％以上であればよく、好ましくは０．５％以上であり、より好ましくは１．０％以上であり、さらに好ましくは１．５％以上である。実施例において実証されているように、ビタミンＤ水酸化酵素の水酸化活性における上記変換率は、特に好ましくは２．０％以上である。

（Ｂ）ビタミンＤ水酸化酵素の取得方法
ビタミンＤ水酸化酵素は、特に制限されるものではなく、物理化学的に合成してもよいし、改変アミノ酸配列をコードする核酸に基づいて生物学的に作製してもよいし、通常知られる手段を用いた各種スクリーニング法により取得してもよい。ビタミンＤ水酸化酵素は、その取得を容易にするなどのために、ヒスタグ（His-tag）やシグナルペプチド等をＮ末端側又はＣ末端側に適宜付加することができる。ビタミンＤ水酸化酵素の取得方法の一つの態様として、改変アミノ酸配列をコードする核酸に基づいて生物学的にビタミンＤ水酸化酵素を作製する方法について説明する。

ビタミンＤ水酸化酵素をコードする核酸は、例えば、改変アミノ酸配列をコードする核酸；改変アミノ酸配列において、７３位のアルギニン及び８４位のアルギニンの置換の他さらに、１から数個のアミノ酸の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の修飾を有するアミノ酸配列をコードする核酸；並びに、改変アミノ酸配列との相同性が高く、改変配列における７３位のアルギニン及び８４位のアルギニンの置換を含むアミノ酸配列をコードする核酸などが挙げられる。ただし、いずれの核酸であっても、発現産物であるビタミンＤ水酸化酵素は、ビタミンＤ水酸化活性を有する。

ビタミンＤ水酸化酵素をコードする核酸の取得方法は特に限定されない。例えば、配列番号２又は３に記載の塩基配列の情報に基づいて、ＣＹＰ１０５Ａ１遺伝子（配列表の配列番号１）から部位特異的変異誘発法によって得ることができる。より詳細には、以下の方法により、ビタミンＤ水酸化酵素をコードする核酸を取得できる。

２１７〜２１９塩基付近の塩基配列を含むプライマーであって２１７〜２１９塩基が改変アミノ酸配列の７３位のアミノ酸をコードする塩基に置換したプライマーと該プライマーに相補的なプライマーとの第一のプライマーセットを用いて、ＣＹＰ１０５Ａ１をコードする塩基配列を含む核酸をＰＣＲによって増幅して第一のＰＣＲ産物を得る。次いで、２５０〜２５２塩基付近の塩基配列を含むプライマーであって２５０〜２５２塩基を改変アミノ酸配列の８４位のアミノ酸をコードする塩基に置換したプライマーと該プライマーに相補的なプライマーとの第二のプライマーセットを用いて、第二のＰＣＲ産物をＰＣＲによって増幅することにより、ビタミンＤ水酸化酵素をコードする核酸を取得することができる。ここで、第一のプライマーセットと第二のプライマーセットとの使用の順序は逆であってもかまわない。ビタミンＤ水酸化酵素をコードする核酸の取得方法の具体例は実施例に記載されている。

ビタミンＤ水酸化酵素をコードする核酸は、例えば、配列表の配列番号１に記載したアミノ酸配列、又は配列番号２若しくは３に記載の塩基配列の情報に基づいて適当なプローブやプライマーを調製し、それらを用いてStreptomyces griseolus由来の染色体ＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより単離することもできる。染色体ＤＮＡライブラリーは、ＣＹＰ１０５Ａ１を発現しているStreptomyces griseolus由来のＣＹＰ１０５Ａ１遺伝子に、通常知られる方法によって変異を導入して作製することができる。

上記したプライマー及びプローブの調製、ＰＣＲ、染色体ＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングなどの操作は当業者に知られており、例えば、Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989（以下、モレキュラークローニング第２版と呼ぶ）、又はCurrent Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと呼ぶ）等に記載の方法に準じて実施することができる。

さらに、ビタミンＤ水酸化酵素をコードする核酸は、ＣＹＰ１０５Ａ１遺伝子（配列表の配列番号４）から、配列表の配列番号２又は３に記載の塩基配列の情報に基づいて化学合成法により得ることができ、さらにＣＹＰ１０５Ａ１遺伝子に対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法や紫外線を照射する方法により突然変異を誘発するなどの当業者に通常知られる任意の方法で作製することができる。

ビタミンＤ水酸化酵素をコードする核酸を適当なベクターに挿入して組換えベクターを得て、次いで該組換えベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を得て、次いで該形質転換体をビタミンＤ水酸化酵素が発現する条件下で培養することにより、ビタミンＤ水酸化体を得ることができる。

ベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製することが可能なベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、又は宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれ、ゲノムＤＮＡと共に複製されるものであってもよい。好ましくは、ベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいてビタミンＤ水酸化酵素をコードする核酸は、転写に必要な要素（例えば、プロモータ等）が機能的に連結されている。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主細胞の種類に応じて適宜選択することができる。

自立的に複製することが可能なベクターの具体例としては、ｐｋｋ２２３−３、ｐＲＳＥＴＡ、ｐＣＲ８、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）、ｐＵＣ１８、ｐＣＲ２．１、ｐＩＪ６０２１、ＳＣＰ２、ｐＨＪＬ１９０、ｐＨＪＬ１９１、ｐＩＪ１０１、ｐＩＪ７０２、ｐＳＫＮ０１、ｐＳＫ０４、ｐＬＲ５９１、ｐＵＬＪＡ３０等のプラスミドベクターやλｇｔ１１、λＺＡＰ等のファージベクターが挙げられるが、大腸菌で発現させるには、ｐｋｋ２２３−３、ｐＵＣ１９、ｐＲＳＥＴＡ、ｐＣＲ８、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）、ｐＵＣ１８、およびｐＣＲ２．１が好ましく、枯草菌で発現させるにはｐＩＪ６０２１、ｐＩＪ６０２１、ＳＣＰ２、ｐＨＪＬ１９０、ｐＨＪＬ１９１、ｐＩＪ１０１、ｐＩＪ７０２、ｐＳＫＮ０１、ｐＳＫ０４、ｐＬＲ５９１、ｐＵＬＪＡ３０が好ましい。細菌細胞で作動可能なプロモータとしては、大腸菌のｌａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃプロモータ、放線菌のｔｉｐＡ、ｅｒｍＥプロモータなどが挙げられる。

ビタミンＤ水酸化酵素をコードする核酸が組み込まれた組換えベクター（以下、単に「組換えベクター」とよぶ）は、選択マーカーを含有してもいてもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）又はシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、又はアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ヒグロマイシンなどの薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。

組換えベクターは、宿主細胞である放線菌を形質転換する場合、形質転換体内で発現するビタミンＤ水酸化酵素を活性化するために、例えば、電子供与体および電子供与体還元酵素のそれぞれをコードする遺伝子である、放線菌Streptomyces griseolus由来のＦＤＸ１遺伝子（Omer, C.A. et al, (1990), J Bacteriol., 172, 3335-3345）及びStreptomyces coelicolor由来のＦＤＲ１遺伝子（Chun YJ et al., (2007), J Biol Chem. 282, 17486-17500）をビタミンＤ水酸化酵素をコードする核酸の周辺、好ましくは下流に連結してあってもよい。ＦＤＸ１遺伝子およびＦＤＲ１遺伝子以外にも、種々の電子供与体および電子供与体還元酵素のそれぞれをコードする遺伝子を用いることができる。したがって、ビタミンＤ水酸化酵素をコードする核酸は、プロモータ、ターミネータ、エンハンサー、分泌シグナル配列、電子伝達系酵素遺伝子などと機能的に連結されてベクターに挿入される。組換えベクターの作製は、モレキュラークローニング第２版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーの記載を参照するなどして、当業者に通常知られる方法で実施される。

組換えベクターを宿主細胞に導入して、形質転換体を作製することができる。このようにして作製された形質転換体は、ビタミンＤ水酸化酵素をコードする核酸が挿入された組換えベクターを含有する形質転換体である。

組換えベクターが導入される宿主細胞は、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。細菌細胞の例としては、放線菌、枯草菌等のグラム陽性菌または大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられ、好ましくは放線菌又は大腸菌である。この中で、放線菌として好ましいのは、Streptomyces lividans TK23株であり、大腸菌として好ましいのはＪＭ１０９株であるが、これらに限定されるものではない。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、カルシウムイオンを用いる方法等により行うことができる。哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞、ＣＨＯ細胞等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換するためには、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。

酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）またはサッカロマイセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）等が挙げられる。酵母宿主への組換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。

他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞を挙げることができる。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、通常知られる方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。

ビタミンＤ水酸化酵素は、ビタミンＤ水酸化酵素を発現する形質転換体を、ビタミンＤ水酸化酵素が発現する条件下で培養した後の、培養物及び／又は培養上清から得られる。ビタミンＤ水酸化酵素が形質転換体の細胞外に生成蓄積される場合は、例えば、通常知られる手段によって細胞を除いた後に培養上清を粗酵素として用いることができる。ビタミンＤ水酸化酵素が形質転換体の細胞内に生成蓄積される場合は、例えば、培養して得られた培養物を固液分離操作によって細胞と培養上清に分離し、得られた細胞を破砕したものを、粗酵素として用いることができる。固液分離には、通常知られる方法を制限なく利用することができ、例えば、培養物そのものをそのまま遠心分離する方法、培養物に濾過助剤を加えることや濾過助剤をプレコートしたプレコートフィルターなどにより濾過分離する方法、平膜、中空糸膜などを用いる膜濾過分離する方法などが採用される。細胞の破砕は、通常知られる方法を制限なく利用することができ、例えば、有機溶剤やリゾチームなどの酵素によって細胞を溶解する方法、超音波破砕法、凍結融解法、フレンチプレス法、ガラスビーズ破砕法、ダイノミル破砕法などを採用することができる。細胞破砕物を固液分離して得た分離液を、粗酵素として用いることもできる。さらに、固液分離した細胞は、破砕することなく、そのまま粗酵素として用いられ得る。

ビタミンＤ水酸化酵素の粗酵素は、そのままで使用することもできるが、精製して使用することもできる。例えば、ここに挙げるものに限定されるものではないが、得られた粗酵素を、熱処理の如く耐熱性の差を利用する方法、透析、限外ろ過、レジンカラム、ゲルろ過、ゲルろ過クロマトグラフィー及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の如く分子量の差を利用する方法、塩沈澱、硫安沈殿、アルコール沈殿及びその他の溶媒沈澱の如く溶解性の差を利用する方法、ＤＥＡＥ−トヨパール樹脂などを用いるイオン交換クロマトグラフィーの如く電荷の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーの如く特異的親和性を利用する方法、ブチルトヨパール樹脂などを用いる疎水クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィーの如く疎水性の差を利用する方法、吸着クロマトグラフィーの如く物理化学的な吸着性の差を利用する方法、等電点電気泳動及び等電点クロマトグラフィーなどの如く等電点の差を利用する方法などの通常知られる方法を単独または組み合わせて供することにより、工業用途の精製酵素を調製できる。

得られたビタミンＤ水酸化酵素の粗酵素及び精製酵素は、固定化することもできる。例えば、イオン交換体への結合法、樹脂及び膜などとの共有結合・吸着法、高分子物質を用いた包括法などを採用することができる。

（Ｃ）ビタミンＤ水酸化酵素によるビタミンＤから１α，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤへの水酸化
ビタミンＤ水酸化酵素は、下記式の通りに、ビタミンＤ₃から１α，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤ₃へ水酸化する触媒作用を有する。

化１で示した通り、ビタミンＤ水酸化酵素による水酸化は、ビタミンＤ₃→１α−ヒドロキシビタミンＤ₃→１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃→１α，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤ₃という過程と、ビタミンＤ₃→２５−ヒドロキシビタミンＤ₃→１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃→１α，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤ₃という過程の二通りが想定される。ただし、７３位のアルギニンがバリンに置換されており、かつ８４位のアルギニンがアラニン又はフェニルアラニンに置換されているアミノ酸配列を有するビタミンＤ水酸化酵素は、活性の強さが２５位水酸化活性＞１α位水酸化活性であるので、ビタミンＤ₃→２５−ヒドロキシビタミンＤ₃→１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃という過程を経由して、ビタミンＤ₃を１α，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤ₃へ変換すると考えられる。

ビタミンＤ水酸化酵素の活性は、後述する実施例に記載の方法により測定する。実施例に記載のビタミンＤ水酸化酵素の活性測定法では、ビタミンＤ水酸化酵素へ電子を供与する電子供与体及び該電子供与体を還元するための酵素として、ホウレン草由来のフェレドキシンおよびフェレドキシン還元酵素を用いる。例えば、放線菌由来のフェレドキシン及びフェレドキシン還元酵素、シュードモナスプチダ由来のプチダレドキシン及びプチダレドキシン還元酵素などもまた、ビタミンＤ水酸化酵素へ電子を供与する電子供与体となり得る。さらに、上記測定法では、反応の持続を意図して、反応が進むにつれて消費されるＮＡＤＰＨを再生するために、グルコース脱水素酵素およびグルコースを添加する。上記測定法におけるカタラーゼは、反応の持続を意図して、反応の副産物として生じる過酸化水素を分解し、及びＮＡＤＰＨを再生させるために添加している。したがって、カタラーゼの添加は、ＮＤＡＰＨ再生系の長時間反応を持続させることができる。ビタミンＤ水酸化酵素によるビタミンＤからの１α，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤの変換率は、反応後の高速液体クロマトグラフィーによる分析結果を基に、反応液に加えたビタミンＤのモル数当たりの１α，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤのモル数により求めることができる。

ビタミンＤ水酸化酵素によるビタミンＤの水酸化は、例えば、ビタミンＤ水酸化酵素を含む粗酵素やビタミンＤ水酸化酵素を主成分とする精製酵素を用いて生化学的にビタミンＤを水酸化する酵素変換による方法によって実施できる。また、ビタミンＤ水酸化酵素によるビタミンＤの水酸化は、例えば、菌体を用いる微生物変換による方法として実施できる。微生物変換による方法では、培養液の組成は限定されないが、増殖中の菌体培養液に直接基質を添加して培養を続ける方法（生菌体法）と、菌体を緩衝液に懸濁し、増殖させずにグルコースを添加して反応を進行させる方法（休止菌体法）がある。休止菌体法では、グルコースが菌体内に取り込まれるとＮＡＤＰＨが生成され、菌体内でビタミンＤの水酸化反応が進行する。

（Ｄ）酵素変換による１α，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤの製造方法
ビタミンＤ、ビタミンＤ水酸化体又はビタミンＤ及びビタミンＤ水酸化体を含む基質溶液に、粗酵素又は精製酵素としてのビタミンＤ水酸化酵素を作用させて、１α，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤを主成分として含む１α，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤ分離物を得ることにより、１α，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤを製造することができる。

１α，２５、２６−トリヒドロキシビタミンＤ分離物は、例えば、１α，２５、２６−トリヒドロキシビタミンＤを溶媒に溶解した後、各種クロマトグラフィー、イオン交換樹脂処理などの分離・精製手段を単独または適宜組み合わせて得ることができる。具体的には、１α，２５、２６−トリヒドロキシビタミンＤ分離物は、培養液に２〜６倍容、好ましくは４倍容のクロロホルム−メタノール混合液を添加し、激しく攪拌することにより回収した後、下記条件による高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供して、リテンションタイム５．５〜５．９分の溶出画分として得られる。カラム：ＯＤＳカラム、好ましくはＹＭＣ社製ＹＭＣ−ＰａｃｋＯＤＳ−ＡＭ（内径４．６ｍｍ×長さ３００ｍｍ）；検出波長：２６５ｎｍ；流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ；カラム温度：４０℃、溶出条件：水／アセトニトリル系；７０−１００％アセトニトリル直線濃度勾配（１５分間）の後、１００％アセトニトリル（２５分間）。クロロホルム−メタノール混合液に溶解させた１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤは、上記条件のＨＰＬＣに供すことにより、リテンションタイム９．３〜９．８分の溶出画分として得られる。したがって、上記条件のＨＰＬＣでは、１α，２５、２６−トリヒドロキシビタミンＤ分離物のリテンションタイムと１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤのリテンションタイムとの間に３．４分の間隔があり、さらに１α，２５、２６−トリヒドロキシビタミンＤ分離物を含む溶出画分のテーリングの影響も小さいことから、上記条件のＨＰＬＣによって、１α，２５、２６−トリヒドロキシビタミンＤ分離物は、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤを実質的に排除して分離することができる。クロロホルム−メタノール混合液におけるクロロホルム：メタノールの混合比は、例えば、３：１に設定することができる。１α，２５、２６−トリヒドロキシビタミンＤ分離物は、１α，２５、２６−トリヒドロキシビタミンＤを９５ｗ／ｖ％以上含んでおり、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤが１ｗ／ｖ％以下であるものが好ましい。

基質溶液に含めるビタミンＤは、ビタミンＤそのものを用いてもよいし、ビタミンＤ含有物（例えば、シイタケ抽出液や魚類肝臓抽出液）を用いてもよい。基質溶液に含めるビタミンＤとして好ましいのはビタミンＤ₃であり、これらを用いた場合に製造されるのは１α，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤ₃である。

ビタミンＤ水酸化体としては、上記ビタミンＤを水酸化したものであれば特に制限されないが、例えば、１α−ヒドロキシビタミンＤ、２５−ヒドロキシビタミンＤ、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤなどが挙げられ、好ましくは１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ、より好ましくは１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃である。

基質溶液には、ビタミンＤ水酸化酵素へ電子を供与する電子供与体及び電子供与体を還元するための酵素を含めることが好ましい。電子供与体及び電子供与体を還元するための酵素は、それぞれ、例えば、ホウレン草由来のフェレドキシンおよびフェレドキシン還元酵素、放線菌由来のフェレドキシン及びフェレドキシン還元酵素、シュードモナスプチダ由来のプチダレドキシン及びプチダレドキシン還元酵素などを用いることができ、好ましくはホウレン草由来のフェレドキシンおよびフェレドキシン還元酵素を用いる。さらに、基質溶液には、ＮＡＤＰＨ、グルコース脱水素酵素、グルコース、カタラーゼなどを含めることがより好ましい。

ビタミンＤ水酸化酵素の使用量は特に制限はないが、１α，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤの収率及び経済性の観点から、基質１ｇに対して、好ましくは０．１から５０単位であり、より好ましくは０．５から２０単位であり、さらに好ましくは０．８から５単位が好適である。基質量は、例えば、０．０１μＭ〜１００ｍＭ、好ましくは０．１μＭ〜１００μＭの間に設定することができる。電子供与体及び電子供与体を還元するための酵素の濃度は、ビタミンＤ水酸化酵素の活性が維持できる濃度であれば特に制限されないが、例えば、それぞれ０．１μｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ及び０．００１Ｕ／ｍｌ〜１００Ｕ／ｍｌの範囲の濃度を挙げることができるが、これらに限定されない。基質溶液に含めるＮＡＤＰＨ、グルコース脱水素酵素、グルコース、カタラーゼなどの濃度は、ビタミンＤ水酸化活性の際に用いるこれらの濃度を参照して、当業者により適宜選択可能である。

基質溶液の調製に用いる水性媒体としては、ビタミンＤ水酸化酵素による酵素触媒反応を妨げるものでなければ特に制限されないが、例えば、水、緩衝液などが挙げられる。緩衝液としては、例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液などが採用され、好ましくはトリス塩酸緩衝液、より好ましくはＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、ＥＤＴＡ緩衝液である。

前記反応はビタミンＤ水酸化酵素の水酸化活性がみられる温度で実施すれば特に制限はなく、例えば、２０〜４０℃が好ましく、２５〜３５℃がより好ましい。ｐＨはビタミンＤ水酸化酵素の最適条件下で行うことが好ましく、例えば、６．０〜８．０で行うのが適当である。上記条件で十分な１α，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤ生成が見られた時点で反応を終了するが、反応は通常数十分〜数十時間、好ましくは２０分〜１０時間程度で終了する。１α，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤの生成率は、酵素反応液の基質濃度、反応条件などによって異なる。

（Ｅ）微生物変換による１α，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤの製造方法
上記形質転換体を常法にしたがって適当な培地に接種し、ＮＡＤＰＨなどの還元型補酵素を加えることなく、ビタミンＤ及び／又はビタミンＤ水酸化体の存在下、好ましくはビタミンＤ及び／又はビタミンＤ水酸化体並びに包摂化合物の存在下、より好ましくはビタミンＤ及び／又はビタミンＤ水酸化体、包摂化合物並びにビタミンＤ水酸化酵素の発現を誘導する薬剤の存在下で培養することにより、１α，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤを製造することができる。微生物変換による１α，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤの製造方法は、以下の特徴がある：ＮＡＤＰＨを加えなくてもよい、ビタミンＤ水酸化反応と同時に触媒である菌体を増殖することができる（生菌体法）、増殖した菌体に対して精製などの処理を施さなくてもよい、菌体の保存が容易であることから菌体を繰り返し反応に使用できる、反応時間を１００時間以上とることができる、通常用いられる培地を利用することにより安価に工業的規模で大量生産ができる。

休止菌体を用いる場合、反応に使用する水性媒体としては水、緩衝液等が挙げられる。緩衝液としては酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、ＥＤＴＡ緩衝液等を用いることができる。

１α，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤの製造において使用する包摂化合物は、シクロデキストリン、ゼオライト（Ｎａ₁₂・Ａｌ₁₂Ｓｉ₁₂Ｏ₄₈）、フラーレン（Ｃ₆₀、Ｃ₇₀等）、クラウンエーテル又はカリックスアレーンが好ましく、シクロデキストリンがより好ましく、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンが特に好ましい。包摂化合物の濃度は、形質転換体がビタミンＤを１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤに変換することができる濃度であれば特に制限されないが、例えば、包摂化合物が２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである場合、終濃度は１０〜３０００ｍｇ／ｌが好ましく、１００〜２０００ｍｇ／ｍｌがより好ましい。生菌体法及び休止菌体法のいずれの場合もビタミンＤの濃度は、包摂化合物の濃度に比例して高めることができ、例えば、２０〜２０００ｍｇ／ｌに設定することができる。休止菌体法の場合、一般的にグルコースを含む緩衝液を用いて菌体内でＮＡＤＰＨを生産するが、菌体内にＮＡＤＰＨが生産され、電子伝達系が正常に機能するのであればよく、グルコース以外の化合物を使用することもできる。

上記形質転換体の培養に用いる栄養培地としては、炭素源、窒素源、無機物、および必要に応じ使用菌株の必要とする微量栄養素を程よく含有するものであれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。

上記形質転換体の培養に用いる栄養培地の炭素源としては、該形質転換体が資化しうる物であればよく、例えば、グルコース、マルトース、フラクトース、マンノース、トレハロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、デンプン、デキストリン、糖蜜などの糖質、またはクエン酸、コハク酸などの有機酸、またはグリセリンや脂肪酸も使用することができる。

上記形質転換体の培養に用いる栄養培地の窒素源としては、各種有機および無機の窒素化合物、さらに培地は各種の無機塩を含むことができる。たとえば、コーンスティープリカー、大豆粕、あるいは各種ペプトン類等の有機窒素源、及び塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、リン酸アンモニウム等の無機窒素源などの化合物が使用可能である。また、グルタミン酸などのアミノ酸および尿素などの有機窒素源が炭素源にもなることはいうまでもない。さらに、ペプトン、ポリペプトン、バクトペプトン、バクトソイトン、オキソイドマルトエキス、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、大豆粉、大豆粕、乾燥酵母、カザミノ酸、ソリュブルベジタブルプロテイン等の窒素含有天然物も窒素源として使用できる。

上記形質転換体の培養に用いる栄養培地の無機物としては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩などが適宜用いられる。具体的には、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等が用いられる。上記形質転換体の培養に用いる栄養培地のタンパク質成分としては、例えば、ＮＺ−ｃａｓｅやＮＺ−ａｍｉｎｅなどのカゼイン分解物が挙げられる。さらに、必要に応じて、アミノ酸ならびにビオチンおよびチアミンなどの微量栄養素ビタミンなども適宜用いられる。

培養法としては液体培養法（振とう培養法もしくは通気攪拌培養法）がよく、工業的には通気攪拌培養法が好ましい。培養温度とｐＨは、使用する形質転換体の増殖に適し、かつビタミンＤ水酸化酵素の活性が高くかつ安定した条件を選べばよい。たとえば、上記形質転換体が微生物の場合の培養は、通常、２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃、より好ましくは３０℃であり、ｐＨは５〜９、好ましくは６〜８から選ばれる条件で好気的に行われる。培養時間は微生物が増殖し始める時間以上であればよく、好ましくは８〜１５０時間であり、さらに好ましくは上記ビタミンＤ水酸化酵素が最大に生成している時間帯である。培養時には、１α，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤが生成していることを、培養上清をＨＰＬＣで分析するなどしてモニタリングすることが好ましい。ビタミンＤを基質とする培養において、１α，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤの生成量が最大に達する時間は、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤの生成量が最大に達する時間の後に見られる（図３を参照）。図３を参照すると、１α，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤを得るための培養時間は、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤの生成量が最大に達する時間の後２４時間以上あることが好ましい。

微生物の増殖を確認する方法は特に制限はないが、たとえば、培養物を採取して顕微鏡で観察してもよいし、吸光度で観察してもよい。また、培養液の溶存酸素濃度には特に制限はないが、通常は、０．５〜２０ｐｐｍが好ましい。そのために、通気量を調節したり、撹拌したり、通気に酸素を追加したりすればよい。培養方式は、回分培養、流加培養、連続培養または灌流培養のいずれでもよい。

上記形質転換体の培養において、組換えベクターに選択マーカーを含有させている場合などでは、選択マーカーに対応した抗生物質を栄養培地とともに加える。たとえば、選択マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子を含有する場合は、適当な濃度に調製したカナマイシン溶液を加える。

上記形質転換体を培養した後、培養物（液体分と形質転換体や不溶成分等の固形分とが混合したもの）に上記ビタミンＤ水酸化酵素の発現を誘導する薬剤を加える。発現を誘導する薬剤とは、例えば、チオストレプトンやイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）などを用いる。

以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。

１．ＣＹＰ１０５Ａ１変異体発現プラスミドの構築
野生型ＣＹＰ１０５Ａ１を大腸菌内で発現させるためのプラスミドは非特許文献１２及び１３に記載した方法にしたがって構築した。変異体をコードする遺伝子は変異体作成キットＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ^TM（ストラタジェン社）を使用し、それぞれの変異体に応じてプライマーＤＮＡ（２０ｍｅｒ程度）を用いた。プライマーの塩基配列を配列表の配列番号７〜２４に示した（表１を参照）。構築したプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９株に導入した。発現系におけるベクターと大腸菌宿主については特に限定されるものではない。

２．組換え大腸菌の培養及び細胞質画分の調製
それぞれの変異体を発現する組換え大腸菌は５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＴＢ培地（Sugimoto, H.et al., (2008), Biochemistry 47, 4017-4027）において３７℃で培養し、菌体濃度（Ｏ．Ｄ．_660nm）が０．５に達した時点でイソプロピル−チオーβ−Ｄ−ガラクトピラノシドを終濃度１ｍＭになるまで、及びδ−アミノレブリン酸を終濃度０．５ｍＭになるまで添加した。その後、４０〜５０時間２５℃で培養し、遠心分離により菌体を回収し、超音波破砕装置を用いて菌体を破砕し、遠心分離により細胞質画分を調製した。

３．変異体の定量
野生型および変異体の定量は吸収スペクトルを測定し４１７ｎｍにおける吸光度を求め、モル分子吸光係数１１０ｍＭ^-1ｃｍ^-1を用いて算出した。変異体の種類により発現量に違いが見られたが、培養液１Ｌあたりの発現量は１〜５μｍｏｌであった。

４．ＣＹＰ１０５Ａ１変異体の放線菌内での発現
変異体Ｒ７３Ｖ／Ｒ８４Ａを放線菌内で発現させ、組換え菌体を用いてビタミンＤ水酸化体を製造することを試みた。ＣＹＰ１０５Ａ１遺伝子の下流にはフェレドキシン（ＦＤＸ１）遺伝子を含んでいるが、フェレドキシン還元酵素遺伝子を含んでいないため、既存の放線菌内発現ベクターｐＩＪ６０２１のクローニング部位にStreptomyces coelicolor A3株由来のＦＤＲ１遺伝子を挿入し、その上流にＲ７３Ｖ／Ｒ８４Ａ＋ＦＤＸ１遺伝子を連結することを試みた。

ＣＹＰ１０５Ａ１＋ＦＤＸ１＋ＦＤＲ１遺伝子の取得は以下の方法で行なった。クローニングしやすいようにＣＹＰ１０５Ａ１＋ＦＤＸ１のＮ末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を、Ｃ末端にＰｓｔＩ部位を付加した配列表の配列番号２５及び２６に記載のプライマー（表２の１０５Ａ１Ｎ−ＨｉｎｄＩＩＩ、１０５Ａ１Ｃ−ＰｓｔＩ）を設計し、ｐｋｋ２２３−３にクローニングされているＣＹＰ１０５Ａ１＋ＦＤＸ１を鋳型として増幅した。またＦＤＲ１遺伝子はＮ末端にＰｓｔＩ部位を、Ｃ末端にＥｃｏＲＩ部位を付加した配列表の配列番号２７及び２８に記載のプライマー（表４ＦＤＲ１Ｎ−ＰｓｔＩ、ＦＤＲ１Ｃ−ＥｃｏＲＩ）を用いてStreptomyces coelicolor A3（非特許文献２を参照）よりＰＣＲで取得し、ＰｓｔＩ部位で両者を連結してＣＹＰ１０５Ａ１＋ＦＤＸ１＋ＦＤＲ１遺伝子を取得し、ｐＵＣ１９ベクターに結合した。

ＰＣＲはＫＯＤｐｌｕｓ（東洋紡社製）を使用し、９４℃で１５秒間、６１℃で３０秒間、６８℃で１分３０秒間からなる反応工程を１サイクルとして３０サイクル行なった後、６８℃で７分間反応させる条件で行なった。さらに放線菌の制限修飾系を避けるためにメチル化欠損株大腸菌ＳＣＳ１１０株を形質転換してプラスミドを構築した。前記した通り、ｐＵＣ１９のＨｉｎｄＩＩ、ＥｃｏＲＩサイトにいったんクローニングし、そこからＨｉｎｄＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片を切り出してｐＩＪ６０２１のＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩサイトに連結した。次に、ＣＹＰ１０５Ａ１＋ＦＤＸ１＋ＦＤＲ１遺伝子を含むＤＮＡ断片を放線菌用ベクターｐＩＪ６０２１のＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩサイトに連結し、ＰｒａｃｔｉｃａｌＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓＧｅｎｅｔｉｃｓ（ＩＳＢＮ０−７０８４−０６２３−８）に記載の方法を用いてStreptomyces lividans TK23株のプロトプラストに導入し、Ｒ５再生培地に塗布した。１６時間後に、カナマイシン（最終濃度１０μｇ／ｍＬ）を含む軟寒天培地を重層した後、３０℃で３日間培養し、カナマイシン耐性株を取得した。

５．組換え放線菌の培養
１％ｓｏｌｕｂｌｅｓｔａｒｃｈ、０．５％ｇｌｕｃｏｓｅ、０．３％ＮＺ−ｃａｓｅ、０．２％Ｄｉｆｃｏｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ、０．５％ＤｉｆｃｏＢａｃｔｏ−ｐｅｐｔｏｎｅ、０．１％ＫＨ₂ＰＯ₄、０．０５％ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．３％ＣａＣＯ₃よりなる培地（滅菌前ｐＨ７．０）を１０ｍＬずつ１００ｍＬ容の試験管に分注し、１２１℃、２０分間滅菌した。この培地にＢｅｎｎｅｔｔ’ｓ寒天培地（０．１％Ｄｉｆｃｏｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ、０．１％Ｍｅａｔｅｘｔｒａｃｔ、０．２％ＮＺ−ａｍｉｎｅ、１％ｍａｌｔｏｓｅ、２％ａｇａｒ）に生育させた形質転換体をかき取って接種し、３０℃で２日間振盪培養し、種培養液とした。本培養は３種類の培地のいずれかを用いて行なった：（１）種培養液と同様の組成の培地；（２）１．５％ｇｌｕｃｏｓｅ、１．５％ＤｉｆｃｏｂａｃｔｏＳｏｙｔｏｎｅ、０．５％Ｃｏｒｎｓｔｅｅｐｌｉｑｕｏｒ、０．５％ＮａＣｌ、０．２％ＣａＣＯ₃よりなる培地（滅菌前のｐＨ７．０）；（３）ＹＥＭＥ培地（０．３％Ｄｉｆｃｏｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ、０．５％ＤｉｆｃｏＢａｃｔｏ−ｐｅｐｔｏｎｅ、０．３％ｏｘｏｉｄｍａｌｔｅｘｔｒａｃｔ、１％ｇｌｕｃｏｓｅ、３４％ｓｕｃｒｏｓｅ、５ｍＭＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ。これらの培地をＫ型フラスコ（５００ｍＬ容）に１００ｍＬずつ分注し、１２１℃で２０分間滅菌し、種培養液をそれぞれ１％接種し、３０℃、２００回転／分で培養した。

６．Ｒ７３Ｖ／Ｒ８４Ａを発現する放線菌を用いたビタミンＤ ₃ の変換と各代謝物の経時変化
変異体Ｒ７３Ｖ／Ｒ８４Ａ＋ＦＤＸ１＋ＦＤＲ１遺伝子をｐＩＪ６０２１ベクターに連結し、放線菌Streptomyces lividans TK23株に組込んだ形質転換体を前記（２）の培地を用いて２４時間培養した後、１００ｍｌ培養液中にチオストレプトンを１ｍｇ添加し、さらに２４時間培養を続けた後、０．２ｇ／ｍＬの２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン水溶液を１ｍｌ添加し、また、４ｍｇ／ｍＬのビタミンＤ₃エタノール溶液を０．５ｍｌ添加し、９６時間培養を続けた。次に、培養液に２倍容のクロロホルム：メタノール＝３：１を添加し、激しく攪拌した後、クロロホルム層を回収し、減圧乾固し、アセトニトリルに溶解した。培養２４時間後の代謝物をＨＰＬＣ分析（条件：カラム：ＹＭＣ社製ＹＭＣ−ＰａｃｋＯＤＳ−ＡＭ（内径４．６ｍｍ×長さ３００ｍｍ）；検出波長：２６５ｎｍ；流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ；カラム温度：４０℃、溶出条件：水／アセトニトリル系；７０−１００％アセトニトリル直線濃度勾配（１５分間）の後、１００％アセトニトリル（２５分間））した結果を図１に示す。ＲＴ５．７ｍｉｎ付近に見られたピークを代謝物Ｍ３由来のピークとした。

７．代謝物Ｍ３の構造の推定
代謝物Ｍ３の構造を決定するために、ＬＣ−ＭＳ分析とＮＭＲ分析を行った。ＬＣ−ＭＳについてはＦｉｎｎｉｇａｎＬＣＱＡＤＶＡＮＴＡＧＥＭＩＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用い、ＡＰＣＩ法、ｐｏｓｉｔｉｖｅｍｏｄｅで行った。ＬＣ条件は以下のとおりである。カラム；ＯＤＳ（２ｍｍ×１５０ｍｍ，ＤｅｖｅｌｏｓｉｌＯＤＳ−ＨＧ−３，ＮｏｍｕｒａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．Ｌｔｄ．，Ａｉｃｈｉ，Ｊａｐａｎ）；移動相，アセトニトリル：メタノール：水＝３：４：３；流速，０．２ｍＬ／ｍｉｎ；ＵＶ検出，２６５ｎｍ．

図２にＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す。分子イオンピーク（Ｍ＋Ｈ）はｍ／ｚ＝４３３であり、代謝物Ｍ３の分子量は４３２であることがわかった。１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃（１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃）の分子量４１６と比較すると、１６マス大きいことがわかった。すなわち、Ｍ３は１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃にさらに水酸基が付加した構造であることが示唆された。

次に、１Ｈ−ＮＭＲを行い、１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃のチャートと比較した。その結果、１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃では、１．２ｐｐｍに、２６位、２７位のＣＨ₃基帰属のシングルピークが６Ｈ存在したのに対し、Ｍ３で同じ位置のピークが消滅していたことから、Ｍ３は１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の２６位（２７位）に水酸基が付加した構造、すなわち１α，２５，２６（ＯＨ）₃Ｄ₃であると推定した。

基質添加後の各代謝物の経時変化を図３に示す。２５（ＯＨ）Ｄ₃は２４時間における濃度が７．８ｍｇ／Ｌ（変換率３９％）と最高値を示し、４８時間において減少し（変換率２３％）それ以降、濃度はほとんど変化しなかった。一方、１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃は７２時間まで増え続け、９６時間では若干減少した。１α，２５，２６（ＯＨ）₃Ｄ₃については９６時間まで直線的に増加した。９６時間後の濃度は、２５（ＯＨ）Ｄ₃が４．７ｍｇ／Ｌ（変換率２４％）、１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃は３．０ｍｇ／Ｌ（変換率１５％）、１α，２５，２６（ＯＨ）₃Ｄ₃は２．０ｍｇ／Ｌ（変換率１０％）であった。

８．１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ ₃ 水酸化活性測定
活性は１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭＥＤＴＡ緩衝液中で、以下のものを含む再構成系を用いて１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃に対する活性を測定した。基質：１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃（終濃度０．５〜１０μＭ）；０．２μＭシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ１０５変異体を含む組み換え大腸菌細胞質画分）；０．１ｍｇ／ｍｌホウレン草由来フェレドキシン（Ｆｄｘ）、０．１Ｕ／ｍｌホウレン草由来フェレドキシン還元酵素（Ｆｄｒ）、１Ｕ／ｍｌグルコース脱水素酵素；１％グルコース；０．１ｍｇ／ｍｌカタラーゼ。

反応は終濃度１ｍＭになるまでＮＡＤＰＨを添加して３０℃で反応を開始し、３０℃で１０〜６０分反応させ、反応液の四倍容のクロロホルム：メタノール＝３：１を添加し、激しく攪拌した後、代謝物を高速液体クロマトグラフィーにより分析した。条件は以下のとおりである：カラム：ＹＭＣ社製ＹＭＣ−ＰａｃｋＯＤＳ−ＡＭ（内径４．６ｍｍ×長さ３００ｍｍ）；検出波長：２６５ｎｍ；流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ；カラム温度：４０℃、溶出条件：水／アセトニトリル系；７０−１００％アセトニトリル直線濃度勾配（１５分間）の後、１００％アセトニトリル（２５分間）

その結果、ＣＹＰ１０５Ａ１変異体Ｒ７３Ｖ／Ｒ８４Ａ及びＲ７３Ａ／Ｒ８４Ａにおいて１α，２５，２６（ＯＨ）₃Ｄ₃と考えられる代謝物が検出された。図４は、上記の条件のもと、基質１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃濃度１０μＭで３０分反応させた後、代謝物をＨＰＬＣで分析した結果であり、変換率は２．５％であった。したがって、Ｒ７３Ｖ／Ｒ８４Ａを発現する組み換え放線菌において見られた１α，２５，２６（ＯＨ）₃Ｄ₃はＲ７３Ｖ／Ｒ８４Ａによって生産されたと考えられ、ＣＹＰ１０５Ａ１変異体は図５に示すような経路でビタミンＤ₃を１α，２５，２６（ＯＨ）₃Ｄ₃に変換することがわかった。

１α，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤは、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤと比べて、カルシウム作用が弱く、かつ癌細胞の増殖を抑制する作用が強いことから、副作用の少ない、癌や乾癬などの治療及び／又は予防のための医薬の有効成分としての利用が期待できる。

Claims

ビタミンＤ及びビタミンＤ水酸化体からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物を含む基質溶液に、下記（ａ）〜（ｂ）のいずれか１種のアミノ酸配列を有し、かつ下記（ｄ）の活性を有するビタミンＤ水酸化酵素を作用させて、１α，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤを主成分として含む１α，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤ分離物を得ることを特徴とする、１α，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤの製造方法。
（ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、
７３位のアルギニンがアラニン、バリン又はロイシンに、及び８４位のアルギニンがアラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、又はグルタミンに置換された、改変アミノ酸配列
（ｂ）前記改変アミノ酸配列において、前記７３位のアルギニン及び８４位のアルギニンの置換の他さらに、１から９個のアミノ酸の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の修飾を有するアミノ酸配列
（ｄ）０．２μＭビタミンＤ水酸化酵素を、０．１ｍｇ／ｍｌフェレドキシン、０．１Ｕ／ｍｌフェレドキシン還元酵素、１Ｕ／ｍｌグルコース脱水素酵素、１％グルコース、０．１ｍｇ／ｍｌカタラーゼ及び１ｍＭＮＡＤＰＨを含む１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）−１ｍＭＥＤＴＡ緩衝液中の１０μＭ１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃に、３０℃、３０分間作用させた場合の１α，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤ₃への変換率は０．１％以上である
前記１α，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤ分離物が、クロロホルム−メタノール混合液に溶解された後、下記条件のＨＰＬＣに供して、リテンションタイム５．５〜５．９分の溶出分画に含まれる化合物として得られる、請求項１に記載の製造方法。
カラム：ＯＤＳカラム；
検出波長：２６５ｎｍ；
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ；
カラム温度：４０℃；
溶出条件：７０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液からアセトニトリルまでのアセトニトリル直線濃度勾配（１５分間）
前記ビタミンＤ水酸化酵素が、形質転換体内で発現するビタミンＤ水酸化酵素である、請求項１又は２に記載の製造方法。
前記形質転換体の宿主が、大腸菌又は放線菌である、請求項３に記載の製造方法。
前記基質溶液が、電子供与体及び該電子供与体を還元するための酵素をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
前記電子供与体及び前記電子供与体を還元するための酵素が、それぞれ、フェレドキシン及びフェレドキシン還元酵素、又はプチダレドキシン及びプチダレドキシン還元酵素である、請求項５に記載の方法。
前記改変アミノ酸配列が、
７３位のアルギニンがアラニン又はバリンに、及び８４位のアルギニンがアラニン、バリン、又はフェニルアラニンに置換された配列である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
前記ビタミンＤがビタミンＤ₂又はビタミンＤ₃であり、かつ前記ビタミンＤ水酸化体がビタミンＤ₂水酸化体又はビタミンＤ₃水酸化体である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
前記ビタミンＤ水酸化体が、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
前記ビタミンＤ水酸化体が、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
前記基質溶液が、包摂化合物をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の製造方法。
前記包摂化合物が、シクロデキストリン、ゼオライト、フラーレン、クラウンエーテル又はカリックスアレーンである、請求項１１に記載の製造方法。