KR100511734B1 - 광학활성화합물의제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 4(S)-4-히드록시-2-케토글루타르산 알도라아제 유전자를 코딩하는 DNA 단편을 함유한 재조합 DNA 를 수반하는 재조합 미생물을 이용한, 산업적으로 유리한 (S)-4-히드록시-2-케토글루타르산의 제조 방법 및 전구체 (S)-4-히드록시-2-케토글루타르산으로부터 생합성에 의해 형성되는 화합물, 예컨데 (2S,4S)-4-히드록시-L-글루타민산 및 (2S,4S)-4-히드록시-L-프롤린과 같은 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

광학 활성 화합물의 제조 방법{METHOD FOR PRODUCING OPTICALLY ACTIVE COMPOUND}
본 발명은 (S)-4-히드록시-2-케토글루타르산의 제조 방법 및 전구체 (S)-4-히드록시-2-케토글루타르산으로부터 형성될 수 있는 화합물, 예컨데 (2S,4S)-4-히드록시-L-글루타민산 및 (2S, 4S)-4-히드록시-L-프롤린과 같은 화합물의 제조 방법에 관한 것이다. (2S, 4S)-4-히드록시-L-프롤린은 항-종양세포 활성 [Cancer Res. 48., 2483 (1988)] 및 항-비만세포 활성 (일본 공개 공보 제 63-218621 호) 을 포함한 생물학적 활성을 갖는다. (S)-4-히드록시-2-케토글루타르산 및 (2S, 4S)-4-히드록시-L-글루타민산은 (2S, 4S)-4-히드록시-L-프롤린의 제조에 유용하다.
(S)-4-히드록시-2-케토글루타르산의 통상적인 제조 방법으로서, 트레오-4-히드록시-L-글루타민산의 화학적 탈아민화 [Methods in Enzymology, 17 part B, 275] 를 비롯해 여러가지 방법이 공지되어 있다.
본 발명자들은 이미 피루브산으로부터 (S)-4-히드록시-2-케토글루타르산을 생성시키는 활성을 가진 생체촉매를 글리옥실산 및 피루브산 또는 생체촉매의 작용을 통해 피루브산으로 전환가능한 화합물에 작용시키는 (예컨데, 제공하는) 것을 포함하는, (S)-4-히드록시-2-케토글루타르산의 제조 방법을 개시하였다 (일본 공개 공보 제 7-289284 호). 통상적으로 공지된 방법들과 비교해, 상기 방법은 산업적으로는 훨씬 더 유리하지만, 저가의 글루코스가 기질로써 사용될 경우 (S)-4-히드록시-2-케토글루타르산의 축적이 적어지고, 20mM 이상의 (S)-4-히드록시-2-케토글루타르산의 축적도를 수득하려면 반드시 고가의 피루브산을 기질로써 사용해야만 한다는 점에서 불리한다.
하기와 같은 (2S, 4S)-4-히드록시-L-글루타민산의 통상적인 제조 방법이 공지되어 있다; 글루타메이트 탈수소효소를 암모니아 및 NADPH 의 존재하에 화학적으로 합성된 DL-4-히드록시-2-케토글루타르산에 작용토록 하고 생성된 4(R)- 및 4(S)-4-히드록시-글루타민산을 이온교환 크로마토그래피로 분리하는 것을 포함하는 방법; 식물 (Phlox decussata) 에서 (2S, 4S)-4-히드록시-L-글루타민산을 추출하는 것을 포함하는 방법 [Methods in Enzymology, 17 part B, 277]; 및 트랜스아미나제를 L-4-히드록시-2-케토글루타르산 및 시스테인 술핀산에 작용토록 하는 것을 포함하는 방법 [Tetrahedron Letters, 28, 1277 (1987)].
본 발명자들은 이미 아미노기 공여체의 존재하에 피루브산 및 글리옥실산으로부터 (2S, 4S)-4-히드록시-L-글루타민산을 생성시키는 활성을 가진 생체촉매를 글리옥실산 및 피루브산 또는 피루브산으로 전환가능한 화합물에 작용시키는 (예컨데, 제공하는) 것을 포함하는 (2S, 4S)-4-히드록시-L-글루타민산의 제조 방법을 공개한 바 있다 (일본 공개 공보 제 8-80198 호). 상기 방법은 단지 4(S) 형만이 제조될 수 있다는 점에서 산업적으로 유리하다; 그러나, 상기 방법은 (2S, 4S)-4-히드록시-L-글루타민산을 대량 생산하기 위해서 (S)-4-히드록시-L-케토글루타민산의 합성 단계 후 또다른 박테리아를 (S)-4-히드록시-L-케토글루타민산에 첨가하여 (S)-4-히드록시-L-케토글루타민산을 (2S, 4S)-4-히드록시-L-글루타민산으로 전환시키는 단계를 추가로 요구한다는 점에서 힘들고 불리하다.
통상적인 (2S, 4S)-4-히드록시-L-프롤린의 제조방법으로는 하기 방법들이 공지되어 있다; 헬리코세라스 (Helicoceras) 또는 아크로실린드리움 (Acrocylindrium) 속의 미생물을 배양하고 배양액에서 프롤린을 추출하는 것을 포함하는 방법 (일본 공개 공보 제 5-111388 호); 및 4-히드록시-2-케토글루타르산을 4-히드록시-L-프롤린으로 전환시키는 활성을 가진 미생물을 4-히드록시-2-케토글루타르산에 작용시키는 (예컨데, 제공하는) 것을 포함하는 방법 (일본 공개 공보 제 3-266996 호); 및 그 밖의 방법. 그러나, 전자의 방법은 수율이 낮고 후자의 방법은 동시 생성되는 4(S) 형 및 4(R) 형의 분리 및 정제의 힘든 과정을 요구하기 때문에, 상기 방법들의 산업상 이용은 어렵다.
본 발명의 목적은 (S)-4-히드록시-2-케토글루타르산 및 전구체 (S)-4-히드록시-2-케토글루타민산으로부터 생성되는 화합물, 예컨데 (2S,4S)-4-히드록시-L-글루타민산 및 (2S,4S)-4-히드록시-L-프롤린을 산업적으로 유리하게 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명은 (S)-4-히드록시-2-케토글루타레이트 알도라제를 코딩하는 DNA 단편 (이하 "KAL 유전자"로 약칭) 을 함유한 재조합 DNA 를 수반하는 재조합 미생물을 수성 배지내에서 아미노기 공여체의 존재 또는 부재하에 당 및 글리옥실산에 작용시키고 (예컨데, 제공하고), 상기 수성 배지내에서 생성된 광학 활성 (S)-4-히드록시-2-케토글루타르산 또는 전구체 (S)-4-히드록시-2-케토글루타르산 (이하 "4(S)KHG 라 약칭) 로부터 생성된 화합물을 수합하는 것을 특징으로 하는 광학 활성 화합물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 (S)-4-히드록시-2-케토글루타르산 (4(S)KHG) 의 제조 방법 또는 전구체 4(S)KHG 로부터 형성될 수 있는 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.
전구체 (S)-4-히드록시-2-케토글루타르산으로부터 생성될 수 있는 화합물로는 (2S, 4S)-4-히드록시-L-글루타민산 [이하 "4(S)HG" 로 약칭], (2S, 4S)-4-히드록시-L-프롤린 [이하 "4(S)HYP" 로 약칭], (S)-4-히드록시-L-글루타민, (S)-4-히드록시-L-아르기닌, (S)-4-히드록시-L-오르니틴 등이 포함된다. (S)-4-히드록시-L-글루타민, (S)-4-히드록시-L-아르기닌, (S)-4-히드록시-L-오르니틴은 동물용 사료 첨가제로 유용하다.
본 발명에 따르면, 상기 화합물은 KAL 유전자를 함유한 재조합 DNA 를 수반하는 미생물을 사용하여 직접 형성될 수 있다 (즉, 중간체로써 전구체 4(S)KHG 가 형성될 필요가 없다). 또는, 미생물을 생체촉매로써 사용하여 전구체 4(S)KHG 를 상기 화합물로 전환시킬 수 있다. 여기서 전구체 4(S)KHG 로부터의 화합물이란, 상기 화합물 형성 기법중 어느 하나를 이용해 생성된 화합물을 의미한다.
KAL 유전자를 함유한 재조합 DNA 를 수반하는 미생물을 이용한 4(S)KHG, 4(S)HG 및 4(S)HYP 의 제조 방법이 아래에 기재되어 있다.
KAL 유전자는 에쉐리키아 (Escherichia), 슈도모나스 (Pseudomonas), 파라코커스 (Paracoccus), 프로비덴시아 (Providencia), 리조비움 (Rhizobium) 또는 모르가넬라 (Morganella) 속의 미생물에서 유래된 유전자를 포함하고; KAL 유전자는 바람직하게는 에쉐리키아 속에서 유래한 유전자이다. KAL 유전자를, 예컨데, 에쉐리키아 속으로부터 회수하는 방법을 이제 구체적으로 기재한다.
4-히드록시-2-케토글루타레이트 알도라제 활성을 가진 미생물, 예컨데 E. Coli 균주 W3110 (ATCC 14948) 로부터, 통상적인 방법 [Biochim. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)] 으로 염색체 DNA 를 제조한다. 참고문헌 [R.V. Patil 및 E.E. Dekker, J. Bacteriol. 174, 102 (1992)] 에 기재된 뉴클레오티드 서열을 기초로, 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성한다. 이어서, 생성된 염색체 DNA 주형에 대해 중합효소 연쇄 반응 (이하 "PCR" 로 약칭) [R.F. Saiki 등, Science 230, 1350 (1985)] 을 수행하여 상기 유전자를 수득한다.
KAL 유전자를 숙주, 예컨데 에쉐리키아 콜라이 (Escherichia Coli) 내로 도입하기 위해, 자율 복제될 수 있거나 또는 숙주 미생물의 염색체내로 유전자를 혼입시킬 수 있는 벡터라면, 파지 벡터, 플라스미드 벡터 등을 포함해 어떠한 벡터든지 사용될 수 있다. 에쉐리키아 콜라이 숙주에 적합한 벡터로는 pBR322, pUC119, pACY184 및 trp 프로모터를 수반하는 pTrS33 (일본 공개 공보 제 2-227075 호) 가 포함된다. 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속의 미생물 숙주에 적합한 벡터로는 pCG1 에서 유래한 벡터가 포함된다.
KAL 유전자에서 유래한 재조합 DNA 및 벡터 DNA 는, 동일한 제한효소 부위를 갖는 제한 효소로 두 DNA 를 시험관내에서 절단하고, 절단된 생성물을 DNA 리가아제로 결찰시킴으로써, 각종 재조합 혼합물과 함께 제조될 수 있다. 생성된 재조합 혼합물을 사용해, 숙주 미생물을 형질전환시키고, 피루브산 및 글리옥실산으로부터 4(S)KHG 를 생성하는 반응을 촉매하는 활성을 가진 형질전환체 균주를 선택함으로써 재조합 DNA를 균주로부터 수득할 수 있다. 상기 재조합 DNA 로는 구체적으로 pKSR101, pKSR125 및 pKSR601 가 포함된다. 형질전환은 공지된 방법, 예컨데 문헌[Molecular Cloning, T. Maniatis 등, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982] 에 기재된 분자 클로닝에 따라 실행될 수 있다.
KAL 유전자를 함유한 재조합 DNA 를 수반하는 재조합 미생물은, 유전 정보를 수반하는 DNA 단편을 벡터 DNA 내로 혼입시켜 재조합 DNA 를 제조하고, 이어서 생성된 재조합 DNA 로 숙주 미생물을 형질전환시킴으로써 제조될 수 있다. 상기 숙주 미생물로써, 재조합 DNA 가 혼입될 수 있고, 유전 정보를 기초로 피루브산 및 글리옥실산으로부터 4(S)KHG 가 생성되는 반응을 촉매하는 효소 활성을 발현할 수 있는 미생물이라면 어떠한 미생물이든지 사용할 수 있다. 상기 미생물로는, 예컨데, 에쉐리키아 또는 코리네박테리움 속의 미생물이 포함된다. 보다 구체적으로, 상기 미생물로는 예컨데 에쉐리키아 콜라이 K-12 의 균주 ATCC 33625, 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032, 및 코리네박테리움 아세토아시도필룸 (Corynebacterium acetoacidophilum) FERM P-4962 가 포함된다.
KAL 유전자를 함유한 재조합 DNA 를 수반하는 재조합 미생물을 사용해 4(S)KHG, 4(S)HG 또는 4(S)HYP 를 제조하기 위해서, 리포에이트 요구성을 갖거나 또는 말산 합성효소 활성의 감소 또는 상실을 갖는 것 중 하나 이상의 특성을 갖는 미생물이 숙주 미생물로써 바람직하게 사용된다.
상기 미생물로써, 예컨데 에쉐리키아 또는 코리네박테리움 속의 미생물을 포함해, 재조합 DNA 가 혼입될 수 있고, 유전 정보를 기초로 피루브산 및 글리옥실산으로부터 4(S)KHG 가 생성되는 반응을 촉매하는 효소 활성을 발현할 수 있는 어떠한 미생물도 사용할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 미생물로는 예컨데 에쉐리키아 콜라이 K-12 의 균주 ATCC 33625, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032, 및 코리네박테리움 아세토아시도필룸 FERM P-4962 가 포함된다.
보다 구체적으로, 에쉐리키아 콜라이 K-12 계통의 아주 NHK40 [리포에이트 요구성(lip), 4KAL 결실 (eda)] 를 사용할 수 있다. 균주 NHK40 은 부다페스트 조약하에 1997년 4월 16일자로 일본 공업기술원 생명공학공업기술연구소에 FERM-BP 5919 로 기탁되었다.
4(S)HG 를 제조하는데 있어서, 포스포에놀피루베이트 카르복실라아제 활성이 결실된 미생물이 숙주 미생물로써 바람직하게 사용된다.
상기 미생물로써, 예컨데 에쉐리키아 또는 코리네박테리움 속 미생물을 포함해, 재조합 DNA 가 혼입될 수 있고, 유전 정보를 기초로 피루브산 및 글리옥실산으로부터 4(S)KHG 가 생성되는 반응을 촉매하는 효소 활성을 발현할 수 있는 어떠한 미생물도 사용할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 미생물로는, 예컨데 에쉐리키아 콜라이 K-12 의 균주 ATCC 33625, 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 ATCC 13032, 및 코리네박테리움 아세토아시도필룸 FERM P-4962 가 포함된다.
보다 구체적으로, 에쉐리키아 콜라이 K-12 계통의 아주 NHK46 [lip, eda, 말산 합성효소 결실 (glc), 포스포에놀피루베이트 카르복실레이트 결실 (ppc)] 을 사용할 수 있다. 에쉐리키아 콜라이 NHK46 은 부다페스트 조약하에 1997년 4월 16일자로 일본 공업기술원 생명공학공업기술연구소에 FERM-BP 5920 로 기탁되었다.
이와는 달리, 4(S)HYP 를 제조하려면 리포에이트 요구성, 말산 합성효소 활성의 감소 또는 결실 및 포스포에놀피루베이트 카르복실라아제 활성의 결실과 같은 특성 중 하나 이상을 가지며 프롤린 유사체에 내성을 가진 미생물이 보다 바람직하게 사용된다. 상기 프롤린 유사체로는 아제티딘-2-카르복실산, 3,4-데히드로프롤린 및 티오프롤린이 포함된다.
상기 미생물로써, 예컨데 에쉐리키아 또는 코리네박테리움 속의 미생물을 포함해, 재조합 DNA 가 혼입될 수 있고, 유전 정보를 기초로 피루브산 및 글리옥실산으로부터 4(S)KHG 가 생성되는 반응을 촉매하는 효소 활성을 발현할 수 있는 어떠한 미생물도 사용할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 미생물로는 에쉐리키아 콜라이 K-12 의 균주 ATCC 33625, 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 ATCC 13032 및 코리네박테리움 아세토아시도필룸 FERM P-4962 가 포함된다.
보다 구체적으로, 에쉐리키아 콜라이 K-12 계통의 아주 NHK47 [lip, eda, glc, ppc, 및 항-아제티딘-2-카르복실레이트 내성을 가짐] 이 언급되었다. 에쉐리키아 콜라이 균주 NHK47 은 부다페스트 조약하에 1997년 4월 16일자로 일본 공업기술원 생명공학공업기술연구소에 FERM-BP 5921 로 기탁되었다.
상기 언급된 각종 결실 균주 또는 내성 균주는 상기 기재된 특성을 갖는 야생형 균주이거나, 또는 상기 특성을 갖지 않는 그들의 모균주를 통상적인 변이 방법, 즉 예컨데 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 (NTG), UV 조사 또는 γ 선 조사와 같은 변이제로 처리하고, 생성된 균주를 적절한 아가 플레이트 배지 위에 도포하고, 성장한 변이주를 채취하여, 모균주와 비교해 목적 효소 활성의 결실 또는 감소가 일어난 균주를 선택하거나 또는 모균주보다 유사체에 더 내성적인 균주를 채취하는 방법으로 처리함으로써 수득할 수 있다. 파지 P1 을 사용해, 목적 결실 또는 내성 변이를 갖는 균주로부터 원하는 균주내로 결실변이를 이전 (형질도입) 시키므로써 에쉐리키아 콜라이 K-12 의 균주에 있어서 각종 결실 변이주 및 내성 변이주를 회수할 수 있다 [J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1972)].
본 발명에 따라 사용될 미생물은 통상적인 배양 방법에 의해 배양될 수 있다. 상기 배양에 사용될 배양 배지는, 사용될 미생물에 의해 동화될 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 함유하여 미생물이 효율적으로 배양될 수 있는 배지라면 어떠한 천연 배지 또는 합성 배지든 사용될 수 있다. 글루코스, 프룩토스, 수크로스, 말토스, 전분, 전분 가수분해물, 및 당밀과 같은 당; 아세트산, 락트산 및 글루콘산과 같은 유기산; 또는 에탄올 및 프로파놀과 같은 알코올을 포함하여,사용될 미생물에 의해 동화될 수 있는 탄소원이라면 어떠한 것도 사용가능하다. 암모니아, 암모늄 술페이트, 암모늄 클로라이드, 및 암모늄 포스페이트와 같은 무기염; 유기산의 암모늄 염, 펩톤, 카세인 가수분해물, 육류 추출물, 효모 추출물, 옥수수 침지액, 콩 겨, 콩 겨 가수분해물, 각종 발효성 박테리아 및 상기 박테리아의 분해 생성물을 포함하여, 상기 미생물에 의해 동화될 수 있는 질소원이라면 어떠한 것도 사용가능하다. 인산 칼륨, 황산 암모늄, 염화 암모늄, 염화 나트륨, 황산 마그네슘, 황산 철 및 황산 망간을 포함해, 미생물에 의해 동화될 수 있는 무기염이라면 어떠한 것도 사용가능하다. 추가로, 칼슘, 아연, 붕소, 구리, 코발트 및 몰리브덴의 염을 미량 원소로써 첨가할 수 있다. 필요하다면, 배양 배지는 예컨데 티아민 및 비오틴과 같은 비타민, 글루타민산 및 아스파르트산과 같은 아미노산, 및 아데닌 및 구아닌과 같은 핵산-관련 물질을 함유할 수 있다. 배양은 호기성 조건하에 교반 배양 또는 심부 통기 교반 배양에 의해 수행된다. 상기 배양은 바람직하게 20 내지 45℃ 에서 10 내지 96 시간동안 pH 5.0 내지 9.0 에서 수행된다. pH 는 무기 또는 유기산, 알칼리성 용액, 요소, 탄산 칼슘, 및 암모니아로 조정된다. 상기 생성된 배양액을 그 자체로 목적 반응에 사용할 수 있다; 이와는 달리, 배양액을 처리하고, 처리된 생성물을 추후 반응시킬 수도 있다. 처리된 생성물로는 축합 및 건조된 생성물, 동결-건조된 생성물, 계면활성제-처리된 생성물, 유기용매-처리된 생성물, 열 처리된 생성물, 효소 처리된 생성물, 배양액의 초음파-처리된 생성물 및 기계 분쇄-처리된 생성물, 및 박테리아의 고정화 생성물 또는 박테리아의 처리된 생성물의 형태가 포함된다.
본 발명에서 사용되는 수성 배지의 예로는 물; 포스페이트, 카보네이트, 아세테이트, 보레이트, 시트레이트, 및 트리스와 같은 완충액; 및 메탄올 및 에탄올과 같은 알코올을 포함한 유기 용매를 함유하는 수용액; 에틸 아세테이트와 같은 에스테르; 아세톤과 같은 케톤; 및 아세타미드와 같은 아미드가 포함된다. 필요하다면, 더 나아가, 트리톤 X-100 (Nacalai Tesque, Inc.) 및 노니온 HS204 (NOF Corporation) 과 같은 계면활성제, 또한 톨루엔 및 크실렌과 같은 유기 용매를 약 0.1 내지 20 g/리터 가량 배지에 첨가할 수 있다.
본 발명에 따라 사용될 아미노기 공여체로는 암모니아; 암모늄 술페이트, 암모늄 클로라이드, 및 요소와 같은 무기 암모늄 염; 및 글루타민산과 같은 각종 아미노산이 포함된다. 아미노기 공여체의 농도는 0.1 내지 100 g/리터, 바람직하게는 1 내지 50 g/리터 이다.
KAL 유전자를 함유한 재조합 DNA 를 수반하는 재조합 미생물을 당 및 글리옥실산에 작용시키는 것에 의한 4(S)KHG 의 제조 농도는 일반적으로 5 내지 100 g/리터 이다. 당 및 글리옥실산의 농도는 모두 1 내지 200 g/리터, 바람직하게는 20 내지 200 g/리터 이다. 재조합 균주에 의해 동화될 수 있는 당이라면, 글루코스, 프룩토스, 수크로스, 말토스, 전분, 전분 가수분해물 및 당밀을 포함해, 어떤 것이든 사용가능하다. 반응은 15 내지 80℃, 바람직하게는 25 내지 60℃ 에서, pH 3 내지 11, 바람직하게는 pH 5 내지 9 에서, 1 내지 96 시간동안 수행된다.
상기 과정에서, KAL 유전자를 함유한 재조합 DNA 를 수반하는 미생물 배양의 시작 또는 도중에 상기 언급된 농도의 글리옥실산을 첨가함으로써 4(S)KHG 를 제조할 수 있다. 당을 배양 기질로써 미리 첨가하거나 또는 글리옥실산과 함께 첨가할 수 있다.
생성된 4(S)KHG 는 통상적인 유기산 정제 방법으로 분리 및 정제될 수 있다. 원심분리에 의해 고형물이 제거된 반응 상청액으로부터, 예컨데, 4(S)KHG 를 이온 교환 수지 및 막 가공법을 조합한 방법으로 분리 및 정제할 수 있다.
KAL 유전자를 함유한 재조합 DNA 를 수반하는 재조합 미생물을 아미노기 공여체의 존재하에 수성 배지내의 당 및 글리옥실산에 작용시켜 4(S)HG 또는 4(S)HYP 를 제조하는데 사용되는 당으로써, 재조합 균주에 의해 동화될 수 있는 당이라면, 글루코스, 프룩토스, 수크로스, 말토스, 전분, 전분 가수분해물, 및 당밀을 포함해, 어떠한 것도 사용가능하다. 반응에 있어서 박테리아 농도는 일반적으로 5 내지 100 g/l 이다. 당 및 글리옥실산의 농도는 모두 1 내지 200 g/l, 바람직하게는 10 내지 200 g/l 이다. 반응은 15 내지 80℃, 바람직하게는 25 내지 60℃ 에서 pH 3 내지 11, 바람직하게는 pH 5 내지 9 에서, 1 내지 96 시간동안 수행한다. 상기 과정에서, 4(S)HG 또는 4(S)HYP 를 KAL 유전자를 함유한 재조합 DNA 를 수반하는 미생물의 배양 시작 또는 도중에 상기 언급된 농도의 글리옥실산을 첨가함으로써 제조할 수 있다.
또한, 4(S)HYP 는 4(S)KHG 를 4(S)HYP 로 전환시키는 활성을 가진 생체촉매를 4(S)KHG 와 함께 아미노기 공여체의 존재하에 수성 배지에 첨가함으로써 제조될 수도 있다.
4(S)HYP 제조에 있어서 4(S)KHG 사용의 예로는, 분리 정제된 4(S)KHG, 4(R)KHG 또는 4(R)HG 를 함유하지 않은 조정제 시료, 및 생체촉매 반응을 통해 형성된 4(S)KHG 를 함유하는 반응 용액이 포함된다. 4(S)KHG 의 농도는 1 내지 200 g/리터, 바람직하게는 20 내지 200 g/리터이다.
아미노기 공여체의 존재하에 4(S)KHG 를 4(S)HYP 로 전환시키는 활성을 가진 생체촉매의 예로는 4(S)KHG 를 4(S)HYP 로 전환시키는 활성을 가진 미생물의 세포, 배양액 및 처리물이 포함된다. 상기 미생물로는 에쉐리키아 및 코리네박테리움 속의 미생물이 포함된다. 보다 구체적으로, 상기 미생물로는 에쉐리키아 콜라이 K-12 의 균주 ATCC 33625 가 포함되는데, 이는 에쉐리키아 콜라이에서 프롤린 합성 효소를 코딩하는 proBA 유전자 (proB 및 proA 를 코딩함) 를 변형시키고, 이어서 피드백 억제가 완화된 생성된 변이형 proBA 유전자를 수반하는 플라스미드 pKSR25 를 제조한 후, 플라스미드를 에쉐리키아 콜라이 균주내로 도입시킴으로써 제조할 수 있다. 보다 바람직하게, 글루타민산 요구성을 갖는 변이주가 언급된다. 상기 변이주는 그의 모균주에, 예컨데 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 (NTG), UV 조사 또는 γ선 조사와 같은 통상적인 변이조작 기술을 수행하고, 생성된 균주를 적절한 아가 플레이트 배지에 도포하고, 성장한 변이주를 채취하여, 성장에 글루타민산을 요구하는 균주를 선택함으로써 제조될 수 있다. 에쉐리키아 콜라이 K-12 미생물의 경우, 더욱이, 결실 변이주는 또한 형질도입에 의해 제조할 수 있다. 상기 미생물로는, 일차적으로 에쉐리키아 콜라이 K-12 의 균주 ATCC 33625 에 이소시트레이트 탈수소효소 결실 변이 (icd) 를 부여하여 균주 NHK3 를 수득한 다음, pKSR25 를 균주 NHK3 내로 도입시켜 제조된 NHK3/pKSR25 균주가 포함되고; 상기 미생물로는 또한 글루타메이트 탈수소효소 및 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소를 추가로 함유하는 플라스미드 pKSR50 을 도입시킨 균주 (NHK3/pKSR25 + pKSR50) 가 포함된다. 글루타민산 요구성 및 아제티딘-2-카르복실산, 및 3,4-데히드로프롤린 및 티오프롤린과 같은 프롤린 유사체에 대한 내성을 가진 숙주 미생물을 사용하는 것이 보다 유리하다. 상기 미생물은 그의 모균주를 변이조작 및 형질도입시켜 수득할 수 있고; 또한, 미생물은 프롤린 유사체 내성을 가진 플라스미드를 모균주내로 도입시켜서 수득할 수도 있다. 보다 구체적으로, 에쉐리키아 콜라이 균주 NHK23/pKSR25 + pKSR50 이 언급된다. 에쉐리키아 콜라이 균주 NHK3/pKSR25 + pKSR50 및 에쉐리키아 콜라이 균주 NHK23/pKSR25 + pKSR50 는 부다페스트 조약하에 1997년 4월 16일자로, 각각, FERM BP-5922 및 BP-5923 으로 일본 공업기술원 생명공학공업기술연구소에 기탁되었다.
반응에 사용될 생체촉매의 농도는 일반적으로 5 내지 100 g/리터이다. 반응은 15 내지 80℃ 에서, 바람직하게는 25 내지 60℃ 에서 pH 3 내지 11, 바람직하게는 pH 5 내지 9 에서, 1 내지 96 시간동안 수행된다. 4(S)HYP 는 아미노기 공여체의 존재하에 4(S)KHG 를 4(S)HYP 로 전환시키는 활성을 가진 미생물 배양 시작 또는 도중에 4(S)KHG 를 첨가함으로써 제조된다.
상기 생성된 4(S)HG 또는 4(S)HYP 는 통상적인 아미노산 정제 방법에 의해 분리될 수 있다. 이온 교환 수지 및 막 처리법을 조합하여, 예컨데, 4(S)HG 또는 4(S)HYP 를 원심분리법에 의해 고형물이 미리 제거된 반응 상청액으로부터 분리할 수 있다.
실시예
본 발명은 이제 하기 실시예에서 보다 상세히 설명될 것이다. 별도로 명시하지 않은 한, 재조합 DNA 와 관련한 일반적인 방법들은 문헌 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, T. Maniatis 등, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982] 에 기재된 방법에 따른 것이다.
실시예 1: KAL 유전자를 함유하는 플라스미드의 제조
에쉐리키아 콜라이 K-12 의 균주 W 3110 (ATCC 14948) 의 1 백금 고리를, 10-ml LB 액체 배지 [물 1 리터 당 박토트립톤 (10 g; Difco, Co. 제품), 효모 추출물 (5 g; Difco, Co. 제품) 및 NaCl (5 g) 을 함유하고, pH 7.2 로 조정됨] 에 접종하여 30℃ 에서 20 시간동안 배양하였다. 배양된 미생물로부터 염색체 DNA 를 공지된 방법 [H. Saito & K.I. Miura, Biochim. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)] 에 의해 분리하였다.
이미 보고된 KAL 유전자의 뉴클레오티드 서열 [R.V.Patil 및 E.E. Dekker, J. Bacteriol. 174, 102 (1992)] 을 기초로, 유전자 산물의 N 말단에 해당하는 서열 1 의 DNA 서열의 올리고뉴클레오티드 및 KAL 유전자의 C 말단에 해당하는 서열 2 의 DNA 서열의 올리고뉴클레오티드를 각각 통상적인 방법에 의해 합성하였다. 상기 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용해, KAL 유전자를 PCR 법 [R.F.Saiki, 등, Science 230, 1350 (1985)] 으로 증폭하였다 . 에쉐리키아 콜라이 W 3110 (ATCC 14948) 의 분리된 염색체 DNA 를 주형으로 사용해, Gene AmpTM 키트 (Perkin Elmer, Japan 제품) 및 동 회사의 DNA 열 순환기 (thermal cycler) 로 증폭을, 94℃ 에서 30 초, 52℃ 에서 30 초 및 72℃ 에서 1 분으로 구성된 각 회전을 30 회전씩 수행한 후, 이어서 72℃ 에서 5 분동안 반응시켰다. 반응 종결 후, 약 630 bp 의 증폭된 DNA 단편을 클로로포름으로 추출하고 에탄올 침전을 통해 정제하였다. 상기 DNA 단편 (2 μg) 및 trp 프로모터를 수반하는 벡터 플라스미드 pTrS33 (1 μg) (일본 공개 공보 제 2-227075 호) 을 각각 HindIII 및 BamHI 을 사용해 이중 절단한 다음, 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 정제된 두 단편을 함께 혼합한 다음 에탄올 침전시키고, 이어서 생성된 혼합물을 증류수 (5μl) 에 용해하고 결찰을 수행함으로써 재조합 DNA 를 제조하였다.
수득된 재조합 DNA 를 사용하여 마니아티스 (Maniatis) 등의 방법 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)] 을 이용해 에쉐리키아 콜라이 ATCC 33625 를 형질전환시킨 다음, 생성된 균주를 100μg/ml 의 앰피실린을 함유한 LB 아가 배양 배지상에 도말하고, 37℃ 에서 24 시간동안 항온배양하였다. 생성된 8 개의 앰피실린-내성 형질전환체 콜로니를 피루브산 및 글리옥실산으로부터 4-히드록시-2-케토글루타르산을 합성시키는 활성에 대해 검정하였다. 보다 구체적으로, 각각의 형질전환체 균주를 100μg/ml 앰피실린을 함유한 LB 액체 배지 (3 ml) 에서 30℃ 에서 20 시간동안 배양하고, 이어서 크실렌 (30 μl), 2M 소듐 피루베이트 (150 μl) 및 2M 글리옥실산 용액 (150 μl; NaOH 를 사용해 pH 6.4 로 조정됨) 을 배양액에 첨가하여 37℃ 에서 30 분 동안 교반하였다. 원심분리된 반응 용액의 상청액을 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 로 검정하여, 4(R)- 및 4(S)-4-히드록시-2-케토글루타르산의 수율을 측정하였다.
HPLC 검정 조건
칼럼; SUMICHIRAL OA-5000 칼럼 (Sumitomo Chemical Assay Center, Co. 제품).
이동층; 1 mM 구리 (II) 술페이트 및 0.1 mM 암모늄 아세테이트 수용액 (pH 4.5) 한 쌍 및 이소프로판올이 85 : 15 인 혼합 용액.
유속; 1 ml/분
온도; 40℃
검출; UV 210 nm 에서의 흡광도.
그 결과, 4(S)KHG 를 합성하는 활성이 모든 형질전환체에서 관찰되었다. 또한, 상기 균주들을 100 μg/ml 앰피실린을 함유한 LB 액체 배지 (3 ml) 에서 37℃ 에서 16 시간동안 진탕배양한 다음 원심분리하고, 생성된 미생물로부터 공지된 방법 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)] 에 따라 플라스미드를 분리하고, 각종 제한 효소로 절단하여 구조를 확인하였다. 상기 플라스미드가 모두 동일한 구조를 갖는 것으로 밝혀졌다. 상기 제조된 플라스미드를 pKSR101 이라 명명하였다. pKSR101 의 제한효소 지도를 도 1 에 나타내었다. pKSR101 과 관련해, pKSR101 을 수반하는 에쉐리키아 콜라이 NHK46/pKSR101 은 부다페스트 조약하에 1998년 6월 2일자로 일본 공업기술원 생명공학공업기술연구소에 FERM-BP 6382 로 기탁되었다.
4(S)KAL 유전자를 코리네박테리움 속 미생물내로 도입하기 위해, pKSR101 을자가 복제가능한 벡터 플라스미드 pCS116 (일본 공개 공보 제 6-277082호) 에 결찰시켰다. pCS116 (1 μg) 및 pKSR101 (1 μg) 을 H 완충액 (45 μl; Takara Brewery 제품) 에 용해하고, 여기에 Bgl II 10 유니트를 첨가하여 37℃ 에서 3 시간동안 절단한 후, 이어서 페놀 추출 및 에탄올 침전을 시행했다. 생성된 물질을 증류수 (5 μl) 에 용해하여 결찰시켜서 재조합 DNA 를 제조하였다. 재조합 DNA 를 사용해, 에쉐리키아 콜라이 ATCC 33625 를 마니아티스 등의 방법 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)] 에 의해 형질전환시켰다. 생성된 균주를 100 μg/ml 앰피실린 및 100 μg/ml 스펙티노마이신을 함유한 LB 아가 배양 배지상에 도말하고 37℃ 에서 24 시간동안 항온배양하였다. 앰피실린 및 스펙티노마이신에 대해 내성을 갖는 생성된 콜로니로부터, 플라스미드를 상기 기재된 것과 동일한 방식으로 분리하고, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 를 공지된 방법 (일본 공개 공보 제 6-277082 호) 에 의해 상기 플라스미드로 형질전환시켰다. 그런 다음 형질전환체를 100 μg/ml 글루타미쿰을 함유하는 BY 아가 배양 배지 [물 1 리터에 부일론 (20 g; Kyokuto Co. 제품) 및 효모 추출물 (5 g; Kyokuto Co. 제품) 을 함유하며, 미리 pH 7.2 로 조정되고 2% 아가 첨가를 통해 고형화된 배지] 위에 도말하고, 30℃ 에서 48 시간동안 항온배양하였다. 공지된 방법 (일본 공개 공보 제 57-183799 호) 에 의해, 생성된 8 개의 스펙티노마이신-내성을 갖는 콜로니로부터 플라스미드를 분리하여 구조를 확인하였다. 그 결과, 상기 플라스미드 모두가 동일한 구조를 갖는 것으로 밝혀졌다. 상기 제조된 플라스미드를 pKSR601 로 명명하였다. pKSR601 의 제한효소 지도를 도 2 에 나타내었다.
실시예 2: 에쉐리키아 콜라이 변이주에서의 4(S)KHG 의 제조
에쉐리키아 콜라이 K-12 균주의 ppc 변이를 갖는 균주 DV21A05 [J. Bacterial. 132, 832 (1977)] 로부터 P1 파지를 사용한 형질도입을 통해 에쉐리키아 콜라이 K-12 의 균주 WA802 [J.Mol. Biol. 16, 118 (1966)] 에 ppc 변이를 부여하고, P1 파지를 이용한 형질도입 방법을 계속해서 사용해, 상기 균주에 lip 변이를 부여한 후 eda 변이를 부여하여, ppc, lip 및 eda 삼중 결실 변이를 가진 균주 NHK42 를 제조하였다. 균주 NHK42 로부터, 감소된 말산 합성효소 활성을 갖는 균주를 유도하였다. 2 g/l 의 글루타민산 및 100 μg/l 의 리포산을 함유한 LB 배지에서 대수증식기까지 배양된 균주 NHK42 의 미생물을 원심분리하여 채취하고, 0.05M 트리스-말레에이트 완충용액 (pH 6.0) 으로 세척하고, 최종 박테리아 농도 109 세포/ml 까지 완충용액중에 현탁시킨다. NTG 를 최종 농도 600 mg/l 로 현탁액에 첨가하고, 생성된 혼합액을 실온에서 20 분 동안 방치하여 변이처리를 수행한다. 변이처리 후, 미생물을 0.5% 글루코스, 0.05 g/l 글루타민산, 100 μg/l 리포산, 및 30 mM 글리옥실산이 첨가된 M9 최소 아가 배양 배지 [Molecular Cloning, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)] 에 도말하였다 . 37℃에서 이틀동안 항온배양 후, 생성된 콜로니 중 작은 콜로니들을 2 g/l 의 글루타민산 및 100 μg/l 의 리포산이 첨가된 LB 아가 배양 배지에서 수합하였다. 수합된 변이주를 0.5% 글루코스, 0.5 g/l 글루타민산 및 100 μg/l 리포산이 첨가된 M9 최소 아가 배양 배지, 및 0.5% 글루코스, 100 μg/l 리포산, 및 30mM 글리옥실산이 첨가된 M9 최소 아가 배양 배지에서 복제시켰다. 그런 다음, 전자의 배지에서는 성장하지만 후자의 배지에서는 절대 성장하지 않는 균주를 선별하였다. 선별된 균주를 MS 배지 [물 1 리터당 3 g 글루코스, 4 g KH2PO4, 10 g (NH4)2SO4, 1 g MgSO4, 100 μg 티아민 히드로클로라이드, 1 g 효모 추출물, 1 g 펩톤, 50 μg 리포산, 20 g CaCO3, 및 2 g 글루타민산을 함유하고 pH 7.2 로 조정된 배지] 중 37℃ 에서 진탕배양하였다. 대수증식기의 후기에서, 미생물을 채취하고 50 mM 트리스-염산 완충액 (pH 7.0) 으로 세척한 후, 미생물을 초음파 분쇄 기기로 분쇄하고, 15,000 rpm 에서 45 분 동안 원심분리하여 세포 추출액이라 규정되는 상청액을 수득하였다. 상기 세포 추출액을 사용하여, 말산 합성효소 활성을 공지된 방법 [Methods in Enzymology 5, 633 (1962)]으로 검정하였다. 활성을 갖지 않는 것으로 밝혀진 균주 NHK46 을 목적 변이주로 선별하였다.
P1 파지를 이용한 형질도입 방법을 사용해, lip+ 유전자를 에쉐리키아 콜라이 W3110 (ATCC 14948) 로부터 균주 NHK46 내로 도입하여, 리포산 요구성을 갖지 않은 균주 NHK48 을 제조하였다.
마니아티스 등의 방법 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)] 을 사용하여, pKSR101 을 균주 NHK42, NHK46 및 NHK48 내로 도입하여 (단, 100 μg/l 의 리포산 및 2 g/l 의 글루타민산을 배지에 첨가한 후 배양을 수행한다), 앰피실린 내성을 마커로써 사용하여 형질전환체를 수득하였다.
각각의 형질전환체를 1% 글루코스, 2% 탄산 칼슘, 100 μg/l 리포산, 및 2 g/l 글루타민산을 함유한 LB 배지 중 28℃ 에서 16 시간동안 진탕배양하였다. 각각의 배양액을 5 ml 의 멸균된 T 배지 [물 1 리터당 50 g 글루코스, 4 g KH2PO4, 10 g (NH4)2SO4, 1 g MgSO4, 10 μg 티아민 히드로클로라이드, 0.2 g 효모 추출물, 3 g KCl, 50 μg 리포산, 250 mg 트립토판, 20 g CaCO3, 및 2 g 글루타민산을 함유하고 pH 7.2 로 조정된 배지] 에 30℃ 에서 24 시간동안 첨가하고, 이어서, 0.25 ml 의 2M 글리옥실산 용액 (NaOH 를 사용해 pH 6.4 로 조정) 을 첨가한 다음, 37℃ 에서의 또 다른 24-시간 진탕을 수행하였다. 수득된 배양액을 원심분리하고, 생성된 배양 상청액을 HPLC 로 분석하여 4(R)KHG 및 4(S)KHG 의 수율을 검정하였다. 상기 결과를 표 1에 나타내었다. 4(S)KHG 의 수율에서 명백히 알 수 있듯이, 리포에이트 요구성에 대한 변이 및 말산 합성효소 활성 감소에 대한 변이가 4(S)KHG 의 수율에 기여하였다.
숙주 플라스미드 4(R)KHG (mM) 4(S)KHG (mM)
에쉐리키아 콜라이 NHK42 pKSR101 0.8 7.5
에쉐리키아 콜라이 NHK46 pKSR101 3.1 28.1
에쉐리키아 콜라이 NHK48 pKSR101 0.0 0.0
실시예 3: 코리네박테리움 글루타미쿰에서의 4(S)KHG 의 생산
pKSR601 이 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 ATCC 13032 를 LB 배양 배지에서 16 시간동안 진탕배양하였다. 배양액 (0.5 ml) 을 멸균된 TC 배지 (5 ml) [물 1 리터당 10 g 글루코스, 0.5 g KH2PO4, 0.5 g K2HPO4, 20 g (NH4)2SO4, 0.25 g MgSO4, 3 g 요소, 100 μg 비오틴, 5 g 옥수수 침지액, 10 mg FeSO4·7aq, 5 mg MnSO4·4-6aq, 및 20 g CaCO3 를 함유하며 pH 7.2 로 조정된 배지] 에 첨가하고, 30℃ 에서 24 시간동안 진탕배양하였다. 그런 다음, 2M 글리옥실산 용액 (0.25 ml; NaOH 를 사용해 pH 6.4 로 조정됨) 을 거기에 첨가하고 상기 혼합액을 37℃ 에서 추가로 24 시간동안 진탕배양하였다. 배양 상청액을 실시예 2 에서와 동일한 방식으로 HPLC 로 분석하였다. 4(S)KHG 의 수율은 34.7 mM 이었고 4(R)KHG 는 생성되지 않았다.
실시예 4: 4(S)KHG 생산의 스케일업 (scale up)
실시예 2 의 결과를 기초로, 실시예 2 에서와 같이 에쉐리키아 콜라이 K-12 균주중 lip 및 eda 의 이중 결실 변이를 갖고 있는 균주 NHK40 내로 pKSR101 을 도입하여 4(S)KHG 를 생성하는 균주를 제조하였다. 형질전환체를 1% 글루코스, 2% 탄산 칼슘 및 100 μg/l 리포산을 함유한 LB 배지에서 28℃ 에서 13 시간동안 진탕배양하였다. 상기 배양액 (10 ml) 을 1-리터 용량의 멸균된 에를렌마이에르 플라스크안의 동일한 배양 배지 200 ml 에 첨가하여 28℃ 에서 13 시간동안 진탕배양하였다. 배양액 전체 분량을 5-리터 용량의 멸균된 병에 들어있는 표 2 에 나타낸 조성을 가진 J1 배양 배지에 첨가하고, 2 리터/분의 통기조건 및 500 rpm 의 진탕조건 및 33℃ 에서 배양하였는데, 이때 배지의 pH 는 수성 암모니아를 사용해 pH 6.8 로 유지된다. 20 시간 경과후, 크실렌 (20 ml) 및 2M 글리옥실산 용액 (NaOH 를 사용해 pH 6.4 로 조정됨) 을 병안에 첨가하고, 37℃ 에서 12 시간동안 추가 배양하였다. 배양 상청액을 HPLC 로 분석하였고, 4(S)KHG 의 수율이 305 mM 인 것으로 관찰되었다.
글루코스 30g
KH2PO4 2g
K2HPO4 2g
(NH4)2SO4 10g
MgSO4 1g
FeSO4·7aq 10mg
MnSO4·4-6aq 10mg
CoCl2 1.5mg
CaCl2 15mg
NiCl2 1.5mg
암모늄 몰리브데이트 1.5mg
티아민 히드로클로라이드 염 100μg
효모 추출물 0.5g
KCl 3g
리포산 75μg
트립토판 250mg
실시예 5: 각종 균주에서의 4(S)KHG의 생산
P1 파지를 이용한 형질도입 방법 [J.H.Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)] 을 사용해, ppc+ 유전자를 에쉐리키아 콜라이 W3110 (ATCC 14948) 으로부터 균주 NHK42 내로 도입하여, 글루타민산 요구성을 갖지 않는 균주 NHK45 를 제조하였다. pKSR101 을 실시예 2 에서와 동일한 방식으로 균주내로 도입하였다.
pKSR101 가 모두 도입된 균주 NHK 42, 46, 48 및 45 를 실시예 2 에서와 동일한 방식으로 배양하고, 생성된 배양 상청액을 HPLC 로 검정하여 4(R)HG 및 4(S)HG 의 수율을 측정하였다.
HPLC 검정 조건
칼럼; 리크로스페르 (C18) 칼럼 (Merck, Co. 제품).
이동층; 10 mM 소듐 시트레이트, 10 mM 무수 소듐 술페이트 (pH 2.2), 0.4 % n-프로판올, 및 0.03 % SDS 를 함유하는 용액.
유속; 0.8 ml/분
온도; 40℃
검출; 포스트 칼럼 라벨링에 의해 o-프탈릭 알데히드로 용출된 용액을 처리한 후 검출.
Ex = 350 nm, Em = 448 nm.
결과를 표 3 에 나타내었다. 각 균주의 4(S)HG 의 수율로 알 수 있듯이, 리포에이트 요구성에 대한 변이, 말산 합성효소 활성 감소에 대한 변이, 및 포스포에놀피루베이트 카르복실라제 결실에 대한 변이가 4(S)HG 의 생산에 기여할 수 있다.
pKSR601 이 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 를 LB 배양 배지에서 16 시간동안 진탕배양하였다. 상기 배양액 (0.5 ml) 을 멸균된 TC 배지 (5 ml) [물 1 리터당 100 g 글루코스, 0.5 g KH2PO4, 0.5 g K2HPO4, 20 g (NH4)2SO4, 0.25 g MgSO4, 3 g 요소, 100 μg 비오틴, 5 g 옥수수 침지액, 10 mg FeSO4·7aq, 5 mg MnSO4·4-6aq, 및 20 g CaCO3 를 함유하며 pH 7.2 로 조정된 배지] 내에 첨가하고, 30℃ 에서 24 시간동안 진탕배양하였다. 이어서, 2M 글리옥실산 용액 (0.25 ml; NaOH 를 사용해 pH 6.4 로 조정됨) 을 첨가하고, 혼합물을 37℃ 에서 24 시간동안 추가 배양하였다. 배양 상청액을 상기 기재된 것과 동일한 방식으로 HPLC 를 이용해 분석하여 4(R)HG 및 4(S)HG 의 수율을 검정하였다.
결과를 표 3 에 나타내었다.
숙주 플라스미드 4(R)HG (mM) 4(S)HG (mM)
에쉐리키아 콜라이 NHK42 pKSR101 0.1 14.0
에쉐리키아 콜라이 NHK46 pKSR101 0.1 21.9
에쉐리키아 콜라이 NHK48 pKSR101 0.0 1.5
에쉐리키아 콜라이 NHK45 pKSR101 0.1 3.7
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 pKSR601 0.0 9.8
실시예 6: 4(S)HG 생산의 스케일업
pKSR101 가 도입된 에쉐리키아 콜라이 균주 NHK46 을 1 % 글루코스, 2 % 탄산 칼슘, 100 μg/l 리포산, 및 2 g/l 글루타민산을 함유한 LB 배양 배지 중 28℃ 에서 13 시간동안 진탕배양하였다. 상기 배양액 (10 ml) 을 1-리터 용량의 멸균된 에를렌메이에르 플라스크에 들어 있는 동일한 배지 200 ml 에 첨가하고, 28℃ 에서 13 시간동안 진탕배양하였다. 배양액 전체 분량을 5-리터 용량의 멸균된 병에 들어있는 표 4 에 나와있는 조성을 가진 J2 배양 배지에 첨가하고, 2 리터/분 의 통기량 및 500 rpm 의 진탕조건 및 33℃ 하에 배양했는데, 이때 배지의 pH 는 수성 암모니아를 이용해 pH 6.8 로 유지하였다. 14 시간 경과 후, 2M 글리옥실산 용액 (350ml; NaOH 를 이용해 pH 6.4 로 조정됨) 을 병안에 첨가하고, 적절히 글루코스를 첨가하면서 37℃ 에서 60 시간동안 추가 배양하였다. 배양 상청액을 실시예 5 에서와 동일한 방식으로 HPLC 로 분석하였고, 4(S)HG 의 수율이 141.7 mM 및 4(R)HG 의 수율이 6 mM 인 것으로 관찰되었다.
글루코스 30g
KH2PO4 2g
K2HPO4 2g
(NH4)2SO4 10g
MgSO4 1g
FeSO4·7aq 10mg
MnSO4·4-6aq 10mg
CoCl2 1.5mg
CaCl2 15mg
NiCl2 1.5mg
암모늄 몰리브데이트 1.5mg
티아민 히드로클로라이드 염 100μg
효모 추출물 0.5g
KCl 3g
리포산 75μg
트립토판 250mg
글루타민산 12g
이소류신 20mg
메티오닌 10mg
실시예 7: 4(S)HG 의 정제
원심분리법을 이용하여, 실시예 6 에서처럼 4(S)HG 및 4(R)HG 를 함유하는 배양액 (1 리터) 으로부터 미생물을 제거하고, 생성된 배양 상청액을 양이온 교환 수지 SK1B (500 ml) (H+ 형, Mitsubishi Chemical Corporation 제품) 로 충진된 칼럼을 통과시켰다. 물로 세척한 후, 수성 1N 암모니아를 상기 칼럼내로 통과시켜 HG 용출 분획을 분취하였다. 분취된 용액을 활성탄으로 탈색시키고, 생성된 용액의 절반을 음이온 교환 수지 PA316 (400 ml) (OH 형, Mitsubishi Chemical Corporation 제품) 으로 충진된 칼럼을 통과시켰다. 물로 세척한 후, 0.5N 염산을 상기 칼럼내로 통과시켜 HG 용출 분획을 분취하였다. 증발에 의해, 상기 분취된 용액으로부터 염산을 제거하고, 생성된 용액을 50 ml 로 농축시킨 후 4℃ 에서 이틀동안 방치하였다. 액체내에 생성된 결정을 여과시켜 4(S)HG (7 g) 를 회수하였다. NMR 분석, 질량분광법 및 광 회전 검정에 의해, 결정이 4(S)HG 이며 4(R)HG 는 존재하지 않는 것으로 확인되었다. 그리하여, 균주 NHK46 을 사용해, 4(S)HG 를 4(R)HG 의 오염 없이 일단계 반응으로 수득할 수 있다.
실시예 8: 프롤린 합성효소 유전자와 KAL 유전자의 결찰
일차로, 프롤린 피드백 억제에 대해 탈감작된 변이형 proBA 유전자를 하기 방식으로 프롤린 생합성효소를 코딩하는 proBA (proB 및 proA 를 코딩함) 유전자를 변형시켜 제조하였다.
proBA 유전자를 함유한 에쉐리키아 콜라이-유래 플라스미드 pPRO-1 (일본 공개 공보 제 3-266995 호) 을 EcoRV 로 절단한 후, 절단된 산물을 아가로스 겔에서 전기영동시켜 proB 유전자 일부를 함유하는 DNA 단편을 Prep-A-Gene DNA 정제 시스템 (Bio-Rad Co. 제품) 을 사용해 분리 정제하였다. SmaI 로 pUS119 (Takara Brewery, Co. 제품) 을 절단하여 수득된 절단 생성물에 상기 단편을 결찰시켰다. 생성된 결찰 생성물을 이용하여 에쉐리키아 콜라이 ATCC 33625 를 형질전환시켜 앰피실린 내성을 갖는 형질전환체를 제조하였다. 플라스미드를 상기 형질전환체 중 하나에서 통상적인 방법으로 추출하여 제한효소 분석하였다. 플라스미드에 pUC119 의 SmaI 부위에 proB 유전자 일부를 함유한 약 1kb 의 DNA 단편이 삽입되었음이 확인되었다. 상기 플라스미드를 pBAB51 이라 명명하였다.
공지된 탈감작 proB 효소 유전자의 뉴클레오티드 서열 (proB74 변이) [A.M.Dandekar 및 S.L.Uratsu, J. Bacteriol. 170, 5943 (1988)] 을 기초로, 서열 3 의 서열의 올리고뉴클레오티드 A1 및 서열 4 의 서열의 올리고뉴클레오티드 A2 를 통상적인 방법에 의해 합성 제조하였다. 올리고뉴클레오티드 A1 및 M13 프라이머 M3 (Takara Brewery, Co. 제품) 쌍을 프라이머로써 사용하고 또한 올리고뉴클레오티드 A2 및 M13 프라이머 RV (Takara Brewery, Co. 제품) 쌍을 또 다른 프라이머로 사용하여, 각각, 변이형 proB 유전자의 서열 일부를 pBAB51 을 주형으로 사용해, 실시예 1 에서와 동일한 방식으로, PCR 로 증폭하였다. 증폭된 DNA 를 아가로스 겔에서 전기영동시키고 Prep-A-Gene DNA 정제 시스템 (Bio-Rad, Co.) 을 사용하여 정제하였다. 정제 후 상기 두 DNA 단편의 혼합물을 주형으로 사용해, 또 다시 PCR 을 M13 프라이머 M3 및 M13 프라이머 RV 를 프라이머로 사용해 수행함으로써 변이형 proB 유전자 서열을 함유한 약 1 kb 의 DNA 단편을 증폭시켰다. Eco0651 및 SacII 로 절단 후, DNA 단편을 약 6.8 kb 의 DNA 단편, 즉 Eco0651 및 SacII 으로 pPRO-1 을 절단한 다음 아가로스 겔 전기영동하고 Prep-A-Gene DNA 정제 시스템 (Bio-Rad Co.) 을 사용하여 분리 및 정제함으로써 회수된 단편에 결찰시켰다. 상기 결찰 생성물을 사용하여, 에쉐리키아 콜라이 ATCC 33625 를 형질전환시켜 테트라시클린 내성을 갖는 형질전환체를 제조하였다. 수개의 상기 형질전환체 및 pPRO-1 을 수반하는 에쉐리키아 콜라이 ATCC 33625 를 3,4-데히드로프롤린 (100 mg) 이 첨가된 M9 최소 아가 배양 배지상에서 복제시켰다. 모든 형질전환체가 성장하였으나, pPRO-1 을 수반하는 에쉐리키아 콜라이 ATCC 33625 는 성장하지 않았다. pPRO-1 의 proB 유전자가 탈감작 형태로 변형된 플라스미드가 구축되었음이 확인되었다. 통상적인 방법을 사용해, 플라스미드를 상기 형질전환체로부터 추출하여 제한효소 분석을 하였으며, 모든 플라스미드가 동일한 구조를 갖는 것으로 나타났다. 상기 플라스미드를 pKSR24 이라 명명하였다.
상기 제조된 pKSR24 를 PstI 및 BglII 로 절단하고, DNA 평활화 키트 (Takara Brewery, Co. 제품) 를 사용해 평활말단화시켰다. 아가로스 겔 전기영동 및 Prep-A-Gene DNA 정제 시스템 (Bio-Rad Co.) 으로, 변이형 proBA 유전자를 함유한 약 2.9 kb 의 DNA 단편을 분리 정제하였다. 고온 유도형 프로모터 및 도 3 에 나와있는 제한효소 부위를 가진 플라스미드로써 pPAC1 의 ClaI 절단물을 DNA 평활화 키트를 이용해 DNA 단편을 평활말단화한 후 상기 DNA 단편에 결찰시켰다. 상기 결찰 생성물을 사용해, 에쉐리키아 콜라이 ATCC 33625 를 형질전환시키고, 플라스미드를 형질전환체로부터 추출하여, 변이형 proBA 가 pPAC1 의 고온 유도형 프로모터의 하류에 삽입되어 변이체의 전사 방향이 순차적으로 되는 구조를 가진 pKSR25 를 회수하였다.
실시예 1 에서 제조된 pKSR101 을 EcoRI 및 BdlII 로 절단한 후, DNA 평활화 키트를 사용해 평활말단화하고, 약 1.2 kb 의 KAL 유전자를 함유한 DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동 및 Prep-A-Gene DNA 정제 시스템 (Bio-Rad Co.) 을 사용해 분리 정제하였다. XhoI 로 pKSR25 을 절단하고, 절단된 생성물을 DNA 평활화 키트로 평활말단화해 회수한 DNA 단편과 약 1.2 kb 의 상기 DNA 단편을 결찰시켰다. 결찰 생성물을 이용해, 에쉐리키아 콜라이 ATCC 33625 를 형질전환시키고, 앰피실린 내성을 가진 형질전환체들을 상기 형질전환체들로부터 회수하였다. 수개의 형질전환체를 3,4-데히드로프롤린 내성 및 KAL 활성에 대해 검정하였다. 형질전환체 모두 3,4-데히드로프롤린 내성 및 KAL 활성을 갖는 것으로 확인되었다. 통상적인 방법에 의해, 플라스미드를 8 개의 상기 형질전환체로부터 추출하여 제한효소 분석하였는데, 모든 플라스미드가 동일한 구조를 갖는 것으로 나타났다. 상기 플라스미드를 pKSR125 라 명명하였다. 플라스미드 구축 과정 및 pKSR125 의 제한효소 지도를 도 3 에 나타내었다.
실시예 9: 글리옥실산의 첨가 배양에 의한 4(S)HYP 생산
프롤린 유사체로서의 아제티딘-2-카르복실산에 내성을 갖는 변이주를 실시예 2 에서 제조된 균주 NHK46 로부터 하기와 같이 유도하였다. 실시예 2 에서와 동일한 방식으로 배양된 균주 NHK46 을 실시예 2 에서와 동일한 방식으로 변이조작한 후, 0.5 % 글루코스, 0.5 g/l 글루타민산, 100 μg/l 리포산, 및 100 mg/l 아제티딘-2-카르복실산이 첨가된 M9 최소 아가 배양 배지상에 도말하고 37℃ 에서 이틀동안 항온배양하였다. 생성된 콜로니중 큰 콜로니를 채취하여 아제티딘-2-카르복실레이트 내성을 갖는 변이주 NHK47 을 수득하였다.
실시예 8 에서 제조된 pKSR125 를 균주 NHK46 및 NHK47 내로 도입하여 앰피실린 내성을 마커로 사용해 형질전환체들을 수득하였다. 각각의 형질전환체 및 pKSR101 을 수반하는 균주 NHK46 (실시예 2 에서 제조됨)을 실시예 2 에서와 동일한 방식으로 배양하고, 상기 배양 상청액을 HPLC 로 검정하여 4(S)HYP 를 확인하였다.
HPLC 검정 조건
칼럼: Shiseido CapcellPak-C18 (4.6 X 150 mm)
이동층: A; 10 mM 소듐 시트레이트 (pH 4), B; 동일한 양의 A 및 메탄올의 혼합액
유속: 1.5 ml/분
온도; 50℃
이동층의 변화 시간표:
시간 (분) B (부피 %)
0 - 10 0 - 8
10 - 20 8 - 80
20 - 21 80 - 100
21 - 23 100
23 - 24 0
검출: Ex = 470 mm 및 Em = 530 nm 에서의 형광 검출
결과를 표 5 에 나타내었다.
숙주 플라스미드 4(R)HYP (mM) 4(S)HYP (mM)
에쉐리키아 콜라이 NHK46 pKSR101 0.0 0.0
에쉐리키아 콜라이 NHK46 pKSR125 0.0 2.1
에쉐리키아 콜라이 NHK47 pKSR125 0.0 10.3
실시예 10: 두-단계 반응에 의한 4(S)HYP 의 생산
P1 파지에 의한 형질도입 방법에 의해, 이소시트레이트 탈수소효소 결실 변이 (icd) 를 이소시트레이트 탈수소효소 결실된 에쉐리키아 콜라이 변이주 EB106 [E. coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, Ct., USA 에서 제공됨] 으로부터 에쉐리키아 콜라이 ATCC 33625 에 도입하여 균주 NHK3 을 제조하였다. 변이주는 icd 변이로 인해 글루타민산 요구성을 나타냈다.
실시예 8에서 제조된 pKSR25 를 사용해, 에쉐리키아 콜라이 ATCC 33625 및 NHK3 을 각각 형질전환시켜 앰피실린 내성을 마커로 사용하여 각각의 형질전환체를 수득하였다. 더욱이, PstI 및 ClaI 부위 사이에 위치하는 에쉐리키아 콜라이의 글루타메이트 탈수소효소 유전자 (gdh) 를 수반하는 4.2-kb DNA 단편을 수반하는, pACYC177 에서 유도된 플라스미드 pKSR50 (도 4) 및 BamHI 및 SphI 부위 사이에 위치하는 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 유전자 (zwf) 를 수반하는 약 3-kb DNA 단편을 사용하여, pKSR25 를 수반하는 에쉐리키아 콜라이 NHK3 (NHK3/pKSR25 균주) 를 형질전환시켜 앰피실린 및 클로람페니콜에 대한 내성을 마커로 사용해 pKSR50 및 pKSR25 를 수반하는 균주 NHK3 (NHK3/pKSR50 + pKSR25) 을 수득하였다. 에쉐리키아 콜라이 K-12 균주의 변이형 (icd, sucA, putA, eda) 의 변이주 NHK23 내로 pKSR50 및 pKSR25 를 또한 도입하여 균주 NHK23/pKSR50 + pKSR25 를 수득하였다.
실시예 2 에서와 동일한 방식으로, 모두 상기 기재된대로 제조된 에쉐리키아 콜라이 ATCC 33625, 및 NHK3, ATCC33625/pKSR25, NHK3/pKSR25, NHK3/pKSR50 + pKSR25 및 NHK23/pKSR50 + pKSR25 를 T 배양 배지에서 30℃ 에서 24 시간동안 유사하게 배양하였다. 밀리포어 필터를 통한 여과 및 멸균 후 실시예 4 에서 제조된 4(S)KHG 를 함유하는 상기 생성된 배양 상청액을 최종 4(S)KHG 농도 40 mM 로 생성된 배양액에 첨가하고, 혼합액을 37℃ 에서 24 시간동안 추가 진탕배양하였다. 배양액 내의 4(S)HYP 를 하기 방법에 의해 검정하였다. 80 μl 의 배양 상청액에 1M 보레이트 완충액 (pH 9.6; 20 μl) 및 6 mg/ml NBD-Cl (7-클로로-4-니트로벤조-2-옥사-1,3-디아졸 클로라이드) 를 함유한 메탄올 용액 (100 μl) 을 첨가하고 60℃ 에서 20분 동안 암반응시키고, 이어서 반응 용액에 1N HCl (50 μl) 을 첨가하여 반응을 종료하였다. 상기 혼합액을 밀리포어 필터를 통해 여과시키고, 여액을 실시예 9 에서와 동일한 방식으로 HPLC 로 검정하여 4(S)HYP 를 검정하였다. 결과를 표 6 에 나타내었다.
이와는 달리, 코리네박테리움 글루타미쿰 KY 10912 를 LB 배양배지에서 16 시간동안 진탕배양하였다. 그런 다음 배양액을 5 ml 의 멸균된 TC 배양 배지에 첨가하고 30℃ 에서 24 시간동안 진탕배양하였다. 밀리포어 필터를 통한 여과 및 멸균 후 실시예 4 에서 제조된 4(S)KHG 를 수반하는 배양 상청액을 최종 4(S)KHG 농도 40mM 로 배지에 첨가하고, 37℃ 에서 24 시간동안 추가로 진탕배양하였다. 배양 상청액을 실시예 9 에서와 마찬가지로 HPLC 로 분석하여 4(S)HYP 를 검정하였다. 결과를 표 6 에 나타내었다.
숙주 플라스미드 4(S)HYP (mM)
E. coli ATCC33625 없음 0.0
E. coli ATCC33625 pKSR25 0.4
E. coli NHK3 없음 0.0
E. coli NHK3 pKSR25 0.9
E. coli NHK3 pKSR50+pKSR25 1.6
E. coli NHK23 pKSR50+pKSR25 5.8
코리네박테리움 글루타미쿰 KY10912 없음 1.0
본 발명에 따라, (S)-4-히드록시-2-케토글루타르산 및 전구체 (S)-4-히드록시-2-케토글루타르산에서 유래한 화합물, 예컨데 (2S,4S)-4-히드록시-L-글루타민산 및 (2S,4S)-4-히드록시-L-프롤린을 산업적으로 유리한 방식으로 제조할 수 있다. (2S,4S)-4-히드록시-L-프롤린은 항-종양세포 활성 [Cancer Res.48, 2483 (1988)] 및 항-비만세포 활성 (일본 공개 공보 제 63-218621 호) 을 포함한 생물학적 작용을 갖는다. (S)-4-히드록시-2-케토글루타르산 및 (2S,4S)-4-히드록시-L-글루타민산은 프롤린을 합성하기 위한 원료로써 유용하다.
본 발명의 취지 및 범위에서 벗어나지 않은채 본 발명의 다양한 구현예를 구축할 수 있다. 본 발명이 본 명세서에 기재된 특정 구현예에 제한되지 않는다는 것으로 이해해야 한다. 이와 반대로, 본 발명은 청구항의 취지 및 범위에 속하는 각종 변형 및 상응하는 조건을 포함하고자 한다.
[서열목록]
서열 번호: 1
서열의 길이: 26
서열의 타입: 핵산
쇄의 수: 단일가닥
토폴로지: 선형
분자의 타입: 기타 핵산, 합성 DNA
[서열 1]
서열 번호: 2
서열의 길이: 24
서열의 타입: 핵산
쇄의 수: 단일가닥
토폴로지: 선형
분자의 타입: 기타 핵산, 합성 DNA
[서열 2]
서열 번호: 3
서열의 길이: 22
서열의 타입: 핵산
쇄의 수: 단일가닥
토폴로지: 선형
분자의 타입: 기타 핵산, 합성 DNA
[서열 3]
서열 번호: 4
서열의 길이: 22
서열의 타입: 핵산
쇄의 수: 단일가닥
토폴로지: 선형
분자의 타입: 기타 핵산, 합성 DNA
[서열 4]
도 1 은 플라스미드 pKSR101 및 상기 플라스미드의 제한효소 지도를 나타내고;
도 2 는 플라스미드 pKSR601 및 상기 플라스미드의 제한효소 지도를 나타내고;
도 3 은 플라스미드 pKSR125 의 구축 과정 및 상기 플라스미드의 제한효소 지도를 나타내고; 및
도 4 는 플라스미드 pKSR50 및 상기 플라스미드의 제한효소 지도를 나타낸다.

Claims (23)

  1. (a) (S)-4-히드록시-2-케토글루타르산 알도라제 유전자를 함유한 재조합 DNA 를 수반하는 재조합 미생물을 수성 배지에서 당 및 글리옥실산에 작용토록 하고,
    (b) 수성 배지내에 생성된 광학 활성 (S)-4-히드록시-2-케토글루타르산 또는 전구체 (S)-4-히드록시-2-케토글루타르산에서 유래한 화합물을 수합하는 것을 포함하는 광학 활성 화합물의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 전구체 (S)-4-히드록시-2-케토글루타르산에서 유래한 화합물이 (2S,4S)-4-히드록시-L-글루타민산인 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 전구체 (S)-4-히드록시-2-케토글루타르산에서 유래한 화합물이 (2S,4S)-4-히드록시-L-프롤린인 방법.
  4. 제 1 항 내지 3 항 중 어느 한 항에 있어서, (S)-4-히드록시-2-케토글루타르산 알도라제 유전자가 에쉐리키아 (Escherichia), 슈도모나스 (Pseudomonas), 파라코커스 (Paracoccus), 프로비덴시아 (Providencia), 리조비움 (Rhizobium) 또는 모르가넬라 (Morganella) 속에 속하는 미생물에서 유래한 유전자인 방법.
  5. 제 1 항 내지 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 미생물이 에쉐리키아 (Escherichia) 또는 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속에 속하는 미생물인 방법.
  6. 제 1 항 내지 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 미생물이 리포에이트 요구성 또는 말산 합성효소 활성의 감소 또는 결실 중 하나 이상의 특성을 갖는 미생물인 방법.
  7. 제 1 항 내지 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 미생물이 포스포에놀피루베이트 카르복실라제 활성이 결실된 미생물인 방법.
  8. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 재조합 미생물이 프롤린 유사체에 대한 내성을 갖고 있는 미생물인 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 화합물이 (2S,4S)-4-히드록시-L-글루타민산, (2S,4S)-4-히드록시-L-프롤린, (S)-4-히드록시-L-글루타민, (S)-4-히드록시-L-아르기닌 및 (S)-4-히드록시-L-오르니틴으로 구성된 군 중에서 선택되는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 수성 배지가 아미노기 공여체를 함유하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 수성 배지가 아미노기 공여체를 함유하지 않는 방법.
  12. (a) (S)-4-히드록시-2-케토글루타르산을 (2S,4S)-4-히드록시-L-프롤린으로 전환시키는 활성을 갖는 생체촉매를 (S)-4-히드록시-2-케토글루타르산과 수성 배지중에서 반응시키고,
    (b) 수성 배지내에 생성된 (2S,4S)-4-히드록시-L-프롤린을 수합하는 것을 포함하는 (2S,4S)-4-히드록시-L-프롤린의 제조 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 생체촉매가 미생물의 배양액 또는 세포 또는 처리물인 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 미생물이 에쉐리키아 또는 코리네박테리움 속에 속하는 방법.
  15. 제 13 항에 있어서, 미생물이 프롤린 유사체에 대한 내성을 갖는 미생물인 방법.
  16. 제 13 항에 있어서, 미생물이 글루타민산 요구성을 갖는 미생물인 방법.
  17. (S)-4-히드록시-2-케토글루타르산 알도라제 유전자가 벡터 플라스미드 pTrS33으로 혼입된 재조합 플라스미드 pKSR101.
  18. 에쉐리키아 콜라이 FERM BP-5919 의 생물학적으로 정제된 배양액.
  19. 에쉐리키아 콜라이 FERM BP-5920 의 생물학적으로 정제된 배양액.
  20. 에쉐리키아 콜라이 FERM BP-5921 의 생물학적으로 정제된 배양액.
  21. 에쉐리키아 콜라이 FERM BP-5922 의 생물학적으로 정제된 배양액.
  22. 에쉐리키아 콜라이 FERM BP-5923 의 생물학적으로 정제된 배양액.
  23. 에쉐리키아 콜라이 FERM BP-6382 의 생물학적으로 정제된 배양액.
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