JP2002330784A - ５置換ヒダントインラセマーゼ、これをコードするｄｎａ、組み換えｄｎａ、形質転換された細胞および光学活性アミノ酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 ５置換ヒダントインのラセミ化反応の至適温
度が高い新規５置換ヒダントインラセマーゼを単離し、
当該酵素を用いた光学活性アミノ酸の製造方法を提供す
る。 【解決手段】 下記(a)または(b)のアミノ酸配列を有
し、５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパ
ク質。（a）ミコバクテリウム・リクエファシエンス由
来のアミノ酸配列（b）上記のアミノ酸配列において1ま
たは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加また
は逆位を含むアミノ酸配列

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規５置換ヒダン
トインラセマーゼ、これをコードするＤＮＡ、組み換え
ＤＮＡ、形質転換された細胞および光学活性アミノ酸の
製造方法に関し、特に、ラセミ化反応の作用至適温度が
高く、ラセミ化反応を効率的に触媒する新規５置換ヒダ
ントインラセマーゼ、これをコードするＤＮＡ、組み換
えＤＮＡ、形質転換された細胞および光学活性アミノ酸
の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】５置換ヒダントインラセマーゼ（以下Ｈ
Ｒａｓｅと略す）は、光学活性な５置換ヒダントイン化
合物、すなわちＤ−またはＬ−５置換ヒダントイン化合
物に作用し、当該物質のラセミ化反応を触媒する酵素で
ある。

【０００３】５置換ヒダントイン化合物は、下記反応式
（I）に示すように、、の酵素による加水分解反応
を経てアミノ酸となる。 ５置換ヒダントイン化合物に作用し、当該物質を加水
分解することによりＮ−カルバミルアミノ酸を生成する
反応を触媒する酵素（ヒダントイナーゼ）。 生成したＮ−カルバミルアミノ酸に作用し、当該物質
を加水分解することにより光学活性アミノ酸を生成する
反応を触媒する酵素（Ｎ−カルバミルアミノ酸ハイドロ
ラーゼ）。

【０００４】

【化１】

【０００５】５置換ヒダントイン化合物から光学活性ア
ミノ酸を製造するためには、上記ヒダントイナーゼお
よびＮ−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼのうち、
少なくとも一方に光学選択性の酵素を用いればよく、従
来から微生物酵素系を用いた方法および微生物酵素系と
化学反応系とを組み合わせた方法が知られている。この
５置換ヒダントイン化合物から、光学活性アミノ酸を製
造する方法は、医薬品、化学工業品、食品添加物等の製
造に重要である。

【０００６】微生物酵素系あるいは微生物酵素系と化学
反応系との組み合わせにより、ＤＬ−５置換ヒダントイ
ン化合物の全量を光学選択的に加水分解させ、光学活性
アミノ酸に変換するには、基質とならないエナンチオマ
ーを効率的にラセミ化し、基質となるエナンチオマーに
変化させる必要がある。ところが、微生物酵素系の作用
する中性条件下では、基質とならない光学活性５置換ヒ
ダントイン化合物のラセミ化速度がきわめて遅く、ラセ
ミ化が律速となって効率的に光学活性アミノ酸に変換す
ることができないといった問題があった。

【０００７】そこで、中性条件下での光学活性５置換ヒ
ダントイン化合物のラセミ化を目的として、ＨＲａｓｅ
の検索がなされ、アースロバクター（Arthrobacter）属
細菌由来（特開昭６２−１２２５９１号公報、Ann.N.Y.
Acad.Sci ６７２巻４７８ページ、特開平６−３４３４
６２号公報）、シュードモナス(Pseudomonas)属細菌由
来(特開平４−２７１７８４号公報、J.Bacteriol.１７
４巻、７９８９ページ、１９９２年)が報告されてい
る。従来報告されている細菌由来のＨＲａｓｅの至適反
応温度は、アースロバクター エスピー（Arthrobacter
sp.）ＤＳＭ−３７４７株由来のものが３７℃（Ann.N.
Y.Acad.Sci ６７２巻 ４７８ページ）、同じくアース
ロバクター エスピー（Arthrobacter sp.）ＤＫ２００
株由来のものが１０℃〜５０℃（特開昭６２−１２２５
９１号公報）、またシュードモナスエスピー(Pseudomon
as sp.)ＮＳ６７１由来のものが４５℃である。

【０００８】一般的に、酵素反応における作用至適温度
が高いほど、酵素の産業的な利用価値が高くなる。すな
わち反応温度を高くすることができれば、より反応速度
を速くすることが可能となる結果、目的とする反応が効
率的に進むようになるのはもちろんのこと、反応中、反
応液の微生物汚染のリスクが軽減されることから、品質
保持を含めた工程管理が容易になる利点がある。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】上述したように、工業
的応用の観点から、反応の至適温度が高いＨＲａｓｅは
有用である。しかしながら、今まで報告されているＨＲ
ａｓｅの作用至適温度の上限は５０℃であり、ラセミ化
反応を効率的に進行させるため、また反応液の微生物汚
染のリスクを軽減するため、さらに作用至適温度の高い
ＨＲａｓｅが求められている。

【００１０】従って、本発明の目的は、従来になく反応
の至適温度が高い新規ＨＲａｓｅを単離し、当該酵素を
用いた光学活性アミノ酸の製造方法を提供することにあ
る。

【００１１】

【課題を解決するための手段】上記問題に鑑み鋭意研究
の結果、本発明者らは、マイクロバクテリウム属細菌に
目的とする反応の至適温度が高い新規ＨＲａｓｅが存在
することを見出し、本発明を完成するに至った。

【００１２】即ち、本発明は、以下のとおりである。

【００１３】（請求項１） ５置換ヒダントインのラセ
ミ化反応を触媒する５置換ヒダントインラセマーゼにお
いて、作用至適ｐＨがｐＨ７〜９の範囲内にあり、作用
至適温度が５０〜６０℃の範囲内にあることを特徴とす
る５置換ヒダントインラセマーゼ。

【００１４】（請求項２） 下記(a)または(b)のアミノ
酸配列を有し、５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有
するタンパク質。 （a）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列 （b）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
て1または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列

【００１５】（請求項３） マイクロバクテリウム属細
菌を培養して得た菌体を破砕または溶菌後、精製処理を
行うことにより取得されるマイクロバクテリウム属細菌
由来の５置換ヒダントインラセマーゼ画分。

【００１６】（請求項４） 請求項１または２に記載の
５置換ヒダントインラセマーゼまたは請求項３に記載の
５置換ヒダントインラセマーゼ画分を、光学活性５置換
ヒダントイン化合物に作用させることを特徴とする光学
活性５置換ヒダントイン化合物のラセミ化方法。

【００１７】（請求項５） 請求項１または２に記載の
５置換ヒダントインラセマーゼまたは請求項３に記載の
５置換ヒダントインラセマーゼ画分、および、５置換ヒ
ダントインを光学選択的に加水分解する酵素または当該
酵素含有物を、５置換ヒダントインに作用させることを
特徴とするＮ−カルバミルアミノ酸の製造方法。

【００１８】（請求項６） 請求項１または２に記載の
５置換ヒダントインラセマーゼまたは請求項３に記載の
５置換ヒダントインラセマーゼ画分、５置換ヒダントイ
ンを加水分解する酵素または当該酵素含有物、および、
Ｎ−カルバミルアミノ酸を光学選択的に加水分解する酵
素または当該酵素含有物を、５置換ヒダントインに作用
させることを特徴とする光学活性アミノ酸の製造方法。

【００１９】（請求項７） 請求項１に記載の５置換ヒ
ダントインラセマーゼをコードするＤＮＡ。

【００２０】（請求項８） 下記(a)または(b)の塩基配
列を有し、５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有する
タンパク質をコードするＤＮＡ。 （a）配列表配列番号１に記載の塩基配列 （b）配列表配列番号１に記載の塩基配列とストリンジ
ェントな条件でハイブリダイズする塩基配列

【００２１】（請求項９） 下記(c)または(d)のアミノ
酸配列を有し、５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有
するタンパク質をコードするＤＮＡ。 （c）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列 （d）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
て1または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列

【００２２】（請求項１０） 請求項７〜９のいずれか
に記載のＤＮＡとベクターＤＮＡとが接続されて得られ
る組み換えＤＮＡ。

【００２３】（請求項１１） 前記ベクターＤＮＡは、
ｐＵＣ系プラスミド、ｐＢＲ３２２系プラスミドまたは
その誘導体に由来することを特徴とする請求項１０に記
載の組み換えＤＮＡ。

【００２４】（請求項１２） 請求項１０または１１に
記載の組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞。

【００２５】（請求項１３） 前記細胞は、エシェリヒ
ア コリに由来することを特徴とする請求項１２に記載
の細胞。

【００２６】（請求項１４） 請求項１２または１３に
記載の細胞を培地中で培養し、培地中および／または細
胞中に５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタン
パク質を蓄積させることを特徴とする５置換ヒダントイ
ンラセマーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。

【００２７】

【発明の実施の形態】以下、本発明について、 [I] ＨＲａｓｅ [II] ＨＲａｓｅを用いた光学活性アミノ酸の製造方法 の順に添付の図面を参照して詳細に説明する。

【００２８】[I] ＨＲａｓｅ フラボバクテリウム属細菌に、ＤＬ−５−インドリルメ
チルヒダントインを光学選択的に加水分解し、対応する
Ｌ−トリプトファンを生成する菌株が報告されている。
このＬ−トリプトファンを生成する菌株であるフラボバ
クテリウム エスピー.（Flavobacterium sp.）ＡＪ３
９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３）を用い、ＤＬ−５−イ
ンドリルメチルヒダントインを基質としＬ−トリプトフ
ァン生成反応を行なわせた場合、Ｌ−トリプトファンの
生成モル収率は８０％以上に達する（Agric.Biol.Chem.
５１巻 ３６３ページ、１９８７年）。

【００２９】光学活性インドリルメチルヒダントイン
は、酵素反応が行われるような中性条件下では、自発的
ラセミ化がほとんど起こらないことから、本発明者ら
は、当該菌株に新規ＨＲａｓｅが存在すると考えた。こ
の考えに基づき、本発明者らは、新規ＨＲａｓｅの存在
を明らかにすべく、当該菌株の培養菌体からＨＲａｓｅ
を精製単離するとともに、この酵素が目的とする反応の
至適温度が高い新規ＨＲａｓｅであることを見いだし
た。

【００３０】なお、フラボバクテリウム エスピー.（F
lavobacterium sp.）ＡＪ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ３１
３３）は、当初フラボバクテリウム エスピー.（Flavo
bacterium sp.）ＡＪ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ３１３
３）として１９７５年６月２７日に通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所に寄託されたが、再同定の結
果オーレオバクテリウム リクエファシエンス（Aureob
acterium liquefaciens）に分類されることが判明し
た。現在では、種名変更により、オーレオバクテリウム
リクエファシエンス（Aureobacterium liquefaciens
）はマイクロバクテリウム リクエファシエンス（Mic
robacterium liquefaciens ）に分類され、マイクロバ
クテリウム リクエファシエンス（Microbacterium liq
uefaciens ）ＡＪ３９１２（国内寄託番号ＦＥＲＭ−Ｐ
３１３３、国際寄託番号ＦＥＲＭ−ＢＰ７６４３）とし
て独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ
ーに寄託されている。

【００３１】マイクロバクテリウム リクエファシエン
ス（Microbacterium liquefaciens）ＡＪ３９１２（Ｆ
ＥＲＭ−Ｐ３１３３）について、細菌の分類学書である
バージェーズ マニュアル オブ デターミネイティブ
バクテリオロジー 第１巻（第９版 1994年、ウイリ
アム アンド ウイルキンス社出版）に照らしあわせて
生理性状試験を実施した試験結果を表１に示す。

【００３２】

【表１】

【００３３】また、本発明者らは、マイクロバクテリウ
ム リクエファシエンス（Microbacterium liquefacien
s ）ＡＪ３９１２由来のＨＲａｓｅを精製し、ＨＲａｓ
ｅのアミノ酸配列を決定した。さらに、ＨＲａｓｅのア
ミノ酸配列から演繹した３０塩基対程度のＤＮＡ分子を
合成し、これをプローブとして利用しマイクロバクテリ
ウム属細菌由来ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡ全長を、
マイクロバクテリウム属細菌染色体遺伝子ライブラリー
から単離することに成功した。

【００３４】さらに、本発明者らは、マイクロバクテリ
ウム属細菌由来ＨＲａｓｅ遺伝子の単離の際、同時に得
られたＨＲａｓｅ遺伝子下流の塩基配列がヒダントイナ
ーゼ（以下ＨＨａｓｅ）遺伝子の一部であると予想し、
該ＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅し、プローブとして
利用することにより、当該菌株の遺伝子ライブラリーか
らＨＨａｓｅ遺伝子の全長の単離・取得に成功した。同
様に、ＨＨａｓｅ遺伝子の単離の際、ＨＨａｓｅ遺伝子
下流の塩基配列がＮ−カルバミルアミノ酸ハイドロラー
ゼ（以下ＣＨａｓｅ）遺伝子の一部であると予想し、該
ＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅し、プローブとして利
用することにより、ＣＨａｓｅ遺伝子の全長の単離・取
得に成功した。

【００３５】すなわち、図１に示すように、本発明のＨ
Ｒａｓｅは、ＨＨａｓｅ遺伝子およびＣＨａｓｅ遺伝子
とともにオペロンを形成していると考えられる。図１
中、はＥｃｏＲ Ｉ／ＰｓｔＩ断片であり、はＫｐ
ｎ Ｉ／Ｓａｃ Ｉ断片であり、はＢｇｌ ＩＩ断片で
ある。

【００３６】なお、添付した本発明の配列表において、
上記方法によって特定された本発明のＨＲａｓｅをコー
ドするＤＮＡを配列番号１に示し、ＨＨａｓｅをコード
するＤＮＡを配列番号３に示し、ＣＨａｓｅをコードす
るＤＮＡを配列番号５に示す。また、ＨＲａｓｅ遺伝
子、ＨＨａｓｅ遺伝子およびＣＨａｓｅ遺伝子を含む構
造遺伝子群をコードするＤＮＡを配列番号７に示す。配
列番号７に記載の塩基配列のうち、塩基番号１〜７０８
が本発明のＨＲａｓｅをコードし、塩基番号７２９〜２
１０５がＨＨａｓｅをコードし、塩基番号２１０５〜３
３４０がＣＨａｓｅをコードしている。

【００３７】これらのＤＮＡは、マイクロバクテリウム
リクエファシエンス（Microbacterium liquefacien
s）ＡＪ３９１２株の染色体ＤＮＡから単離されたもの
であり、いずれもＬ−アミノ酸の製造に係わるタンパク
質をコードするものである。

【００３８】また、配列表の配列番号２に、配列表の配
列番号１の塩基配列がコードするＨＲａｓｅのアミノ酸
配列を示し、配列表の配列番号４に、配列表の配列番号
３の塩基配列がコードするＨＨａｓｅのアミノ酸配列を
示し、配列表の配列番号６に、配列表の配列番号５の塩
基配列がコードするＣＨａｓｅのアミノ酸配列を示す。

【００３９】配列表の配列番号２に記載のＨＲａｓｅ、
配列表の配列番号４に記載のＨＨａｓｅおよび配列表の
配列番号６に記載のＣＨａｓｅは、下記反応式（II）に
示すように、５−（４−ヒドロキシベンジル）ヒダント
インに代表される５置換ヒダントインから、Ｌ−チロシ
ンに代表される光学活性アミノ酸を生成する反応を触媒
する。

【００４０】

【化２】

【００４１】次に、本発明の新規ＨＲａｓｅについて、
（1）ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡ、（2）ＨＲａｓｅ
の性質、（3）ＨＲａｓｅの製造方法の順に詳細に説明
する。

【００４２】（1）ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡ 配列表の配列番号１の塩基配列を有する本発明のＨＲａ
ｓｅ遺伝子は、前述したようにマイクロバクテリウム
リクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens）
ＡＪ３９１２株の染色体ＤＮＡから単離されたものであ
る。配列表の配列番号１の塩基配列は、既知のシュード
モナス属細菌由来のＨＲａｓｅ（J.Bacteriol.１７４
巻、９６２ページ、１９９２年）とアミノ酸配列におい
て４８％の相同性を示し、塩基配列において４９％の相
同性を示す。

【００４３】マイクロバクテリウム属細菌からＨＲａｓ
ｅをコードするＤＮＡを取得する方法について説明す
る。

【００４４】はじめに、精製されたＨＲａｓｅのアミノ
酸配列を決定する。エドマン法（Edman,P., Acta Chem.
Scand. 4, 227 (1950)）を用いてアミノ酸配列を決定
することができる。またApplied Biosystems社製のシー
クエンサーを用いてアミノ酸配列を決定することができ
る。本発明のマイクロバクテリウム属細菌由来ＨＲａｓ
ｅについて、Ｎ末端から３０残基のアミノ酸配列を決定
したところ、配列表配列番号８に示される配列が明らか
となった。

【００４５】明らかとなったアミノ酸配列に基づいて、
これをコードするＤＮＡの塩基配列を演繹できる。ＤＮ
Ａの塩基配列を演繹するには、ユニバーサルコドンを採
用する。

【００４６】演繹された塩基配列に基づいて、３０塩基
対程度のＤＮＡ分子を合成する。該ＤＮＡ分子を合成す
る方法はTetrahedron Letters, 22, 1859 (1981)に開示
されている。また、Applied Biosystems社製のシンセサ
イザーを用いて該ＤＮＡ分子を合成できる。該ＤＮＡ分
子は、マイクロバクテリウム属細菌由来ＨＲａｓｅをコ
ードするＤＮＡ全長を、マイクロバクテリウム属細菌染
色体遺伝子ライブラリーから単離する際に、プローブと
して利用できる。あるいは、マイクロバクテリウム属細
菌由来ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡをＰＣＲ法で増幅
する際に、プライマーとして利用できる。ただし、ＰＣ
Ｒ法を用いて増幅されるＤＮＡはマイクロバクテリウム
属細菌由来ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡ全長を含んで
いないので、ＰＣＲ法を用いて増幅されるＤＮＡをプロ
ーブとして用いて、マイクロバクテリウム属細菌由来Ｈ
ＲａｓｅをコードするＤＮＡ全長をマイクロバクテリウ
ム属細菌染色体遺伝子ライブラリーから単離する。

【００４７】ＰＣＲ法の操作については、White, T.J.
et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)等に記載されて
いる。染色体ＤＮＡを調製する方法、さらにＤＮＡ分子
をプローブとして用いて、遺伝子ライブラリーから目的
とするＤＮＡ分子を単離する方法については、Molecula
r Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1
989)等に記載されている。

【００４８】単離されたマイクロバクテリウム属細菌由
来ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡの塩基配列を決定する
方法は、A Practical Guide to Molecular Cloning, Jo
hn Wiley & Sons, Inc. (1985)に記載されている。ま
た、Applied Biosystems社製のＤＮＡシークエンサーを
用いて、塩基配列を決定することができる。マイクロバ
クテリウム属細菌由来ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡを
配列表配列番号１に示す。

【００４９】なお、マイクロバクテリウム属細菌由来Ｈ
ＲａｓｅをコードするＤＮＡは、配列表配列番号１に示
されるＤＮＡだけではない。すなわち、マイクロバクテ
リウム属に属する細菌の種および株ごとに、塩基配列の
違いが観察されるはずだからである。

【００５０】また、本発明のＤＮＡは単離されたＨＲａ
ｓｅをコードするＤＮＡのみではなく、当然ながら、マ
イクロバクテリウム属細菌の染色体ＤＮＡから単離され
たＨＲａｓｅをコードするＤＮＡに人工的に変異を加え
たＤＮＡであっても、ＨＲａｓｅをコードする場合に
は、本発明のＤＮＡである。人工的に変異を加える方法
として頻繁に用いられるものとして、Method. in Enzym
ol.,154 (1987)に記載されている部位特異的変異導入法
がある。

【００５１】また、配列表配列番号１に記載の塩基配列
とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配
列を有し、５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有する
タンパク質をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡであ
る。ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる
特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリ
ッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値
化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高
いＤＮＡ同士、例えば５０％以上、より好ましくは８０
％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有する
ＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い
ＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常
のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６
０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、このましくは、６
０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、さらに好まし
くは６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当す
る塩濃度でハイブリダイズする条件があげられる。ま
た、「５置換ヒダントインラセマーゼ活性」とは、５置
換ヒダントイン化合物をラセミ化する活性であればよ
い。ただし、配列表の配列番号１に記載の塩基配列とス
トリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列の
場合には、５０℃、ｐＨ８の条件下で配列表の配列番号
２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度
以上の酵素活性を保持していることが望ましい。

【００５２】さらに、配列表の配列番号１に記載のＤＮ
ＡがコードするＨＲａｓｅと実質的に同一のタンパク質
をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡである。すなわ
ち、（a）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列、
（b）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
て1または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列を有し、５置換ヒダン
トインラセマーゼ活性を有するタンパク質をコードする
ＤＮＡも本発明のＤＮＡである。ここで、「数個」と
は、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造や、５置換ヒ
ダントインラセマーゼ活性を大きく損なわない範囲のも
のであり、具体的には、２〜５０個、好ましくは２〜３
０個、さらに好ましくは２〜１０個である。また、「５
置換ヒダントインラセマーゼ活性」とは、前述のとお
り、５置換ヒダントイン化合物をラセミ化する活性を意
味する。ただし、（b）配列表の配列番号２に記載のア
ミノ酸配列において1または数個のアミノ酸残基の置
換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列の
場合には、５０℃、ｐＨ８の条件下で配列表の配列番号
２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度
以上の酵素活性を保持していることが望ましい。

【００５３】（2）ＨＲａｓｅの性質 つぎに、精製されたマイクロバクテリウム属細菌由来Ｈ
Ｒａｓｅの性質について説明する。

【００５４】本発明のＨＲａｓｅは前述した遺伝子の単
離と解析より明らかにされるように、配列表配列番号２
に記載のアミノ酸配列を有する。しかし、本発明は、配
列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において1また
は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または
逆位を含むアミノ酸配列を有し、５置換ヒダントインラ
セマーゼ活性を有するタンパク質をも含むものである。

【００５５】すなわち、本発明のＨＲａｓｅは、下記
(a)または(b)のアミノ酸配列を有し、５置換ヒダントイ
ンラセマーゼ活性を有するタンパク質である。 （a）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列 （b）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
て1または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列 ここで、「数個」および「５置換ヒダントインラセマー
ゼ活性」の定義は（1）ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡ
の項の説明と同義である。

【００５６】本発明のＨＲａｓｅは、５置換ヒダントイ
ン化合物のラセミ化反応を触媒する。

【００５７】本発明のＨＲａｓｅのＨＲａｓｅ活性の測
定は、光学活性なＤ−、またはＬ−５置換ヒダントイン
化合物を基質とし、ラセミ化度をこれらの旋光度の変化
を測定する、または、光学分割カラムを用いた高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定することに
より行うことが可能である。

【００５８】具体的には、１２０ ｍｇ／ｄｌ Ｌ−また
はＤ−ベンジルヒダントイン（ＢＨ）、５０ mM リン酸
−カリウム緩衝液（ＫＰＢ） (ｐＨ ８．０)、５ mM ジ
チオスレイトール（ＤＴＴ）およびＨＲａｓｅ酵素溶液
を含む反応液を３７℃で３０分間インキュベートした
後、９倍容の１．１ mM ＣｕＳＯ₄、１１．１ mM Ｈ₃Ｐ
Ｏ₄溶液を添加することにより反応を停止させた。２
０，０００ｇ×１０分の遠心により沈澱を取り除いた
後、ＨＰＬＣにてラセミ化したＢＨ量を定量し、ラセミ
化活性を見積もった。なお、酵素活性の単位として、こ
の条件にて１分に１μｍｏｌのＢＨをラセミ化する酵素
活性をもって１Ｕと定義した。

【００５９】ＨＰＬＣを用いた分析光学活性ＢＨの定量
分析はダイセル化学ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＷＨ ０．４６
ｃｍφ×２５ｃｍを用いて行った。分析条件は以下の通
り。 移動相：５％ (ｖ／ｖ) methanol, １ mM ＣｕＳＯ₄カラム 温度：５０℃ 流速：１．５ ml/分 検出：ＵＶ₂₁₀ この条件において、Ｄ−ＢＨ (リテンションタイム４．
２分)、Ｌ−ＢＨ （同５．３ 分）に溶出した。

【００６０】次に、本発明のＨＲａｓｅについて、上記
分析方法にて測定した酵素化学的性質を以下に述べる。

【００６１】本発明のＨＲａｓｅは、今まで報告されて
いるＨＲａｓｅと比較して作用至適温度が高温領域にあ
るため、ラセミ化反応を効率的に触媒できることを特徴
とする。すなわち、上記（a）または（b）のアミノ酸配
列を有する本発明のＨＲａｓｅは、そのアミノ酸配列の
違いにより、多少の差はあるものの、作用至適温度が５
０℃超であることを特徴とする。より好ましい作用至適
温度は５２℃以上であり、より好ましくは５５℃超であ
る。作用至適温度の上限は特にないが、ＨＲａｓｅの温
度安定性を考慮すると６０℃以下であることが好まし
い。なお、本願明細書における「作用至適温度」とは、
ｐＨ８の条件下において、最大活性を示す温度を意味す
る。

【００６２】至適ｐＨ：約７〜約９付近にある。作用至
適ｐＨの範囲を求めるために、４０℃の条件下で３０分
間反応を行った。

【００６３】ｐＨ安定性：約６〜約９付近にある。０℃
の条件下で、３０分間各ｐＨ処理した場合のｐＨ安定性
を調べた。

【００６４】温度安定性：約４０℃以下で安定である。
ｐＨ８．０の条件下で３０分間加温処理した場合の温度
安定性を調べた。

【００６５】阻害剤の影響：ＮＥＭ（Ｎ−エチルマレイ
ミド）、銅イオン、ＩＡＡ（モノヨード酢酸）によって
強く阻害される。ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）
ではほとんど阻害されない。なお、本発明のＨＲａｓｅ
はＤＴＴ（ジチオトレイトール）を添加することにより
活性化される。

【００６６】分子量：ａ）約１０７，０００（ゲル濾過
法）、ｂ）約２７，０００(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法) 本発明のＨＲａｓｅは、分子量は２７，０００のサブユ
ニット４量体構造をとると想定される。

【００６７】（3）ＨＲａｓｅおよび５置換ヒダントイ
ンラセマーゼ活性を有するタンパク質の製造方法 次に本発明のＨＲａｓｅおよび５置換ヒダントインラセ
マーゼ活性を有するタンパク質の製造方法について説明
する。本発明のＨＲａｓｅおよび５置換ヒダントインラ
セマーゼ活性を有するタンパク質の製造方法としては、
(i) 微生物培養によりＨＲａｓｅを生成蓄積させる方法
と、(ii)組み換えＤＮＡ技術によりＨＲａｓｅまたは５
置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質を
生成する形質転換体を作成し、当該形質転換体を培養す
ることにより当該タンパク質を生成蓄積させる方法の２
つがある。

【００６８】(i) 微生物培養により生成蓄積する方法 微生物培養により生成蓄積する方法において、ＨＲａｓ
ｅの取得源となる微生物としてはマイクロバクテリウム
（Microbacterium）属に属する微生物があげられる。好
適なものとしては、マイクロバクテリウム リクエファ
シエンス（Microbacterium liquefaciens ）ＡＪ３９１
２（ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３）があげられる。

【００６９】マイクロバクテリウム属に属する微生物の
培養形態は液体培養、固体培養いずれも可能であるが、
工業的に有利な方法は、深部通気撹拌培養法である。栄
養培地の栄養源としては、微生物培養に通常用いられる
炭素源、窒素源、無機塩およびその他の微量栄養源を使
用できる。使用菌株が利用できる栄養源であればすべて
を使用できる。

【００７０】通気条件としては、好気条件を採用する。
培養温度としては、菌が発育し、ＨＲａｓｅが生産され
る範囲であれば良い。従って、厳密な条件は無いが、通
常１０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃である。培養
時間は、その他の培養条件に応じて変化する。例えば、
ＨＲａｓｅが最も生産される時間まで培養すれば良く、
通常５時間〜７日間、好ましくは１０時間〜３日間程度
である。

【００７１】培養後菌体を遠心分離（たとえば、１０，
０００ｘｇ、１０分）により集菌する。当該酵素は菌体
中に存在するので、この菌体を破砕、または溶菌させる
ことにより、酵素の可溶化を行う。菌体破砕には、超音
波破砕、フレンチプレス破砕、ガラスビーズ破砕等の方
法を用いることができ、また溶菌させる場合には、卵白
リゾチームや、ペプチダーゼ処理またはこれらを適宜組
み合わせた方法が用いられる。

【００７２】マイクロバクテリウム属細菌由来ＨＲａｓ
ｅを精製する場合、酵素可溶化液を出発材料として精製
することになるが、未破砕あるいは未溶菌残査が存在す
るようであれば、可溶化液を再度遠心分離操作に供し、
沈殿する残査を除いた方が、精製に有利である。

【００７３】酵素の精製には、通常酵素の精製を行うた
めに用いられる全ての常法、例えば硫安塩析法、ゲル濾
過法、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水クロマト
グラフィー法等を採用することができる。その結果、よ
り比活性が高いＨＲａｓｅ含有画分を得ることができ
る。

【００７４】(ii)組み換えＤＮＡ技術による製法 次に、組み換えＤＮＡ技術によってＨＲａｓｅまたは５
置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質
（以下、(ii)組み換えＤＮＡ技術による製法において、
ＨＲａｓｅと省略する。）を製造する方法について説明
する。組み換えＤＮＡ技術を利用して酵素、生理活性物
質等の有用タンパク質を製造する例は数多く知られてお
り、組み換えＤＮＡ技術を用いることで、天然に微量に
存在する有用タンパク質を大量生産できる。

【００７５】図２は、本発明のＨＲａｓｅの製造工程の
フローチャートである。先ず、本発明のＨＲａｓｅをコ
ードするＤＮＡを調製する(ステップＳ１)。次に、調製
したＤＮＡをベクターＤＮＡと接続して組み換えＤＮＡ
を作製し(ステップＳ２)、該組み換えＤＮＡによって細
胞を形質転換して形質転換体を作製する(ステップＳ
３)。続いて、該形質転換体を培地中で培養し、培地中
および／または細胞中にＨＲａｓｅを生成蓄積させる
(ステップＳ４)。その後、ステップＳ５に進み、該酵素
を回収・精製することによって精製ＨＲａｓｅを製造す
る。また、ステップＳ５で生産した精製ＨＲａｓｅまた
はステップＳ４のＨＲａｓｅが蓄積された培地をアミノ
酸を合成に用いることで、目的とする光学活性アミノ酸
を大量に製造することができる(ステップＳ６)。

【００７６】なお、ベクターＤＮＡと接続されるＤＮＡ
は、本発明のＨＲａｓｅが発現可能であればよい。

【００７７】ここで、ベクターＤＮＡに接続されるＨＲ
ａｓｅゼ遺伝子としては、上述の(a)配列表の配列番号
１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、(b)配列表の配列
番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件でハ
イブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡ、(c)配列表
の配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａ、(d)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列にお
いて1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿
入、付加または逆位を含むアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡなどを使用できる。

【００７８】タンパクを組み換えＤＮＡ技術を用いて大
量生産する場合、該タンパクを生産する形質転換体内で
該タンパクが会合し、タンパクの封入体（inclusion bo
dy）を形成させることが好ましい。この発現生産方法の
利点は、目的のタンパク質を菌体内に存在するプロテア
ーゼによる消化から保護する点および目的のタンパク質
を菌体破砕に続く遠心分離操作によって簡単に精製でき
る点等である。

【００７９】このようにして得られるタンパク封入体
は、タンパク変性剤により可溶化され、主にその変性剤
を除去することによる活性再生操作を経た後、正しく折
り畳まれた生理的に活性なタンパクに変換される。例え
ば、ヒトインターロイキン−２の活性再生（特開昭６１
−２５７９３１号公報）等多くの例がある。

【００８０】タンパク封入体から活性型タンパクを得る
ためには、可溶化・活性再生等の一連の操作が必要であ
り、直接活性型タンパクを生産する場合よりも操作が複
雑になる。しかし、菌体の生育に影響を及ぼすようなタ
ンパクを菌体内で大量に生産させる場合は、不活性なタ
ンパク封入体として菌体内に蓄積させることにより、そ
の影響を抑えることができる。

【００８１】目的タンパクを封入体として大量生産させ
る方法として、強力なプロモータの制御下、目的のタン
パクを単独で発現させる方法の他、大量発現することが
知られているタンパクとの融合タンパクとして発現させ
る方法がある。

【００８２】さらに、融合タンパクとして発現させた後
に、目的のタンパクを切り出すため、制限プロテアーゼ
の認識配列を適当な位置に配しておくことも有効であ
る。

【００８３】タンパクを組み換えＤＮＡ技術を用いて大
量生産する場合、形質転換される宿主細胞としては、細
菌細胞、放線菌細胞、酵母細胞、カビ細胞、植物細胞、
動物細胞等を用いることができるが、一般に大腸菌、好
ましくはエシェリヒア コリが用いられる。大腸菌を用
いてタンパクを大量生産する技術について数多くの知見
があるためである。以下、形質転換された大腸菌を用い
てＨＲａｓｅを製造する方法を説明する。

【００８４】ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡを発現させ
るプロモータとしては、通常大腸菌における異種タンパ
ク生産に用いられるプロモータを使用することができ、
例えば、Ｔ７プロモータ、ｔｒｐプロモータ、ｌａｃプ
ロモータ、ｔａｃプロモータ、ＰＬプロモータ等の強力
なプロモータが挙げられる。

【００８５】ＨＲａｓｅを融合タンパク封入体として生
産させるためには、ＨＲａｓｅ遺伝子の上流あるいは下
流に、他のタンパク、好ましくは親水性であるペプチド
をコードする遺伝子を連結して、融合タンパク遺伝子と
する。このような他のタンパクをコードする遺伝子とし
ては、融合タンパクの蓄積量を増加させ、変性・再生工
程後に融合タンパクの溶解性を高めるものであればよ
く、例えば、Ｔ７ｇｅｎｅ １０、β−ガラクトシダー
ゼ遺伝子、デヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、インターフェ
ロンγ遺伝子、インターロイキン−２遺伝子、プロキモ
シン遺伝子等が候補として挙げられる。

【００８６】これらの遺伝子とＨＲａｓｅをコードする
遺伝子とを連結する際には、コドンの読み取りフレーム
が一致するようにする。適当な制限酵素部位で連結する
か、あるいは適当な配列の合成ＤＮＡを利用すればよ
い。

【００８７】また、生産量を増大させるためには、融合
タンパク遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネー
ターを連結することが好ましい。このターミネータとし
ては、Ｔ７ターミネータ、ｆｄファージターミネータ、
Ｔ４ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子のター
ミネータ、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネータ等が挙
げられる。

【００８８】ＨＲａｓｅまたはＨＲａｓｅと他のタンパ
クとの融合タンパクをコードする遺伝子を大腸菌に導入
するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型
のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を有す
るプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３
２２系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。
ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位などによってプラスミドに改変を施したも
のを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異剤やＵ
Ｖ照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによ
る改変をも含む。

【００８９】また、形質転換体を選別するために、該ベ
クターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有する
ことが好ましい。このようなプラスミドとして、強力な
プロモーターを持つ発現ベクターが市販されている（ｐ
ＵＣ系（宝酒造（株）製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテ
ック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック製）ほ
か）。

【００９０】プロモータ、ＨＲａｓｅまたはＨＲａｓｅ
と他のタンパクとの融合タンパクをコードする遺伝子、
ターミネータの順に連結したＤＮＡ断片と、ベクターＤ
ＮＡとを連結して組み換えＤＮＡを得る。

【００９１】該組み換えＤＮＡを用いて大腸菌を形質転
換し、この大腸菌を培養すると、ＨＲａｓｅまたはＨＲ
ａｓｅと他のタンパクとの融合タンパクが発現生産され
る。形質転換される宿主は、異種遺伝子の発現に通常用
いられる株を使用することができるが、エシェリヒア
コリ ＪＭ１０９株，特にＪＭ１０９（ＤＥ３）株が好
ましい。形質転換を行う方法、および形質転換体を選別
する方法はMolecular Cloning, 2nd edition, Cold Spr
ing Harbor press (1989)等に記載されている。

【００９２】融合タンパクとして発現させた場合、血液
凝固因子Ｘａ、カリクレインなどの、ＨＲａｓｅ内に存
在しない配列を認識配列とする制限プロテアーゼを用い
てＨＲａｓｅを切り出せるようにしてもよい。

【００９３】生産培地としては、Ｍ９−カザミノ酸培
地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる
培地を用いてもよい。また、培養条件、生産誘導条件
は、用いたベクターのマーカー、プロモータ、宿主菌等
の種類に応じて適宜選択する。

【００９４】ＨＲａｓｅまたはＨＲａｓｅと他のタンパ
クとの融合タンパクを回収するには、以下の方法などが
ある。ＨＲａｓｅあるいはその融合タンパク質が菌体内
に可溶化されていれば、菌体を回収した後、菌体を破砕
あるいは溶菌させ、粗酵素液として使用できる。さら
に、必要に応じて、通常の沈澱、濾過、カラムクロマト
グラフィー等の手法によりＨＲａｓｅあるいはその融合
タンパク質を精製して用いることも可能である。この場
合、ＨＲａｓｅあるいは融合タンパク質の抗体を利用し
た精製法も利用できる。

【００９５】タンパク封入体が形成される場合には、変
性剤でこれを可溶化する。菌体タンパクとともに可溶化
してもよいが、以降の精製操作を考慮すると、封入体を
取り出して、これを可溶化するのが好ましい。封入体を
菌体から回収するには、従来公知の方法で行えばよい。
例えば、菌体を破壊し、遠心分離操作等によって封入体
を回収する。タンパク封入体を可溶化させる変性剤とし
ては、グアニジン塩酸（例えば、６Ｍ、ｐＨ５〜８）や
尿素（例えば８Ｍ）などが挙げられる。

【００９６】これらの変性剤を透析等により除くと、活
性を有するタンパクとして再生される。透析に用いる透
析溶液としては、トリス塩酸緩衝液やリン酸緩衝液など
を用いればよく、濃度としては２０ｍＭ〜０．５Ｍ、ｐ
Ｈとしては５〜８が挙げられる。

【００９７】再生工程時のタンパク濃度は、５００μｇ
／ｍｌ程度以下に抑えるのが好ましい。再生したＨＲａ
ｓｅが自己架橋を行うのを抑えるために、透析温度は５
℃以下であることが好ましい。また、変性剤除去の方法
として、この透析法のほか、希釈法、限外濾過法などが
あり、いずれを用いても活性の再生が期待できる。

【００９８】ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡとして、配
列表配列番号１に示されるＤＮＡを用いた場合には配列
番号２に記載のアミノ酸配列を有するＨＲａｓｅが生産
される。

【００９９】[II] ＨＲａｓｅを用いた光学活性アミノ
酸の製法 次に、本発明のＨＲａｓｅを用いて、５置換ヒダントイ
ン化合物から光学活性アミノ酸を製造する方法について
述べる。

【０１００】光学活性アミノ酸製造反応に用いる本発明
のＨＲａｓｅとしては、下記(a)または(b)のアミノ酸配
列を有し、ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパ
ク質が挙げられる。 （a）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列 （b）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列におい
て1または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列

【０１０１】上記ＨＲａｓｅとしては、（１）マイクロ
バクテリウム属細菌を培養して得たＨＲａｓｅを用いて
も良いし、（２）組み換えＤＮＡ技術によりマイクロバ
クテリウム属細菌由来のＨＲａｓｅを生成する形質転換
体を作成し、当該形質転換体を培養して得たＨＲａｓｅ
を用いても良い。

【０１０２】マイクロバクテリウム属細菌または組み換
えＤＮＡによって形質転換された細胞を用いて、ＨＲａ
ｓｅを製造する場合、培養しながら、培養液中に直接基
質を添加してもよいし、培養液より分離された菌体、洗
浄菌体などいずれも使用可能である。また、菌体を破砕
あるいは溶菌させた菌体処理物をそのまま用いてもよい
し、当該菌体処理物からＨＲａｓｅを回収し、粗酵素液
として使用してもよいし、さらに、酵素を精製して用い
てもよい。すなわち、ＨＲａｓｅ活性を有する画分であ
れば、酵素と当該酵素含有物全てを使用することが可能
である。ここで「酵素含有物」とは、当該酵素を含むも
のであればよく、具体的には培養物、培養菌体、洗浄菌
体、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理物、粗酵素
液、精製酵素などを含む。

【０１０３】本発明の光学活性アミノ酸の製造方法にお
いては、本発明のＨＲａｓｅの他、 ５置換ヒダントイン化合物に作用し、当該物質を加水
分解することによりＮ−カルバミルアミノ酸を生成する
反応を触媒するヒダントイナーゼ（ＨＨａｓｅ）、 生成したＮ−カルバミルアミノ酸に作用し、当該物質
を加水分解することにより光学活性アミノ酸を生成する
反応を触媒するＮ−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼ
（ＣＨａｓｅ） の２つの酵素が必要である。

【０１０４】ここで、５置換ヒダントイン化合物を加水
分解するＨＨａｓｅの光学選択性が高い場合には、光学
選択性の高いＨＨａｓｅと本発明のＨＲａｓｅとを５置
換ヒダントイン化合物に作用させることにより、高収率
（ＨＲａｓｅの作用によりモル収率５０％以上）で光学
活性のＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸またはＮ−カルバ
ミル−Ｄ−アミノ酸の一方のみを生成させることができ
る。この場合は、引き続きＣＨａｓｅまたは当該酵素含
有物を用いて光学活性アミノ酸を製造しても良いし、亜
硝酸による化学的な加水分解処理を施すことにより、光
学活性を維持したまま、高収率で光学活性アミノ酸を製
造できる（微生物酵素系と化学反応系との組み合わせに
よる方法）。

【０１０５】５置換ヒダントイン化合物を光学選択的に
加水分解するＨＨａｓｅは次のようにして入手できる。
たとえば、Ｎ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸を生成するＤ
−ＨＨａｓｅを有する菌としては、バチルス属細菌に耐
熱性の酵素の存在が知られており、例としてバチルス
ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilu
s)ＡＴＣＣ３１１９５等からＨＨａｓｅまたは、ＨＨａ
ｓｅ含有画分を調製すれば良い(Appl.Microbiol. Biot
echnol.４３巻 ２７０ページ、１９９５年)。ＡＴＣＣ
３１１９５株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション（American Type Culture Collection、住所
12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U
nited States of America）から入手することができ
る。また、Ｌ体ヒダントイン化合物に特異的に作用する
Ｌ−ＨＨａｓｅは、例えばバチルスエスピー（Bacillus
sp.）ＡＪ１２２９９株にその存在が知られている（特
開昭６３−２４８９４号公報）。バチルス エスピー
ＡＪ１２２９９株は、１９８６年７月５日に通商産業省
工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番
号ＦＥＲＭ−Ｐ８８３７が付与され、２００１年６月２
７日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託セ
ンターにブタペスト条約に基づき移管され、受託番号Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ-７６４６が付与された微生物である。

【０１０６】ＨＨａｓｅに光学選択的加水分解活性がな
くとも、ＣＨａｓｅに光学選択性があれば、生成アミノ
酸はＤ−もしくはＬ−の光学活性体となる。この場合、
反応液中には未反応のエナンチオマーであるＮ−カルバ
ミルアミノ酸、すなわちＣＨａｓｅがＮ−カルバミル−
Ｌ−アミノ酸を選択的に分解し、Ｌ−アミノ酸を生成さ
せる場合には、Ｎ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸が、また
逆にＤ−アミノ酸を生成させる場合には、Ｎ−カルバミ
ル−Ｌ−アミノ酸が残存することが想定される。しかし
ながら、このような場合においてＨＨａｓｅは、残存す
ることになる未反応エナンチオマーのＮ−カルバミルア
ミノ酸を脱水縮合させ、再度５置換ヒダントイン化合物
を生成させる逆反応をもわずかながら触媒するので、Ｈ
Ｒａｓｅ、ＨＨａｓｅ、光学選択性の高いＣＨａｓｅの
３種の酵素、もしくは３種の酵素含有物により、高収率
（ＨＲａｓｅの作用によりモル収率５０％以上）で光学
活性アミノ酸を製造することが可能となる。

【０１０７】光学選択性のないＨＨａｓｅは、本発明に
示したマイクロバクテリウム リクエファシエンス（Mi
crobacterium liquefaciens）ＡＪ３９１２株のほか、
例えばアースロバクター オーレセンス（Arthrobacter
aurescens）にその存在が知られている（J.Biotechno
l.６１巻、１ページ、１９９８年）。

【０１０８】Ｎ−カルバミルアミノ酸をＤ体選択的に加
水分解するＣＨａｓｅは、たとえばシュードモナス（Ps
eudomonas sp. ）ＡＪ １１２２０株にその存在が知ら
れている(特公昭５６−００３０３４号公報)。再同定の
結果、シュードモナス（Pseudomonas sp. ）ＡＪ １１
２２０株は、アグロバクテリウム エスピー（Agrobact
erium sp. ）に属することが判明している。アグロバク
テリウム エスピー ＡＪ １１２２０株は１９７７年１
２月２０日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研
究所に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ４３４７が付与
され、２００１年６月２７日に独立行政法人産業技術総
合研究所特許生物寄託センターにブタペスト条約に基づ
き移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ-７６４５が付与
された微生物である。またＮ−カルバミルアミノ酸をＬ
体選択的に加水分解するＣＨａｓｅは、たとえばフラボ
バクテリウム エスピー.（Flavobacterium sp.）ＡＪ
３９１２ (特公昭５６−００８７４９号公報)、バチル
ス エスピー.(Bacillus sp.)ＡＪ１２２９９にその存
在が知られている。フラボバクテリウム エスピー.Ａ
Ｊ３９１２株は、上述の通り現在ではマイクロバクテリ
ウム リクエファシエンス（Microbacterium liquefaci
ens ）ＡＪ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３）に分類さ
れているが、１９７５年６月２７日に通商産業省工業技
術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号ＦＥ
ＲＭ−Ｐ３１３３が付与され、２００１年６月２７日に
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター
にブタペスト条約に基づき移管され、受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ-７６４３が付与された微生物である。またバチ
ルス エスピーＡＪ１２２９９株は、１９８６年７月５
日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に
寄託され、受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ８８３７が付与され、
２００１年６月２７日に独立行政法人産業技術総合研究
所特許生物寄託センターにブタペスト条約に基づき移管
され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ-７６４６が付与された
微生物である。

【０１０９】ＨＲａｓｅまたはＨＲａｓｅ含有画分の基
質としては、当該酵素の基質特異性においてラセミ化で
きる５置換ヒダントイン化合物であれば、いかなるもの
も使用できる。５置換ヒダントイン化合物の例として
は、５−インドリルメチルヒダントイン、５−（ｐ−ハ
イドロキシベンジル）ヒダントイン、５−イソブチルヒ
ダントイン、５−（３’−ピリジル）−メチルヒダント
イン等が挙げられる。

【０１１０】なお、好ましいＨＲａｓｅ、ＨＨａｓｅお
よびＣＨａｓｅの組み合わせとして、配列表配列番号２
に記載のアミノ酸配列を有するＨＲａｓｅ、配列表配列
番号４に記載のアミノ酸配列を有するＨＨａｓｅ、配列
表配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するＣＨａｓｅ
の組み合わせが挙げられる。これらの酵素いずれも、マ
イクロバクテリウム リクエファシエンス（Microbacte
rium liquefaciens）ＡＪ３９１２株由来の酵素であ
る。

【０１１１】配列表配列番号２に記載のアミノ酸配列を
有するＨＲａｓｅ、配列表配列番号４に記載のアミノ酸
配列を有するＨＨａｓｅおよび配列表配列番号６に記載
のアミノ酸配列を有するＣＨａｓｅを組み合わせて用い
る場合、これらのＬ−アミノ酸の製造に係わるタンパク
質のすべてをコードする配列表の配列番号７に記載の構
造遺伝子群とベクターとが接続されて得られる組み換え
ＤＮＡを用いて形質転換された細胞を培養することによ
って得られたＨＲａｓｅ、ＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅ
からなる混成タンパク質を用いることもできる。当該混
成タンパク質を用いた場合、下記反応式（II）に示すよ
うに、混成タンパク質に含まれるヒダントンラセマーゼ
が５置換ヒダントイン化合物のラセミ化を触媒するの
で、ＤＬ体の５置換ヒダントイン化合物から理論的には
モル収率１００％でＬ−アミノ酸を製造することが可能
となる。

【０１１２】

【化３】

【０１１３】なお、上記混成タンパク質を用いてＮ−カ
ルバミルアミノ酸を製造することも可能である。例え
ば、上記混成タンパク質にＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ
酸ハイドロラーゼの阻害剤等を添加して加水分解反応を
Ｎ−カルバミルアミノ酸で止めることにより、Ｎ−カル
バミルアミノ酸を製造できる。

【０１１４】マイクロバクテリウム属細菌または組み換
えＤＮＡによって形質転換された細胞の培養液、分離菌
体、洗浄菌体、菌体処理物、当該菌体処理物から得られ
る粗酵素液または精製酵素を用いてアミノ酸生成反応を
進行させる場合には、５置換ヒダントイン化合物と培養
液、分離菌体、洗浄菌体、菌体処理物、粗酵素液、また
は精製酵素を含む反応液を２５〜４０℃の適当な温度に
調整し、ｐＨ５〜９に保ちつつ、８時間〜５日静置また
は攪拌すればよい。

【０１１５】また、マイクロバクテリウム属細菌または
組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞を水溶性媒
体中で培養しながら、アミノ酸生成反応を進行させる場
合には、５置換ヒダントイン化合物を含み、かつ形質転
換された細胞の生育に必要な炭素源、窒素源、無機イオ
ンなどの栄養素を含む水溶性媒体が用いられる。さらに
ビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を添加すると望
ましい結果が得られる場合が多い。５置換ヒダントイン
化合物は分割添加してもよい。好気的条件下でｐＨ５〜
９、温度２５〜４０℃の適当な範囲に制御しつつ、８時
間〜５日培養することが好ましい。

【０１１６】生成したアミノ酸は、公知の手法により分
離精製することができる。例えば、イオン交換樹脂に接
触させて塩基性アミノ酸を吸着させ、これを溶離後晶析
する方法または溶離後、活性炭等による脱色濾過し晶析
する方法等が挙げられる。

【０１１７】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに説明す
る。尚、本発明は実施例の記載に限定されない。

【０１１８】（実施例１）ＨＲａｓｅの生産および精製 マイクロバクテリウム リクエファシエンス（Microbac
terium liquefaciens ）ＡＪ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ３
１３３）を培養し、充分にＨＲａｓｅ活性を有する菌体
を得た。まずＣＭ２Ｇ寒天培地（０．５ｇ／ｄｌ Ｄ−g
lucose, １ｇ／ｄｌ yeast extract, １ｇ／ｄｌ pepto
ne, ０．５ｇ／ｄｌ ＮａＣｌ, ２ｇ／ｄｌ agar, ｐＨ
７．０）にて、３０℃、２４時間リフレッシュ後、ＣＭ
２Ｇ液体培地で３０℃、２４時間シード培養を行った。

【０１１９】その後、１ｍｌのシード培養液をメイン培
養培地５０ｍｌを張り込んだ５００ｍｌ容の坂口フラス
コに接種後、３０℃、１８時間振盪培養した。メイン培
養の培地は０．５ｇ／ｄｌＤ−glucose, ０．５ｇ／ｄ
ｌ (ＮＨ₄)₂ＳＯ₄, １ｇ／ｄｌ yeast extract, １ｇ／
ｄｌ peptone, ０．１ｇ／ｄｌ ＫＨ₂ＰＯ₄, ０．３ｇ
／ｄｌ Ｋ₂ＨＰＯ₄, ０．０１ｇ／ｄｌ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ
₂Ｏ, ０．３５ｇ／ｄｌ ＤＬ−５−インドリルメチルヒ
ダントイン（ＩＭＨ）, ｐＨ７．０を１２０℃、２０分
オートクレーブ後、各１ｍｇ／ｄｌのＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂
Ｏ、ＭｎＳＯ₄・４〜５Ｈ₂Ｏ、ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏを添加
し、更に４℃で静置することによりＩＭＨを十分に析出
させた後に使用した。培養終了後は、遠心分離により集
菌し、０．１Ｍ ＫＰＢ (ｐＨ７．０)で洗浄し、洗浄菌
体を得た。こうして得られた菌体をＨＲａｓｅを精製す
るための材料として用いた。

【０１２０】１．菌体破砕 洗浄菌体６６ｇ（培養液３．７Ｌ相当）を出発原料と
し、この菌体を１３０ｍｌの０．１Ｍ ＫＰＢ (ｐＨ
７．０)に懸濁後、０．１ｍｍφ glass beadsとともに
３分（３０秒×６回、９０秒インターバル）ビーズビー
ターにて破砕した。溶液を回収し、終濃度５μg/ｍｌの
ＤＮａｓｅＩによって室温で２０分間処理した。その
後、１３，０００ｇ×１０分の遠心分離操作により未破
砕細胞を除去し、更に１００，０００ｇ×６０分の超遠
心分離操作によって膜画分を取り除き、上清を無細胞抽
出液とした。

【０１２１】２．硫安分画 上記無細胞抽出液１２５ｍｌに終濃度７０％飽和となる
よう、５９ｇの硫安を添加し、ＫＯＨでｐＨを７．０に
調整した後、５℃で６０分攪拌した。１３，０００ｇ×
１５分の遠心分離操作により沈澱を回収し、少量の２０
ｍＭＫＰＢ (ｐＨ ７．０)で溶解した後、１．２Ｍ (Ｎ
Ｈ₄)₂ＳＯ₄, ２０ｍＭ ＫＰＢ, ０．５ｍＭＣｏＣｌ₂,
ｐＨ ７．０（; Buffer A）に対して透析した。透析
後、１３，０００ g×３０ 分の遠心分離操作を行い、
得られた上清４０ mlを以下の精製に用いた。

【０１２２】３．疎水性クロマトグラフィー 得られた酵素溶液を、予めBuffer Aで平衡化した疎水性
クロマトグラフィーカラムPhenyl Sepharose HP 26/10
(Pharmacia)に供した。Buffer Aで非吸着タンパク質を
溶出した後、１．２〜０Ｍの直線的硫安濃度勾配（−
１．２Ｍ ／１２ＣＶ）により吸着タンパク質を溶出し
た。溶出フラクションのＨＲａｓｅ活性を測定したとこ
ろ、硫安濃度がおよそ５００ｍＭから１００ｍＭの溶出
位置に活性が認められた。ＨＲａｓｅ活性を含むフラク
ションを回収、膜濃縮後、２０ｍＭＫＰＢ (ｐＨ７．
０)に対して透析した。

【０１２３】４．陰イオン交換クロマトグラフィー 得られた酵素溶液を、予め２０ｍＭ ＫＰＢ (ｐＨ７．
０)で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラ
ムQ-Sepharose HP 16/10 (Pharmacia)に供した。２０ｍ
Ｍ ＫＰＢ (ｐＨ７．０)で非吸着タンパク質を溶出した
後、０〜０．５Ｍの直線的ＮａＣｌ濃度勾配（０．５Ｍ
/１２ＣＶ）により吸着タンパク質を溶出した。溶出フ
ラクションのＨＲａｓｅ活性を測定しところ、ＮａＣｌ
濃度がおよそ３００ｍＭから４００ｍＭの溶出位置に活
性が認められた。ＨＲａｓｅ活性を含むフラクションを
回収、膜濃縮した。

【０１２４】５．ゲル濾過 得られた酵素溶液を、予め２０ｍＭ ＫＰＢ (ｐＨ７．
０)で平衡化したSuperdex 200 pg 16/60 (Pharmacia)に
供し、同bufferにて展開した。溶出フラクションのＨＲ
ａｓｅ活性を測定したところ、分子量が約１０７，００
００程度と見積もられる位置に活性が認められた。ＨＲ
ａｓｅ活性を含むフラクションを回収、膜濃縮後、１．
０Ｍ (ＮＨ₄)₂ＳＯ₄, ２０ ｍＭ ＫＰＢ, １ｍＭ Ｌ−
ベンジルヒダントイン（ＢＨ）, ｐＨ７．０ (; Buffer
B)に対して透析した。

【０１２５】６．疎水性クロマトグラフィー 得られた酵素溶液を、Buffer Bで平衡化したPhenyl Sup
erose 5/5 (Pharmacia)に供した。非吸着タンパク質をB
uffer Bで溶出した後、１．２〜０Ｍの直線的硫安濃度
勾配（−１．２Ｍ／１７ＣＶ）により吸着タンパク質を
溶出した。溶出フラクションのＨＲａｓｅ活性を測定
し、ＨＲａｓｅ活性を含むフラクションを回収、膜濃縮
した。この後、このPhenyl Superoseによる精製行程
を、Ｌ−ＢＨを含まないbuffer系で一度行った後、Ｌ−
ＢＨを加えたbuffer系で更にもう一度行った。以上の操
作で得られた酵素溶液を、精製ＨＲａｓｅ溶液として使
用した。

【０１２６】上記精製を行った結果の比活性の上昇を測
定した。前出の菌体破砕後の無細胞抽出液、および精製
により得られた活性画分のＨＲａｓｅ活性を測定した結
果、この一連の精製操作により、単位タンパク質重量あ
たりの比活性は６５８倍に上昇したことがわかった。な
お、後述する活性測定法においては、精製したＨＲａｓ
ｅの比活性は、７９Ｕ／ｍｇと見積もられた。

【０１２７】得られた活性画分を定法に従い、ＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、クマジーブリ
リアントブルー染色したところ、ＨＲａｓｅは、１本の
バンドになるまでに精製されていることが確認され、そ
の分子量は２７，０００と見積もられた。ゲル濾過の結
果とあわせ、本ＨＲａｓｅは、分子量は２７，０００の
サブユニット４量体構造をとることが想定された。

【０１２８】７．Ｎ末端付近のアミノ酸配列の決定 上記のように精製されたＨＲａｓｅのＮ末端付近の配列
を以下のようにして決定した。即ち、精製されたＨＲａ
ｓｅ画分のうち、タンパク質量約１０μｇ分をＳＤＳ存
在下ポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、ミリポア
社ミリブロットを用い、セミドライ方式（タンパク質構
造解析、平野久著、東京化学同人）によって電気泳動後
のゲルからポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ（Bio-
Rad、Trans-Blot））膜に目的酵素を転写した。続い
て、ＰＶＤＦ膜上の目的酵素をプロテインシーケンサー
（ABI社製、モデル476A）に供し、Ｎ末端アミノ酸配列
解析を行った。

【０１２９】Ｎ末端から３０残基のアミノ酸配列を決定
した。決定されたＨＲａｓｅのＮ末端付近のアミノ酸配
列を配列表の配列番号８に示した。

【０１３０】（実施例２）：ｐＨのＨＲａｓｅへの効果 反応ｐＨによる酵素活性の変化（至適ｐＨ）を以下の方
法で測定した。０．３μｇ／ｍｌの精製ＨＲａｓｅを用
い、０．１Ｍのsodium acetate buffer (ｐＨ ３．１，
３．９， ４．９， ６．１)、ＫＰＢ (ｐＨ６．４，
７．２， ８．０)、あるいはsodium carbonate buffer
(ｐＨ ８．２， ９．１， １０．２， １０．９)の存在
下で３７℃、３０分間反応を行い、ＨＲａｓｅの反応至
適ｐＨを測定した。

【０１３１】測定結果は、それぞれの反応溶液の実測の
ｐＨに対する酵素活性の相対値の形で示した。便宜上、
最も高い活性を１００とした。測定結果は図３に示し
た。

【０１３２】本発明のＨＲａｓｅの至適ｐＨは約７〜約
９、厳密には約ｐＨ８．０〜９．０の範囲であることが
分かった（図３参照）。

【０１３３】（実施例３）：ＨＲａｓｅのｐＨ安定性 ３．０μｇ／ｍｌの精製ＨＲａｓｅを上述の０．１ Ｍ
の各ｐＨ Buffer存在下で０℃、３０分静置した後、ｐ
Ｈを８．０に調整し、ｐＨ８．０、３７℃で３０分反応
を行い、残存する活性を測定することによりＨＲａｓｅ
のｐＨ安定性を測定した。

【０１３４】測定結果は、各ｐＨでの前処理に対する酵
素活性の相対値の形で示した。便宜上、最も高い活性を
１００とした。測定結果を図４に示した。

【０１３５】本発明のＨＲａｓｅは、約ｐＨ６〜９の範
囲において安定であることがわかった（図４参照）。

【０１３６】（実施例４）：温度のＨＲａｓｅへの効果 ０．３μｇ／ｍｌの精製ＨＲａｓｅを用い、０，２１，
３０，４０，５０，６０，７０および８０℃においてｐ
Ｈ８．０で３０分間反応を行い、ＨＲａｓｅの作用至適
温度を測定した。

【０１３７】測定結果は、それぞれの反応溶液の実測の
温度に対する酵素活性の相対値の形で示した。便宜上、
最も高い活性を１００とした。測定結果は図５に示し
た。

【０１３８】本発明のＨＲａｓｅの至適温度は、５０〜
６０℃の範囲内であることが分かった（図５参照）。こ
の反応の至適温度は、従来知られているＨＲａｓｅの中
で、最も高いものである。

【０１３９】（実施例５）：ＨＲａｓｅの温度安定性 ３．０μg/mlの精製ＨＲａｓｅをｐＨ８．０で０， ２
１， ３０， ４０， ５０， ６０， ７０および８０℃
において３０分静置した後、ｐＨ８．０、３７℃で３０
分間反応を行い、残存する活性を測定することによりＨ
Ｒａｓｅの温度安定性を測定した。

【０１４０】測定結果は、各温度での前処理に対する酵
素活性の相対値の形で示した。便宜上、最も高い活性を
１００とした。測定結果を図６に示した。

【０１４１】本発明のＨＲａｓｅは、４０℃以下の範囲
において安定であることがわかった（図６参照）。

【０１４２】（実施例６）：ＨＲａｓｅ活性に対する酵
素阻害剤等各種試薬の効果 １．５μｇ／ｍｌの精製ＨＲａｓｅを、２５ｍＭ ＤＴ
Ｔ、２５ｍＭ Ｎ−ethylmaleimide (ＮＥＭ)、１２．５
ｍＭ ＣｕＳＯ₄、５０ｍＭモノヨード酢酸(ＩＡＡ)、５
０ｍＭ ＥＤＴＡ、あるいは５０％ (v/v) methanolと共
にｐＨ８．０、０℃で３０分間プレインキュベートし
た。これらを酵素源としてｐＨ８．０、３０℃で３０分
間反応を行って残存活性を測定し、ＨＲａｓｅの各阻害
剤に対する感受性を測定した。なお、反応時の酵素濃度
および阻害剤濃度は、プレインキュベート時のそれぞれ
５分の１となる。

【０１４３】残存活性を、試薬無添加時の活性を１００
％とした場合の相対活性で示した（表２参照）。本発明
のＨＲａｓｅはＤＴＴの添加により活性化され（結果未
表示）、また、ＮＥＭ、ヨード酢酸、あるいはＣｕ²⁺と
いったシステイン残基修飾試薬によって著しく阻害さ
れ、活性発現に対するシステイン残基の寄与が考えられ
た。ＥＤＴＡの添加によっては有意な阻害効果は見られ
なかったため、ＨＲａｓｅの活性発現に２価イオンは必
要でないと考えられた。また、５０％ (v/v)のメタノー
ルのプレインキュベートもＨＲａｓｅ活性には影響を与
えなかった（表２）。

【０１４４】

【表２】

【０１４５】（実施例７）：精製ＨＲａｓｅによるＢＨ
のラセミ化 ０．３ｍｇ／ｍｌ 精製ＨＲａｓｅ、 ０．１２ｇ／ｄｌ
Ｄ− or Ｌ−ＢＨ、５０ｍＭ ＫＰＢ (ｐＨ ８．０)、
５ｍＭ ＤＴＴを含む反応液を３７℃でインキュベート
し、経時的にサンプリングを行いＢＨ量をＨＰＬＣにて
定量した。対照として、酵素を含まない実験区でも同様
の実験を行い、ＢＨの自発的ラセミ化を定量した。その
結果を図７に示した。

【０１４６】本発明のＨＲａｓｅはＤ−ＢＨ、Ｌ−ＢＨ
のいずれをも基質認識し、どちらからスタートした場合
でも、Ｄ、Ｌ体比１：１になるまで反応が進行した。し
かしラセミ化反応の反応初速度はＬ−ＢＨをスタート基
質とした場合の方が早く、反応初速度から計算される精
製ＨＲａｓｅの比活性は、Ｌ−ＢＨからＤ−ＢＨを生成
する場合で１００Ｕ／ｍｇ、Ｄ−ＢＨからＬ−ＢＨを生
成する場合で７９Ｕ／ｍｇとそれぞれ見積もられた（図
７参照）。

【０１４７】一方、ＨＲａｓｅを添加しない対照区でも
自発的なＢＨのラセミ化が観察されたが、ＨＲａｓｅに
よって触媒されるラセミ化に比べ、著しく遅いものであ
った（図７参照）。

【０１４８】（実施例８）：アグロバクテリウム エス
ピー（Agrobacterim sp. ）ＡＪ１１２２０株とＨＲａ
ｓｅの組合わせによるＤＬ−ＢＨ、またはＬ−ＢＨから
のＤ−Ｐｈｅ生産 アグロバクテリウム エスピーＡＪ１１２２０株は１９
７７年１２月２０日に通商産業省工業技術院生命工学工
業技術研究所に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ４３４
７が付与された微生物である。当該株は、Ｄ体の５置換
ヒダントイン化合物を加水分解し、対応するＤ−アミノ
酸を生成することが知られている（Agric.Biol.Chem.５
１巻、７２１ページ、１９８７年）。ところがＡＪ１１
２２０株は、ヒダントインラセマーゼを有しないことか
ら、ヒダントイン化合物が自発的にラセミ化しない場
合、Ｌ体の５置換ヒダントイン化合物からはＤ体アミノ
酸は生成しないことから、化学合成により安価に調製で
きるＤＬ−５置換ヒダントイン化合物からの対応するＤ
−アミノ酸の生成モル収率は最大でも５０％となる。そ
こで、自発的にラセミ化しにくいＢＨを基質に、ＡＪ１
１２２０菌体と精製ＨＲａｓｅの組合わせによるＤ−Ｐ
ｈｅ生産の検討を行った。

【０１４９】１．ＡＪ １１２２０株の培養 ＣＭ２Ｇ寒天培地（０．５ｇ／ｄｌ Ｄ−glucose, １ｇ
／ｄｌ yeast extract,１ｇ／ｄｌ peptone, ０．５ｇ
／ｄｌ ＮａＣｌ, ２ｇ／ｄｌ agar, ｐＨ７．０）に
て、３０℃、２４時間リフレッシュ後、ＣＭ２Ｇ液体培
地で３０℃、２４時間シード培養を行った。メイン培養
の培地は０．５ｇ／ｄｌ Ｄ−glucose， ０．５ｇ／ｄ
ｌ (ＮＨ₄)₂ＳＯ₄, １ｇ／ｄｌ yeast extract, ０．１
ｇ／ｄｌ ＫＨ₂ＰＯ₄, ０．３ｇ／ｄｌ Ｋ₂ＨＰＯ₄,
０．０１ｇ／ｄｌ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ, ｐＨ７．０を１
２０℃、２０ 分オートクレーブ後、各１ｍｇ／ｄｌの
ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、ＭｎＳＯ₄・４〜５Ｈ₂Ｏおよび２ｇ
／ｄｌのＣａＣＯ₃を添加し使用した。このメイン培養
培地５０ｍｌを５００ｍｌ容の坂口フラスコに張り込
み、１ｍｌのシード培養液を接種後、３０℃、２２時間
振盪培養した。酵素の誘導のため、メイン培養開始後１
４時間後に終濃度２ｇ／ｄｌＤ−glucose, ０．２ｇ／
ｄｌ ＤＬ−ＢＨを、同１６、１８ 時間後に終濃度０．
２ｇ／ｄｌ ＤＬ−ＢＨを添加した。培養終了後は、遠
心分離操作（１０，０００×ｇ、４℃、１０分間）によ
り集菌し、０．１Ｍ ＫＰＢ (ｐＨ７．０)で洗浄し、洗
浄菌体を得た。

【０１５０】２．ＡＪ １１２２０株とＨＲａｓｅの組
合わせによるＤＬ−ＢＨまたはＬ−ＢＨからのＤ−Ｐｈ
ｅ生産 ０．５ｇ／ｄｌ (２６ｍＭ) ＤＬ−ＢＨまたはＬ−ＢＨ
を、０．８４μｇ／ｍｌ精製ＨＲａｓｅ、０．１Ｍ Ｋ
ＰＢ (ｐＨ８．０)、０．５ｍＭ ＣｏＣｌ₂および２ｇ
／ｄｌのＡＪ１１２２０株湿菌体とともに３０℃で静置
反応させた。反応液は、窒素置換により反応液中の酸素
をあらかじめ除去した。反応液を経時的にサンプリング
し、ＨＰＬＣで解析することにより生成Ｄ−Ｐｈｅを定
量した。

【０１５１】Ｄ−Ｐｈｅ生成のタイムコースを図８に示
した。ＨＲａｓｅを添加しない場合、対照となるＤ−Ｂ
Ｈを同様に基質とした場合、３０時間反応で、ほぼ基質
のすべてがＤ−Ｐｈｅに変換された（生成量２５．４ｍ
Ｍ、モル収率９８％、図８の□）。ところがＤＬ−ＢＨ
からのＤ−Ｐｈｅの生成量は、最大で１２．９ｍＭ（反
応２２時間、モル収率４９％、図８の○）となり、Ｌ−
ＢＨからでは１．５ｍＭの生成に留まった（反応３０時
間、モル収率６％、図８の△）。ＤＬ−ＢＨを基質とし
た場合のＤ−Ｐｈｅ生成量がＤ−ＢＨを基質とした場合
のおよそ半分であること、Ｌ−ＢＨを基質とした場合に
はほとんどＤ−Ｐｈｅが生成しなかったことから、本反
応系ではＢＨからのＤ−Ｐｈｅ生成の律速反応は、Ｌ−
ＢＨからＤ−ＢＨへのラセミ化反応であると考えられ
た。

【０１５２】一方、ＨＲａｓｅを添加した場合には、反
応３０時間後に、ＤＬ−ＢＨからは２４．６ｍＭ（モル
収率９４％）のＤ−Ｐｈｅ（図８の黒□）が、またＬ−
ＢＨからでも同様に２４．６ｍＭ（モル収率９４％）の
Ｄ−Ｐｈｅ（図８の黒△）が生成することが観察され
た。これらの値はＤ−ＢＨを基質とした場合とほぼ同量
であり、ＨＲａｓｅの添加によりＬ−ＢＨからＤ−ＢＨ
へのラセミ化反応の律速がほぼ完全に解除されていると
考えられた。

【０１５３】上述のことから、ＤＬ−またはＬ−５置換
ヒダントイン化合物をＤ体選択的加水分解反応系に作用
させ、対応するＤ−アミノ酸を生成させる際、基質とし
て用いる５置換ヒダントイン化合物に自発的ラセミ化能
がない、もしくは弱い場合には、Ｌ−５置換ヒダントイ
ン化合物は、加水分解を受けないことから未反応のまま
反応液に残存することになるが、これにＨＲａｓｅを組
み合わせるにより、基質全量が効率的に加水分解され高
収率でＤ−アミノ酸を生成させることができる。

【０１５４】当然のことながら、同様に５置換ヒダント
イン化合物をＬ体選択的加水分解反応系に作用させ、対
応するＬ−アミノ酸を生成させる際にも、ＨＲａｓｅを
組み合わせることにより、基質全量が効率的に加水分解
され高収率でＬ−アミノ酸を生成させることができる。

【０１５５】（実施例９）：ＢＨ以外の各種光学活性５
置換ヒダントイン化合物のラセミ化 本ＨＲａｓｅのＢＨ以外の光学活性５置換ヒダントイン
化合物に対するラセミ化触媒能を検討した。実施例８と
同様にアグロバクテリウム エスピーＡＪ １１２２０
株とＨＲａｓｅの組合わせによるＬ−５置換ヒダントイ
ンからのＤ−アミノ酸の生成を確認する方法によった。

【０１５６】１ｇ／ｄｌの各種５置換ヒダントインを
１．３μｇ／ｍｌ 精製ＨＲａｓｅ、０．１Ｍ ＫＰＢ
(ｐＨ ８．０)、０．５ｍＭ ＣｏＣｌ₂および２ｇ／ｄ
ｌのＡＪ１１２２０株湿菌体とともに３７℃で２２時間
静置反応させた。基質はＤ体、Ｌ体でそれぞれ反応を行
い、ＨＲａｓｅ非存在下でＤ体基質から対応するＤ−ア
ミノ酸が生成すること、Ｌ体基質からは対応するＤ−ア
ミノ酸が生成しないことを確認した上で、ＨＲａｓｅ存
在下でＬ体基質からＤ−アミノ酸の生成が見られた場合
に基質認識されたと判断した。Ｄ−アミノ酸の生成は、
光学分割ＴＬＣ（MERCK、HPTLC CHIR）をメタノール：
Ｈ₂Ｏ：アセトニトリル＝１：１：４で展開することに
より、定性的に見積もった。

【０１５７】その結果、ＨＲａｓｅがＬ−５−インドリ
ルメチルヒダントイン、Ｌ−５−(ｐ−ハイドロキシベ
ンジル)ヒダントイン、Ｌ−５−イソブチルヒダントイ
ンをラセミ化し、各々対応するＤ−トリプトファン、Ｄ
−チロシン、Ｄ−ロイシンの生成を認めた。

【０１５８】（実施例１０）：ＨＲａｓｅ遺伝子の単離 以下、ＨＲａｓｅ遺伝子の単離とＥ．ＣｏｌｉでのＨＲ
ａｓｅの発現について述べるが、使用菌株は、マイクロ
バクテリウム リクエファシエンス（Microbacterium l
iquefaciens ）ＡＪ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３）
株を用いた。遺伝子の単離、ＨＲａｓｅの発現とも、
Ｅ．Ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を宿主に用い、ベクターはｐ
ＵＣ１８を用いた。

【０１５９】１．決定アミノ酸配列に基づいたＰＣＲ
プライマーの作成 前述のマイクロバクテリウム リクエファシエンス（Mi
crobacterium liquefaciens ）ＡＪ３９１２（ＦＥＲＭ
−Ｐ３１３３）株由来のＨＲａｓｅのＮ末端アミノ酸配
列（配列表配列番号８）をもとに、配列表配列番号９、
１０にそれぞれ示すミックスプライマーを作成した。

【０１６０】２．菌体の取得 マイクロバクテリウム リクエファシエンス（Microbac
terium liquefaciens）ＡＪ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ３
１３３）株をＣＭ２Ｇ寒天培地（０．５ｇ／ｄｌ グル
コース、 １．０ｇ／ｄｌ yeast extract、１．０ｇ
／ｄｌ Peptone、０．５ｇ／ｄｌ ＮａＣｌ、２ｇ／ｄ
ｌ 寒天、ｐＨ７．０）上で３０℃、２４ 時間培養し
菌をリフレッシュした。これを５０ｍｌのＣＭ２Ｇ液体
培地を張り込んだ５００ｍｌの坂口フラスコに１白金耳
植菌し、３０℃、１６時間好気的に振とう培養した。

【０１６１】３．菌体からの染色体ＤＮＡの取得 培養液５０ｍｌを遠心分離操作（１２，０００ｘｇ、４
℃、１５分間）に供し、集菌した。この菌体を１０ｍｌ
の５０:２０ＴＥ（５０ｍＭ Tris-HCl，ｐＨ８．０，
２０ｍＭＥＤＴＡ）に懸濁し、洗浄し、遠心分離操作に
より、菌体を回収した。再び、この菌体を１０ｍｌ ５
０:２０ ＴＥに懸濁した。さらに、この懸濁液に、０．
５ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液、１ｍｌの１０
％ＳＤＳ溶液を加えた後、５５℃で２０分間インキュベ
ートした。インキュベート後、１倍容の１０:１ＴＥ飽
和のフェノールを加えて除タンパクを行った。分離した
水層に対して、１倍容の２−プロパノールを加えて、Ｄ
ＮＡを沈澱させ、回収した。沈澱したＤＮＡを０．５ｍ
ｌ５０:２０ ＴＥに溶解した後、５μｌの１０ｍｇ／ｍ
ｌ ＲＮａｓｅ、５μlの１０ｍｇ／ｍｌ ProteinaseＫ
を加えて、５５℃で２時間反応させた。反応後、１倍容
の１０:１ＴＥ飽和のフェノールで除タンパクを行っ
た。さらに、分離した水層に対して、１倍容の２４:１
クロロホルム／イソアミルアルコールを加えて攪拌し、
水層を回収した。この操作をさらに２回行った後に得ら
れた水層に、終濃度０．４Ｍとなるように3M酢酸ナトリ
ウム溶液（ｐＨ５．２）を加え、さらに２倍容のエタノ
ールを加えた。沈澱となって生じたＤＮＡを回収し、７
０％エタノールで洗浄した後、乾燥させ、１ｍｌの１
０:１ ＴＥに溶解させた。

【０１６２】４．カセットＰＣＲ法によるＨＲａｓｅ遺
伝子の一部を含むＤＮＡ断片の取得 カセットＰＣＲ法によるＨＲａｓｅをコードする遺伝子
（ｆｈｒ）を含むＤＮＡ分子の単離・増幅には、TaKaRa
LA PCR in vitro Cloning Kit（宝酒造社製）を用い
た。以下断わりの無い限り、説明書の方法に基づき実験
を行った。カセットＰＣＲ法において、プライマー 1
(１ｓｔ ＰＣＲ)とプライマー２(２ｎｄＰＣＲ)をプラ
イマーとした場合に、Ｈｉｎｄ ＩＩＩカセットとの間
で約０．４ｋｂのバンド（フラグメント １）が増幅し
た。この断片の塩基配列を決定することにより、フラグ
メント １がｆｈｒの一部分であることを確認した。

【０１６３】５．遺伝子ライブラリーからのＨＲａｓｅ
遺伝子のクローニング 次ぎに、ｆｈｒの全長取得のために、フラグメント１を
プローブとしてまず、サザンハイブリダイゼーションを
行った。

【０１６４】プローブとなるＤＮＡ断片を約５０ｎｇ／
μｌに調整し、このＤＮＡ溶液１６μｌをDIG High Pri
me（Boehringer Mannheim）を使用して、プロトコール
に準じて３７℃で２４時間インキュベートしてプローブ
の標識を行った。染色体ＤＮＡ １μｇを各種制限酵素
の組合わせで完全消化し、０．８％アガロースゲルで電
気泳動した後に、ナイロンメンブレン（Boehringer Man
nheim, Nylone membranes positively charged）にブロ
ッティングした。以下定法に従ってサザンハイブリダイ
ゼーションを行った。ハイブリダイゼーションはDIG Ea
syHyb（Boehringer Mannheim）を用いて行い、５０℃、
３０分間プレハイブリダイゼーションを行った後にプロ
ーブを添加して、５０℃、１８時間ハイブリダイゼーシ
ョンさせた。検出はDIG Nucleotide Detection Kit（Bo
ehringer Mannheim）を用いて行った。

【０１６５】その結果、ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩの切断物
においては、約２．９ｋｂの位置にバンドが検出され
た。この２．９ｋｂ領域の断片を回収してｐＵＣ１８に
連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９にてライブラリー
（１２０株）を作製した。以下定法に従ってコロニーハ
イブリダイゼーションを行った。コロニーをナイロンメ
ンブレンフィルター（Boehringer Mannheim、Nylon mem
branes for colony and plaque hybridization）に転写
し、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイ
ブリダイゼーションはDIG Easy Hybを用いて行った。フ
ィルターをbuffer中に浸し、４２℃、３０分間プレハイ
ブリダイゼーションを行った。その後、上述の標識プロ
ーブを添加し、４２℃、１８時間ハイブリダイゼーショ
ンを行った。SSC bufferでの洗浄後、DIG Nucleotide D
etection Kitを用いてポジティブクローン１株を選抜し
た。

【０１６６】６．マイクロバクテリウム リクエファシ
エンス（Microbacterium liquefaciens ）ＡＪ３９１２
（ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３）由来ＨＲａｓｅ遺伝子の塩基
配列 選抜した形質転換体が保有するプラスミドをMolecular
Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (19
89)に記載される方法に従って調製し、プローブとハイ
ブリダイズした近傍の塩基配列を決定した。ＨＲａｓｅ
の３０残基のＮ末端アミノ酸配列を含むタンパク質をコ
ードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存
在し、ＨＲａｓｅをコードする遺伝子ｆｈｒであること
を確認した。ＨＲａｓｅ遺伝子全長の塩基配列を配列表
配列番号１に示した。得られたＯＲＦは既知のシュード
モナス属細菌由来のＨＲａｓｅ（J.Bacteriol.１７４
巻、９６２ページ、１９９２年）と４８％の相同性を示
した。

【０１６７】７．ＨＲａｓｅ遺伝子のＥ．Ｃｏｌｉでの
発現 ｆｈｒをＥ．Ｃｏｌｉで発現させるために、ｐＵＣ１８
のｌａｃプロモーターの下流にｆｈｒを連結したプラス
ミドｐＵＣＦＨＲを構築した。マイクロバクテリウム
リクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens ）
ＡＪ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３）株染色体ＤＮＡ
を鋳型とし、表２に示すオリゴヌクレオチドをプライマ
ーとしてＰＣＲにより増幅した断片をＥｃｏＲＩ、Ｂａ
ｍＨ Ｉで処理し、ｐＵＣ１８のＥｃｏＲ Ｉ、ＢａｍＨ
Ｉ切断物とライゲーションした後、Ｅ．Ｃｏｌｉ ＪＭ
１０９ に形質転換した。アンピシリン耐性株の中か
ら、目的のプラスミドを持った株を選択し、構築した発
現プラスミドｐＵＣＦＨＲと命名した。

【０１６８】

【表３】

【０１６９】ｐＵＣＦＨＲを持つＨＲａｓｅのＥ． Ｃ
ｏｌｉ での発現形質転換体を０．１ｍｇ／ｍｌ アンピ
シリンを含むＬＢ培地で、３７℃、１６時間、シード培
養した。ＬＢ培地５０ｍｌを張り込んだ５００ｍｌ坂口
フラスコに、この前培養液を１ｍｌシードし、３７℃に
て本培養を行った。培養開始２．５時間後に、終濃度１
ｍＭとなるようにイソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラ
クトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに４時間培
養を行った。培養終了後、集菌、洗浄を行い、５ ｍｌ
の５０ ｍＭ ＫＰＢ (ｐＨ ８．０)に懸濁し、０．１ m
mφ glass beadsとともに３分間（３０ 秒×６ 回、９
０秒のインターバル）ビーズビーターにて破砕した。溶
液を回収し、２０，０００ g×１０ 分の遠心分離操作
を行い、その上清を無細胞抽出液とした。

【０１７０】８．ＨＲａｓｅ活性測定 培養終了後、無細胞抽出液を調製し、これを酵素源とし
てＨＲａｓｅ活性の測定を行った。ＨＲａｓｅ活性の測
定は、１２０ ｍｇ／ｄｌ Ｌ−ＢＨ、５０ ｍＭ ＫＰＢ
(ｐＨ ８．０)、５ ｍＭ ＤＴＴ、５ ｍＭ ＥＤＴＡ、
１５０ ｍＭ ＮａＣｌおよび酵素溶液を含む反応液を３
７℃で３０分インキュベートした後、９倍容の1.1ｍＭ
ＣｕＳＯ₄、１１．１ ｍＭ Ｈ₃ＰＯ₄を添加することに
より反応を停止させた。２０，０００ g×１０ 分の遠
心により沈澱を取り除いた後、ＨＰＬＣにてラセミ化し
たＢＨ量を定量することによった。酵素活性の単位とし
て、この条件にて１分に１μｍｏｌのＢＨをラセミ化す
る酵素活性をもって１Ｕと定義した。

【０１７１】分析に用いたＨＰＬＣの条件は以下の通
り。 カラム：ダイセル化学CHIRALPAK WH ０．４６ｃｍφ×
２５ｃｍ 移動相：５％ (v/v) methanol, １ｍＭ ＣｕＳＯ₄ カラム温度：５０℃ 流速：１．５ ｍｌ/分 検出：ＵＶ₂₁₀

【０１７２】その結果、ｐＵＣ１８ＦＨＲを導入した場
合のみＨＲａｓｅ活性が検出され、クローニングしたｆ
ｈｒ遺伝子がＥ. ｃｏｌｉで発現したことを確認した
（表４）。

【０１７３】

【表４】

【０１７４】

【発明の効果】本発明によれば、マイクロバクテリウム
属細菌からこれまで知られていないＨＲａｓｅを得るこ
とができる。このＨＲａｓｅは従来知られているＨＲａ
ｓｅに比較して、反応の至適温度が高いという特徴を有
するので、反応温度を高くできる結果、より反応速度を
速くすることが可能となり、目的とする反応を効率的に
進めさせることができる。また反応中の反応液の微生物
汚染のリスクが軽減されることから、品質保持を含めた
工程管理が容易になる利点がある。さらに、本発明のヒ
ダントインラセマーゼと、５置換ヒダントイン化合物を
光学選択的に加水分解する系とを組み合わせて利用する
ことにより、高収率にて医薬品、化学工業品、食品添加
物等の製造に有用な光学活性アミノ酸を生成させること
ができる。

【０１７５】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 味の素株式会社（AJINOMOTO CO., LTD.） <120> ５置換ヒダントインラセマーゼ、これをコードするＤＮＡ、組み換えＤＮ Ａ、形質転換された細胞および光学活性アミノ酸の製造方法 <130> ＰＡＭＡ−１３２７３ <140> <141> <150> JP2000-278571 <151> 2000-09-13 <160> 12 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 711 <212> DNA <213> Microbacterium liquefaciens <220> <221> CDS <222> (1)..(708) <223> HRase <400> 1 atg aga atc cat gtc atc aat ccc aac agc tcg gtg gat ctc acc gat 48 Met Arg Ile His Val Ile Asn Pro Asn Ser Ser Val Asp Leu Thr Asp 1 5 10 15 gcg gtg gcc gag gcg gcg cga agt gtg gtg tca ccg gga acc acc atc 96 Ala Val Ala Glu Ala Ala Arg Ser Val Val Ser Pro Gly Thr Thr Ile 20 25 30 acc gcg gtc aac cct tcg aag ggc ccc acg gtc atc gag ggc agt tac 144 Thr Ala Val Asn Pro Ser Lys Gly Pro Thr Val Ile Glu Gly Ser Tyr 35 40 45 gac gag gtg ctg gcc acg tat cac ctc gtc gaa gag gtc cgc cgc gcg 192 Asp Glu Val Leu Ala Thr Tyr His Leu Val Glu Glu Val Arg Arg Ala 50 55 60 gag cgc gaa gac cga ccg gac gcc tac gtc atc gcc tgt ttc ggc gat 240 Glu Arg Glu Asp Arg Pro Asp Ala Tyr Val Ile Ala Cys Phe Gly Asp 65 70 75 80 cca ggt ctc gac gcc gtc agg gag ctc acc gac agg ccc gtg gtc gga 288 Pro Gly Leu Asp Ala Val Arg Glu Leu Thr Asp Arg Pro Val Val Gly 85 90 95 atc gcc gag gcg gcg atc cag atg acg agc ttc gtc gcc gcg agc ttc 336 Ile Ala Glu Ala Ala Ile Gln Met Thr Ser Phe Val Ala Ala Ser Phe 100 105 110 tcc atc gtg agc atc ctc ccg cgc gtg cgc aag cat ctg cac gag ctg 384 Ser Ile Val Ser Ile Leu Pro Arg Val Arg Lys His Leu His Glu Leu 115 120 125 gtg cac cgg gcg ggg gca acg gat cga ctc gcc tca ctc aag ctt ccg 432 Val His Arg Ala Gly Ala Thr Asp Arg Leu Ala Ser Leu Lys Leu Pro 130 135 140 gat ctc gga gtg ctc gca ttc cac gag gac gag gca gcg gcg ttc gag 480 Asp Leu Gly Val Leu Ala Phe His Glu Asp Glu Ala Ala Ala Phe Glu 145 150 155 160 acc ctc cgg cgc gtg gca ggt gag gcg gtg cgc gag gac ggc gcg gag 528 Thr Leu Arg Arg Val Ala Gly Glu Ala Val Arg Glu Asp Gly Ala Glu 165 170 175 tcg atc gtg ctc ggc tgc gcg ggc atg gcc gga ttc gcc aga cag ctg 576 Ser Ile Val Leu Gly Cys Ala Gly Met Ala Gly Phe Ala Arg Gln Leu 180 185 190 agt gaa gag ctc ggc gtc ccc gtc atc gac gcg gtc gag gca gcc tgc 624 Ser Glu Glu Leu Gly Val Pro Val Ile Asp Ala Val Glu Ala Ala Cys 195 200 205 cgc gtc gcg gag agc ctc gtc gcc ctg ggg tac cgc acc agc aag gcg 672 Arg Val Ala Glu Ser Leu Val Ala Leu Gly Tyr Arg Thr Ser Lys Ala 210 215 220 aac acc tac caa gca ccc acc gag aag cag tac ctc taa 711 Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Thr Glu Lys Gln Tyr Leu 225 230 235 <210> 2 <211> 236 <212> PRT <213> Microbacterium liquefaciens <400> 2 Met Arg Ile His Val Ile Asn Pro Asn Ser Ser Val Asp Leu Thr Asp 1 5 10 15 Ala Val Ala Glu Ala Ala Arg Ser Val Val Ser Pro Gly Thr Thr Ile 20 25 30 Thr Ala Val Asn Pro Ser Lys Gly Pro Thr Val Ile Glu Gly Ser Tyr 35 40 45 Asp Glu Val Leu Ala Thr Tyr His Leu Val Glu Glu Val Arg Arg Ala 50 55 60 Glu Arg Glu Asp Arg Pro Asp Ala Tyr Val Ile Ala Cys Phe Gly Asp 65 70 75 80 Pro Gly Leu Asp Ala Val Arg Glu Leu Thr Asp Arg Pro Val Val Gly 85 90 95 Ile Ala Glu Ala Ala Ile Gln Met Thr Ser Phe Val Ala Ala Ser Phe 100 105 110 Ser Ile Val Ser Ile Leu Pro Arg Val Arg Lys His Leu His Glu Leu 115 120 125 Val His Arg Ala Gly Ala Thr Asp Arg Leu Ala Ser Leu Lys Leu Pro 130 135 140 Asp Leu Gly Val Leu Ala Phe His Glu Asp Glu Ala Ala Ala Phe Glu 145 150 155 160 Thr Leu Arg Arg Val Ala Gly Glu Ala Val Arg Glu Asp Gly Ala Glu 165 170 175 Ser Ile Val Leu Gly Cys Ala Gly Met Ala Gly Phe Ala Arg Gln Leu 180 185 190 Ser Glu Glu Leu Gly Val Pro Val Ile Asp Ala Val Glu Ala Ala Cys 195 200 205 Arg Val Ala Glu Ser Leu Val Ala Leu Gly Tyr Arg Thr Ser Lys Ala 210 215 220 Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Thr Glu Lys Gln Tyr Leu 225 230 235 <210> 3 <211> 1380 <212> DNA <213> Microbacterium liquefaciens <220> <221> CDS <222> (1)..(1377) <223> HHase <400> 3 atg ttc gac gtc att gtg aag aac tgt cga gtg gtt tcc agt cag ggc 48 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Val Val Ser Ser Gln Gly 1 5 10 15 atc atc gaa gcc gac atc ctc gtg aag gac ggc cgg atc gcc gcc atc 96 Ile Ile Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Arg Ile Ala Ala Ile 20 25 30 agc gag gag ccc ctc gag gcc gaa gcc gcc cgg acc atc gat gcc gca 144 Ser Glu Glu Pro Leu Glu Ala Glu Ala Ala Arg Thr Ile Asp Ala Ala 35 40 45 ggc agg ttc gtg atg ccc ggt gtg gtc gat gaa cac gtg cac atc atc 192 Gly Arg Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Ile 50 55 60 gac atg gat ctg aag gag gtc tac ggg cgg ttc gaa ctc gat tcc gag 240 Asp Met Asp Leu Lys Glu Val Tyr Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 tcg gcg gcc gtc ggc ggt gtg acc acc atc atc gag atg ccg atc acg 288 Ser Ala Ala Val Gly Gly Val Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 ttc ccg ccc acg acc acc ctg gag gcc ttc ctc gag aag aag aag cag 336 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Glu Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 gga gag cag cga ctc aag gtc gac ttc gcg ctg tac ggc ggc gga gtg 384 Gly Glu Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 ccc gga aac ctg agc gag atc cgg aag atg cat gat gcc ggc gcc gtg 432 Pro Gly Asn Leu Ser Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 ggc ttc aag tcg atg atg gcg gcc tcc gtt ccc ggg atg ttc gaa gcc 480 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ala Ser Val Pro Gly Met Phe Glu Ala 145 150 155 160 gtc gac gac gga cag ctg ttc gag atc ttc cag gag atc gcg gcc tgc 528 Val Asp Asp Gly Gln Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 ggc tcg gtg atc gtg gtg cac gcc gag aac gag atg ctc atc cag acg 576 Gly Ser Val Ile Val Val His Ala Glu Asn Glu Met Leu Ile Gln Thr 180 185 190 ctg cag aag cag ctc aag gcg gcc ggg cgc aag gac ctg gcg gcg tat 624 Leu Gln Lys Gln Leu Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Leu Ala Ala Tyr 195 200 205 gag gcg tcc cag ccg gtc ttc cag gag aac gag gcg atc cag cgc gcg 672 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 ctg ctc ctg cag aag gag gcg ggc tgc cga ctc atc gtc gtt cac gtg 720 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Val His Val 225 230 235 240 agc aac ccc ggc ggc gtg gag ttg atc cac aag gcg cag tcg gag ggt 768 Ser Asn Pro Gly Gly Val Glu Leu Ile His Lys Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 cag gac gtg cac tgc gag tca ggc cct cag tac ctc aac ctc aca atg 816 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Leu Thr Met 260 265 270 gat gac gcc gag aag gtc ggc ccg tac atg aag atc gcc ccg ccg gtc 864 Asp Asp Ala Glu Lys Val Gly Pro Tyr Met Lys Ile Ala Pro Pro Val 275 280 285 cgt tcg gcc gag ctg aac gcc gtc ctc tgg gag cag ctc gag aag ggg 912 Arg Ser Ala Glu Leu Asn Ala Val Leu Trp Glu Gln Leu Glu Lys Gly 290 295 300 tac atc gac acg ctc gga tcg gat cac ggt ggg cac ccc gtc gag aac 960 Tyr Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asn 305 310 315 320 aag gag ggc ggc tgg gac gac atc tgg acg gcc agc aac ggt gcg ctg 1008 Lys Glu Gly Gly Trp Asp Asp Ile Trp Thr Ala Ser Asn Gly Ala Leu 325 330 335 gga ctg gag acg tcg ctg ccg atg atg ctg acc aac ggc gtc aac aag 1056 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 ggc cgc gtc tcg ctg gag cga ctg gtc gag gtg atg tgc gag aac ccg 1104 Gly Arg Val Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Asn Pro 355 360 365 gcg aag ctc ttc ggg atc tat ccg cag aag ggc acg ctc cag gtc ggc 1152 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 tcg gac gcc gat ctc ctc atc ctc gat ctc gag atc gag gac agg aag 1200 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Glu Ile Glu Asp Arg Lys 385 390 395 400 gtg gat gct tcg cag ttc cgc tcg ctc ctg cac tac agt cca ttc gat 1248 Val Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu Leu His Tyr Ser Pro Phe Asp 405 410 415 gga cgg ccg gtc acc ggc gcg ccc gtc ctc acg atg atc cgt gga aca 1296 Gly Arg Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Ile Arg Gly Thr 420 425 430 gtc gtc gcc cag gac gga gag atc ctc gtc gac cag ggg ttc ggg cag 1344 Val Val Ala Gln Asp Gly Glu Ile Leu Val Asp Gln Gly Phe Gly Gln 435 440 445 ttc gtg acc cgg cgc gac agc gag gtg tcg tcg tga 1380 Phe Val Thr Arg Arg Asp Ser Glu Val Ser Ser 450 455 <210> 4 <211> 459 <212> PRT <213> Microbacterium liquefaciens <400> 4 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Val Val Ser Ser Gln Gly 1 5 10 15 Ile Ile Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Arg Ile Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Glu Glu Pro Leu Glu Ala Glu Ala Ala Arg Thr Ile Asp Ala Ala 35 40 45 Gly Arg Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Ile 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Glu Val Tyr Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Val Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Glu Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Gly Glu Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Ser Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ala Ser Val Pro Gly Met Phe Glu Ala 145 150 155 160 Val Asp Asp Gly Gln Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Ile Val Val His Ala Glu Asn Glu Met Leu Ile Gln Thr 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Leu Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Leu Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Val His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Gly Gly Val Glu Leu Ile His Lys Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Leu Thr Met 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Lys Val Gly Pro Tyr Met Lys Ile Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Leu Asn Ala Val Leu Trp Glu Gln Leu Glu Lys Gly 290 295 300 Tyr Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asn 305 310 315 320 Lys Glu Gly Gly Trp Asp Asp Ile Trp Thr Ala Ser Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Val Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Asn Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Glu Ile Glu Asp Arg Lys 385 390 395 400 Val Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu Leu His Tyr Ser Pro Phe Asp 405 410 415 Gly Arg Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Ile Arg Gly Thr 420 425 430 Val Val Ala Gln Asp Gly Glu Ile Leu Val Asp Gln Gly Phe Gly Gln 435 440 445 Phe Val Thr Arg Arg Asp Ser Glu Val Ser Ser 450 455 <210> 5 <211> 1239 <212> DNA <213> Microbacterium liquefaciens <220> <221> CDS <222> (1)..(1236) <223> CHase <400> 5 gtg acg ctg cag cag gcg cgg gcc gat cgc atc gag gag gag ctc tgg 48 Val Thr Leu Gln Gln Ala Arg Ala Asp Arg Ile Glu Glu Glu Leu Trp 1 5 10 15 act ctc tcc cgc ttc tcg gtc gaa ggg ccc ggc gtg aca cgt ctc acg 96 Thr Leu Ser Arg Phe Ser Val Glu Gly Pro Gly Val Thr Arg Leu Thr 20 25 30 tac act ccg gag cac gcc gcc gcg cga gag gtg atc gtc gcc gcc atg 144 Tyr Thr Pro Glu His Ala Ala Ala Arg Glu Val Ile Val Ala Ala Met 35 40 45 cag cgg acg ggg ctg agc gtc cac gag gac gct ctc ggc aac atc atc 192 Gln Arg Thr Gly Leu Ser Val His Glu Asp Ala Leu Gly Asn Ile Ile 50 55 60 ggt cgg cgt gag ggg agc gac ccc gct ctg ccg gcg atc gcc ttc ggc 240 Gly Arg Arg Glu Gly Ser Asp Pro Ala Leu Pro Ala Ile Ala Phe Gly 65 70 75 80 tcg cac ttc gac tcg gtc cgc aac ggc ggg atg ttc gac ggc acc gcg 288 Ser His Phe Asp Ser Val Arg Asn Gly Gly Met Phe Asp Gly Thr Ala 85 90 95 ggc gtg gtg tgc gcg ctc gag gct gcg agg gtg ctg cag gag agc gga 336 Gly Val Val Cys Ala Leu Glu Ala Ala Arg Val Leu Gln Glu Ser Gly 100 105 110 tat gtg aac cgt cat cct ctc gag gtc atc gcg atc gtc gaa gag gag 384 Tyr Val Asn Arg His Pro Leu Glu Val Ile Ala Ile Val Glu Glu Glu 115 120 125 ggc acc cgc ttc agc agc ggc atg ctg ggc ggt cgc gcg atc gcg ggg 432 Gly Thr Arg Phe Ser Ser Gly Met Leu Gly Gly Arg Ala Ile Ala Gly 130 135 140 ctc gtg tcc gac gcc gat ctg gac acc ctg gtg gac gaa gac ggc gtg 480 Leu Val Ser Asp Ala Asp Leu Asp Thr Leu Val Asp Glu Asp Gly Val 145 150 155 160 acg gtg cgc gag gcg gcc acg gcc ttc ggg ctg gaa ccg ggt gag ctg 528 Thr Val Arg Glu Ala Ala Thr Ala Phe Gly Leu Glu Pro Gly Glu Leu 165 170 175 cgg acg gcg gcc cgt acg agg gat gac ctt cgc gcc ttc atc gag ttg 576 Arg Thr Ala Ala Arg Thr Arg Asp Asp Leu Arg Ala Phe Ile Glu Leu 180 185 190 cac atc gag cag ggg ccg atc ctc gag cag gag aag gtg gag atc ggc 624 His Ile Glu Gln Gly Pro Ile Leu Glu Gln Glu Lys Val Glu Ile Gly 195 200 205 gtc gtg acg ggg atc gtc ggt gtc cgc gcc ttc cgg atc acg gtg gag 672 Val Val Thr Gly Ile Val Gly Val Arg Ala Phe Arg Ile Thr Val Glu 210 215 220 ggc agg agc gac cac gcc ggg acg acc ccc atg cac ctg cgg cag gac 720 Gly Arg Ser Asp His Ala Gly Thr Thr Pro Met His Leu Arg Gln Asp 225 230 235 240 gcg ctg gtg ccg gcg gcg ctc atg gtg cga gag atc aat cgg ttc gtc 768 Ala Leu Val Pro Ala Ala Leu Met Val Arg Glu Ile Asn Arg Phe Val 245 250 255 aac gag atc gcg gac ggc acg gtg gcg acc gtc ggc cac ctc acg gtg 816 Asn Glu Ile Ala Asp Gly Thr Val Ala Thr Val Gly His Leu Thr Val 260 265 270 acc cct ggt ggg ctc aac cag gtt ccc ggg ggc gtc gag ttc acg ctc 864 Thr Pro Gly Gly Leu Asn Gln Val Pro Gly Gly Val Glu Phe Thr Leu 275 280 285 gat ctg cga tcg ccc cac gag gag tcg atc cgg ctc ctg gtc gac agg 912 Asp Leu Arg Ser Pro His Glu Glu Ser Ile Arg Leu Leu Val Asp Arg 290 295 300 atc gag gcg atg gtg gca gaa gtc gcc gcc gcg gcc gga gtc gag gcc 960 Ile Glu Ala Met Val Ala Glu Val Ala Ala Ala Ala Gly Val Glu Ala 305 310 315 320 gcg gtg aac ggg ttc ttc gcg ctc agc cct gtc ggt ctg tct ccg gtg 1008 Ala Val Asn Gly Phe Phe Ala Leu Ser Pro Val Gly Leu Ser Pro Val 325 330 335 gtc gtg gat cgc gtg cgc gac gcg gcg tcc gaa ctc ggc ttc acc cat 1056 Val Val Asp Arg Val Arg Asp Ala Ala Ser Glu Leu Gly Phe Thr His 340 345 350 cgc gac atc acg agc ggg gca ggg cac gac tcg atg ttc atc gcc cag 1104 Arg Asp Ile Thr Ser Gly Ala Gly His Asp Ser Met Phe Ile Ala Gln 355 360 365 atc acc gac gtc gga atg gtg ttc gtc ccc agc cgc gcc ggg cga agc 1152 Ile Thr Asp Val Gly Met Val Phe Val Pro Ser Arg Ala Gly Arg Ser 370 375 380 cat gtg ccg gag gaa tgg tcc gat ttc gac gat ctg cgg aag ggg acg 1200 His Val Pro Glu Glu Trp Ser Asp Phe Asp Asp Leu Arg Lys Gly Thr 385 390 395 400 gat gtg gtc ctt cac gtc gtg acg gcg ctt gac cgg tga 1239 Asp Val Val Leu His Val Val Thr Ala Leu Asp Arg 405 410 <210> 6 <211> 412 <212> PRT <213> Microbacterium liquefaciens <400> 6 Val Thr Leu Gln Gln Ala Arg Ala Asp Arg Ile Glu Glu Glu Leu Trp 1 5 10 15 Thr Leu Ser Arg Phe Ser Val Glu Gly Pro Gly Val Thr Arg Leu Thr 20 25 30 Tyr Thr Pro Glu His Ala Ala Ala Arg Glu Val Ile Val Ala Ala Met 35 40 45 Gln Arg Thr Gly Leu Ser Val His Glu Asp Ala Leu Gly Asn Ile Ile 50 55 60 Gly Arg Arg Glu Gly Ser Asp Pro Ala Leu Pro Ala Ile Ala Phe Gly 65 70 75 80 Ser His Phe Asp Ser Val Arg Asn Gly Gly Met Phe Asp Gly Thr Ala 85 90 95 Gly Val Val Cys Ala Leu Glu Ala Ala Arg Val Leu Gln Glu Ser Gly 100 105 110 Tyr Val Asn Arg His Pro Leu Glu Val Ile Ala Ile Val Glu Glu Glu 115 120 125 Gly Thr Arg Phe Ser Ser Gly Met Leu Gly Gly Arg Ala Ile Ala Gly 130 135 140 Leu Val Ser Asp Ala Asp Leu Asp Thr Leu Val Asp Glu Asp Gly Val 145 150 155 160 Thr Val Arg Glu Ala Ala Thr Ala Phe Gly Leu Glu Pro Gly Glu Leu 165 170 175 Arg Thr Ala Ala Arg Thr Arg Asp Asp Leu Arg Ala Phe Ile Glu Leu 180 185 190 His Ile Glu Gln Gly Pro Ile Leu Glu Gln Glu Lys Val Glu Ile Gly 195 200 205 Val Val Thr Gly Ile Val Gly Val Arg Ala Phe Arg Ile Thr Val Glu 210 215 220 Gly Arg Ser Asp His Ala Gly Thr Thr Pro Met His Leu Arg Gln Asp 225 230 235 240 Ala Leu Val Pro Ala Ala Leu Met Val Arg Glu Ile Asn Arg Phe Val 245 250 255 Asn Glu Ile Ala Asp Gly Thr Val Ala Thr Val Gly His Leu Thr Val 260 265 270 Thr Pro Gly Gly Leu Asn Gln Val Pro Gly Gly Val Glu Phe Thr Leu 275 280 285 Asp Leu Arg Ser Pro His Glu Glu Ser Ile Arg Leu Leu Val Asp Arg 290 295 300 Ile Glu Ala Met Val Ala Glu Val Ala Ala Ala Ala Gly Val Glu Ala 305 310 315 320 Ala Val Asn Gly Phe Phe Ala Leu Ser Pro Val Gly Leu Ser Pro Val 325 330 335 Val Val Asp Arg Val Arg Asp Ala Ala Ser Glu Leu Gly Phe Thr His 340 345 350 Arg Asp Ile Thr Ser Gly Ala Gly His Asp Ser Met Phe Ile Ala Gln 355 360 365 Ile Thr Asp Val Gly Met Val Phe Val Pro Ser Arg Ala Gly Arg Ser 370 375 380 His Val Pro Glu Glu Trp Ser Asp Phe Asp Asp Leu Arg Lys Gly Thr 385 390 395 400 Asp Val Val Leu His Val Val Thr Ala Leu Asp Arg 405 410 <210> 7 <211> 3343 <212> DNA <213> Microbacterium liquefaciens <400> 7 atgagaatcc atgtcatcaa tcccaacagc tcggtggatc tcaccgatgc ggtggccgag 60 gcggcgcgaa gtgtggtgtc accgggaacc accatcaccg cggtcaaccc ttcgaagggc 120 cccacggtca tcgagggcag ttacgacgag gtgctggcca cgtatcacct cgtcgaagag 180 gtccgccgcg cggagcgcga agaccgaccg gacgcctacg tcatcgcctg tttcggcgat 240 ccaggtctcg acgccgtcag ggagctcacc gacaggcccg tggtcggaat cgccgaggcg 300 gcgatccaga tgacgagctt cgtcgccgcg agcttctcca tcgtgagcat cctcccgcgc 360 gtgcgcaagc atctgcacga gctggtgcac cgggcggggg caacggatcg actcgcctca 420 ctcaagcttc cggatctcgg agtgctcgca ttccacgagg acgaggcagc ggcgttcgag 480 accctccggc gcgtggcagg tgaggcggtg cgcgaggacg gcgcggagtc gatcgtgctc 540 ggctgcgcgg gcatggccgg attcgccaga cagctgagtg aagagctcgg cgtccccgtc 600 atcgacgcgg tcgaggcagc ctgccgcgtc gcggagagcc tcgtcgccct ggggtaccgc 660 accagcaagg cgaacaccta ccaagcaccc accgagaagc agtacctcta acgagaagga 720 gcgatgtcat gttcgacgtc attgtgaaga actgtcgagt ggtttccagt cagggcatca 780 tcgaagccga catcctcgtg aaggacggcc ggatcgccgc catcagcgag gagcccctcg 840 aggccgaagc cgcccggacc atcgatgccg caggcaggtt cgtgatgccc ggtgtggtcg 900 atgaacacgt gcacatcatc gacatggatc tgaaggaggt ctacgggcgg ttcgaactcg 960 attccgagtc ggcggccgtc ggcggtgtga ccaccatcat cgagatgccg atcacgttcc 1020 cgcccacgac caccctggag gccttcctcg agaagaagaa gcagggagag cagcgactca 1080 aggtcgactt cgcgctgtac ggcggcggag tgcccggaaa cctgagcgag atccggaaga 1140 tgcatgatgc cggcgccgtg ggcttcaagt cgatgatggc ggcctccgtt cccgggatgt 1200 tcgaagccgt cgacgacgga cagctgttcg agatcttcca ggagatcgcg gcctgcggct 1260 cggtgatcgt ggtgcacgcc gagaacgaga tgctcatcca gacgctgcag aagcagctca 1320 aggcggccgg gcgcaaggac ctggcggcgt atgaggcgtc ccagccggtc ttccaggaga 1380 acgaggcgat ccagcgcgcg ctgctcctgc agaaggaggc gggctgccga ctcatcgtcg 1440 ttcacgtgag caaccccggc ggcgtggagt tgatccacaa ggcgcagtcg gagggtcagg 1500 acgtgcactg cgagtcaggc cctcagtacc tcaacctcac aatggatgac gccgagaagg 1560 tcggcccgta catgaagatc gccccgccgg tccgttcggc cgagctgaac gccgtcctct 1620 gggagcagct cgagaagggg tacatcgaca cgctcggatc ggatcacggt gggcaccccg 1680 tcgagaacaa ggagggcggc tgggacgaca tctggacggc cagcaacggt gcgctgggac 1740 tggagacgtc gctgccgatg atgctgacca acggcgtcaa caagggccgc gtctcgctgg 1800 agcgactggt cgaggtgatg tgcgagaacc cggcgaagct cttcgggatc tatccgcaga 1860 agggcacgct ccaggtcggc tcggacgccg atctcctcat cctcgatctc gagatcgagg 1920 acaggaaggt ggatgcttcg cagttccgct cgctcctgca ctacagtcca ttcgatggac 1980 ggccggtcac cggcgcgccc gtcctcacga tgatccgtgg aacagtcgtc gcccaggacg 2040 gagagatcct cgtcgaccag gggttcgggc agttcgtgac ccggcgcgac agcgaggtgt 2100 cgtcgtgacg ctgcagcagg cgcgggccga tcgcatcgag gaggagctct ggactctctc 2160 ccgcttctcg gtcgaagggc ccggcgtgac acgtctcacg tacactccgg agcacgccgc 2220 cgcgcgagag gtgatcgtcg ccgccatgca gcggacgggg ctgagcgtcc acgaggacgc 2280 tctcggcaac atcatcggtc ggcgtgaggg gagcgacccc gctctgccgg cgatcgcctt 2340 cggctcgcac ttcgactcgg tccgcaacgg cgggatgttc gacggcaccg cgggcgtggt 2400 gtgcgcgctc gaggctgcga gggtgctgca ggagagcgga tatgtgaacc gtcatcctct 2460 cgaggtcatc gcgatcgtcg aagaggaggg cacccgcttc agcagcggca tgctgggcgg 2520 tcgcgcgatc gcggggctcg tgtccgacgc cgatctggac accctggtgg acgaagacgg 2580 cgtgacggtg cgcgaggcgg ccacggcctt cgggctggaa ccgggtgagc tgcggacggc 2640 ggcccgtacg agggatgacc ttcgcgcctt catcgagttg cacatcgagc aggggccgat 2700 cctcgagcag gagaaggtgg agatcggcgt cgtgacgggg atcgtcggtg tccgcgcctt 2760 ccggatcacg gtggagggca ggagcgacca cgccgggacg acccccatgc acctgcggca 2820 ggacgcgctg gtgccggcgg cgctcatggt gcgagagatc aatcggttcg tcaacgagat 2880 cgcggacggc acggtggcga ccgtcggcca cctcacggtg acccctggtg ggctcaacca 2940 ggttcccggg ggcgtcgagt tcacgctcga tctgcgatcg ccccacgagg agtcgatccg 3000 gctcctggtc gacaggatcg aggcgatggt ggcagaagtc gccgccgcgg ccggagtcga 3060 ggccgcggtg aacgggttct tcgcgctcag ccctgtcggt ctgtctccgg tggtcgtgga 3120 tcgcgtgcgc gacgcggcgt ccgaactcgg cttcacccat cgcgacatca cgagcggggc 3180 agggcacgac tcgatgttca tcgcccagat caccgacgtc ggaatggtgt tcgtccccag 3240 ccgcgccggg cgaagccatg tgccggagga atggtccgat ttcgacgatc tgcggaaggg 3300 gacggatgtg gtccttcacg tcgtgacggc gcttgaccgg tga 3343 <210> 8 <211> 30 <212> PRT <213> Microbacterium liquefaciens <400> 8 Met Arg Ile His Val Ile Asn Pro Asn Ser Ser Val Asp Leu Thr Asp 1 5 10 15 Ala Val Ala Glu Ala Ala Arg Ser Val Val Ser Pro Gly Thr 20 25 30 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthesized primer <400> 9 atgmgnathc aygtnathaa ycc 23 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthesized primer <400> 10 gtggayytga cngaygcagt tgcagargcn gc 32 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthesized primer <400> 11 gccgaattcg cgactggcaa cacgaagg 28 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthesized primer <400> 12 cggggatcct tctcgttaga ggtactgc 28

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒダントインラセマーゼ、ヒダントイナーゼお
よびＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼをコ
ードする構造遺伝子群の構造を示す図である。

【図２】本発明のヒダントインラセマーゼの製造工程を
示すフローチャートである。

【図３】本発明のヒダントインラセマーゼの至適ｐＨ曲
線を示す図である。

【図４】本発明のヒダントインラセマーゼのｐＨ安定曲
線を示す図である。

【図５】本発明のヒダントインラセマーゼの至適温度曲
線を示す図である。

【図６】本発明のヒダントインラセマーゼの温度安定曲
線を示す図である。

【図７】本発明のヒダントインラセマーゼによるBHのラ
セミ化のタイムコースを示す図である。 ○：基質D-BH（HRase添加）、 △：基質D-BH（HRase無
添加）、●：基質L-BH（HRase添加）、黒△：基質L-BH
（HRase無添加）

【図８】D-Phe生成のタイムコースを示す図である。 □：基質D-BH（HRase無添加）、 ○：基質DL-BH（HRas
e無添加）、△：基質L-BH（HRase無添加）、黒□：基質
DL-BH（HRase添加）、黒△：基質L-BH（HRase添加）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 17/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 横関 健三 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社アミノサイエンス研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 BA07 CA04 CA12 DA06 4B050 CC03 DD02 EE03 FF01 FF04 FF05 FF09 FF11 FF12 LL05 4B064 AE02 AE03 CA19 CD12 CD13 4B065 AA26X AA36Y AB01 CA27

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ５置換ヒダントインのラセミ化反応を触
   媒する５置換ヒダントインラセマーゼにおいて、作用至
   適ｐＨがｐＨ７〜９の範囲内にあり、作用至適温度が５
   ０〜６０℃の範囲内にあることを特徴とする５置換ヒダ
   ントインラセマーゼ。
2. 【請求項２】 下記(a)または(b)のアミノ酸配列を有
   し、５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパ
   ク質。 (a)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列 (b)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において1
   または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加ま
   たは逆位を含むアミノ酸配列
3. 【請求項３】 マイクロバクテリウム属細菌を培養して
   得た菌体を破砕または溶菌後、精製処理を行うことによ
   り取得されるマイクロバクテリウム属細菌由来の５置換
   ヒダントインラセマーゼ画分。
4. 【請求項４】 請求項１または２に記載の５置換ヒダン
   トインラセマーゼまたは請求項３に記載の５置換ヒダン
   トインラセマーゼ画分を、光学活性５置換ヒダントイン
   化合物に作用させることを特徴とする光学活性５置換ヒ
   ダントイン化合物のラセミ化方法。
5. 【請求項５】 請求項１または２に記載の５置換ヒダン
   トインラセマーゼまたは請求項３に記載の５置換ヒダン
   トインラセマーゼ画分、および、５置換ヒダントインを
   光学選択的に加水分解する酵素または当該酵素含有物
   を、５置換ヒダントインに作用させることを特徴とする
   Ｎ−カルバミルアミノ酸の製造方法。
6. 【請求項６】 請求項１または２に記載の５置換ヒダン
   トインラセマーゼまたは請求項３に記載の５置換ヒダン
   トインラセマーゼ画分、５置換ヒダントインを加水分解
   する酵素または当該酵素含有物、および、Ｎ−カルバミ
   ルアミノ酸を光学選択的に加水分解する酵素または当該
   酵素含有物を、５置換ヒダントインに作用させることを
   特徴とする光学活性アミノ酸の製造方法。
7. 【請求項７】 請求項１に記載の５置換ヒダントインラ
   セマーゼをコードするＤＮＡ。
8. 【請求項８】 下記(a)または(b)の塩基配列を有し、５
   置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質を
   コードするＤＮＡ。 (a)配列表配列番号１に記載の塩基配列 (b)配列表配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェ
   ントな条件でハイブリダイズする塩基配列
9. 【請求項９】 下記(c)または(d)のアミノ酸配列を有
   し、５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパ
   ク質をコードするＤＮＡ。 (c)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列 (d)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において1
   または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加ま
   たは逆位を含むアミノ酸配列
10. 【請求項１０】 請求項７〜９のいずれかに記載のＤＮ
    ＡとベクターＤＮＡとが接続されて得られる組み換えＤ
    ＮＡ。
11. 【請求項１１】 前記ベクターＤＮＡは、ｐＵＣ系プラ
    スミド、ｐＢＲ３２２系プラスミドまたはその誘導体に
    由来することを特徴とする請求項１０に記載の組み換え
    ＤＮＡ。
12. 【請求項１２】 請求項１０または１１に記載の組み換
    えＤＮＡによって形質転換された細胞。
13. 【請求項１３】 前記細胞は、エシェリヒア コリに由
    来することを特徴とする請求項１２に記載の細胞。
14. 【請求項１４】 請求項１２または１３に記載の細胞を
    培地中で培養し、培地中および／または細胞中に５置換
    ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質を蓄積
    させることを特徴とする５置換ヒダントインラセマーゼ
    活性を有するタンパク質の製造方法。