JPWO2003085108A1 - ヒダントイナーゼ遺伝子及びカルバミラーゼ遺伝子を有する組換えｄｎａ、並びにアミノ酸製造方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ＨＨａｓｅ等の酵素遺伝子が効率よく共発現される組換えＤＮＡを作製すること、さらにはこのような組換えＤＮＡを利用してヒダントインからのアミノ酸製造を効率よく行うことを課題とするものである。本発明により、下記（Ｉ）および（ＩＩ）の遺伝子領域をコードする塩基配列が所定の方向に所定の順序で組み込まれた組換えＤＮＡが提供され、アミノ酸を効率よく製造することができる。（Ｉ）ヒダントイナーゼ遺伝子をコードする塩基配列と、当該ヒダントイナーゼ遺伝子をコードする塩基配列の上流部に位置し当該ヒダントイナーゼ遺伝子の発現を調節するｔｒｐプロモーター配列とを含む遺伝子領域（ＩＩ）カルバミラーゼ遺伝子をコードする塩基配列と、当該カルバミラーゼ遺伝子をコードする塩基配列の上流部に位置し当該カルバミラーゼ遺伝子の発現を調節するｔｒｐプロモーター配列とを含む遺伝子領域。
Description
技術分野
本発明は、組換えＤＮＡおよびこれを用いたアミノ酸製造方法に関し、詳しくは、ヒダントイナーゼ遺伝子およびカルバミラーゼ遺伝子が効率良く共発現する組換えＤＮＡおよびこれを用いた生産性の高いアミノ酸製造方法に関する。
背景技術
酵素を用いたアミノ酸製法の一つとして、化学的に安価に合成される５置換ヒダントイン化合物を出発物質として、これを光学活性なアミノ酸に不斉分解する方法が知られている。この５置換ヒダントイン化合物から光学活性アミノ酸を製造する方法は、医薬品、化学工業品、食品添加物などの製造に重要な方法である。
５置換ヒダントイン化合物から光学活性アミノ酸を製造する方法の一つとして、以下の（Ａ）、（Ｂ）の酵素を用いる方法がある。
（Ａ）５置換ヒダントイン化合物に作用し、当該物質を加水分解することによりＮ−カルバミルアミノ酸を生成する反応を触媒する酵素：ヒダントイナーゼ（ヒダントインハイドロラーゼともいわれる。以下「ＨＨａｓｅ」とも記す）。
（Ｂ）生成したＮ−カルバミルアミノ酸に作用し、当該物質を加水分解することによりアミノ酸を生成する反応を触媒する酵素：カルバミラーゼ（Ｎ−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼともいわれる。以下「ＣＨａｓｅ」とも記す）。
ここで、５置換ヒダントイン化合物から光学活性アミノ酸を製造するためには、上記（Ａ）ＨＨａｓｅおよび（Ｂ）ＣＨａｓｅのうち、少なくとも一方に光学選択性の酵素を用いればよい。
上記のように酵素を用いる場合、ＨＨａｓｅ、ＣＨａｓｅをコードする遺伝子を大腸菌などの宿主に導入して形質転換体を作製し、この形質転換体を培養して５置換ヒダントインからアミノ酸を生成させて培地中に蓄積させるという方法をとり得る。組換えＤＮＡを利用してアミノ酸製造を行う方法としては、例えば、ＷＯ ０１／２３５８２号公報、ＷＯ ０５／８４４９号公報等が報告されている。これらに記載の技術ではＨＨａｓｅ等の発現用プロモーターとしてラムノースプロモーターが用いられている。
発明の開示
外来遺伝子を組換えベクターに搭載して微生物などの細胞に導入し、その細胞内で発現させることは既に様々な実用技術が開発されている。アミノ酸製造に関連したものとしては、例えば、上記２公報に記載された技術があるが、これらにおいてはラムノースプロモーターが用いられている。ラムノースプロモーターを機能させるためには所定の時期に誘導剤としてラムノースを添加することを要するが、ラムノースの添加についてはその添加時期などの設定が極めて重要となる。工業的にアミノ酸を製造する場合、誘導剤の添加という工程が増える上に、その添加時期の調節は繊細さが要求され、製造工程を複雑化してしまうことになる。
また、周知のプロモーターとして、ｌａｃプロモーターがある。しかし、組換え微生物を用いて工業的にアミノ酸を大量生産する場合、微生物を高密度に保つ必要性があり、そのために栄養源としてグルコースを添加して培養することがある。しかるにグルコースの添加は、ｌａｃプロモーターを抑制することにつながるため、工業的なアミノ酸製造をするにあたっては、ｌａｃプロモーターを採用することが好ましくない場合がある。
このように、どのようなプロモーターを組み合わせるか、また宿主に何を選ぶかなどは、具体的な状況に応じて適切に選択する必要がある。実験室レベルで可能であることが工業的にも有利であるとは限らず、単に発現量を強化できるプロモーター等として知られているものを利用すればよいというものではない。さらに、上記のように複数の酵素を発現させることを要する場合、最終的な目的に応じて複数の遺伝子をバランス良く共発現させる必要がある。
本発明は、上記のような観点からなされたものであり、ＨＨａｓｅ等の酵素遺伝子が効率よく共発現される組換えＤＮＡを作製すること、さらにはこのような組換えＤＮＡを利用してヒダントインからのアミノ酸製造を効率よく行うことを課題とする。
本発明者らは、ＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅ遺伝子の共発現を効率よく行うことができる組換えＤＮＡを得るため鋭意研究を進めたところ、数あるプロモーターの中でもｔｒｐプロモーターが、ＨＨａｓｅ、ＣＨａｓｅ、さらにはヒダントインラセマーゼ（以下「ＨＲａｓｅ」とも記す）を効率よく発現させることができると共に、アミノ酸の工業的製造上も好適なプロモーターであることを見出した。さらに、本発明者らは、ＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅを組換えＤＮＡに挿入するにあたり、これらの遺伝子の向きおよび挿入順序などの配置によっても酵素活性に大きな差が現れることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕 下記（Ｉ）および（ＩＩ）の遺伝子領域をコードする塩基配列を有する組換えＤＮＡ。
（Ｉ）ヒダントイナーゼ遺伝子をコードする塩基配列と、当該ヒダントイナーゼ遺伝子をコードする塩基配列の上流部に位置し当該ヒダントイナーゼ遺伝子の発現を調節するｔｒｐプロモーター配列とを含む遺伝子領域
（ＩＩ）カルバミラーゼ遺伝子をコードする塩基配列と、当該カルバミラーゼ遺伝子をコードする塩基配列の上流部に位置し当該カルバミラーゼ遺伝子の発現を調節するｔｒｐプロモーター配列とを含む遺伝子領域
〔２〕 （Ｉ）の遺伝子領域をコードする塩基配列と（ＩＩ）の遺伝子領域をコードする塩基配列の転写方向が同じ方向であり、かつ当該転写方向と同じ方向に向かって（Ｉ）の遺伝子領域をコードする塩基配列、（ＩＩ）の遺伝子領域をコードする塩基配列の順に配列されていることを特徴とする、上記〔１〕に記載の組換えＤＮＡ。
〔３〕 （Ｉ）の遺伝子領域をコードする塩基配列と（ＩＩ）の遺伝子領域をコードする塩基配列の転写方向が逆方向であることを特徴とする、上記〔１〕に記載の組換えＤＮＡ。
〔４〕 （Ｉ）の遺伝子領域をコードする塩基配列と（ＩＩ）の遺伝子領域をコードする塩基配列の転写方向が同じ方向であり、かつ、当該転写方向と同じ方向に向かって（ＩＩ）の遺伝子領域をコードする塩基配列、（Ｉ）の遺伝子領域をコードする塩基配列の順に配列されていることを特徴とする、上記〔１〕に記載の組換えＤＮＡ。
〔５〕 組換えＤＮＡが、プラスミドである、上記〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の組換えＤＮＡ。
〔６〕 上記〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の組換えＤＮＡにより形質転換された形質転換細胞。
〔７〕 上記〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の組換えＤＮＡと、
ヒダントインラセマーゼ遺伝子をコードする塩基配列および当該ヒダントインラセマーゼ遺伝子の上流部に位置し当該ヒダントインラセマーゼ遺伝子の発現を調節するｔｒｐプロモーター配列を有する組換えＤＮＡと、
によって形質転換された形質転換細胞。
〔８〕 上記〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の組換えＤＮＡが低コピーな組換えＤＮＡであり、ヒダントインラセマーゼ遺伝子をコードする塩基配列および当該ヒダントインラセマーゼ遺伝子の上流部に位置し当該ヒダントインラセマーゼ遺伝子の発現を調節するｔｒｐプロモーター配列を有する組換えＤＮＡが高コピーな組換えＤＮＡである〔７〕に記載の形質転換細胞。
〔９〕 組換えＤＮＡの宿主がエシェリヒア コリである、上記〔６〕から〔８〕のいずれかに記載の形質転換細胞。
〔１０〕 上記〔６〕に記載の形質転換細胞を培地中で培養し、培地中および／または形質転換細胞中にヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質およびカルバミラーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させることを特徴とする、混合タンパク質の製造方法。
〔１１〕 上記〔７〕に記載の形質転換細胞を培地中で培養し、培地中および／または形質転換細胞中に、ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質、カルバミラーゼ活性を有するタンパク質およびヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させることを特徴とする、混合タンパク質の製造方法。
〔１２〕 上記〔６〕から〔９〕のいずれかに記載の形質転換細胞を培地中で培養して培養物を得、当該培養物に５置換ヒダントインを混合してアミノ酸を生成させることを特徴とするアミノ酸の製造方法。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明について、１．組換えＤＮＡ等、２．酵素タンパク質の製造、３．アミノ酸の製造方法、の順により詳細に説明する。
１．組換えＤＮＡ等
本発明の組換えＤＮＡは以下の（Ｉ）および（ＩＩ）の遺伝子領域をコードする塩基配列を有する。
（Ｉ）ＨＨａｓｅ遺伝子をコードする塩基配列と、当該ＨＨａｓｅ遺伝子をコードする塩基配列の上流部に位置し当該ＨＨａｓｅ遺伝子の発現を調節するｔｒｐプロモーター配列とを含む遺伝子領域（以下「ｔｒｐ＋ＨＨａｓｅ」と記載する場合がある。また図面においてはｔｒｐプロモーターを「Ｐｔｒｐ」と表示する。）
（ＩＩ）ＣＨａｓｅ遺伝子をコードする塩基配列と、当該ＣＨａｓｅ遺伝子をコードする塩基配列の上流部に位置し当該ＣＨａｓｅ遺伝子の発現を調節するｔｒｐプロモーター配列とを含む遺伝子領域（以下「ｔｒｐ＋ＣＨａｓｅ」と記載する場合がある。）
すなわち、本発明の組換えＤＮＡは、ＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅのそれぞれを発現させるためのプロモーターとして、ｔｒｐプロモーターを採用したものである。ｔｒｐプロモーターは、トリプトファンの生合成に関与するいくつかの酵素をコードする遺伝子群の上流に存在するプロモーターであり、大腸菌などに存在する。本発明では、ｔｒｐプロモーターとして既に知られているものを用いてもよい。ｔｒｐプロモーターは、ｔｒｐプロモーターを含むクローニング用ベクターあるいはこのようなベクターを含む細胞の形態で市販されている。ｔｒｐプロモーターを用いることにより、ＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅの発現量を十分に得ることができる。また、ｔｒｐプロモーターはラムノースプロモーターにおけるラムノース添加のような誘導剤を添加を要しない。したがって、アミノ酸製造を行う生産工程において誘導剤添加に伴う種々の工程または処理を省くことができる。さらに、ｔｒｐプロモーターは、グルコースによって抑制されないので、工業的規模でのアミノ酸製造で形質転換微生物を高密度培養するためにグルコースを用いても、酵素の発現量が抑制されずにすむ。
ベクターなどの組換えＤＮＡに、ＨＨａｓｅをコードする塩基配列を有するＤＮＡ（以下「ＨＨａｓｅをコードするＤＮＡ」と表記しても同じ意味である。ＣＨａｓｅ等について同じ）およびＣＨａｓｅをコードするＤＮＡを組み込む際には、その挿入向きと順序に関し以下の３種の形態がある。
（第１の形態） （Ｉ）の遺伝子領域をコードする塩基配列と（ＩＩ）の遺伝子領域をコードする塩基配列の転写方向が同じ方向であり、かつ当該転写方向と同じ方向に向かって（Ｉ）の遺伝子領域をコードする塩基配列、（ＩＩ）の遺伝子領域をコードする塩基配列の順になるように組み込む（図１の▲１▼）。すなわち、図１の▲１▼では、「ｔｒｐ＋ＨＨａｓｅ」遺伝子領域、「ｔｒｐ＋ＣＨａｓｅ」遺伝子領域ともに転写方向が左から右向きであり、その順序が左から「ｔｒｐ＋ＨＨａｓｅ」遺伝子領域、「ｔｒｐ＋ＣＨａｓｅ」遺伝子領域の順に配置される。なお、図１においては、ＨＨａｓｅ、ＣＨａｓｅ共に、Ｄ体を特異的に基質とするＤＨＨａｓｅおよびＤＣＨａｓｅを例示している。
（第２の形態） （Ｉ）の遺伝子領域をコードする塩基配列と（ＩＩ）の遺伝子領域をコードする塩基配列の転写方向が逆方向になるように組み込む（図１の▲２▼）。すなわち、図１の▲２▼においては、「ｔｒｐ＋ＣＨａｓｅ」遺伝子領域の転写方向が右から左であり、「ｔｒｐ＋ＨＨａｓｅ」遺伝子領域の転写方向が左から右である。
（第３の形態） （Ｉ）の遺伝子領域をコードする塩基配列と（ＩＩ）の遺伝子領域をコードする塩基配列の転写方向が同じ方向であり、かつ、当該転写方向と同じ方向に向かって（ＩＩ）の遺伝子領域をコードする塩基配列、（Ｉ）の遺伝子領域をコードする塩基配列の順となるように組み込む（図１の▲３▼）。すなわち、「ｔｒｐ＋ＨＨａｓｅ」遺伝子領域および「ｔｒｐ＋ＣＨａｓｅ」遺伝子領域の転写方向が共に右から左方向であり、右から「ｔｒｐ＋ＣＨａｓｅ」遺伝子領域、「ｔｒｐ＋ＨＨａｓｅ」遺伝子領域の順に配置されている。
図１に示す例において、「Ｐｔｒｐ」とはｔｒｐプロモーターのことである。また、「ＤＨＨａｓｅ」はＤ−ヒダントイナーゼ活性を有するＨＨａｓｅであり、「ＤＣＨａｓｅ」はＤ−カルバミラーゼ活性を有するＣＨａｓｅである。また、矢印は、矢印の方向に転写が進むことを意味する。
これら３形態のうち、最もＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅの共発現が強いのは第３（図１の▲３▼）の形態である。すなわち、第３の形態は、１つの組換え体の中に２種の酵素遺伝子を有していながらこれらの共発現が最もバランス良く効率的に行われる形態であり、工業的にアミノ酸を大量生産するに特に好適である。
形質転換体を使って２種以上の酵素を発現させる場合、１つの組換えＤＮＡに１種の遺伝子のみのせ、複数種の組換えＤＮＡを宿主に導入することも考えられるが、宿主でのコピー数の高低や組換えＤＮＡの消失等により、複数の遺伝子の発現量にばらつきが生じる場合がある。しかし、本発明では１つの組換えＤＮＡに２つの酵素遺伝子を搭載して効率よく共発現させることができるため、宿主の分裂・増殖などによってＨＨａｓｅとＣＨａｓｅの発現量に偏りが生じたりするおそれが少ない。
また、ＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅを用いてアミノ酸を生産する場合、両方の発現量が高いことが望ましいが、その反応系からすると、ＨＨａｓｅとＣＨａｓｅとを対比した場合、相対的にはＣＨａｓｅの活性がより高いことが効率よいアミノ酸生産のためには望ましい。このように１つの組換え体にＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅをコードする２種の遺伝子を搭載した場合、それぞれの発現がアミノ酸の工業的製造に適するようなバランスで生じることが望ましく、この点においても第３の形態が最も優良である。
本発明の組換えＤＮＡに搭載される、ＨＨａｓｅ、ＣＨａｓｅをコードするＤＮＡは、既知のものを用いてよい。ＨＨａｓｅは、ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質であればよく、またＣＨａｓｅは、カルバミラーゼ活性を有するタンパク質であればよい。光学活性を有するアミノ酸、すなわちＬ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸のいずれか一方を選択的に製造する場合には、ＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅのうち少なくとも一方に、光学選択性を有するものを用いればよい。酵素について光学選択性とは、Ｌ体またはＤ体のいずれか一方を特異的に基質として反応を触媒するということである。
５置換ヒダントイン化合物を光学選択的に加水分解するＨＨａｓｅは次のようにして入手できる。たとえば、Ｎ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸を生成するＤＨＨａｓｅを有する菌としては、バチルス属細菌に耐熱性の酵素の存在が知られており、例としてバチルス ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＡＴＣＣ３１１９５株等からＨＨａｓｅまたは、ＨＨａｓｅ含有画分を調製すればよい（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４３巻 ２７０ページ、１９９５年）。ＡＴＣＣ３１１９５株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、住所１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）から入手することができる。また、Ｌ体ヒダントイン化合物に特異的に作用するＬＨＨａｓｅは、例えばバチルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＡＪ１２２９９株にその存在が知られている（特開昭６３−２４８９４号公報）。バチルス エスピーＡＪ１２２９９株は、１９８６年７月５日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ８８３７が付与され、２００１年６月２７日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）にブタペスト条約に基づき移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６４６が付与された微生物である。
光学選択性のないＨＨａｓｅは、マイクロバクテリウム リクエファシエンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＡＪ３９１２株のほか、例えばアースロバクター オーレセンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ）にその存在が知られている（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６１巻、１ページ、１９９８年）。
Ｎ−カルバミルアミノ酸をＤ体選択的に加水分解するＣＨａｓｅは、たとえばシュードモナス エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＡＪ１１２２０株にその存在が知られている（特公昭５６−００３０３４号公報）。再同定の結果、シュードモナス エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＡＪ１１２２０株は、アグロバクテリウムエスピー（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）に属することが判明している。アグロバクテリウム エスピーＡＪ１１２２０株は１９７７年１２月２０日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ４３４７が付与され、２００１年６月２７日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにブタペスト条約に基づき移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６４５が付与された微生物である。またＮ−カルバミルアミノ酸をＬ体選択的に加水分解するＣＨａｓｅは、たとえばフラボバクテリウム エスピー．（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＡＪ３９１２株（特公昭５６−００８７４９号公報）、バチルス エスピー．（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＡＪ１２２９９株にその存在が知られている。フラボバクテリウム エスピー．ＡＪ３９１２株は、上述の通り現在ではマイクロバクテリウム リクエファシエンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＡＪ３９１２株（ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３）に分類されているが、１９７５年６月２７日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３が付与され、２００１年６月２７日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにブタペスト条約に基づき移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６４３が付与された微生物である。またバチルス エスピーＡＪ１２２９９株は、１９８６年７月５日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ８８３７が付与され、２００１年６月２７日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにブタペスト条約に基づき移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６４６が付与された微生物である。
また、本発明の組換えＤＮＡを用いたアミノ酸製造において、組換えＤＮＡに搭載するＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅをコードするＤＮＡの好適な組み合わせとしては、以下のＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅから選ばれる組み合わせが挙げられる。以下の組み合わせにより、Ｄ−アミノ酸が選択的に生産される。
ＨＨａｓｅをコードするＤＮＡとして好ましくは、以下の（ｉ）から（ｉｖ）から選ばれるＤＮＡが挙げられる。
（ｉ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｉｉ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｉｉｉ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（ｉｖ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
などである。
ＣＨａｓｅをコードするＤＮＡとして好ましくは、以下の（ｖ）から（ｖｉｉｉ）から選ばれるＤＮＡが挙げられる。
（ｖ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｖｉ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｖｉｉ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（ｖｉｉｉ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
などを使用できる。
ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、さらに好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件があげられる。
また、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造や、ＤＨＨａｓｅ活性またはＤＣＨａｓｅ活性を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、２〜５０個、好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２〜１０個である。
上記の（ｉ）〜（ｉｖ）から選ばれるＤＨＨａｓｅと、上記（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）から選ばれるＤＣＨａｓｅとの組み合わせは、工業的にＤ−アミノ酸を大量生産すために必要となる酵素活性を得るために特に有利である。
なお、配列表配列番号１および３のＤＮＡは、フラボバクテリウム エスピー（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＡＪ１１１９９（ＦＥＲＭ−Ｐ４２２９）株の染色体ＤＮＡより単離、取得されたものである（特公昭５６−０２５１１９号公報）。フラボバクテリウム エスピー（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＡＪ１１１９９（ＦＥＲＭ−Ｐ４２２９）株は、当初アルカリゲネス アクアマリヌス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ａｑｕａｍａｒｉｎｕｓ）として通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託された微生物であるが、再同定の結果、フラボバクテリウム エスピー（Ｆｌａｖｏｔａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）に分類されることが判明した。フラボバクテリウム エスピー（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＡＪ１１１９９株は、昭和５２年９月２９日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ４２２９が付与され、さらに２００２年５月３０日に、ブタペスト条約に基づき、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに移管されて受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８０６３が付与された微生物である。
ＨＨａｓｅ、ＣＨａｓｅおよびＨＲａｓｅをコードする遺伝子を搭載する組換えＤＮＡは、宿主細胞にこれらの遺伝子を導入するためのベクターであることが望ましい。そのようなベクターとしては、具体的な例を挙げると、ｐＨＳＧ系（宝酒造（株）製）、ｐＵＣ系（宝酒造（株）製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック社製）、ｐＳＴＶ系（宝酒造（株）製）、ｐＴＷＶ系（宝酒造（株）製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック社製）、ｐＢＲ３２２系のプラスミド、あるいはその誘導体などが挙げられる。ここで「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。上記プラスミド並びにその誘導体は、複製開始点の種類により、宿主細胞内でのコピー数が異なり、高コピープラスミドとしては、ｐＨＳＧ系、ｐＵＣ系、ｐＰＲＯＫ系のプラスミドが挙げられ、低コピープラスミドとしては、ｐＳＴＶ系、ｐＴＷＶ系、ｐＫＫ２３３系、ｐＢＲ３２２系のプラスミドが挙げられる。
また、生産量を増大させるためには、タンパク質遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネーターを連結することが好ましい。このようなターミネーターとしては、ｒｒｎＢターミネーター、Ｔ７ターミネーター、ｆｄファージターミネーター、Ｔ４ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネーター、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネーター、などが挙げられる。また、ｒｒｎＢターミネーターなどは、プラスミドの安定性を良くするという点でも好ましい。
また、形質転換体を選別するために、該ベクターはアンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性などのマーカーを有することが好ましい。
プロモーター、ＨＨａｓｅをコードするＤＮＡおよびＣＨａａｓｅをコードするＤＮＡ、ターミネーターを所定の配置になるように連結したＤＮＡ断片と、ベクターＤＮＡとを連結して組換えＤＮＡを得ることができる。
上記のようにして得られた組換えＤＮＡを宿主細胞に導入して形質転換体が得られる。組換えＤＮＡ技術を用いてタンパク質を大量生産する場合、形質転換される宿主細胞としては、細菌細胞、放線菌細胞、酵母細胞、カビ細胞、植物細胞、動物細胞などを用いることができる。一般には、大腸菌（腸内細菌）を用いてタンパク質を大量生産する技術について数多くの知見があるため、大腸菌（腸内細菌）、好ましくはエシェリヒア コリが用いられる。特に、エシェリヒア コリＪＭ１０９株、特に（ＤＥ３）株が好ましい。
下記にて詳説するが、本発明のアミノ酸製造方法における他の形態としては、ＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅと共に、ＨＲａｓｅも用いる形態が挙げられる。この場合、ＨＲａｓｅも形質転換体によって生成させ、アミノ酸の製造に用いることができる。すなわち、ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡを有する組換えＤＮＡを作製し、当該組換えＤＮＡを宿主細胞に導入して形質転換させる。
本発明においては、ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡとして公知のものを用いてもよいが、好ましいものとしては、以下のものが挙げられる。
（ｉｘ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｘ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｘｉ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（ｘｉｉ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸を残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸をコードするＤＮＡ、
などが挙げられる。「ストリンジェントな条件」、「数個」の意味は上記ＨＨａｓｅ等をコードするＤＮＡについて説明したものと同様である。
なお、配列表の配列番号５のＤＮＡは、マイクロバクテリウム リクエファシエンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＡＪ３９１２株から単離・精製されたものである。マイクロバクテリウム リクエファシエンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＡＪ３９１２株は、当初フラボバクテリウム エスピー．（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＡＪ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３）株として１９７５年６月２７日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されたが、再同定の結果オーレオバクテリウム リクエファシエンス（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）に分類されることが判明した。さらに現在では、種名変更により、オーレオバクテリウム リクエファシエンス（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）はマイクロバクテリウム リクエファシエンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）に分類され、マイクロバクテリウム リクエファシエンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＡＪ３９１２（国内寄託番号ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３、国際寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６４３）として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡを搭載する組換えＤＮＡにおいても、ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡの発現を調節するプロモーターとして、ｔｒｐプロモーターを用いることが好ましい。また、ＨＲａｓｅが組み込まれた組換えＤＮＡにおいても、好ましいターミネーター、ベースとなる組換えＤＮＡ、選択のためのマーカー、宿主などは、ＨＨａｓｅ等を搭載する組換えＤＮＡの場合と同様である。
ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡを有する組換えＤＮＡは、ＨＨａｓｅをコードするＤＮＡおよびＣＨａｓｅをコードするＤＮＡが導入された宿主細胞に導入して、発現させることができる。このようにすることにより、１つの形質転換体を用いて、アミノ酸生産に必要となる３種の酵素を発現させることができ、複数の形質転換体を扱うよりも作業が軽減される。ただし、この場合には、ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡを有する組換えＤＮＡは、ＨＨａｓｅ等をコードするＤＮＡを搭載する組換えＤＮＡとは別個に作製することが望ましい。酵素遺伝子の大きさなどからすると、３種の酵素遺伝子を１つの組換えＤＮＡに搭載したものを作製することは実用性が低い。したがって、ＨＲａｓｅも発現させる場合には、２種の組換えＤＮＡが導入された形質転換体を作製することが望ましい。
また、一般に、２種以上の高コピー組換えＤＮＡを１つの宿主細胞内で同時に発現させることは困難であるため、２種の組換えＤＮＡを導入する場合には、いずれか一方の組換えＤＮＡを高コピー性の組換えＤＮＡとし、他方は相対的に低コピー性の組換えＤＮＡとすることが好ましい。どちらの組換えＤＮＡを高コピー性の組換えＤＮＡとするかは、各ＤＮＡによって生産される酵素量、プラスミドの安定性等を勘案し、決定する。本発明の組換えＤＮＡを用いてアミノ酸生産をするにあたっては、ＨＲａｓｅを有する組換えＤＮＡを高コピーな組換えＤＮＡ、ＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅを有する組換えＤＮＡを低コピーな組換えＤＮＡとすることが好ましい。高コピーか否かは、各組換えＤＮＡごとに形質転換体を作製し、それぞれの形質転換体により生成される酵素の活性を測定して判断することができる。
なお、本発明におけるプラスミド、ＤＮＡ断片、種々の酵素、形質転換体の作製、形質転換体の選抜などを扱う諸操作については、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、１９８９、ＣＯＬＤ ＳＰＲＩＮＧ ＨＡＲＢＯＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＰＲＥＳＳ等の既知の手法に従って行うことができる。
２．酵素タンパク質の製造方法
上記のような、組換えＤＮＡにより形質転換された細胞を培養することにより、ＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅ、さらにＨＲａｓｅをコードするＤＮＡを導入した場合にはＨＲａｓｅが発現生産される。生産培地としては、Ｍ９−カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地を用いてもよい。より具体的な培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、宿主菌などの種類に応じて適宜選択する。
培養した形質転換細胞を遠心分離操作などにより回収した後、形質転換体を破砕あるいは溶菌させ、ＨＨａｓｅおよび／またはＣＨａｓｅを回収し、粗酵素液として使用することができる。破砕には超音波破砕、フレンチプレス破砕、ガラスビーズ破砕などの方法を用いることができ、また溶菌させる場合には卵白リゾチームや、ペプチターゼ処理、または、これらを適宜組み合わせた方法が用いられる。さらに、必要に応じて、通常の沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィーなどの手法により、これらの酵素を精製して用いることも可能である。この場合、これらの酵素の抗体を利用した精製法も利用できる。
また、タンパク質を組み換えＤＮＡ技術を用いて大量生産するには、該タンパク質を生産する形質転換体内で該タンパク質が会合し、タンパク質の封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）を形成させることも好ましい形態として挙げられる。この発現生産方法の利点は、目的のタンパク質を菌体内に存在するプロテアーゼによる消化から保護する点および目的のタンパク質を菌体破砕に続く遠心分離操作によって簡単に精製できる点等である。
このようにして得られるタンパク質封入体は、タンパク質変性剤により可溶化され、主にその変性剤を除去することによる活性再生操作を経た後、正しく折り畳まれた生理的に活性なタンパク質に変換される。例えば、ヒトインターロイキン−２の活性再生（特開昭６１−２５７９３１号公報）等多くの例がある。
タンパク質封入体から活性型タンパク質を得るためには、可溶化・活性再生等の一連の操作が必要であり、直接活性型タンパク質を生産する場合よりも操作が複雑になる。しかし、菌体の生育に影響を及ぼすようなタンパク質を菌体内で大量に生産させる場合は、不活性なタンパク質封入体として菌体内に蓄積させることにより、その影響を抑えることができる。
目的タンパク質を封入体として大量生産させる方法として、強力なプロモーターの制御下、目的のタンパク質を単独で発現させる方法の他、大量発現することが知られているタンパク質との融合タンパク質として発現させる方法がある。
さらに、融合タンパク質として発現させた後に、目的のタンパク質を切り出すため、制限プロテアーゼの認識配列を適当な位置に配しておくことも有効である。
タンパク質封入体が形成される場合には、変性剤で融合タンパク質として回収されたタンパク質封入体を可溶化する。菌体タンパク質とともに可溶化してもよいが、以降の精製操作を考慮すると、封入体を取り出して、これを可溶化するのが好ましい。封入体を菌体から回収するには、従来公知の方法で行えばよい。例えば、菌体を破壊し、遠心分離操作等によって封入体を回収する。タンパク質封入体を可溶化させる変性剤としては、グアニジン塩酸（例えば、６Ｍ、ｐＨ５〜８）や尿素（例えば８Ｍ）などが挙げられる。
これらの変性剤を透析等により除くと、活性を有するタンパク質として再生される。透析に用いる透析溶液としては、トリス塩酸緩衝液やリン酸緩衝液などを用いればよく、濃度としては２０ｍＭ〜０．５Ｍ、ｐＨとしては５〜８が挙げられる。
再生工程時のタンパク質濃度は、５００μｇ／ｍｌ程度以下に抑えるのが好ましい。再生した酵素タンパク質が自己架橋を行うのを抑えるために、透析温度は５℃以下であることが好ましい。また、変性剤除去の方法として、この透析法のほか、希釈法、限外濾過法などがあり、いずれを用いても活性の再生が期待できる。
３．アミノ酸の製造方法
本発明のアミノ酸製造方法では、上記のようにＨＨａｓｅ等が組み込まれた組換えＤＮＡを導入して得た形質転換細胞を培地中で培養して、ＨＨａｓｅ等の酵素を生成させた培養物を得、当該培養物に５置換ヒダントインを混合してアミノ酸を生成させることによりアミノ酸を製造する。培養物は、ＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅをコードするＤＮＡを導入した場合には、ＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅが含まれるようにすればよい。また、加えてＨＲａｓｅをコードするＤＮＡを導入した場合にはＨＲａｓｅも含まれるようにすればよい。これらの所定の酵素が含まれていれば、培養物の形態は特に限定されない。すなわち、形質転換体を含む培地に５置換ヒダントインを直接添加してもよいし、培地から分離された菌体などの形質転換体、形質転換体の洗浄物、形質転換体を破砕処理あるいは溶菌処理等した処理物、ＨＨａｓｅ等を回収した粗酵素液、さらに精製した酵素液などと、５置換ヒダントインとを混合することにより、所望のアミノ酸を生産することができる。
ＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅを用いて、５置換ヒダントインからアミノ酸を生成する反応工程を下記化学式（Ｉ）に示す。
光学活性を有するアミノ酸を製造するには、光学選択性を有するＨＨａｓｅを用いることにより、Ｎ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸またはＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸のいずれかを生成させ、さらにカルバミルアミノ酸にＣＨａｓｅを作用させて、光学活性アミノ酸を製造することができる。
また、ＨＨａｓｅに光学選択的加水分解活性がなくとも、ＣＨａｓｅに光学選択性があれば、生成アミノ酸はＤ型もしくはＬ型の光学活性体を得ることができる。この場合、反応液中には未反応のエナンチオマーであるＮ−カルバミルアミノ酸、すなわちＣＨａｓｅがＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸を選択的に分解しＬ−アミノ酸を生成させる場合にはＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸が、また逆にＤ−アミノ酸を生成させる場合にはＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸が、それぞれ残存することが想定される。しかしながら、このような場合においてＨＨａｓｅは、残存することになる未反応エナンチオマーのＮ−カルバミルアミノ酸を脱水縮合させ、再度５置換ヒダントイン化合物を生成させる逆反応をもわずかながら触媒するので、ＨＨａｓｅ、光学選択性の高いＣＨａｓｅの２種の酵素、もしくは２種の酵素含有物により、高収率（モル収率５０％以上）で光学活性アミノ酸を製造することが可能となる。
次に、ＤＬ５置換ヒダントインから光学活性アミノ酸を生成する反応の例として、ＨＲａｓｅを用いてＤ−アミノ酸を光学選択的に生成する反応を、化学式（ＩＩ）に示す。
ＨＲａｓｅを用いた場合、下記反応式（ＩＩ）に示すように、混合タンパク質に含まれＨＲａｓｅが５置換ヒダントイン化合物のラセミ化を触媒するので、ＤＬ体の５置換ヒダントイン化合物から理論的にはモル収率１００％でＤ−アミノ酸を製造することが可能となる。
本発明のアミノ酸製造においては、ＨＨａｓｅまたはＨＲａｓｅの基質となる５置換ヒダントイン化合物が用いられる。５置換ヒダントイン化合物の具体例としては、ヒダントイン、５−メチルヒダントイン、５−ベンジルヒダントイン、５−（４−ヒドロキシベンジル）ヒダントイン、５−インドリルメチルヒダントイン、５−（３，４−ジヒドロキシベンジル）ヒダントイン、５−（ｐ−ハイドロキシベンジル）ヒダントイン、５−（３’−ピリジル）−メチルヒダントイン、５−メチルチオエチルヒダントイン、５−イソプロピルヒダントイン、５−イソブチルヒダントイン、５−ｓｅｃ−ブチルヒダントイン、５−カルボキシエチルヒダントイン、５−カルボキシメチルヒダントイン、５−（４−アミノブチル）ヒダントイン、５−ヒドロキシメチルヒダントインなどに代表されるような天然型アミノ酸に対応する５置換ヒダントイン化合物の他、５−フェニルヒダントイン、５−（４−ヒドロキシフェニル）ヒダントイン、５−メトキシメチルヒダントイン、５−ベンジロキシメチルヒダントイン、５−（３，４−メチレンジオキシベンジル）ヒダントイン、ジヒドロウラシルなどに代表されるような非天然型のアミノ酸若しくはその誘導体に対応する５置換ヒダントインなどが挙げられる。
なお、上記の酵素タンパク質を用いてＮ−カルバミルアミノ酸を製造することも可能である。例えば、上記混合タンパク質に、Ｌ−又はＤ−ＣＨａｓｅの阻害剤等を添加して加水分解反応をＮ−カルバミルアミノ酸で止めることにより、Ｎ−カルバミルアミノ酸を製造できる。
組換えＤＮＡによって形質転換された細胞の培養液、分離菌体、洗浄菌体、菌体処理物、当該菌体処理物から得られる粗酵素液または精製酵素を用いてアミノ酸生成反応を進行させる場合には、５置換ヒダントイン化合物と培養液、分離菌体、洗浄菌体、菌体処理物、粗酵素液、または精製酵素を含む反応液を２５〜４０℃の適当な温度に調整し、ｐＨ５〜９に保ちつつ、８時間〜５日静置または攪拌すればよい。
また、組換えＤＮＡによって形質転換された細胞を水溶性媒体中で培養しながら、アミノ酸生成反応を進行させる場合には、５置換ヒダントイン化合物を含み、かつ形質転換された細胞の生育に必要な炭素源、窒素源、無機イオンなどの栄養素を含む水溶性媒体が用いられる。さらにビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を添加すると望ましい結果が得られる場合が多い。５置換ヒダントイン化合物は分割添加してもよい。好気的条件下でｐＨ５〜９、温度２５〜４０℃の適当な範囲に制御しつつ、８時間〜５日培養することが好ましい。
培養液あるいは反応液中のＤ−アミノ酸の定量は周知の方法を用いて速やかに測定することができる。即ち、簡便にはＭｅｒｃｋ製のＨＰＴＬＣ ＣＨＩＲなどを利用した薄層クロマトグラフィーを利用することができ、より分析精度を高めるには、ダイセル化学工業製のＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＷＨなどの光学分割カラムを利用した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いればよい。
生成したアミノ酸は、公知の手法により分離精製することができる。例えば、イオン交換樹脂に接触させて塩基性アミノ酸を吸着させ、これを溶離後晶析する方法または溶離後、活性炭等による脱色濾過し晶析する方法等が挙げられる。
大腸菌などの形質転換体を培養する条件にも左右されるが、概算として、ｔｒｐプロモータを用いた本発明の組換えＤＮＡを用いることにより、ラムノースプロモーターなどの他のプロモーターを用いた場合に比べて、約５倍程度の生産性（単位時間あたりのアミノ酸の生産量）の向上が可能である。
実施例
以下、実施例１〜実施例８を参照して本発明をさらに説明する。尚、本発明は実施例の記載に限定されない。
（実施例１）ＡＪ１１１９９株由来Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子のＥ．ｃｏｌｉにおける発現
１．発現プラスミドの構築
１−１．ｔｒｐプロモーター搭載プラスミドの構築
ｐＨＳＧ２９８（Ｔａｋａｒａ社製）をＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩにて処理し、得られたＤＮＡ断片とｔｒｐプロモーターカセット１（図２）をライゲーションし、このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換した。カナマイシン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、目的のプラスミドをｐＴｒｐ２９８ＥＫと命名した。なお、配列表配列番号２１には、図２に示されるｔｒｐプロモーターカセット１の上側の鎖について記載した。
１−２．Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子搭載プラスミドの構築
フラボバクテリウム エスピー（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＡＪ１１１９９株の染色体ＤＮＡを鋳型として、表１に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ（▲１▼〜▲４▼のいずれかと▲５▼との組み合わせで、計４種）により目的遺伝子を増幅した。これらの断片をＫｐｎＩ／ＸｂａＩにて処理し、得られたＤＮＡ断片とｐＴｒｐ２９８ＥＫのＫｐｎＩ／ＸｂａＩ処理物をライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、カナマイシン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、▲１▼〜▲４▼のいずれかと▲５▼とのプライマーで増幅したＤＮＡ断片を搭載する、それぞれのプラスミドをｐＴｒｐ２９８ＤＨＨａｓｅ１、２、３、４と命名した。
２．無細胞抽出液の調製
ｐＴｒｐ２９８ＤＨＨａｓｅ１、２、３または４を有する各Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を、カナマイシン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地（２ｍｌ）で３０℃、１６時間培養した。得られた培養液１００μｌを、４ｍｌの培地Ｉ（カザミノ酸１％、ペプトン１％、グルコース１％、硫酸アンモニウム０．５％、リン酸一カリウム０．１％、リン酸二カリウム０．３％、硫酸マグネシウム０．０５％、カナマイシン０．０１％（ｐＨ７．０））に移し、３７℃、１６時間培養した。培養後、１ｍｌの培養液から遠心分離（１０，０００ｇ×１０ｍｉｎ）により集菌し、得られた菌体を１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ、ｐＨ７．５）にて洗浄した。この洗浄菌体を０．５ｍｌの同緩衝液に懸濁し、超音波破砕（２０ＫＨｚ、１５ｍｉｎ、東湘電気製ＵＣＷ−２０１）を行った。この超音波破砕液を遠心分離（１０，０００ｇ×１０ｍｉｎ）し、得られた上清を無細胞抽出液とした。
３．ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によるＤ−ヒダントイナーゼ遺伝子発現の確認
無細胞抽出液１０μｌをＳＤＳポリアクリルアミドゲル（第一化学薬品製、マルチゲル１０／２０）に供し、Ｌａｅｍｅｌｌｉらの方法に従い、電気泳動を行った。その結果、ｐＴｒｐ２９８ＤＨＨａｓｅ３を有する形質転換体の無細胞抽出液のみに、Ｄ−ヒダントイナーゼに相当するタンパク質のバンドを認めた。
４．Ｄ−ヒダントイナーゼ活性測定
ｐＴｒｐ２９８ＤＨＨａｓｅ３を有するＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を、カナマイシン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地（２ｍｌ）で３０℃、１６時間培養した。得られた培養液０．５ｍｌを、５０ｍｌの培地ＩＩ（カザミノ酸１％、ペプトン１％、グルコース０．２％、硫酸アンモニウム０．５％、リン酸一カリウム０．１％、リン酸二カリウム０．３％、硫酸マグネシウム０．０５％、硫酸マンガン０．０１％、カナマイシン０．０１％（ｐＨ７．０））に移し、３７℃、２４時間培養した。
培養後、５ｍｌの培養液から遠心分離（１０，０００ｇ×１０ｍｉｎ）により集菌し、得られた菌体を１００ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．５）にて洗浄した。この洗浄菌体を５ｍｌの同緩衝液に懸濁し、その０．１ｍｌを０．９ｍｌの基質溶液（１３３ｍｇ／ｄｌ Ｄ−５−ベンジルヒダントイン、１．１ｍＭ ＭｎＳＯ４、１００ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．５））に添加し、３７℃にて６０分反応を行った。反応後、０．１ｍｌの反応液に、０．９ｍｌの反応停止溶液（１．１ｍＭ ＣｕＳＯ４）を添加し、遠心分離にて得られた上清をＨＰＬＣ（カラム：キラルパックＷＨ，０．４６×２５ｃｍ、溶出液：１ｍＭ ＣｕＳＯ４、流速：１．５ｍｌ／ｍｉｎ、温度：５０℃、検出波長：２１０ｎｍ）に供し、生成したＮ−カルバミル−Ｄ−Ｐｈｅを定量した。この条件にて、１分間に１μモルのＮ−カルバミル−Ｄ−Ｐｈｅを生成する酵素量を１Ｕと定義した。
その結果、ｐＴｒｐ２９８ＤＨＨａｓｅ３を有するＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９は、培養液１ｍｌ当り、１．５ＵのＤ−ヒダントイナーゼ活性を示した。
（実腋例２）ＡＪ１１１９９株由来Ｄ−カルバミラーゼ遺伝子のＥ．ｃｏｌｉにおける発現
１．Ｄ−カルバミラーゼ遺伝子搭載プラスミドの構築
フラボバクテリウム エスピー（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＡＪ１１１９９株の染色体ＤＮＡを鋳型として、表２に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ（▲１▼、▲２▼のいずれかと▲３▼との組み合わせで、計２種）により目的遺伝子を増幅した。これらの断片をＫｐｎＩ／ＸｂａＩにて処理し、得られたＤＮＡ断片とｐＴｒｐ２９８ＥＫのＫｐｎＩ／ＸｂａＩ処理物をライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、カナマイシン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、▲１▼、▲２▼のいずれかと▲３▼とのプライマーで増幅した断片を搭載する、それぞれのプラスミドをｐＴｒｐ２９８ＤＣＨａｓｅ１、２と命名した。
次にｐＴｒｐ２９８ＤＣＨａｓｅ１をＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩにて処理し、ｔｒｐプロモーターとカルバミラーゼ遺伝子が連結したＤＮＡ断片を得、このＤＮＡ断片をｐＨＳＧ２９９（Ｔａｋａｒａ社製）のＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、カナマイシン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、そのプラスミドをｐＴｒｐ２９９ＤＣＨａｓｅ１と命名した。
２．無細胞抽出液の調製
ｐＴｒｐ２９８ＤＣＨａｓｅ１、２またはｐＴｒｐ２９９ＤＣＨａｓｅ１を有する各Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９からの無細胞抽出液の調製は、実施例１記載の無細胞抽出液の調製と同様の方法で行った。
３．ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によるＤ−カルバミラーゼ発現の確認
無細胞抽出液１０μｌをＳＤＳポリアクリルアミドゲル（第一化学薬品社製、マルチゲル１０／２０）に供し、Ｌａｅｍｅｌｌｉらの方法に従い、電気泳動を行った。その結果、ｐＴｒｐ２９９ＤＣＨａｓｅ１を有する形質転換体の無細胞抽出液のみに、Ｄ−カルバミラーゼに相当するタンパク質のバンドを認めた。
４．Ｄ−カルバミラーゼ活性測定
ｐＴｒｐ２９９ＤＣＨａｓｅ１を有するＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９の菌体調製は、実施例１記載の酵素活性測定時と同様に行った。得られた洗浄菌体を５ｍｌの１００ｍＭＫＰＢ（ｐＨ７．５）に懸濁し、その０．１ｍｌを０．９ｍｌの基質溶液（４５８ｍｇ／ｄｌ Ｎ−カルバミル−Ｄ−Ｐｈｅ、１００ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．５））に添加し、３７℃にて６０分反応を行った。反応後、０．１ｍｌの反応液に、０．９ｍｌの反応停止溶液を添加し、遠心分離にて得られた上清をＨＰＬＣに供し、生成したＤ−Ｐｈｅを定量した。この条件にて、１分間に１μモルのＤ−Ｐｈｅを生成する酵素量を１Ｕと定義した。
その結果、ｐＴｒｐ２９９ＤＣＨａｓｅ１を有するＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９は、培養液１ｍｌ当り、０．６ＵのＤ−カルバミラーゼ活性を示した。
（実施例３） ＡＪ３９１２由来ヒダントインラセマーゼ遺伝子のＥ．ｃｏｌｉにおける発現
１．発現プラスミドの構築
１−１．ｔｒｐプロモーター搭載プラスミドの構築
ｐＨＳＧ２９８並びにｐＨＳＧ２９９をＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩにて処理し、得られたＤＮＡ断片とｔｒｐプロモーターカセット２（図２）をライゲーションし、このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換した。カナマイシン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、それぞれのプラスミドをｐＴｒｐ２９８ＥＸ並びにｐＴｒｐ２９９ＥＸと命名した。なお、配列表の配列番号２２には、図２に示されるｔｒｐプロモーターカセット２の上側の鎖について記載した。
１−２．ヒダントインラセマーゼ遺伝子搭載プラスミドの構築
マイクロバクテリウム リクエファシエンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＡＪ３９１２株の染色体ＤＮＡを鋳型として、表３に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ（▲１▼、▲２▼のいずれかと▲３▼との組み合わせで計２種）により目的遺伝子を増幅した。これらの断片をＸｂａＩ／ＰｓｔＩにて処理し、得られたＤＮＡ断片とｐＴｒｐ２９８ＥＸ並びにｐＴｒｐ２９９ＥＸのＸｂａＩ／ＰｓｔＩ処理物をライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、カナマイシン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、▲１▼、▲２▼のいずれかと▲３▼とのプライマーで増幅した断片を搭載する、それぞれのプラスミドをｐＴｒｐ２９８ＨＲａｓｅ１、２、ｐＴｒｐ２９９ＨＲａｓｅ１、２と命名した。
次に、ｐＴｒｐ２９９ＨＲａｓｅ２をＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩにて処理し、ｔｒｐプロモーターとヒダントインラセマーゼ遺伝子が連結したＤＮＡ断片を得、このＤＮＡ断片をｐＳＴＶ２９（Ｔａｋａｒａ社製）のＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、クロラムフェニコール耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、そのプラスミドをｐＴｒｐ２９ＨＲａｓｅと命名した。
２．ヒダントインラセマーゼ活性測定
ｐＴｒｐ２９８ＨＲａｓｅ１もしくは２、ｐＴｒｐ２９９ＨＲａｓｅ１もしくは２、またはｐＴｒｐ２９ＨＲａｓｅを有するＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９の菌体調製は、実施例１記載の酵素活性測定時と同様に行った。得られた洗浄菌体を５ｍｌの１００ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．５）に懸濁し、その０．１ｍｌを０．９ｍｌの基質溶液（１３３ｍｇ／ｄｌ Ｄ−５−ベンジルヒダントイン、１００ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．５））に添加し、３７℃にて１５分反応を行った。反応後、０．１ｍｌの反応液に、０．９ｍｌの反応停止溶液を添加し、遠心分離にて得られた上清をＨＰＬＣに供し、生成したＬ−５−ベンジルヒダントインを定量した。この条件にて、１分間に１μモルのＬ−５−ベンジルヒダントインを生成する酵素量を１Ｕと定義した。そのの結果を表４に示す。
（実施例４）ＡＪ１１９９９由来Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子およびＤ−カルバミラーゼ遺伝子のＥ．ｃｏｌｉにおける共発現
１．共発現プラスミドの構築
１−１．ｐＴｒｐＨｆＣｆプラスミドの構築
ｐＴｒｐ２９９ＤＣＨａｓｅ１を鋳型として、表５に示す▲１▼と▲２▼のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をＸｂａＩ／ＰｓｔＩ処理後、ｐＴｒｐ２９８ＤＨＨａｓｅ３のＸｂａＩ／ＰｓｔＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、カナマイシン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、そのプラスミドをｐＴｒｐＨｆＣｆと命名した（図３）。
１−２．ｐＴｒｐＣｒＨｆプラスミドの構築
ｐＴｒｐ２９９ＤＣＨａｓｅ１を鋳型として、表５に示す▲１▼と▲２▼のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（プロメガ社製）にライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、そのプラスミドをｐＧＥＭＤＣＨａｓｅ１と命名した。次にこのプラスミドをＥｃｏＲＩにて処理し、ｔｒｐプロモーターとカルバミラーゼ遺伝子が連結したＤＮＡ断片を得、このＤＮＡ断片をｐＴｒｐ２９８ＤＨＨａｓｅ３のＥｃｏＲＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、カナマイシン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、そのプラスミドをｐＴｒｐＣｒＨｆと命名した（図４）。
１−３．ｐＴｒｐＨｒＣｒプラスミドの構築
ｐＴｒｐ２９８ＤＨＨａｓｅ３を鋳型として、表５に示す▲１▼と▲３▼のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をＸｂａＩ／ＰｓｔＩ処理後、ｐＴｒｐ２９９ＤＣＨａｓｅ１のＸｂａＩ／ＰｓｔＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、カナマイシン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、そのプラスミドをｐＴｒｐＨｒＣｒと命名した（図５）。
２．酵素活性測定
ｐＴｒｐＨｆＣｆ、ｐＴｒｐＣｒＨｆ、ｐＴｒｐＨｒＣｒの各プラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９の菌体調製は、実施例１の酵素活性測定時と同様に行った。得られた菌体懸濁液０．２ｍｌを基質溶液０．８ｍｌ（０．１２５ｇ／ｄｌ ＤＬ−ベンジルヒダントイン、１．２５ｍＭ ＭｎＳＯ４、１００ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．５））に添加し、３７℃にて６０分反応を行った。反応後、０．１ｍｌの反応液に、０．９ｍｌの反応停止溶液を添加した。遠心分離にて得られた上清をＨＰＬＣに供し、生成したＮ−カルバミル−Ｄ−Ｐｈｅ並びにＤ−Ｐｈｅを定量した。その結果を表６に示す。いずれのプラスミドを有する形質転換体においても、Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子並びにＤ−カルバミラーゼ遺伝子の共発現が認められた。
（実施例５）Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子、Ｄ−カルバミラーゼ遺伝子並びにヒダントインラセマーゼ遺伝子のＥ．ｃｏｌｉにおける共発現
ｐＴｒｐＨｒＣｒを有するＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９に、ｐＴｒｐ２９ＨＲａｓｅを導入し、２種のプラスミドを有する形質転換体を作製した。この形質転換体をカナマイシン１００μｇ／ｍｌ、クロラムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地（４ｍｌ）で３０℃、１６時間培養した。得られた培養液１ｍｌを、５０ｍｌの培地ＩＩに移し、３５℃、２４時間培養した。培養後、１ｍｌの培養液から遠心分離（１０，０００ｇ×１０ｍｉｎ）により集菌し、得られた菌体を１００ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．５）にて洗浄した。この洗浄菌体を１ｍｌの同緩衝液に懸濁し、０．１ｍｌの菌体懸濁液を０．９ｍｌの基質溶液（０．１１ｇ／ｄｌ Ｌ−５−ベンジルヒダントイン、１．１ｍＭ ＭｎＳＯ４、０．１１％ ＴｒｉｒｏｎＸ−１００、１００ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．５））に添加し、３７℃にて６０分反応を行った。反応後、生成したＤ−Ｐｈｅを定量したところ、９２．７ｍｇ／ｄｌのＤ−Ｐｈｅが生成しており、３酵素遺伝子の共発現を確認した。
（実施例６）Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子、Ｄ−カルバミラーゼ遺伝子並びにヒダントインラセマーゼ遺伝子共発現菌を用いたＤ−Ｐｈｅの生産
ｐＴｒｐＨｒＣｒ並びにｐＴｒｐ２９ＨＲａｓｅの２プラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を、カナマイシン１００μｇ／ｍｌ、クロラムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地（５０ｍｌ）で３０℃、１６時間培養した。得られた培養液１５ｍｌを３００ｍｌの培地ＩＩＩ（カザミノ酸１％、ペプトン１％、グルコース２％、硫酸アンモニウム０．５％、リン酸一カリウム０．１％、リン酸二カリウム０．３％、硫酸マグネシウム０．０５％、硫酸マンガン０．０１％、カナマイシン０．０１％、クロラムフェニコール０．００５％（ｐＨ７．０））に移し、Ｊａｒ培養装置（ｐＨ７．０制御）を用いて３５℃、１５時間培養した。得られた培養液３０ｍｌ（乾燥菌体重量３００ｍｇ）を２７０ｍｌの基質溶液（５．５ｇ／ｄｌ ＤＬ−５−ベンジルヒダントイン、１．１１ｍＭ ＭｎＳＯ４、０．１１％ ＴｒｉｒｏｎＸ−１００、２２ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．５））に添加し、反応液のｐＨをｐＨ７．５に保ちながら（１Ｎ ＮａＯＨと２Ｎ Ｈ２ＳＯ４にて調整）、３７℃にて４４時間反応を行った。その結果、４．１３ｇ／ｄｌ（モル収率９５％）のＤ−Ｐｈｅの生成を認めた。
（実施例７）Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子、Ｄ−カルバミラーゼ遺伝子並びにヒダントインラセマーゼ遺伝子共発現菌を用いたＤ−Ｐｈｅの生産（抗生物質無添加培養）
ｐＴｒｐＨｒＣｒ並びにｐＴｒｐ２９ＨＲａｓｅの２プラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を、カナマイシン、クロラムフェニコールを含まないＬＢ培地（５０ｍｌ）で３０℃、１６時間培養した。得られた培養液１５ｍｌを３００ｍｌのカナマイシン、クロラムフェニコールを含まない培地ＩＩＩにてＪａｒ培養装置（ｐＨ７．０制御）を用いて３５℃、１５時間培養した。得られた培養液３０ｍｌ（乾燥菌体重量３００ｍｇ）を２７０ｍｌの基質溶液（５．５ｇ／ｄｌ ＤＬ−５−ベンジルヒダントイン、１．１１ｍＭ ＭｎＳＯ４、０．１１％ ＴｒｉｒｏｎＸ−１００、２２ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．５））に添加し、反応液のｐＨをｐＨ７．５に保ちながら（１Ｎ ＮａＯＨと２Ｎ Ｈ２ＳＯ４にて調整）、３７℃にて４４時間反応を行った。その結果、２．０６ｇ／ｄｌ（モル収率４８％）のＤ−Ｐｈｅの生成を認めた。
（実施例８）
１−１．ｔｒｐプロモーター及びｒｒｎＢターミネーター搭載プラスミドの構築
エシェリヒア コリ（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０染色体ＤＮＡ上のｔｒｐオペロンのプロモーター領域を表７に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ（▲１▼と▲２▼の組み合わせ）により目的遺伝子領域を増幅し、得られたＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（プロメガ製）にライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中からｔｒｐプロモーターの方向がｌａｃプロモーターと反対向きに挿入された目的のプラスミドを有する株を選択した。
次にこのプラスミドをＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＥｃｏＲＩにて処理して得られるｔｒｐプロモーターを含むＤＮＡ断片と、ｐＵＣ１９（Ｔａｋａｒａ製）のＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＥｃｏＲＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、プラスミドをｐＴｒｐ１と命名した。
次にｐＫＫ２２３−３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）をＨｉｎｄＩＩＩ／ＨｉｎｃＩＩにて処理し、得られたｒｒｎＢターミネーターを含むＤＮＡ断片とｐＴｒｐ１のＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｖｕＩＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、プラスミドをｐＴｒｐ２と命名した。
次にｐＴｒｐ２を鋳型として表に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ（▲１▼と▲３▼の組み合わせ）によりｔｒｐプロモーター領域を増幅した。このＤＮＡ断片をＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＮｄｅＩにより処理し、ｐＴｒｐ２のＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＮｄｅＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをｐＴｒｐ４と命名した。
ｐＳＴＶ２８（Ｔａｋａｒａ社製）のＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＰｖｕＩ処理して得られる２．４ｋｂのＤＮＡ断片、ｐＫＫ２２３−３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）をＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｖｕＩにて処理して得られる０．９ｋｂのＤＮＡ断片、及びｐＴｒｐ４のＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＨｉｎｄＩＩＩ処理によって得られる０．３ｋｂのＤＮＡ断片をライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、クロラムフェニコール耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、プラスミドをｐＴｒｐ８と命名した。
１−２．ヒダントインラセマーゼ遺伝子搭載プラスミドの構築
マイクロバクテリウム リクエファシエンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＡＪ３９１２株の染色体ＤＮＡを鋳型として表８に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより目的遺伝子を増幅した。この断片をＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩにて処理し、得られたＤＮＡ断片とｐＴｒｐ４のＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ処理物をライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、プラスミドをｐＴｒｐ４Ｒと命名した（図６）。なお、図６、図７中ｒｒｎＢターミネーターを「ＴｒｒｎＢ」と表示する。
１−３．Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子およびＤ−カルバミラーゼ遺伝子搭載プラスミドの構築
ｐＴｒｐＨｒＣｒを鋳型として表９に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより目的遺伝子を増幅した。この断片をＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩにて処理し、得られたＤＮＡ断片とｐＴｒｐ８のＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ処理物をライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、クロラムフェニコール耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、プラスミドをｐＴｒｐ８ＣＨと命名した（図７）。
１−４．Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子、Ｄ−カルバミラーゼ遺伝子並びにヒダントインラセマーゼ遺伝子共発現株の作製と、Ｄ−Ｐｈｅ生産
ｐＴｒｐ４Ｒを有するＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９に、ｐＴｒｐ８ＣＨを導入し、２種のプラスミドを有する形質転換体を作製した。この形質転換体をアンピシリン１００μｇ／ｍｌ、クロラムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地（５０ｍｌ）で３０℃、１６時間培養した。得られた培養液１ｍｌを３００ｍｌの培地ＩＶ（グルコース２．５％、硫酸アンモニウム０．５％、燐酸２水素１カリウム０．１４％、クエン酸３ナトリウム２水和物０．２３％、硫酸鉄（ＩＩ）７水和物０．００２％、硫酸マグネシウム７水和物０．１％、硫酸マンガン５水和物０．００２％、チアミン塩酸塩０．０００１％、アンピシリン０．０１％、クロラムフェニコール０．００５％（ｐＨ７．０））に移し、Ｊａｒ培養装置にてｐＨ７．０、溶存酸素濃度１．５ｐｐｍ以上に制御しながら３３℃にて２４時間培養した。得られた培養液１５ｍｌを３００ｍｌの培地Ｖ（グルコース２．５％、硫酸アンモニウム０．５％、燐酸０．３％、クエン酸３ナトリウム２水和物０．２３％、硫酸マグネシウム７水和物０．１％、硫酸鉄（ＩＩ）７水和物０．００２％、硫酸マンガン５水和物０．００２％、チアミン塩酸塩０．０００１％、アンピシリン０．０１％、クロラムフェニコール０．００５％（ｐＨ７．０））に移し、Ｊａｒ培養装置にてｐＨ７．０、溶存酸素濃度１．５ｐｐｍ以上に制御し、培養９時間以降グルコース５０％水溶液を３．５ｍｌ／ｈｒにて添加を行いながら、３５℃にて２４時間培養した。得られた培養液１５ｍｌ（乾燥菌体重量６００ｍｇ）を２８５ｍｌの基質溶液（５．３ｇ／ｄｌ ＤＬ−５−ベンジルヒダントイン、１．０５ｍＭ 硫酸マンガン、２１ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．５））に添加し、反応液のｐＨをｐＨ７．５に保ちながら（１Ｎ ＮａＯＨと２Ｎ Ｈ２ＳＯ４にて調整）、３７℃にて４８時間反応を行った。その結果、４．１５ｇ／ｄｌ（モル収率９５％）のＤ−Ｐｈｅの生成を認めた。
１−５． Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子、Ｄ−カルバミラーゼ遺伝子並びにヒダントインラセマーゼ遺伝子共発現株によるＤ−Ｐｈｅ生産（抗生物質無添加系）
ｐＴｒｐ４Ｒ、ｐＴｒｐ８ＣＨの２プラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を、アンピシリン、クロラムフェニコールを含まない、ＬＢ培地（５０ｍｌ）で３０℃、１６時間培養した。得られた培養液１ｍｌをアンピシリン、クロラムフェニコールを含まない、３００ｍｌの培地ＩＶに移し、Ｊａｒ培養装置にてｐＨ７．０、溶存酸素濃度１．５ｐｐｍ以上に制御しながら３３℃にて２４時間培養した。得られた培養液１５ｍｌをアンピシリン、クロラムフェニコールを含まない、３００ｍｌの培地Ｖに移し、Ｊａｒ培養装置にてｐＨ７．０、溶存酸素濃度１．５ｐｐｍ以上に制御し、培養９時間以降グルコース５０％水溶液を３．５ｍｌ／ｈｒにて添加を行いながら、３５℃にて２４時間培養した。得られた培養液１５ｍｌ（乾燥菌体重量６００ｍｇ）を２８５ｍｌの基質溶液（５．３ｇ／ｄｌ ＤＬ−５−ベンジルヒダントイン、１．０５ｍＭ硫酸マンガン、２１ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．５））に添加し、反応液のｐＨをｐＨ７．５に保ちながら（１Ｎ ＮａＯＨと２Ｎ Ｈ２ＳＯ４にて調整）、３７℃にて４８時間反応を行った。その結果、抗生物質無添加培養でも、プラスミドの脱落がなく、４．１５ｇ／ｄｌ（モル収率９５％）のＤ−Ｐｈｅの生成を認めた。
産業上の利用の可能性
本発明により、ヒダントイナーゼ遺伝子およびカルバミラーゼ遺伝子が効率よく共発現する組換えＤＮＡが提供される。また、本発明により、生産性の高いアミノ酸製造を行うことができる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
第１図は、ＨＨａｓｅとＣＨａｓｅのプラスミド上での挿入位置および方向を示す図である。
第２図は、ｔｒｐプロモータカセット１および２を示す図である。
第３図は、ｐＴｒｐＨｆＣｆの作製を示す図である。
第４図は、ｐＴｒｐＣｒＨｆの作製を示す図である。
第５図は、ｐＴｒｐＨｒＣｒの作製を示す図である。
第６図は、ｐＴｒｐ４Ｒの作製を示す図である。
第７図は、ｐＴｒｐ８ＣＨの作製を示す図である。
本発明は、組換えＤＮＡおよびこれを用いたアミノ酸製造方法に関し、詳しくは、ヒダントイナーゼ遺伝子およびカルバミラーゼ遺伝子が効率良く共発現する組換えＤＮＡおよびこれを用いた生産性の高いアミノ酸製造方法に関する。
背景技術
酵素を用いたアミノ酸製法の一つとして、化学的に安価に合成される５置換ヒダントイン化合物を出発物質として、これを光学活性なアミノ酸に不斉分解する方法が知られている。この５置換ヒダントイン化合物から光学活性アミノ酸を製造する方法は、医薬品、化学工業品、食品添加物などの製造に重要な方法である。
５置換ヒダントイン化合物から光学活性アミノ酸を製造する方法の一つとして、以下の（Ａ）、（Ｂ）の酵素を用いる方法がある。
（Ａ）５置換ヒダントイン化合物に作用し、当該物質を加水分解することによりＮ−カルバミルアミノ酸を生成する反応を触媒する酵素：ヒダントイナーゼ（ヒダントインハイドロラーゼともいわれる。以下「ＨＨａｓｅ」とも記す）。
（Ｂ）生成したＮ−カルバミルアミノ酸に作用し、当該物質を加水分解することによりアミノ酸を生成する反応を触媒する酵素：カルバミラーゼ（Ｎ−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼともいわれる。以下「ＣＨａｓｅ」とも記す）。
ここで、５置換ヒダントイン化合物から光学活性アミノ酸を製造するためには、上記（Ａ）ＨＨａｓｅおよび（Ｂ）ＣＨａｓｅのうち、少なくとも一方に光学選択性の酵素を用いればよい。
上記のように酵素を用いる場合、ＨＨａｓｅ、ＣＨａｓｅをコードする遺伝子を大腸菌などの宿主に導入して形質転換体を作製し、この形質転換体を培養して５置換ヒダントインからアミノ酸を生成させて培地中に蓄積させるという方法をとり得る。組換えＤＮＡを利用してアミノ酸製造を行う方法としては、例えば、ＷＯ ０１／２３５８２号公報、ＷＯ ０５／８４４９号公報等が報告されている。これらに記載の技術ではＨＨａｓｅ等の発現用プロモーターとしてラムノースプロモーターが用いられている。
発明の開示
外来遺伝子を組換えベクターに搭載して微生物などの細胞に導入し、その細胞内で発現させることは既に様々な実用技術が開発されている。アミノ酸製造に関連したものとしては、例えば、上記２公報に記載された技術があるが、これらにおいてはラムノースプロモーターが用いられている。ラムノースプロモーターを機能させるためには所定の時期に誘導剤としてラムノースを添加することを要するが、ラムノースの添加についてはその添加時期などの設定が極めて重要となる。工業的にアミノ酸を製造する場合、誘導剤の添加という工程が増える上に、その添加時期の調節は繊細さが要求され、製造工程を複雑化してしまうことになる。
また、周知のプロモーターとして、ｌａｃプロモーターがある。しかし、組換え微生物を用いて工業的にアミノ酸を大量生産する場合、微生物を高密度に保つ必要性があり、そのために栄養源としてグルコースを添加して培養することがある。しかるにグルコースの添加は、ｌａｃプロモーターを抑制することにつながるため、工業的なアミノ酸製造をするにあたっては、ｌａｃプロモーターを採用することが好ましくない場合がある。
このように、どのようなプロモーターを組み合わせるか、また宿主に何を選ぶかなどは、具体的な状況に応じて適切に選択する必要がある。実験室レベルで可能であることが工業的にも有利であるとは限らず、単に発現量を強化できるプロモーター等として知られているものを利用すればよいというものではない。さらに、上記のように複数の酵素を発現させることを要する場合、最終的な目的に応じて複数の遺伝子をバランス良く共発現させる必要がある。
本発明は、上記のような観点からなされたものであり、ＨＨａｓｅ等の酵素遺伝子が効率よく共発現される組換えＤＮＡを作製すること、さらにはこのような組換えＤＮＡを利用してヒダントインからのアミノ酸製造を効率よく行うことを課題とする。
本発明者らは、ＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅ遺伝子の共発現を効率よく行うことができる組換えＤＮＡを得るため鋭意研究を進めたところ、数あるプロモーターの中でもｔｒｐプロモーターが、ＨＨａｓｅ、ＣＨａｓｅ、さらにはヒダントインラセマーゼ（以下「ＨＲａｓｅ」とも記す）を効率よく発現させることができると共に、アミノ酸の工業的製造上も好適なプロモーターであることを見出した。さらに、本発明者らは、ＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅを組換えＤＮＡに挿入するにあたり、これらの遺伝子の向きおよび挿入順序などの配置によっても酵素活性に大きな差が現れることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕 下記（Ｉ）および（ＩＩ）の遺伝子領域をコードする塩基配列を有する組換えＤＮＡ。
（Ｉ）ヒダントイナーゼ遺伝子をコードする塩基配列と、当該ヒダントイナーゼ遺伝子をコードする塩基配列の上流部に位置し当該ヒダントイナーゼ遺伝子の発現を調節するｔｒｐプロモーター配列とを含む遺伝子領域
（ＩＩ）カルバミラーゼ遺伝子をコードする塩基配列と、当該カルバミラーゼ遺伝子をコードする塩基配列の上流部に位置し当該カルバミラーゼ遺伝子の発現を調節するｔｒｐプロモーター配列とを含む遺伝子領域
〔２〕 （Ｉ）の遺伝子領域をコードする塩基配列と（ＩＩ）の遺伝子領域をコードする塩基配列の転写方向が同じ方向であり、かつ当該転写方向と同じ方向に向かって（Ｉ）の遺伝子領域をコードする塩基配列、（ＩＩ）の遺伝子領域をコードする塩基配列の順に配列されていることを特徴とする、上記〔１〕に記載の組換えＤＮＡ。
〔３〕 （Ｉ）の遺伝子領域をコードする塩基配列と（ＩＩ）の遺伝子領域をコードする塩基配列の転写方向が逆方向であることを特徴とする、上記〔１〕に記載の組換えＤＮＡ。
〔４〕 （Ｉ）の遺伝子領域をコードする塩基配列と（ＩＩ）の遺伝子領域をコードする塩基配列の転写方向が同じ方向であり、かつ、当該転写方向と同じ方向に向かって（ＩＩ）の遺伝子領域をコードする塩基配列、（Ｉ）の遺伝子領域をコードする塩基配列の順に配列されていることを特徴とする、上記〔１〕に記載の組換えＤＮＡ。
〔５〕 組換えＤＮＡが、プラスミドである、上記〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の組換えＤＮＡ。
〔６〕 上記〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の組換えＤＮＡにより形質転換された形質転換細胞。
〔７〕 上記〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の組換えＤＮＡと、
ヒダントインラセマーゼ遺伝子をコードする塩基配列および当該ヒダントインラセマーゼ遺伝子の上流部に位置し当該ヒダントインラセマーゼ遺伝子の発現を調節するｔｒｐプロモーター配列を有する組換えＤＮＡと、
によって形質転換された形質転換細胞。
〔８〕 上記〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の組換えＤＮＡが低コピーな組換えＤＮＡであり、ヒダントインラセマーゼ遺伝子をコードする塩基配列および当該ヒダントインラセマーゼ遺伝子の上流部に位置し当該ヒダントインラセマーゼ遺伝子の発現を調節するｔｒｐプロモーター配列を有する組換えＤＮＡが高コピーな組換えＤＮＡである〔７〕に記載の形質転換細胞。
〔９〕 組換えＤＮＡの宿主がエシェリヒア コリである、上記〔６〕から〔８〕のいずれかに記載の形質転換細胞。
〔１０〕 上記〔６〕に記載の形質転換細胞を培地中で培養し、培地中および／または形質転換細胞中にヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質およびカルバミラーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させることを特徴とする、混合タンパク質の製造方法。
〔１１〕 上記〔７〕に記載の形質転換細胞を培地中で培養し、培地中および／または形質転換細胞中に、ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質、カルバミラーゼ活性を有するタンパク質およびヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させることを特徴とする、混合タンパク質の製造方法。
〔１２〕 上記〔６〕から〔９〕のいずれかに記載の形質転換細胞を培地中で培養して培養物を得、当該培養物に５置換ヒダントインを混合してアミノ酸を生成させることを特徴とするアミノ酸の製造方法。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明について、１．組換えＤＮＡ等、２．酵素タンパク質の製造、３．アミノ酸の製造方法、の順により詳細に説明する。
１．組換えＤＮＡ等
本発明の組換えＤＮＡは以下の（Ｉ）および（ＩＩ）の遺伝子領域をコードする塩基配列を有する。
（Ｉ）ＨＨａｓｅ遺伝子をコードする塩基配列と、当該ＨＨａｓｅ遺伝子をコードする塩基配列の上流部に位置し当該ＨＨａｓｅ遺伝子の発現を調節するｔｒｐプロモーター配列とを含む遺伝子領域（以下「ｔｒｐ＋ＨＨａｓｅ」と記載する場合がある。また図面においてはｔｒｐプロモーターを「Ｐｔｒｐ」と表示する。）
（ＩＩ）ＣＨａｓｅ遺伝子をコードする塩基配列と、当該ＣＨａｓｅ遺伝子をコードする塩基配列の上流部に位置し当該ＣＨａｓｅ遺伝子の発現を調節するｔｒｐプロモーター配列とを含む遺伝子領域（以下「ｔｒｐ＋ＣＨａｓｅ」と記載する場合がある。）
すなわち、本発明の組換えＤＮＡは、ＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅのそれぞれを発現させるためのプロモーターとして、ｔｒｐプロモーターを採用したものである。ｔｒｐプロモーターは、トリプトファンの生合成に関与するいくつかの酵素をコードする遺伝子群の上流に存在するプロモーターであり、大腸菌などに存在する。本発明では、ｔｒｐプロモーターとして既に知られているものを用いてもよい。ｔｒｐプロモーターは、ｔｒｐプロモーターを含むクローニング用ベクターあるいはこのようなベクターを含む細胞の形態で市販されている。ｔｒｐプロモーターを用いることにより、ＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅの発現量を十分に得ることができる。また、ｔｒｐプロモーターはラムノースプロモーターにおけるラムノース添加のような誘導剤を添加を要しない。したがって、アミノ酸製造を行う生産工程において誘導剤添加に伴う種々の工程または処理を省くことができる。さらに、ｔｒｐプロモーターは、グルコースによって抑制されないので、工業的規模でのアミノ酸製造で形質転換微生物を高密度培養するためにグルコースを用いても、酵素の発現量が抑制されずにすむ。
ベクターなどの組換えＤＮＡに、ＨＨａｓｅをコードする塩基配列を有するＤＮＡ（以下「ＨＨａｓｅをコードするＤＮＡ」と表記しても同じ意味である。ＣＨａｓｅ等について同じ）およびＣＨａｓｅをコードするＤＮＡを組み込む際には、その挿入向きと順序に関し以下の３種の形態がある。
（第１の形態） （Ｉ）の遺伝子領域をコードする塩基配列と（ＩＩ）の遺伝子領域をコードする塩基配列の転写方向が同じ方向であり、かつ当該転写方向と同じ方向に向かって（Ｉ）の遺伝子領域をコードする塩基配列、（ＩＩ）の遺伝子領域をコードする塩基配列の順になるように組み込む（図１の▲１▼）。すなわち、図１の▲１▼では、「ｔｒｐ＋ＨＨａｓｅ」遺伝子領域、「ｔｒｐ＋ＣＨａｓｅ」遺伝子領域ともに転写方向が左から右向きであり、その順序が左から「ｔｒｐ＋ＨＨａｓｅ」遺伝子領域、「ｔｒｐ＋ＣＨａｓｅ」遺伝子領域の順に配置される。なお、図１においては、ＨＨａｓｅ、ＣＨａｓｅ共に、Ｄ体を特異的に基質とするＤＨＨａｓｅおよびＤＣＨａｓｅを例示している。
（第２の形態） （Ｉ）の遺伝子領域をコードする塩基配列と（ＩＩ）の遺伝子領域をコードする塩基配列の転写方向が逆方向になるように組み込む（図１の▲２▼）。すなわち、図１の▲２▼においては、「ｔｒｐ＋ＣＨａｓｅ」遺伝子領域の転写方向が右から左であり、「ｔｒｐ＋ＨＨａｓｅ」遺伝子領域の転写方向が左から右である。
（第３の形態） （Ｉ）の遺伝子領域をコードする塩基配列と（ＩＩ）の遺伝子領域をコードする塩基配列の転写方向が同じ方向であり、かつ、当該転写方向と同じ方向に向かって（ＩＩ）の遺伝子領域をコードする塩基配列、（Ｉ）の遺伝子領域をコードする塩基配列の順となるように組み込む（図１の▲３▼）。すなわち、「ｔｒｐ＋ＨＨａｓｅ」遺伝子領域および「ｔｒｐ＋ＣＨａｓｅ」遺伝子領域の転写方向が共に右から左方向であり、右から「ｔｒｐ＋ＣＨａｓｅ」遺伝子領域、「ｔｒｐ＋ＨＨａｓｅ」遺伝子領域の順に配置されている。
図１に示す例において、「Ｐｔｒｐ」とはｔｒｐプロモーターのことである。また、「ＤＨＨａｓｅ」はＤ−ヒダントイナーゼ活性を有するＨＨａｓｅであり、「ＤＣＨａｓｅ」はＤ−カルバミラーゼ活性を有するＣＨａｓｅである。また、矢印は、矢印の方向に転写が進むことを意味する。
これら３形態のうち、最もＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅの共発現が強いのは第３（図１の▲３▼）の形態である。すなわち、第３の形態は、１つの組換え体の中に２種の酵素遺伝子を有していながらこれらの共発現が最もバランス良く効率的に行われる形態であり、工業的にアミノ酸を大量生産するに特に好適である。
形質転換体を使って２種以上の酵素を発現させる場合、１つの組換えＤＮＡに１種の遺伝子のみのせ、複数種の組換えＤＮＡを宿主に導入することも考えられるが、宿主でのコピー数の高低や組換えＤＮＡの消失等により、複数の遺伝子の発現量にばらつきが生じる場合がある。しかし、本発明では１つの組換えＤＮＡに２つの酵素遺伝子を搭載して効率よく共発現させることができるため、宿主の分裂・増殖などによってＨＨａｓｅとＣＨａｓｅの発現量に偏りが生じたりするおそれが少ない。
また、ＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅを用いてアミノ酸を生産する場合、両方の発現量が高いことが望ましいが、その反応系からすると、ＨＨａｓｅとＣＨａｓｅとを対比した場合、相対的にはＣＨａｓｅの活性がより高いことが効率よいアミノ酸生産のためには望ましい。このように１つの組換え体にＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅをコードする２種の遺伝子を搭載した場合、それぞれの発現がアミノ酸の工業的製造に適するようなバランスで生じることが望ましく、この点においても第３の形態が最も優良である。
本発明の組換えＤＮＡに搭載される、ＨＨａｓｅ、ＣＨａｓｅをコードするＤＮＡは、既知のものを用いてよい。ＨＨａｓｅは、ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質であればよく、またＣＨａｓｅは、カルバミラーゼ活性を有するタンパク質であればよい。光学活性を有するアミノ酸、すなわちＬ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸のいずれか一方を選択的に製造する場合には、ＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅのうち少なくとも一方に、光学選択性を有するものを用いればよい。酵素について光学選択性とは、Ｌ体またはＤ体のいずれか一方を特異的に基質として反応を触媒するということである。
５置換ヒダントイン化合物を光学選択的に加水分解するＨＨａｓｅは次のようにして入手できる。たとえば、Ｎ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸を生成するＤＨＨａｓｅを有する菌としては、バチルス属細菌に耐熱性の酵素の存在が知られており、例としてバチルス ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＡＴＣＣ３１１９５株等からＨＨａｓｅまたは、ＨＨａｓｅ含有画分を調製すればよい（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４３巻 ２７０ページ、１９９５年）。ＡＴＣＣ３１１９５株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、住所１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）から入手することができる。また、Ｌ体ヒダントイン化合物に特異的に作用するＬＨＨａｓｅは、例えばバチルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＡＪ１２２９９株にその存在が知られている（特開昭６３−２４８９４号公報）。バチルス エスピーＡＪ１２２９９株は、１９８６年７月５日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ８８３７が付与され、２００１年６月２７日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）にブタペスト条約に基づき移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６４６が付与された微生物である。
光学選択性のないＨＨａｓｅは、マイクロバクテリウム リクエファシエンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＡＪ３９１２株のほか、例えばアースロバクター オーレセンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ）にその存在が知られている（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６１巻、１ページ、１９９８年）。
Ｎ−カルバミルアミノ酸をＤ体選択的に加水分解するＣＨａｓｅは、たとえばシュードモナス エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＡＪ１１２２０株にその存在が知られている（特公昭５６−００３０３４号公報）。再同定の結果、シュードモナス エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＡＪ１１２２０株は、アグロバクテリウムエスピー（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）に属することが判明している。アグロバクテリウム エスピーＡＪ１１２２０株は１９７７年１２月２０日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ４３４７が付与され、２００１年６月２７日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにブタペスト条約に基づき移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６４５が付与された微生物である。またＮ−カルバミルアミノ酸をＬ体選択的に加水分解するＣＨａｓｅは、たとえばフラボバクテリウム エスピー．（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＡＪ３９１２株（特公昭５６−００８７４９号公報）、バチルス エスピー．（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＡＪ１２２９９株にその存在が知られている。フラボバクテリウム エスピー．ＡＪ３９１２株は、上述の通り現在ではマイクロバクテリウム リクエファシエンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＡＪ３９１２株（ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３）に分類されているが、１９７５年６月２７日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３が付与され、２００１年６月２７日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにブタペスト条約に基づき移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６４３が付与された微生物である。またバチルス エスピーＡＪ１２２９９株は、１９８６年７月５日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ８８３７が付与され、２００１年６月２７日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにブタペスト条約に基づき移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６４６が付与された微生物である。
また、本発明の組換えＤＮＡを用いたアミノ酸製造において、組換えＤＮＡに搭載するＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅをコードするＤＮＡの好適な組み合わせとしては、以下のＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅから選ばれる組み合わせが挙げられる。以下の組み合わせにより、Ｄ−アミノ酸が選択的に生産される。
ＨＨａｓｅをコードするＤＮＡとして好ましくは、以下の（ｉ）から（ｉｖ）から選ばれるＤＮＡが挙げられる。
（ｉ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｉｉ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｉｉｉ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（ｉｖ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
などである。
ＣＨａｓｅをコードするＤＮＡとして好ましくは、以下の（ｖ）から（ｖｉｉｉ）から選ばれるＤＮＡが挙げられる。
（ｖ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｖｉ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｖｉｉ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（ｖｉｉｉ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
などを使用できる。
ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、さらに好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件があげられる。
また、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造や、ＤＨＨａｓｅ活性またはＤＣＨａｓｅ活性を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、２〜５０個、好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２〜１０個である。
上記の（ｉ）〜（ｉｖ）から選ばれるＤＨＨａｓｅと、上記（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）から選ばれるＤＣＨａｓｅとの組み合わせは、工業的にＤ−アミノ酸を大量生産すために必要となる酵素活性を得るために特に有利である。
なお、配列表配列番号１および３のＤＮＡは、フラボバクテリウム エスピー（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＡＪ１１１９９（ＦＥＲＭ−Ｐ４２２９）株の染色体ＤＮＡより単離、取得されたものである（特公昭５６−０２５１１９号公報）。フラボバクテリウム エスピー（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＡＪ１１１９９（ＦＥＲＭ−Ｐ４２２９）株は、当初アルカリゲネス アクアマリヌス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ａｑｕａｍａｒｉｎｕｓ）として通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託された微生物であるが、再同定の結果、フラボバクテリウム エスピー（Ｆｌａｖｏｔａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）に分類されることが判明した。フラボバクテリウム エスピー（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＡＪ１１１９９株は、昭和５２年９月２９日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ４２２９が付与され、さらに２００２年５月３０日に、ブタペスト条約に基づき、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに移管されて受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８０６３が付与された微生物である。
ＨＨａｓｅ、ＣＨａｓｅおよびＨＲａｓｅをコードする遺伝子を搭載する組換えＤＮＡは、宿主細胞にこれらの遺伝子を導入するためのベクターであることが望ましい。そのようなベクターとしては、具体的な例を挙げると、ｐＨＳＧ系（宝酒造（株）製）、ｐＵＣ系（宝酒造（株）製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック社製）、ｐＳＴＶ系（宝酒造（株）製）、ｐＴＷＶ系（宝酒造（株）製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック社製）、ｐＢＲ３２２系のプラスミド、あるいはその誘導体などが挙げられる。ここで「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。上記プラスミド並びにその誘導体は、複製開始点の種類により、宿主細胞内でのコピー数が異なり、高コピープラスミドとしては、ｐＨＳＧ系、ｐＵＣ系、ｐＰＲＯＫ系のプラスミドが挙げられ、低コピープラスミドとしては、ｐＳＴＶ系、ｐＴＷＶ系、ｐＫＫ２３３系、ｐＢＲ３２２系のプラスミドが挙げられる。
また、生産量を増大させるためには、タンパク質遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネーターを連結することが好ましい。このようなターミネーターとしては、ｒｒｎＢターミネーター、Ｔ７ターミネーター、ｆｄファージターミネーター、Ｔ４ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネーター、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネーター、などが挙げられる。また、ｒｒｎＢターミネーターなどは、プラスミドの安定性を良くするという点でも好ましい。
また、形質転換体を選別するために、該ベクターはアンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性などのマーカーを有することが好ましい。
プロモーター、ＨＨａｓｅをコードするＤＮＡおよびＣＨａａｓｅをコードするＤＮＡ、ターミネーターを所定の配置になるように連結したＤＮＡ断片と、ベクターＤＮＡとを連結して組換えＤＮＡを得ることができる。
上記のようにして得られた組換えＤＮＡを宿主細胞に導入して形質転換体が得られる。組換えＤＮＡ技術を用いてタンパク質を大量生産する場合、形質転換される宿主細胞としては、細菌細胞、放線菌細胞、酵母細胞、カビ細胞、植物細胞、動物細胞などを用いることができる。一般には、大腸菌（腸内細菌）を用いてタンパク質を大量生産する技術について数多くの知見があるため、大腸菌（腸内細菌）、好ましくはエシェリヒア コリが用いられる。特に、エシェリヒア コリＪＭ１０９株、特に（ＤＥ３）株が好ましい。
下記にて詳説するが、本発明のアミノ酸製造方法における他の形態としては、ＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅと共に、ＨＲａｓｅも用いる形態が挙げられる。この場合、ＨＲａｓｅも形質転換体によって生成させ、アミノ酸の製造に用いることができる。すなわち、ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡを有する組換えＤＮＡを作製し、当該組換えＤＮＡを宿主細胞に導入して形質転換させる。
本発明においては、ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡとして公知のものを用いてもよいが、好ましいものとしては、以下のものが挙げられる。
（ｉｘ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｘ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｘｉ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（ｘｉｉ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸を残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸をコードするＤＮＡ、
などが挙げられる。「ストリンジェントな条件」、「数個」の意味は上記ＨＨａｓｅ等をコードするＤＮＡについて説明したものと同様である。
なお、配列表の配列番号５のＤＮＡは、マイクロバクテリウム リクエファシエンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＡＪ３９１２株から単離・精製されたものである。マイクロバクテリウム リクエファシエンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＡＪ３９１２株は、当初フラボバクテリウム エスピー．（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＡＪ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３）株として１９７５年６月２７日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されたが、再同定の結果オーレオバクテリウム リクエファシエンス（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）に分類されることが判明した。さらに現在では、種名変更により、オーレオバクテリウム リクエファシエンス（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）はマイクロバクテリウム リクエファシエンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）に分類され、マイクロバクテリウム リクエファシエンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＡＪ３９１２（国内寄託番号ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３、国際寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６４３）として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡを搭載する組換えＤＮＡにおいても、ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡの発現を調節するプロモーターとして、ｔｒｐプロモーターを用いることが好ましい。また、ＨＲａｓｅが組み込まれた組換えＤＮＡにおいても、好ましいターミネーター、ベースとなる組換えＤＮＡ、選択のためのマーカー、宿主などは、ＨＨａｓｅ等を搭載する組換えＤＮＡの場合と同様である。
ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡを有する組換えＤＮＡは、ＨＨａｓｅをコードするＤＮＡおよびＣＨａｓｅをコードするＤＮＡが導入された宿主細胞に導入して、発現させることができる。このようにすることにより、１つの形質転換体を用いて、アミノ酸生産に必要となる３種の酵素を発現させることができ、複数の形質転換体を扱うよりも作業が軽減される。ただし、この場合には、ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡを有する組換えＤＮＡは、ＨＨａｓｅ等をコードするＤＮＡを搭載する組換えＤＮＡとは別個に作製することが望ましい。酵素遺伝子の大きさなどからすると、３種の酵素遺伝子を１つの組換えＤＮＡに搭載したものを作製することは実用性が低い。したがって、ＨＲａｓｅも発現させる場合には、２種の組換えＤＮＡが導入された形質転換体を作製することが望ましい。
また、一般に、２種以上の高コピー組換えＤＮＡを１つの宿主細胞内で同時に発現させることは困難であるため、２種の組換えＤＮＡを導入する場合には、いずれか一方の組換えＤＮＡを高コピー性の組換えＤＮＡとし、他方は相対的に低コピー性の組換えＤＮＡとすることが好ましい。どちらの組換えＤＮＡを高コピー性の組換えＤＮＡとするかは、各ＤＮＡによって生産される酵素量、プラスミドの安定性等を勘案し、決定する。本発明の組換えＤＮＡを用いてアミノ酸生産をするにあたっては、ＨＲａｓｅを有する組換えＤＮＡを高コピーな組換えＤＮＡ、ＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅを有する組換えＤＮＡを低コピーな組換えＤＮＡとすることが好ましい。高コピーか否かは、各組換えＤＮＡごとに形質転換体を作製し、それぞれの形質転換体により生成される酵素の活性を測定して判断することができる。
なお、本発明におけるプラスミド、ＤＮＡ断片、種々の酵素、形質転換体の作製、形質転換体の選抜などを扱う諸操作については、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、１９８９、ＣＯＬＤ ＳＰＲＩＮＧ ＨＡＲＢＯＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＰＲＥＳＳ等の既知の手法に従って行うことができる。
２．酵素タンパク質の製造方法
上記のような、組換えＤＮＡにより形質転換された細胞を培養することにより、ＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅ、さらにＨＲａｓｅをコードするＤＮＡを導入した場合にはＨＲａｓｅが発現生産される。生産培地としては、Ｍ９−カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地を用いてもよい。より具体的な培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、宿主菌などの種類に応じて適宜選択する。
培養した形質転換細胞を遠心分離操作などにより回収した後、形質転換体を破砕あるいは溶菌させ、ＨＨａｓｅおよび／またはＣＨａｓｅを回収し、粗酵素液として使用することができる。破砕には超音波破砕、フレンチプレス破砕、ガラスビーズ破砕などの方法を用いることができ、また溶菌させる場合には卵白リゾチームや、ペプチターゼ処理、または、これらを適宜組み合わせた方法が用いられる。さらに、必要に応じて、通常の沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィーなどの手法により、これらの酵素を精製して用いることも可能である。この場合、これらの酵素の抗体を利用した精製法も利用できる。
また、タンパク質を組み換えＤＮＡ技術を用いて大量生産するには、該タンパク質を生産する形質転換体内で該タンパク質が会合し、タンパク質の封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）を形成させることも好ましい形態として挙げられる。この発現生産方法の利点は、目的のタンパク質を菌体内に存在するプロテアーゼによる消化から保護する点および目的のタンパク質を菌体破砕に続く遠心分離操作によって簡単に精製できる点等である。
このようにして得られるタンパク質封入体は、タンパク質変性剤により可溶化され、主にその変性剤を除去することによる活性再生操作を経た後、正しく折り畳まれた生理的に活性なタンパク質に変換される。例えば、ヒトインターロイキン−２の活性再生（特開昭６１−２５７９３１号公報）等多くの例がある。
タンパク質封入体から活性型タンパク質を得るためには、可溶化・活性再生等の一連の操作が必要であり、直接活性型タンパク質を生産する場合よりも操作が複雑になる。しかし、菌体の生育に影響を及ぼすようなタンパク質を菌体内で大量に生産させる場合は、不活性なタンパク質封入体として菌体内に蓄積させることにより、その影響を抑えることができる。
目的タンパク質を封入体として大量生産させる方法として、強力なプロモーターの制御下、目的のタンパク質を単独で発現させる方法の他、大量発現することが知られているタンパク質との融合タンパク質として発現させる方法がある。
さらに、融合タンパク質として発現させた後に、目的のタンパク質を切り出すため、制限プロテアーゼの認識配列を適当な位置に配しておくことも有効である。
タンパク質封入体が形成される場合には、変性剤で融合タンパク質として回収されたタンパク質封入体を可溶化する。菌体タンパク質とともに可溶化してもよいが、以降の精製操作を考慮すると、封入体を取り出して、これを可溶化するのが好ましい。封入体を菌体から回収するには、従来公知の方法で行えばよい。例えば、菌体を破壊し、遠心分離操作等によって封入体を回収する。タンパク質封入体を可溶化させる変性剤としては、グアニジン塩酸（例えば、６Ｍ、ｐＨ５〜８）や尿素（例えば８Ｍ）などが挙げられる。
これらの変性剤を透析等により除くと、活性を有するタンパク質として再生される。透析に用いる透析溶液としては、トリス塩酸緩衝液やリン酸緩衝液などを用いればよく、濃度としては２０ｍＭ〜０．５Ｍ、ｐＨとしては５〜８が挙げられる。
再生工程時のタンパク質濃度は、５００μｇ／ｍｌ程度以下に抑えるのが好ましい。再生した酵素タンパク質が自己架橋を行うのを抑えるために、透析温度は５℃以下であることが好ましい。また、変性剤除去の方法として、この透析法のほか、希釈法、限外濾過法などがあり、いずれを用いても活性の再生が期待できる。
３．アミノ酸の製造方法
本発明のアミノ酸製造方法では、上記のようにＨＨａｓｅ等が組み込まれた組換えＤＮＡを導入して得た形質転換細胞を培地中で培養して、ＨＨａｓｅ等の酵素を生成させた培養物を得、当該培養物に５置換ヒダントインを混合してアミノ酸を生成させることによりアミノ酸を製造する。培養物は、ＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅをコードするＤＮＡを導入した場合には、ＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅが含まれるようにすればよい。また、加えてＨＲａｓｅをコードするＤＮＡを導入した場合にはＨＲａｓｅも含まれるようにすればよい。これらの所定の酵素が含まれていれば、培養物の形態は特に限定されない。すなわち、形質転換体を含む培地に５置換ヒダントインを直接添加してもよいし、培地から分離された菌体などの形質転換体、形質転換体の洗浄物、形質転換体を破砕処理あるいは溶菌処理等した処理物、ＨＨａｓｅ等を回収した粗酵素液、さらに精製した酵素液などと、５置換ヒダントインとを混合することにより、所望のアミノ酸を生産することができる。
ＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅを用いて、５置換ヒダントインからアミノ酸を生成する反応工程を下記化学式（Ｉ）に示す。
また、ＨＨａｓｅに光学選択的加水分解活性がなくとも、ＣＨａｓｅに光学選択性があれば、生成アミノ酸はＤ型もしくはＬ型の光学活性体を得ることができる。この場合、反応液中には未反応のエナンチオマーであるＮ−カルバミルアミノ酸、すなわちＣＨａｓｅがＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸を選択的に分解しＬ−アミノ酸を生成させる場合にはＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸が、また逆にＤ−アミノ酸を生成させる場合にはＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸が、それぞれ残存することが想定される。しかしながら、このような場合においてＨＨａｓｅは、残存することになる未反応エナンチオマーのＮ−カルバミルアミノ酸を脱水縮合させ、再度５置換ヒダントイン化合物を生成させる逆反応をもわずかながら触媒するので、ＨＨａｓｅ、光学選択性の高いＣＨａｓｅの２種の酵素、もしくは２種の酵素含有物により、高収率（モル収率５０％以上）で光学活性アミノ酸を製造することが可能となる。
次に、ＤＬ５置換ヒダントインから光学活性アミノ酸を生成する反応の例として、ＨＲａｓｅを用いてＤ−アミノ酸を光学選択的に生成する反応を、化学式（ＩＩ）に示す。
本発明のアミノ酸製造においては、ＨＨａｓｅまたはＨＲａｓｅの基質となる５置換ヒダントイン化合物が用いられる。５置換ヒダントイン化合物の具体例としては、ヒダントイン、５−メチルヒダントイン、５−ベンジルヒダントイン、５−（４−ヒドロキシベンジル）ヒダントイン、５−インドリルメチルヒダントイン、５−（３，４−ジヒドロキシベンジル）ヒダントイン、５−（ｐ−ハイドロキシベンジル）ヒダントイン、５−（３’−ピリジル）−メチルヒダントイン、５−メチルチオエチルヒダントイン、５−イソプロピルヒダントイン、５−イソブチルヒダントイン、５−ｓｅｃ−ブチルヒダントイン、５−カルボキシエチルヒダントイン、５−カルボキシメチルヒダントイン、５−（４−アミノブチル）ヒダントイン、５−ヒドロキシメチルヒダントインなどに代表されるような天然型アミノ酸に対応する５置換ヒダントイン化合物の他、５−フェニルヒダントイン、５−（４−ヒドロキシフェニル）ヒダントイン、５−メトキシメチルヒダントイン、５−ベンジロキシメチルヒダントイン、５−（３，４−メチレンジオキシベンジル）ヒダントイン、ジヒドロウラシルなどに代表されるような非天然型のアミノ酸若しくはその誘導体に対応する５置換ヒダントインなどが挙げられる。
なお、上記の酵素タンパク質を用いてＮ−カルバミルアミノ酸を製造することも可能である。例えば、上記混合タンパク質に、Ｌ−又はＤ−ＣＨａｓｅの阻害剤等を添加して加水分解反応をＮ−カルバミルアミノ酸で止めることにより、Ｎ−カルバミルアミノ酸を製造できる。
組換えＤＮＡによって形質転換された細胞の培養液、分離菌体、洗浄菌体、菌体処理物、当該菌体処理物から得られる粗酵素液または精製酵素を用いてアミノ酸生成反応を進行させる場合には、５置換ヒダントイン化合物と培養液、分離菌体、洗浄菌体、菌体処理物、粗酵素液、または精製酵素を含む反応液を２５〜４０℃の適当な温度に調整し、ｐＨ５〜９に保ちつつ、８時間〜５日静置または攪拌すればよい。
また、組換えＤＮＡによって形質転換された細胞を水溶性媒体中で培養しながら、アミノ酸生成反応を進行させる場合には、５置換ヒダントイン化合物を含み、かつ形質転換された細胞の生育に必要な炭素源、窒素源、無機イオンなどの栄養素を含む水溶性媒体が用いられる。さらにビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を添加すると望ましい結果が得られる場合が多い。５置換ヒダントイン化合物は分割添加してもよい。好気的条件下でｐＨ５〜９、温度２５〜４０℃の適当な範囲に制御しつつ、８時間〜５日培養することが好ましい。
培養液あるいは反応液中のＤ−アミノ酸の定量は周知の方法を用いて速やかに測定することができる。即ち、簡便にはＭｅｒｃｋ製のＨＰＴＬＣ ＣＨＩＲなどを利用した薄層クロマトグラフィーを利用することができ、より分析精度を高めるには、ダイセル化学工業製のＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＷＨなどの光学分割カラムを利用した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いればよい。
生成したアミノ酸は、公知の手法により分離精製することができる。例えば、イオン交換樹脂に接触させて塩基性アミノ酸を吸着させ、これを溶離後晶析する方法または溶離後、活性炭等による脱色濾過し晶析する方法等が挙げられる。
大腸菌などの形質転換体を培養する条件にも左右されるが、概算として、ｔｒｐプロモータを用いた本発明の組換えＤＮＡを用いることにより、ラムノースプロモーターなどの他のプロモーターを用いた場合に比べて、約５倍程度の生産性（単位時間あたりのアミノ酸の生産量）の向上が可能である。
実施例
以下、実施例１〜実施例８を参照して本発明をさらに説明する。尚、本発明は実施例の記載に限定されない。
（実施例１）ＡＪ１１１９９株由来Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子のＥ．ｃｏｌｉにおける発現
１．発現プラスミドの構築
１−１．ｔｒｐプロモーター搭載プラスミドの構築
ｐＨＳＧ２９８（Ｔａｋａｒａ社製）をＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩにて処理し、得られたＤＮＡ断片とｔｒｐプロモーターカセット１（図２）をライゲーションし、このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換した。カナマイシン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、目的のプラスミドをｐＴｒｐ２９８ＥＫと命名した。なお、配列表配列番号２１には、図２に示されるｔｒｐプロモーターカセット１の上側の鎖について記載した。
１−２．Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子搭載プラスミドの構築
フラボバクテリウム エスピー（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＡＪ１１１９９株の染色体ＤＮＡを鋳型として、表１に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ（▲１▼〜▲４▼のいずれかと▲５▼との組み合わせで、計４種）により目的遺伝子を増幅した。これらの断片をＫｐｎＩ／ＸｂａＩにて処理し、得られたＤＮＡ断片とｐＴｒｐ２９８ＥＫのＫｐｎＩ／ＸｂａＩ処理物をライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、カナマイシン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、▲１▼〜▲４▼のいずれかと▲５▼とのプライマーで増幅したＤＮＡ断片を搭載する、それぞれのプラスミドをｐＴｒｐ２９８ＤＨＨａｓｅ１、２、３、４と命名した。
ｐＴｒｐ２９８ＤＨＨａｓｅ１、２、３または４を有する各Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を、カナマイシン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地（２ｍｌ）で３０℃、１６時間培養した。得られた培養液１００μｌを、４ｍｌの培地Ｉ（カザミノ酸１％、ペプトン１％、グルコース１％、硫酸アンモニウム０．５％、リン酸一カリウム０．１％、リン酸二カリウム０．３％、硫酸マグネシウム０．０５％、カナマイシン０．０１％（ｐＨ７．０））に移し、３７℃、１６時間培養した。培養後、１ｍｌの培養液から遠心分離（１０，０００ｇ×１０ｍｉｎ）により集菌し、得られた菌体を１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ、ｐＨ７．５）にて洗浄した。この洗浄菌体を０．５ｍｌの同緩衝液に懸濁し、超音波破砕（２０ＫＨｚ、１５ｍｉｎ、東湘電気製ＵＣＷ−２０１）を行った。この超音波破砕液を遠心分離（１０，０００ｇ×１０ｍｉｎ）し、得られた上清を無細胞抽出液とした。
３．ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によるＤ−ヒダントイナーゼ遺伝子発現の確認
無細胞抽出液１０μｌをＳＤＳポリアクリルアミドゲル（第一化学薬品製、マルチゲル１０／２０）に供し、Ｌａｅｍｅｌｌｉらの方法に従い、電気泳動を行った。その結果、ｐＴｒｐ２９８ＤＨＨａｓｅ３を有する形質転換体の無細胞抽出液のみに、Ｄ−ヒダントイナーゼに相当するタンパク質のバンドを認めた。
４．Ｄ−ヒダントイナーゼ活性測定
ｐＴｒｐ２９８ＤＨＨａｓｅ３を有するＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を、カナマイシン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地（２ｍｌ）で３０℃、１６時間培養した。得られた培養液０．５ｍｌを、５０ｍｌの培地ＩＩ（カザミノ酸１％、ペプトン１％、グルコース０．２％、硫酸アンモニウム０．５％、リン酸一カリウム０．１％、リン酸二カリウム０．３％、硫酸マグネシウム０．０５％、硫酸マンガン０．０１％、カナマイシン０．０１％（ｐＨ７．０））に移し、３７℃、２４時間培養した。
培養後、５ｍｌの培養液から遠心分離（１０，０００ｇ×１０ｍｉｎ）により集菌し、得られた菌体を１００ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．５）にて洗浄した。この洗浄菌体を５ｍｌの同緩衝液に懸濁し、その０．１ｍｌを０．９ｍｌの基質溶液（１３３ｍｇ／ｄｌ Ｄ−５−ベンジルヒダントイン、１．１ｍＭ ＭｎＳＯ４、１００ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．５））に添加し、３７℃にて６０分反応を行った。反応後、０．１ｍｌの反応液に、０．９ｍｌの反応停止溶液（１．１ｍＭ ＣｕＳＯ４）を添加し、遠心分離にて得られた上清をＨＰＬＣ（カラム：キラルパックＷＨ，０．４６×２５ｃｍ、溶出液：１ｍＭ ＣｕＳＯ４、流速：１．５ｍｌ／ｍｉｎ、温度：５０℃、検出波長：２１０ｎｍ）に供し、生成したＮ−カルバミル−Ｄ−Ｐｈｅを定量した。この条件にて、１分間に１μモルのＮ−カルバミル−Ｄ−Ｐｈｅを生成する酵素量を１Ｕと定義した。
その結果、ｐＴｒｐ２９８ＤＨＨａｓｅ３を有するＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９は、培養液１ｍｌ当り、１．５ＵのＤ−ヒダントイナーゼ活性を示した。
（実腋例２）ＡＪ１１１９９株由来Ｄ−カルバミラーゼ遺伝子のＥ．ｃｏｌｉにおける発現
１．Ｄ−カルバミラーゼ遺伝子搭載プラスミドの構築
フラボバクテリウム エスピー（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＡＪ１１１９９株の染色体ＤＮＡを鋳型として、表２に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ（▲１▼、▲２▼のいずれかと▲３▼との組み合わせで、計２種）により目的遺伝子を増幅した。これらの断片をＫｐｎＩ／ＸｂａＩにて処理し、得られたＤＮＡ断片とｐＴｒｐ２９８ＥＫのＫｐｎＩ／ＸｂａＩ処理物をライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、カナマイシン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、▲１▼、▲２▼のいずれかと▲３▼とのプライマーで増幅した断片を搭載する、それぞれのプラスミドをｐＴｒｐ２９８ＤＣＨａｓｅ１、２と命名した。
次にｐＴｒｐ２９８ＤＣＨａｓｅ１をＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩにて処理し、ｔｒｐプロモーターとカルバミラーゼ遺伝子が連結したＤＮＡ断片を得、このＤＮＡ断片をｐＨＳＧ２９９（Ｔａｋａｒａ社製）のＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、カナマイシン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、そのプラスミドをｐＴｒｐ２９９ＤＣＨａｓｅ１と命名した。
ｐＴｒｐ２９８ＤＣＨａｓｅ１、２またはｐＴｒｐ２９９ＤＣＨａｓｅ１を有する各Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９からの無細胞抽出液の調製は、実施例１記載の無細胞抽出液の調製と同様の方法で行った。
３．ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によるＤ−カルバミラーゼ発現の確認
無細胞抽出液１０μｌをＳＤＳポリアクリルアミドゲル（第一化学薬品社製、マルチゲル１０／２０）に供し、Ｌａｅｍｅｌｌｉらの方法に従い、電気泳動を行った。その結果、ｐＴｒｐ２９９ＤＣＨａｓｅ１を有する形質転換体の無細胞抽出液のみに、Ｄ−カルバミラーゼに相当するタンパク質のバンドを認めた。
４．Ｄ−カルバミラーゼ活性測定
ｐＴｒｐ２９９ＤＣＨａｓｅ１を有するＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９の菌体調製は、実施例１記載の酵素活性測定時と同様に行った。得られた洗浄菌体を５ｍｌの１００ｍＭＫＰＢ（ｐＨ７．５）に懸濁し、その０．１ｍｌを０．９ｍｌの基質溶液（４５８ｍｇ／ｄｌ Ｎ−カルバミル−Ｄ−Ｐｈｅ、１００ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．５））に添加し、３７℃にて６０分反応を行った。反応後、０．１ｍｌの反応液に、０．９ｍｌの反応停止溶液を添加し、遠心分離にて得られた上清をＨＰＬＣに供し、生成したＤ−Ｐｈｅを定量した。この条件にて、１分間に１μモルのＤ−Ｐｈｅを生成する酵素量を１Ｕと定義した。
その結果、ｐＴｒｐ２９９ＤＣＨａｓｅ１を有するＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９は、培養液１ｍｌ当り、０．６ＵのＤ−カルバミラーゼ活性を示した。
（実施例３） ＡＪ３９１２由来ヒダントインラセマーゼ遺伝子のＥ．ｃｏｌｉにおける発現
１．発現プラスミドの構築
１−１．ｔｒｐプロモーター搭載プラスミドの構築
ｐＨＳＧ２９８並びにｐＨＳＧ２９９をＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩにて処理し、得られたＤＮＡ断片とｔｒｐプロモーターカセット２（図２）をライゲーションし、このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換した。カナマイシン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、それぞれのプラスミドをｐＴｒｐ２９８ＥＸ並びにｐＴｒｐ２９９ＥＸと命名した。なお、配列表の配列番号２２には、図２に示されるｔｒｐプロモーターカセット２の上側の鎖について記載した。
１−２．ヒダントインラセマーゼ遺伝子搭載プラスミドの構築
マイクロバクテリウム リクエファシエンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＡＪ３９１２株の染色体ＤＮＡを鋳型として、表３に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ（▲１▼、▲２▼のいずれかと▲３▼との組み合わせで計２種）により目的遺伝子を増幅した。これらの断片をＸｂａＩ／ＰｓｔＩにて処理し、得られたＤＮＡ断片とｐＴｒｐ２９８ＥＸ並びにｐＴｒｐ２９９ＥＸのＸｂａＩ／ＰｓｔＩ処理物をライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、カナマイシン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、▲１▼、▲２▼のいずれかと▲３▼とのプライマーで増幅した断片を搭載する、それぞれのプラスミドをｐＴｒｐ２９８ＨＲａｓｅ１、２、ｐＴｒｐ２９９ＨＲａｓｅ１、２と命名した。
次に、ｐＴｒｐ２９９ＨＲａｓｅ２をＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩにて処理し、ｔｒｐプロモーターとヒダントインラセマーゼ遺伝子が連結したＤＮＡ断片を得、このＤＮＡ断片をｐＳＴＶ２９（Ｔａｋａｒａ社製）のＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、クロラムフェニコール耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、そのプラスミドをｐＴｒｐ２９ＨＲａｓｅと命名した。
ｐＴｒｐ２９８ＨＲａｓｅ１もしくは２、ｐＴｒｐ２９９ＨＲａｓｅ１もしくは２、またはｐＴｒｐ２９ＨＲａｓｅを有するＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９の菌体調製は、実施例１記載の酵素活性測定時と同様に行った。得られた洗浄菌体を５ｍｌの１００ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．５）に懸濁し、その０．１ｍｌを０．９ｍｌの基質溶液（１３３ｍｇ／ｄｌ Ｄ−５−ベンジルヒダントイン、１００ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．５））に添加し、３７℃にて１５分反応を行った。反応後、０．１ｍｌの反応液に、０．９ｍｌの反応停止溶液を添加し、遠心分離にて得られた上清をＨＰＬＣに供し、生成したＬ−５−ベンジルヒダントインを定量した。この条件にて、１分間に１μモルのＬ−５−ベンジルヒダントインを生成する酵素量を１Ｕと定義した。そのの結果を表４に示す。
１．共発現プラスミドの構築
１−１．ｐＴｒｐＨｆＣｆプラスミドの構築
ｐＴｒｐ２９９ＤＣＨａｓｅ１を鋳型として、表５に示す▲１▼と▲２▼のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をＸｂａＩ／ＰｓｔＩ処理後、ｐＴｒｐ２９８ＤＨＨａｓｅ３のＸｂａＩ／ＰｓｔＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、カナマイシン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、そのプラスミドをｐＴｒｐＨｆＣｆと命名した（図３）。
１−２．ｐＴｒｐＣｒＨｆプラスミドの構築
ｐＴｒｐ２９９ＤＣＨａｓｅ１を鋳型として、表５に示す▲１▼と▲２▼のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（プロメガ社製）にライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、そのプラスミドをｐＧＥＭＤＣＨａｓｅ１と命名した。次にこのプラスミドをＥｃｏＲＩにて処理し、ｔｒｐプロモーターとカルバミラーゼ遺伝子が連結したＤＮＡ断片を得、このＤＮＡ断片をｐＴｒｐ２９８ＤＨＨａｓｅ３のＥｃｏＲＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、カナマイシン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、そのプラスミドをｐＴｒｐＣｒＨｆと命名した（図４）。
１−３．ｐＴｒｐＨｒＣｒプラスミドの構築
ｐＴｒｐ２９８ＤＨＨａｓｅ３を鋳型として、表５に示す▲１▼と▲３▼のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をＸｂａＩ／ＰｓｔＩ処理後、ｐＴｒｐ２９９ＤＣＨａｓｅ１のＸｂａＩ／ＰｓｔＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、カナマイシン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、そのプラスミドをｐＴｒｐＨｒＣｒと命名した（図５）。
ｐＴｒｐＨｆＣｆ、ｐＴｒｐＣｒＨｆ、ｐＴｒｐＨｒＣｒの各プラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９の菌体調製は、実施例１の酵素活性測定時と同様に行った。得られた菌体懸濁液０．２ｍｌを基質溶液０．８ｍｌ（０．１２５ｇ／ｄｌ ＤＬ−ベンジルヒダントイン、１．２５ｍＭ ＭｎＳＯ４、１００ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．５））に添加し、３７℃にて６０分反応を行った。反応後、０．１ｍｌの反応液に、０．９ｍｌの反応停止溶液を添加した。遠心分離にて得られた上清をＨＰＬＣに供し、生成したＮ−カルバミル−Ｄ−Ｐｈｅ並びにＤ−Ｐｈｅを定量した。その結果を表６に示す。いずれのプラスミドを有する形質転換体においても、Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子並びにＤ−カルバミラーゼ遺伝子の共発現が認められた。
ｐＴｒｐＨｒＣｒを有するＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９に、ｐＴｒｐ２９ＨＲａｓｅを導入し、２種のプラスミドを有する形質転換体を作製した。この形質転換体をカナマイシン１００μｇ／ｍｌ、クロラムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地（４ｍｌ）で３０℃、１６時間培養した。得られた培養液１ｍｌを、５０ｍｌの培地ＩＩに移し、３５℃、２４時間培養した。培養後、１ｍｌの培養液から遠心分離（１０，０００ｇ×１０ｍｉｎ）により集菌し、得られた菌体を１００ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．５）にて洗浄した。この洗浄菌体を１ｍｌの同緩衝液に懸濁し、０．１ｍｌの菌体懸濁液を０．９ｍｌの基質溶液（０．１１ｇ／ｄｌ Ｌ−５−ベンジルヒダントイン、１．１ｍＭ ＭｎＳＯ４、０．１１％ ＴｒｉｒｏｎＸ−１００、１００ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．５））に添加し、３７℃にて６０分反応を行った。反応後、生成したＤ−Ｐｈｅを定量したところ、９２．７ｍｇ／ｄｌのＤ−Ｐｈｅが生成しており、３酵素遺伝子の共発現を確認した。
（実施例６）Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子、Ｄ−カルバミラーゼ遺伝子並びにヒダントインラセマーゼ遺伝子共発現菌を用いたＤ−Ｐｈｅの生産
ｐＴｒｐＨｒＣｒ並びにｐＴｒｐ２９ＨＲａｓｅの２プラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を、カナマイシン１００μｇ／ｍｌ、クロラムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地（５０ｍｌ）で３０℃、１６時間培養した。得られた培養液１５ｍｌを３００ｍｌの培地ＩＩＩ（カザミノ酸１％、ペプトン１％、グルコース２％、硫酸アンモニウム０．５％、リン酸一カリウム０．１％、リン酸二カリウム０．３％、硫酸マグネシウム０．０５％、硫酸マンガン０．０１％、カナマイシン０．０１％、クロラムフェニコール０．００５％（ｐＨ７．０））に移し、Ｊａｒ培養装置（ｐＨ７．０制御）を用いて３５℃、１５時間培養した。得られた培養液３０ｍｌ（乾燥菌体重量３００ｍｇ）を２７０ｍｌの基質溶液（５．５ｇ／ｄｌ ＤＬ−５−ベンジルヒダントイン、１．１１ｍＭ ＭｎＳＯ４、０．１１％ ＴｒｉｒｏｎＸ−１００、２２ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．５））に添加し、反応液のｐＨをｐＨ７．５に保ちながら（１Ｎ ＮａＯＨと２Ｎ Ｈ２ＳＯ４にて調整）、３７℃にて４４時間反応を行った。その結果、４．１３ｇ／ｄｌ（モル収率９５％）のＤ−Ｐｈｅの生成を認めた。
（実施例７）Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子、Ｄ−カルバミラーゼ遺伝子並びにヒダントインラセマーゼ遺伝子共発現菌を用いたＤ−Ｐｈｅの生産（抗生物質無添加培養）
ｐＴｒｐＨｒＣｒ並びにｐＴｒｐ２９ＨＲａｓｅの２プラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を、カナマイシン、クロラムフェニコールを含まないＬＢ培地（５０ｍｌ）で３０℃、１６時間培養した。得られた培養液１５ｍｌを３００ｍｌのカナマイシン、クロラムフェニコールを含まない培地ＩＩＩにてＪａｒ培養装置（ｐＨ７．０制御）を用いて３５℃、１５時間培養した。得られた培養液３０ｍｌ（乾燥菌体重量３００ｍｇ）を２７０ｍｌの基質溶液（５．５ｇ／ｄｌ ＤＬ−５−ベンジルヒダントイン、１．１１ｍＭ ＭｎＳＯ４、０．１１％ ＴｒｉｒｏｎＸ−１００、２２ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．５））に添加し、反応液のｐＨをｐＨ７．５に保ちながら（１Ｎ ＮａＯＨと２Ｎ Ｈ２ＳＯ４にて調整）、３７℃にて４４時間反応を行った。その結果、２．０６ｇ／ｄｌ（モル収率４８％）のＤ−Ｐｈｅの生成を認めた。
（実施例８）
１−１．ｔｒｐプロモーター及びｒｒｎＢターミネーター搭載プラスミドの構築
エシェリヒア コリ（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０染色体ＤＮＡ上のｔｒｐオペロンのプロモーター領域を表７に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ（▲１▼と▲２▼の組み合わせ）により目的遺伝子領域を増幅し、得られたＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（プロメガ製）にライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中からｔｒｐプロモーターの方向がｌａｃプロモーターと反対向きに挿入された目的のプラスミドを有する株を選択した。
次にこのプラスミドをＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＥｃｏＲＩにて処理して得られるｔｒｐプロモーターを含むＤＮＡ断片と、ｐＵＣ１９（Ｔａｋａｒａ製）のＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＥｃｏＲＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、プラスミドをｐＴｒｐ１と命名した。
次にｐＫＫ２２３−３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）をＨｉｎｄＩＩＩ／ＨｉｎｃＩＩにて処理し、得られたｒｒｎＢターミネーターを含むＤＮＡ断片とｐＴｒｐ１のＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｖｕＩＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、プラスミドをｐＴｒｐ２と命名した。
次にｐＴｒｐ２を鋳型として表に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ（▲１▼と▲３▼の組み合わせ）によりｔｒｐプロモーター領域を増幅した。このＤＮＡ断片をＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＮｄｅＩにより処理し、ｐＴｒｐ２のＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＮｄｅＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをｐＴｒｐ４と命名した。
ｐＳＴＶ２８（Ｔａｋａｒａ社製）のＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＰｖｕＩ処理して得られる２．４ｋｂのＤＮＡ断片、ｐＫＫ２２３−３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）をＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｖｕＩにて処理して得られる０．９ｋｂのＤＮＡ断片、及びｐＴｒｐ４のＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＨｉｎｄＩＩＩ処理によって得られる０．３ｋｂのＤＮＡ断片をライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、クロラムフェニコール耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、プラスミドをｐＴｒｐ８と命名した。
マイクロバクテリウム リクエファシエンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＡＪ３９１２株の染色体ＤＮＡを鋳型として表８に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより目的遺伝子を増幅した。この断片をＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩにて処理し、得られたＤＮＡ断片とｐＴｒｐ４のＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ処理物をライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、プラスミドをｐＴｒｐ４Ｒと命名した（図６）。なお、図６、図７中ｒｒｎＢターミネーターを「ＴｒｒｎＢ」と表示する。
ｐＴｒｐＨｒＣｒを鋳型として表９に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより目的遺伝子を増幅した。この断片をＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩにて処理し、得られたＤＮＡ断片とｐＴｒｐ８のＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ処理物をライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、クロラムフェニコール耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、プラスミドをｐＴｒｐ８ＣＨと命名した（図７）。
ｐＴｒｐ４Ｒを有するＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９に、ｐＴｒｐ８ＣＨを導入し、２種のプラスミドを有する形質転換体を作製した。この形質転換体をアンピシリン１００μｇ／ｍｌ、クロラムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地（５０ｍｌ）で３０℃、１６時間培養した。得られた培養液１ｍｌを３００ｍｌの培地ＩＶ（グルコース２．５％、硫酸アンモニウム０．５％、燐酸２水素１カリウム０．１４％、クエン酸３ナトリウム２水和物０．２３％、硫酸鉄（ＩＩ）７水和物０．００２％、硫酸マグネシウム７水和物０．１％、硫酸マンガン５水和物０．００２％、チアミン塩酸塩０．０００１％、アンピシリン０．０１％、クロラムフェニコール０．００５％（ｐＨ７．０））に移し、Ｊａｒ培養装置にてｐＨ７．０、溶存酸素濃度１．５ｐｐｍ以上に制御しながら３３℃にて２４時間培養した。得られた培養液１５ｍｌを３００ｍｌの培地Ｖ（グルコース２．５％、硫酸アンモニウム０．５％、燐酸０．３％、クエン酸３ナトリウム２水和物０．２３％、硫酸マグネシウム７水和物０．１％、硫酸鉄（ＩＩ）７水和物０．００２％、硫酸マンガン５水和物０．００２％、チアミン塩酸塩０．０００１％、アンピシリン０．０１％、クロラムフェニコール０．００５％（ｐＨ７．０））に移し、Ｊａｒ培養装置にてｐＨ７．０、溶存酸素濃度１．５ｐｐｍ以上に制御し、培養９時間以降グルコース５０％水溶液を３．５ｍｌ／ｈｒにて添加を行いながら、３５℃にて２４時間培養した。得られた培養液１５ｍｌ（乾燥菌体重量６００ｍｇ）を２８５ｍｌの基質溶液（５．３ｇ／ｄｌ ＤＬ−５−ベンジルヒダントイン、１．０５ｍＭ 硫酸マンガン、２１ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．５））に添加し、反応液のｐＨをｐＨ７．５に保ちながら（１Ｎ ＮａＯＨと２Ｎ Ｈ２ＳＯ４にて調整）、３７℃にて４８時間反応を行った。その結果、４．１５ｇ／ｄｌ（モル収率９５％）のＤ−Ｐｈｅの生成を認めた。
１−５． Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子、Ｄ−カルバミラーゼ遺伝子並びにヒダントインラセマーゼ遺伝子共発現株によるＤ−Ｐｈｅ生産（抗生物質無添加系）
ｐＴｒｐ４Ｒ、ｐＴｒｐ８ＣＨの２プラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を、アンピシリン、クロラムフェニコールを含まない、ＬＢ培地（５０ｍｌ）で３０℃、１６時間培養した。得られた培養液１ｍｌをアンピシリン、クロラムフェニコールを含まない、３００ｍｌの培地ＩＶに移し、Ｊａｒ培養装置にてｐＨ７．０、溶存酸素濃度１．５ｐｐｍ以上に制御しながら３３℃にて２４時間培養した。得られた培養液１５ｍｌをアンピシリン、クロラムフェニコールを含まない、３００ｍｌの培地Ｖに移し、Ｊａｒ培養装置にてｐＨ７．０、溶存酸素濃度１．５ｐｐｍ以上に制御し、培養９時間以降グルコース５０％水溶液を３．５ｍｌ／ｈｒにて添加を行いながら、３５℃にて２４時間培養した。得られた培養液１５ｍｌ（乾燥菌体重量６００ｍｇ）を２８５ｍｌの基質溶液（５．３ｇ／ｄｌ ＤＬ−５−ベンジルヒダントイン、１．０５ｍＭ硫酸マンガン、２１ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．５））に添加し、反応液のｐＨをｐＨ７．５に保ちながら（１Ｎ ＮａＯＨと２Ｎ Ｈ２ＳＯ４にて調整）、３７℃にて４８時間反応を行った。その結果、抗生物質無添加培養でも、プラスミドの脱落がなく、４．１５ｇ／ｄｌ（モル収率９５％）のＤ−Ｐｈｅの生成を認めた。
産業上の利用の可能性
本発明により、ヒダントイナーゼ遺伝子およびカルバミラーゼ遺伝子が効率よく共発現する組換えＤＮＡが提供される。また、本発明により、生産性の高いアミノ酸製造を行うことができる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
第１図は、ＨＨａｓｅとＣＨａｓｅのプラスミド上での挿入位置および方向を示す図である。
第２図は、ｔｒｐプロモータカセット１および２を示す図である。
第３図は、ｐＴｒｐＨｆＣｆの作製を示す図である。
第４図は、ｐＴｒｐＣｒＨｆの作製を示す図である。
第５図は、ｐＴｒｐＨｒＣｒの作製を示す図である。
第６図は、ｐＴｒｐ４Ｒの作製を示す図である。
第７図は、ｐＴｒｐ８ＣＨの作製を示す図である。
Claims (12)
- 下記（Ｉ）および（ＩＩ）の遺伝子領域をコードする塩基配列を有する組換えＤＮＡ。
（Ｉ）ヒダントイナーゼ遺伝子をコードする塩基配列と、当該ヒダントイナーゼ遺伝子をコードする塩基配列の上流部に位置し当該ヒダントイナーゼ遺伝子の発現を調節するｔｒｐプロモーター配列とを含む遺伝子領域
（ＩＩ）カルバミラーゼ遺伝子をコードする塩基配列と、当該カルバミラーゼ遺伝子をコードする塩基配列の上流部に位置し当該カルバミラーゼ遺伝子の発現を調節するｔｒｐプロモーター配列とを含む遺伝子領域 - （Ｉ）の遺伝子領域をコードする塩基配列と（ＩＩ）の遺伝子領域をコードする塩基配列の転写方向が同じ方向であり、かつ当該転写方向と同じ方向に向かって（Ｉ）の遺伝子領域をコードする塩基配列、（ＩＩ）の遺伝子領域をコードする塩基配列の順に配列されていることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の組換えＤＮＡ。
- （Ｉ）の遺伝子領域をコードする塩基配列と（ＩＩ）の遺伝子領域をコードする塩基配列の転写方向が逆方向であることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の組換えＤＮＡ。
- （Ｉ）の遺伝子領域をコードする塩基配列と（ＩＩ）の遺伝子領域をコードする塩基配列の転写方向が同じ方向であり、かつ、当該転写方向と同じ方向に向かって（ＩＩ）の遺伝子領域をコードする塩基配列、（Ｉ）の遺伝子領域をコードする塩基配列の順に配列されていることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の組換えＤＮＡ。
- 組換えＤＮＡが、プラスミドである、請求の範囲第１項から第４項のいずれかに記載の組換えＤＮＡ。
- 請求の範囲第１項から第５項のいずれかに記載の組換えＤＮＡにより形質転換された形質転換細胞。
- 請求の範囲第１項から第５項のいずれかに記載の組換えＤＮＡと、ヒダントインラセマーゼ遺伝子をコードする塩基配列および当該ヒダントインラセマーゼ遺伝子の上流部に位置し当該ヒダントインラセマーゼ遺伝子の発現を調節するｔｒｐプロモーター配列を有する組換えＤＮＡと、
によって形質転換された形質転換細胞。 - 請求の範囲第１項から第５項のいずれかに記載の組換えＤＮＡが低コピーな組換えＤＮＡであり、ヒダントインラセマーゼ遺伝子をコードする塩基配列および当該ヒダントインラセマーゼ遺伝子の上流部に位置し当該ヒダントインラセマーゼ遺伝子の発現を調節するｔｒｐプロモーター配列を有する組換えＤＮＡが高コピーな組換えＤＮＡである、請求の範囲第７項に記載の形質転換細胞。
- 組換えＤＮＡの宿主がエシェリヒア コリである、請求の範囲第６項から第８項のいずれかに記載の形質転換細胞。
- 請求の範囲第６項に記載の形質転換細胞を培地中で培養し、培地中および／または形質転換細胞中にヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質およびカルバミラーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させることを特徴とする、混合タンパク質の製造方法。
- 請求の範囲第７項に記載の形質転換細胞を培地中で培養し、培地中および／または形質転換細胞中に、ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質、カルバミラーゼ活性を有するタンパク質およびヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させることを特徴とする、混合タンパク質の製造方法。
- 請求の範囲第６項から第９項のいずれかに記載の形質転換細胞を培地中で培養して培養物を得、当該培養物に５置換ヒダントインを混合してアミノ酸を生成させることを特徴とするアミノ酸の製造方法。
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