JP2003210177A - ５置換ヒダントインラセマーゼ、これをコードするｄｎａ、組み換えｄｎａ、形質転換された細胞および光学活性アミノ酸の製造方法 - Google Patents
５置換ヒダントインラセマーゼ、これをコードするｄｎａ、組み換えｄｎａ、形質転換された細胞および光学活性アミノ酸の製造方法Info
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- JP2003210177A JP2003210177A JP2002013553A JP2002013553A JP2003210177A JP 2003210177 A JP2003210177 A JP 2003210177A JP 2002013553 A JP2002013553 A JP 2002013553A JP 2002013553 A JP2002013553 A JP 2002013553A JP 2003210177 A JP2003210177 A JP 2003210177A
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 従来にない新規５置換ヒダントインラセマー
ゼを単離し、酵素を用いた光学活性アミノ酸の製造方法
を提供することを課題とする。 【解決手段】 (a)または(b)のアミノ酸配列を有し、５
置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質。
(a)Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｔｒｏｐｉ
ｃａ由来の特定のアミノ酸配列(b)上記アミノ酸配列に
おいて１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿
入、付加または逆位を含むアミノ酸配列
ゼを単離し、酵素を用いた光学活性アミノ酸の製造方法
を提供することを課題とする。 【解決手段】 (a)または(b)のアミノ酸配列を有し、５
置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質。
(a)Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｔｒｏｐｉ
ｃａ由来の特定のアミノ酸配列(b)上記アミノ酸配列に
おいて１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿
入、付加または逆位を含むアミノ酸配列
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規５置換ヒダン
トインラセマーゼ、これをコードするＤＮＡ、組み換え
ＤＮＡ、形質転換された細胞および光学活性アミノ酸の
製造方法に関し、特に、ラセミ化反応を効率的に触媒す
る新規５置換ヒダントインラセマーゼ、これをコードす
るＤＮＡ、組み換えＤＮＡ、形質転換された細胞および
光学活性アミノ酸の製造方法に関する。
トインラセマーゼ、これをコードするＤＮＡ、組み換え
ＤＮＡ、形質転換された細胞および光学活性アミノ酸の
製造方法に関し、特に、ラセミ化反応を効率的に触媒す
る新規５置換ヒダントインラセマーゼ、これをコードす
るＤＮＡ、組み換えＤＮＡ、形質転換された細胞および
光学活性アミノ酸の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】５置換ヒダントインラセマーゼ（以下
「ＨＲａｓｅ」とも記す）は、光学活性な５置換ヒダン
トイン化合物、すなわちＤ−またはＬ−５置換ヒダント
イン化合物に作用し、当該物質のラセミ化反応を触媒す
る酵素である。
「ＨＲａｓｅ」とも記す）は、光学活性な５置換ヒダン
トイン化合物、すなわちＤ−またはＬ−５置換ヒダント
イン化合物に作用し、当該物質のラセミ化反応を触媒す
る酵素である。
【０００３】５置換ヒダントイン化合物は、下記反応式
（I）に示すように、、の酵素による加水分解反応
を経てアミノ酸となる。 ５置換ヒダントイン化合物に作用し、当該物質を加水
分解することによりＮ−カルバミルアミノ酸を生成する
反応を触媒する酵素（ヒダントイナーゼ、以下「ＨＨａ
ｓｅ」とも記す）。 生成したＮ−カルバミルアミノ酸に作用し、当該物質
を加水分解することにより光学活性アミノ酸を生成する
反応を触媒する酵素（Ｎ−カルバミルアミノ酸ハイドロ
ラーゼ、以下「ＣＨａｓｅ」とも記す。また、一般にカ
ルバミルアミノ酸ハイドロラーゼはカルバミラーゼと略
称される場合がある）。
（I）に示すように、、の酵素による加水分解反応
を経てアミノ酸となる。 ５置換ヒダントイン化合物に作用し、当該物質を加水
分解することによりＮ−カルバミルアミノ酸を生成する
反応を触媒する酵素（ヒダントイナーゼ、以下「ＨＨａ
ｓｅ」とも記す）。 生成したＮ−カルバミルアミノ酸に作用し、当該物質
を加水分解することにより光学活性アミノ酸を生成する
反応を触媒する酵素（Ｎ−カルバミルアミノ酸ハイドロ
ラーゼ、以下「ＣＨａｓｅ」とも記す。また、一般にカ
ルバミルアミノ酸ハイドロラーゼはカルバミラーゼと略
称される場合がある）。
【０００４】
【化１】
【０００５】５置換ヒダントイン化合物から光学活性ア
ミノ酸を製造するためには、上記ヒダントイナーゼお
よびＮ−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼのうち、
少なくとも一方に光学選択性の酵素を用いればよく、従
来から微生物酵素系を用いた方法および微生物酵素系と
化学反応系とを組み合わせた方法が知られている。この
５置換ヒダントイン化合物から、光学活性アミノ酸を製
造する方法は、医薬品、化学工業品、食品添加物等の製
造に重要である。
ミノ酸を製造するためには、上記ヒダントイナーゼお
よびＮ−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼのうち、
少なくとも一方に光学選択性の酵素を用いればよく、従
来から微生物酵素系を用いた方法および微生物酵素系と
化学反応系とを組み合わせた方法が知られている。この
５置換ヒダントイン化合物から、光学活性アミノ酸を製
造する方法は、医薬品、化学工業品、食品添加物等の製
造に重要である。
【０００６】微生物酵素系あるいは微生物酵素系と化学
反応系との組み合わせにより、ＤＬ−５置換ヒダントイ
ン化合物の全量を光学選択的に加水分解させ、光学活性
アミノ酸に変換するには、基質とならないエナンチオマ
ーを効率的にラセミ化し、基質となるエナンチオマーに
変化させる必要がある。ところが、基質とならない光学
活性５置換ヒダントイン化合物のラセミ化速度がきわめ
て遅いものもあり、ラセミ化が律速となって効率的に光
学活性アミノ酸に変換することができないといった問題
があった。
反応系との組み合わせにより、ＤＬ−５置換ヒダントイ
ン化合物の全量を光学選択的に加水分解させ、光学活性
アミノ酸に変換するには、基質とならないエナンチオマ
ーを効率的にラセミ化し、基質となるエナンチオマーに
変化させる必要がある。ところが、基質とならない光学
活性５置換ヒダントイン化合物のラセミ化速度がきわめ
て遅いものもあり、ラセミ化が律速となって効率的に光
学活性アミノ酸に変換することができないといった問題
があった。
【０００７】そこで、中性条件下での光学活性５置換ヒ
ダントイン化合物のラセミ化を目的として、ＨＲａｓｅ
の検索がなされ、アースロバクター（Arthrobacter）属
細菌由来（特開昭６２−１２２５９１号公報、Ann.N.Y.
Acad.Sci ６７２巻４７８ページ、特開平６−３４３４
６２号公報）、シュードモナス(Pseudomonas)属細菌由
来(特開平４−２７１７８４号公報、J.Bacteriol.１７
４巻、７９８９ページ、１９９２年)が報告されてい
る。従来報告されている細菌由来のＨＲａｓｅの至適反
応温度は、アースロバクター エスピー（Arthrobacter
sp.）ＤＳＭ−３７４７株由来のものが３７℃（Ann.N.
Y.Acad.Sci ６７２巻 ４７８ページ）、同じくアース
ロバクター エスピー（Arthrobacter sp.）ＤＫ２００
株由来のものが１０℃〜５０℃（特開昭６２−１２２５
９１号公報）、またシュードモナスエスピー(Pseudomon
as sp.)ＮＳ６７１由来のものが４５℃である。これら
の菌株はいずれもＬ−アミノ酸生産菌である。
ダントイン化合物のラセミ化を目的として、ＨＲａｓｅ
の検索がなされ、アースロバクター（Arthrobacter）属
細菌由来（特開昭６２−１２２５９１号公報、Ann.N.Y.
Acad.Sci ６７２巻４７８ページ、特開平６−３４３４
６２号公報）、シュードモナス(Pseudomonas)属細菌由
来(特開平４−２７１７８４号公報、J.Bacteriol.１７
４巻、７９８９ページ、１９９２年)が報告されてい
る。従来報告されている細菌由来のＨＲａｓｅの至適反
応温度は、アースロバクター エスピー（Arthrobacter
sp.）ＤＳＭ−３７４７株由来のものが３７℃（Ann.N.
Y.Acad.Sci ６７２巻 ４７８ページ）、同じくアース
ロバクター エスピー（Arthrobacter sp.）ＤＫ２００
株由来のものが１０℃〜５０℃（特開昭６２−１２２５
９１号公報）、またシュードモナスエスピー(Pseudomon
as sp.)ＮＳ６７１由来のものが４５℃である。これら
の菌株はいずれもＬ−アミノ酸生産菌である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】上述したように、工業
的応用の観点から、ＨＲａｓｅは有用である。従って、
本発明の目的は、従来にない新規ＨＲａｓｅを単離し、
当該酵素を用いた光学活性アミノ酸の製造方法を提供す
ることにある。
的応用の観点から、ＨＲａｓｅは有用である。従って、
本発明の目的は、従来にない新規ＨＲａｓｅを単離し、
当該酵素を用いた光学活性アミノ酸の製造方法を提供す
ることにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】５置換ヒダントイン化合
物からＤ−アミノ酸を生産する菌株については既に報告
があるものの、Ｄ−アミノ酸生産菌の中でＨＲａｓｅ活
性を有するものについては報告がなく、上記のようにＨ
ＲａｓｅはＬ−アミノ酸生産菌に由来するものしか見出
されていなかった。しかしながら、本発明者らは、Ｌ−
アミノ酸生産菌に限らずＤ−アミノ酸生産菌についても
幅広く探索を続けたところ、初めてＤ−アミノ酸生産菌
の中からＨＲａｓｅ活性を有する菌を見出し、本発明を
完成させるに至った。
物からＤ−アミノ酸を生産する菌株については既に報告
があるものの、Ｄ−アミノ酸生産菌の中でＨＲａｓｅ活
性を有するものについては報告がなく、上記のようにＨ
ＲａｓｅはＬ−アミノ酸生産菌に由来するものしか見出
されていなかった。しかしながら、本発明者らは、Ｌ−
アミノ酸生産菌に限らずＤ−アミノ酸生産菌についても
幅広く探索を続けたところ、初めてＤ−アミノ酸生産菌
の中からＨＲａｓｅ活性を有する菌を見出し、本発明を
完成させるに至った。
【００１０】即ち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕 下記(a)または(b)のアミノ酸配列を有し、５置
換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質。 (a)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列 (b)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において
１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加
または逆位を含むアミノ酸配列 〔２〕 パスツレラ属細菌を培養して得た菌体を破砕ま
たは溶菌後、精製処理を行うことにより取得されるパス
ツレラ属細菌由来の５置換ヒダントインラセマーゼ画
分。 〔３〕 請求項１に記載の５置換ヒダントインラセマー
ゼ活性を有するタンパク質または請求項２に記載の５置
換ヒダントインラセマーゼ画分を、光学活性５置換ヒダ
ントイン化合物に作用させることを特徴とする光学活性
５置換ヒダントイン化合物のラセミ化方法。 〔４〕 上記〔１〕に記載の５置換ヒダントインラセマ
ーゼ活性を有するタンパク質または上記〔２〕に記載の
５置換ヒダントインラセマーゼ画分、および、５置換ヒ
ダントイン化合物を光学選択的に加水分解する酵素また
は当該酵素含有物を、５置換ヒダントイン化合物に作用
させることを特徴とするＮ−カルバミルアミノ酸の製造
方法。 〔５〕 下記(ii)および(iii)のうち少なくとも一方が
光学選択的に基質を加水分解する酵素または酵素含有物
であり、下記(i）、(ii)および(iii)を５置換ヒダント
イン化合物に作用させることを特徴とする光学活性アミ
ノ酸の製造方法。 (i)上記〔１〕に記載の５置換ヒダントインラセマーゼ
活性を有するタンパク質または上記〔２〕に記載の５置
換ヒダントインラセマーゼ画分 (ii)５置換ヒダントイン化合物を加水分解する酵素また
は当該酵素含有物 (iii)Ｎ−カルバミルアミノ酸を加水分解する酵素また
は当該酵素含有物 〔６〕 〔１〕に記載の５置換ヒダントインラセマーゼ
活性を有するタンパク質または〔２〕に記載の５置換ヒ
ダントインラセマーゼ画分と、５置換ヒダントイン化合
物を光学選択的に加水分解する酵素または当該酵素含有
物と、Ｎ−カルバミルアミノ酸を化学的に加水分解する
化学的加水分解剤とを、５置換ヒダントイン化合物に作
用させることを特徴とする光学活性アミノ酸の製造方
法。 〔７〕 下記(a)または(b)の塩基配列を有し、５置換ヒ
ダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質をコード
するＤＮＡ。 (a)配列表の配列番号１に記載の塩基配列 (b)配列表の配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩
基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイ
ブリダイズする塩基配列 〔８〕 下記(c)または(d)のアミノ酸配列を有し５置換
ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質をコー
ドするＤＮＡ。 (c)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列 (d)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において
１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加
または逆位を含むアミノ酸配列
換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質。 (a)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列 (b)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において
１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加
または逆位を含むアミノ酸配列 〔２〕 パスツレラ属細菌を培養して得た菌体を破砕ま
たは溶菌後、精製処理を行うことにより取得されるパス
ツレラ属細菌由来の５置換ヒダントインラセマーゼ画
分。 〔３〕 請求項１に記載の５置換ヒダントインラセマー
ゼ活性を有するタンパク質または請求項２に記載の５置
換ヒダントインラセマーゼ画分を、光学活性５置換ヒダ
ントイン化合物に作用させることを特徴とする光学活性
５置換ヒダントイン化合物のラセミ化方法。 〔４〕 上記〔１〕に記載の５置換ヒダントインラセマ
ーゼ活性を有するタンパク質または上記〔２〕に記載の
５置換ヒダントインラセマーゼ画分、および、５置換ヒ
ダントイン化合物を光学選択的に加水分解する酵素また
は当該酵素含有物を、５置換ヒダントイン化合物に作用
させることを特徴とするＮ−カルバミルアミノ酸の製造
方法。 〔５〕 下記(ii)および(iii)のうち少なくとも一方が
光学選択的に基質を加水分解する酵素または酵素含有物
であり、下記(i）、(ii)および(iii)を５置換ヒダント
イン化合物に作用させることを特徴とする光学活性アミ
ノ酸の製造方法。 (i)上記〔１〕に記載の５置換ヒダントインラセマーゼ
活性を有するタンパク質または上記〔２〕に記載の５置
換ヒダントインラセマーゼ画分 (ii)５置換ヒダントイン化合物を加水分解する酵素また
は当該酵素含有物 (iii)Ｎ−カルバミルアミノ酸を加水分解する酵素また
は当該酵素含有物 〔６〕 〔１〕に記載の５置換ヒダントインラセマーゼ
活性を有するタンパク質または〔２〕に記載の５置換ヒ
ダントインラセマーゼ画分と、５置換ヒダントイン化合
物を光学選択的に加水分解する酵素または当該酵素含有
物と、Ｎ−カルバミルアミノ酸を化学的に加水分解する
化学的加水分解剤とを、５置換ヒダントイン化合物に作
用させることを特徴とする光学活性アミノ酸の製造方
法。 〔７〕 下記(a)または(b)の塩基配列を有し、５置換ヒ
ダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質をコード
するＤＮＡ。 (a)配列表の配列番号１に記載の塩基配列 (b)配列表の配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩
基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイ
ブリダイズする塩基配列 〔８〕 下記(c)または(d)のアミノ酸配列を有し５置換
ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質をコー
ドするＤＮＡ。 (c)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列 (d)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において
１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加
または逆位を含むアミノ酸配列
〔９〕 上記〔７〕または〔８〕のいずれかに記載のＤ
ＮＡとベクターＤＮＡとが接続されて得られる組み換え
ＤＮＡ。 〔１０〕 前記ベクターＤＮＡは、ｐＵＣ系プラスミ
ド、ｐＢＲ３２２系プラスミドまたはその誘導体である
ことを特徴とする上記
ＮＡとベクターＤＮＡとが接続されて得られる組み換え
ＤＮＡ。 〔１０〕 前記ベクターＤＮＡは、ｐＵＣ系プラスミ
ド、ｐＢＲ３２２系プラスミドまたはその誘導体である
ことを特徴とする上記
〔９〕に記載の組み換えＤＮＡ。
〔１１〕 上記
〔９〕または〔１０〕に記載の組み換え
ＤＮＡによって形質転換された細胞。 〔１２〕 前記細胞は、エシェリヒア コリであること
を特徴とする上記〔１１〕に記載の細胞。 〔１３〕 上記〔１１〕または〔１２〕に記載の細胞を
培地中で培養し、培地中および／または細胞中に５置換
ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質を蓄積
させることを特徴とする５置換ヒダントインラセマーゼ
活性を有するタンパク質の製造方法。
ＤＮＡによって形質転換された細胞。 〔１２〕 前記細胞は、エシェリヒア コリであること
を特徴とする上記〔１１〕に記載の細胞。 〔１３〕 上記〔１１〕または〔１２〕に記載の細胞を
培地中で培養し、培地中および／または細胞中に５置換
ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質を蓄積
させることを特徴とする５置換ヒダントインラセマーゼ
活性を有するタンパク質の製造方法。
【００１１】
【発明の実施の形態】以下、本発明について、
［Ｉ］ ＨＲａｓｅ
［ＩＩ］ ＨＲａｓｅを用いた光学活性アミノ酸の製造
方法 の順に添付の図面を参照して詳細に説明する。なお、以
下本明細書においては、特に断る場合を除き、「ＨＲａ
ｓｅ」には５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有する
タンパク質を含めるものとする。
方法 の順に添付の図面を参照して詳細に説明する。なお、以
下本明細書においては、特に断る場合を除き、「ＨＲａ
ｓｅ」には５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有する
タンパク質を含めるものとする。
【００１２】［Ｉ］ ＨＲａｓｅ
５置換ヒダントイン化合物から、酵素を用いてアミノ酸
を製造するに際しては、上記反応式(I)に示したように
２種の酵素が用いられる。したがって、ＨＲａｓｅを探
索する場合、原料となる所定の光学活性５置換ヒダント
イン化合物から目的の光学活性を有するアミノ酸が得ら
れないからといってＨＲａｓｅ活性がないとは限らな
い。たとえＨＲａｓｅ活性が存在していたとしても、Ｈ
ＨａｓｅやＣＨａｓｅの活性不良による場合も考えられ
るからである。また、原料となる５置換ヒダントイン化
合物自体が自発的にラセミ化するような条件下で試験を
するのもＨＲａｓｅ活性の有無の検索としては不適当で
ある。
を製造するに際しては、上記反応式(I)に示したように
２種の酵素が用いられる。したがって、ＨＲａｓｅを探
索する場合、原料となる所定の光学活性５置換ヒダント
イン化合物から目的の光学活性を有するアミノ酸が得ら
れないからといってＨＲａｓｅ活性がないとは限らな
い。たとえＨＲａｓｅ活性が存在していたとしても、Ｈ
ＨａｓｅやＣＨａｓｅの活性不良による場合も考えられ
るからである。また、原料となる５置換ヒダントイン化
合物自体が自発的にラセミ化するような条件下で試験を
するのもＨＲａｓｅ活性の有無の検索としては不適当で
ある。
【００１３】そこで、本発明者らは、光学活性ベンジル
ヒダントインは酵素反応が行われるような中性条件下で
は、自発的ラセミ化がほとんど起こらないことを確認す
ると共に、ＨＨａｓｅ、ＣＨａｓｅの活性が十分にある
実験系を確立した上で幅広くＨＲａｓｅ活性を有する菌
体を探索したところ、Ｄ−アミノ酸生産菌であるパスツ
レラ ニューモトロピカ（Pasteurella pneumotropic
a）ＡＪ１１２２１株に新規ＨＲａｓｅが存在すると考
えるに至った。この考えに基づき、本発明者らは、新規
ＨＲａｓｅの存在を明らかにすべく、当該菌株の培養菌
体からＨＲａｓｅを精製単離するとともに、新規ＨＲａ
ｓｅであることを見いだした。
ヒダントインは酵素反応が行われるような中性条件下で
は、自発的ラセミ化がほとんど起こらないことを確認す
ると共に、ＨＨａｓｅ、ＣＨａｓｅの活性が十分にある
実験系を確立した上で幅広くＨＲａｓｅ活性を有する菌
体を探索したところ、Ｄ−アミノ酸生産菌であるパスツ
レラ ニューモトロピカ（Pasteurella pneumotropic
a）ＡＪ１１２２１株に新規ＨＲａｓｅが存在すると考
えるに至った。この考えに基づき、本発明者らは、新規
ＨＲａｓｅの存在を明らかにすべく、当該菌株の培養菌
体からＨＲａｓｅを精製単離するとともに、新規ＨＲａ
ｓｅであることを見いだした。
【００１４】また、本発明者らは、パスツレラ ニュー
モトロピカ（Pasteurella pneumotropica）ＡＪ１１２
２１株由来のＨＲａｓｅを精製し、ＨＲａｓｅのアミノ
酸配列を決定した。さらに、ＨＲａｓｅのアミノ酸配列
から演繹した３０塩基対程度のＤＮＡ分子を合成し、こ
れをプローブとして利用しパスツレラ属細菌由来ＨＲａ
ｓｅをコードするＤＮＡ全長を、パスツレラ属細菌染色
体遺伝子ライブラリーから単離することに成功した。
モトロピカ（Pasteurella pneumotropica）ＡＪ１１２
２１株由来のＨＲａｓｅを精製し、ＨＲａｓｅのアミノ
酸配列を決定した。さらに、ＨＲａｓｅのアミノ酸配列
から演繹した３０塩基対程度のＤＮＡ分子を合成し、こ
れをプローブとして利用しパスツレラ属細菌由来ＨＲａ
ｓｅをコードするＤＮＡ全長を、パスツレラ属細菌染色
体遺伝子ライブラリーから単離することに成功した。
【００１５】すなわち、本発明のＨＲａｓｅをコードす
る代表的なＤＮＡは、特公昭５６−０１５８７８号に記
載のパスツレラ ニューモトロピカ(Pasteurella pneum
otropica)ＡＪ１１２２１（ＦＥＲＭ−Ｐ４３４８）の
染色体ＤＮＡより単離、取得されたものである。なお、
パスツレラ ニューモトロピカ(Pasteurella pneumotro
pica)ＡＪ１１２２１（ＦＥＲＭ−Ｐ４３４８）はモラ
キセラ ノンリクエファシエンス(Moraxella nonliquef
aciens)として通商産業省工業技術院生命工学工業技術
研究所に寄託された微生物であるが、再同定の結果、パ
スツレラ ニューモトロピカ(Pasteurella pneumotropi
ca)に分類されることが判明した。現在では、パスツレ
ラ ニューモトロピカ(Pasteurella pneumotropica)Ａ
Ｊ１１２２１（ＦＥＲＭ−Ｐ４３４８）として独立行政
法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託さ
れている。
る代表的なＤＮＡは、特公昭５６−０１５８７８号に記
載のパスツレラ ニューモトロピカ(Pasteurella pneum
otropica)ＡＪ１１２２１（ＦＥＲＭ−Ｐ４３４８）の
染色体ＤＮＡより単離、取得されたものである。なお、
パスツレラ ニューモトロピカ(Pasteurella pneumotro
pica)ＡＪ１１２２１（ＦＥＲＭ−Ｐ４３４８）はモラ
キセラ ノンリクエファシエンス(Moraxella nonliquef
aciens)として通商産業省工業技術院生命工学工業技術
研究所に寄託された微生物であるが、再同定の結果、パ
スツレラ ニューモトロピカ(Pasteurella pneumotropi
ca)に分類されることが判明した。現在では、パスツレ
ラ ニューモトロピカ(Pasteurella pneumotropica)Ａ
Ｊ１１２２１（ＦＥＲＭ−Ｐ４３４８）として独立行政
法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託さ
れている。
【００１６】これらの微生物について、細菌の分類学書
であるバージェーズ マニュアルオブ デターミネイテ
ィブ バクテリオロジー 第１巻（第９版 1994年、ウ
イリアム アンド ウイルキンス社出版）に照らしあわ
せて生理性状試験を実施した試験結果を以下に示す。
であるバージェーズ マニュアルオブ デターミネイテ
ィブ バクテリオロジー 第１巻（第９版 1994年、ウ
イリアム アンド ウイルキンス社出版）に照らしあわ
せて生理性状試験を実施した試験結果を以下に示す。
【００１７】パスツレラ ニューモトロピカ(Pasteurel
la pneumotropica)ＡＪ１１２２１の再同定結果 グラム染色 陰性 細胞形態 球状桿菌 運動性 なし 硝酸塩還元 ＋ インドール産生 − ブドウ糖酸性化 − アルギニンジヒドラーゼ − ウレアーゼ ＋ エスクリン加水分解 − ゼラチン加水分解 − β−ガラクトシダーゼ ＋ カタラーゼ ＋ オキシダーゼ ＋ 基質資化能 ブドウ糖 − Ｌ−アラビノース − Ｄ−マンノース − Ｄ−マンニトール − Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン − マルトース ＋ グルコン酸カリウム − ｎ−カプリン酸 − アジピン酸 − ｄｌ−リンゴ酸 − クエン酸ナトリウム − 酢酸フェニル −
la pneumotropica)ＡＪ１１２２１の再同定結果 グラム染色 陰性 細胞形態 球状桿菌 運動性 なし 硝酸塩還元 ＋ インドール産生 − ブドウ糖酸性化 − アルギニンジヒドラーゼ − ウレアーゼ ＋ エスクリン加水分解 − ゼラチン加水分解 − β−ガラクトシダーゼ ＋ カタラーゼ ＋ オキシダーゼ ＋ 基質資化能 ブドウ糖 − Ｌ−アラビノース − Ｄ−マンノース − Ｄ−マンニトール − Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン − マルトース ＋ グルコン酸カリウム − ｎ−カプリン酸 − アジピン酸 − ｄｌ−リンゴ酸 − クエン酸ナトリウム − 酢酸フェニル −
【００１８】以上の菌学的性質より、ＡＪ１１２２１菌
をパスツレラ ニューモトロピカ(Pasteurella pneumot
ropica)と同定した。
をパスツレラ ニューモトロピカ(Pasteurella pneumot
ropica)と同定した。
【００１９】図１に示すように、上記菌株で見出された
本発明のＨＲａｓｅは、ＣＨａｓｅ遺伝子とともにオペ
ロンを形成していると考えられる。図１中、はＳａｕ
３ＡＩ／Ｓａｕ３Ａ Ｉ断片であり、はＳａｌ Ｉ／Ｓ
ａｌ Ｉ断片である。
本発明のＨＲａｓｅは、ＣＨａｓｅ遺伝子とともにオペ
ロンを形成していると考えられる。図１中、はＳａｕ
３ＡＩ／Ｓａｕ３Ａ Ｉ断片であり、はＳａｌ Ｉ／Ｓ
ａｌ Ｉ断片である。
【００２０】なお、添付した本発明の配列表において、
上記方法によって特定された本発明のＨＲａｓｅをコー
ドするＤＮＡを配列番号１に示し、ＨＨａｓｅをコード
するＤＮＡを配列番号１１に示し、ＣＨａｓｅをコード
するＤＮＡを配列番号１３に示す。
上記方法によって特定された本発明のＨＲａｓｅをコー
ドするＤＮＡを配列番号１に示し、ＨＨａｓｅをコード
するＤＮＡを配列番号１１に示し、ＣＨａｓｅをコード
するＤＮＡを配列番号１３に示す。
【００２１】これらのＤＮＡは、パスツレラ ニューモ
トロピカ（Pasteurella pneumotropica）ＡＪ１１２２
１株の染色体ＤＮＡから単離されたものであり、いずれ
もＤ−アミノ酸の製造に用いることができるタンパク質
をコードするものである。
トロピカ（Pasteurella pneumotropica）ＡＪ１１２２
１株の染色体ＤＮＡから単離されたものであり、いずれ
もＤ−アミノ酸の製造に用いることができるタンパク質
をコードするものである。
【００２２】また、配列表の配列番号２に、配列表の配
列番号１の塩基配列がコードするＨＲａｓｅのアミノ酸
配列を示し、配列表の配列番号１２に、配列表の配列番
号１１の塩基配列がコードするＨＨａｓｅのアミノ酸配
列を示し、配列表の配列番号１４に、配列表の配列番号
１３の塩基配列がコードするＣＨａｓｅのアミノ酸配列
を示す。
列番号１の塩基配列がコードするＨＲａｓｅのアミノ酸
配列を示し、配列表の配列番号１２に、配列表の配列番
号１１の塩基配列がコードするＨＨａｓｅのアミノ酸配
列を示し、配列表の配列番号１４に、配列表の配列番号
１３の塩基配列がコードするＣＨａｓｅのアミノ酸配列
を示す。
【００２３】配列表の配列番号２に記載のＨＲａｓｅ
は、ＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅと共に用いられて、下
記反応式（II）に例示するように、５−ベンジルヒダン
トインに代表される５置換ヒダントイン化合物から、Ｄ
−フェニルアラニンに代表される光学活性アミノ酸を生
成する反応を触媒する。
は、ＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅと共に用いられて、下
記反応式（II）に例示するように、５−ベンジルヒダン
トインに代表される５置換ヒダントイン化合物から、Ｄ
−フェニルアラニンに代表される光学活性アミノ酸を生
成する反応を触媒する。
【００２４】
【化２】
【００２５】次に、本発明の新規ＨＲａｓｅについて、
（1）ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡ、（2）ＨＲａｓｅ
の活性測定等、（3）ＨＲａｓｅの製造方法の順に詳細
に説明する。
（1）ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡ、（2）ＨＲａｓｅ
の活性測定等、（3）ＨＲａｓｅの製造方法の順に詳細
に説明する。
【００２６】(1)ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡ
配列表の配列番号１の塩基配列を有する本発明のＨＲａ
ｓｅ遺伝子は、前述したようにパスツレラ ニューモト
ロピカ（Pasteurella pneumotropica）ＡＪ１１２２１
株の染色体ＤＮＡから単離されたものである。配列表の
配列番号１の塩基配列は、本発明をなす以前に本発明者
らが既に見いだしていた、マイクロバクテリウム リク
エファシエンス(Microbacterium liquefaciens)ＡＪ３
９１２株由来のＨＲａｓｅ（特願２００１−２７８７３
９号記載）と、アミノ酸配列において４３％の相同性を
示す。
ｓｅ遺伝子は、前述したようにパスツレラ ニューモト
ロピカ（Pasteurella pneumotropica）ＡＪ１１２２１
株の染色体ＤＮＡから単離されたものである。配列表の
配列番号１の塩基配列は、本発明をなす以前に本発明者
らが既に見いだしていた、マイクロバクテリウム リク
エファシエンス(Microbacterium liquefaciens)ＡＪ３
９１２株由来のＨＲａｓｅ（特願２００１−２７８７３
９号記載）と、アミノ酸配列において４３％の相同性を
示す。
【００２７】なお、マイクロバクテリウム リクエファ
シエンス（Microbacterium liquefaciens ）ＡＪ３９１
２は、当初フラボバクテリウム エスピー.（Flavobact
erium sp.）ＡＪ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３）と
して１９７５年６月２７日に通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所に寄託されたが、再同定の結果オー
レオバクテリウム リクエファシエンス（Aureobacteriu
m liquefaciens ）に分類されることが判明した。さら
に現在では、種名変更により、オーレオバクテリウム
リクエファシエンス（Aureobacterium liquefaciens ）
はマイクロバクテリウム リクエファシエンス（Microb
acterium liquefaciens ）に分類され、マイクロバクテ
リウム リクエファシエンス（Microbacterium liquefa
ciens ）ＡＪ３９１２（国内寄託番号ＦＥＲＭ−Ｐ３１
３３、国際寄託番号ＦＥＲＭ−ＢＰ７６４３）として独
立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに
寄託されている。
シエンス（Microbacterium liquefaciens ）ＡＪ３９１
２は、当初フラボバクテリウム エスピー.（Flavobact
erium sp.）ＡＪ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３）と
して１９７５年６月２７日に通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所に寄託されたが、再同定の結果オー
レオバクテリウム リクエファシエンス（Aureobacteriu
m liquefaciens ）に分類されることが判明した。さら
に現在では、種名変更により、オーレオバクテリウム
リクエファシエンス（Aureobacterium liquefaciens ）
はマイクロバクテリウム リクエファシエンス（Microb
acterium liquefaciens ）に分類され、マイクロバクテ
リウム リクエファシエンス（Microbacterium liquefa
ciens ）ＡＪ３９１２（国内寄託番号ＦＥＲＭ−Ｐ３１
３３、国際寄託番号ＦＥＲＭ−ＢＰ７６４３）として独
立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに
寄託されている。
【００２８】次にパスツレラ属細菌からＨＲａｓｅをコ
ードするＤＮＡを取得する方法について説明する。
ードするＤＮＡを取得する方法について説明する。
【００２９】はじめに、精製されたＨＲａｓｅのアミノ
酸配列を決定する。エドマン法（Edman,P., Acta Chem.
Scand. 4, 227 (1950)）を用いてアミノ酸配列を決定
することができる。またApplied Biosystems社製のシー
クエンサーを用いてアミノ酸配列を決定することができ
る。本発明のパスツレラ属細菌由来ＨＲａｓｅについ
て、Ｎ末端から３０残基のアミノ酸配列を決定し、明ら
かとなったアミノ酸配列に基づいて、これをコードする
ＤＮＡの塩基配列を演繹できる。ＤＮＡの塩基配列を演
繹するには、ユニバーサルコドンを採用する。
酸配列を決定する。エドマン法（Edman,P., Acta Chem.
Scand. 4, 227 (1950)）を用いてアミノ酸配列を決定
することができる。またApplied Biosystems社製のシー
クエンサーを用いてアミノ酸配列を決定することができ
る。本発明のパスツレラ属細菌由来ＨＲａｓｅについ
て、Ｎ末端から３０残基のアミノ酸配列を決定し、明ら
かとなったアミノ酸配列に基づいて、これをコードする
ＤＮＡの塩基配列を演繹できる。ＤＮＡの塩基配列を演
繹するには、ユニバーサルコドンを採用する。
【００３０】演繹された塩基配列に基づいて、３０塩基
対程度のＤＮＡ分子を合成する。該ＤＮＡ分子を合成す
る方法はTetrahedron Letters, 22, 1859 (1981)に開示
されている。また、Applied Biosystems社製のシンセサ
イザーを用いて該ＤＮＡ分子を合成できる。該ＤＮＡ分
子は、パスツレラ属細菌由来ＨＲａｓｅをコードするＤ
ＮＡ全長を、パスツレラ属細菌染色体遺伝子ライブラリ
ーから単離する際に、プローブとして利用できる。ある
いは、パスツレラ属細菌由来ＨＲａｓｅをコードするＤ
ＮＡをＰＣＲ法で増幅する際に、プライマーとして利用
できる。ただし、ＰＣＲ法を用いて増幅されるＤＮＡは
パスツレラ属細菌由来ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡ全
長を含んでいないので、ＰＣＲ法を用いて増幅されるＤ
ＮＡをプローブとして用いて、パスツレラ属細菌由来Ｈ
ＲａｓｅをコードするＤＮＡ全長をパスツレラ属細菌染
色体遺伝子ライブラリーから単離する。
対程度のＤＮＡ分子を合成する。該ＤＮＡ分子を合成す
る方法はTetrahedron Letters, 22, 1859 (1981)に開示
されている。また、Applied Biosystems社製のシンセサ
イザーを用いて該ＤＮＡ分子を合成できる。該ＤＮＡ分
子は、パスツレラ属細菌由来ＨＲａｓｅをコードするＤ
ＮＡ全長を、パスツレラ属細菌染色体遺伝子ライブラリ
ーから単離する際に、プローブとして利用できる。ある
いは、パスツレラ属細菌由来ＨＲａｓｅをコードするＤ
ＮＡをＰＣＲ法で増幅する際に、プライマーとして利用
できる。ただし、ＰＣＲ法を用いて増幅されるＤＮＡは
パスツレラ属細菌由来ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡ全
長を含んでいないので、ＰＣＲ法を用いて増幅されるＤ
ＮＡをプローブとして用いて、パスツレラ属細菌由来Ｈ
ＲａｓｅをコードするＤＮＡ全長をパスツレラ属細菌染
色体遺伝子ライブラリーから単離する。
【００３１】ＰＣＲ法の操作については、White, T.J.
et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)等に記載されて
いる。染色体ＤＮＡを調製する方法、さらにＤＮＡ分子
をプローブとして用いて、遺伝子ライブラリーから目的
とするＤＮＡ分子を単離する方法については、Molecula
r Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1
989)等に記載されている。
et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)等に記載されて
いる。染色体ＤＮＡを調製する方法、さらにＤＮＡ分子
をプローブとして用いて、遺伝子ライブラリーから目的
とするＤＮＡ分子を単離する方法については、Molecula
r Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1
989)等に記載されている。
【００３２】単離されたパスツレラ属細菌由来ＨＲａｓ
ｅをコードするＤＮＡの塩基配列を決定する方法は、A
Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley &
Sons, Inc. (1985)に記載されている。また、Applied
Biosystems社製のＤＮＡシークエンサーを用いて、塩基
配列を決定することができる。パスツレラ属細菌由来Ｈ
ＲａｓｅをコードするＤＮＡを配列表配列番号１に示
す。
ｅをコードするＤＮＡの塩基配列を決定する方法は、A
Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley &
Sons, Inc. (1985)に記載されている。また、Applied
Biosystems社製のＤＮＡシークエンサーを用いて、塩基
配列を決定することができる。パスツレラ属細菌由来Ｈ
ＲａｓｅをコードするＤＮＡを配列表配列番号１に示
す。
【００３３】なお、パスツレラ属細菌由来ＨＲａｓｅを
コードするＤＮＡは、配列表配列番号１に示されるＤＮ
Ａだけではない。すなわち、パスツレラ属に属する細菌
の種および株ごとに、塩基配列の違いが観察されるはず
だからである。
コードするＤＮＡは、配列表配列番号１に示されるＤＮ
Ａだけではない。すなわち、パスツレラ属に属する細菌
の種および株ごとに、塩基配列の違いが観察されるはず
だからである。
【００３４】また、本発明のＤＮＡは単離されたＨＲａ
ｓｅをコードするＤＮＡのみではなく、当然ながら、パ
スツレラ属細菌の染色体ＤＮＡから単離されたＨＲａｓ
ｅをコードするＤＮＡに人工的に変異を加えたＤＮＡで
あっても、ＨＲａｓｅをコードする場合には、本発明の
ＤＮＡである。人工的に変異を加える方法として頻繁に
用いられるものとして、Method. in Enzymol.,154 (198
7)に記載されている部位特異的変異導入法がある。
ｓｅをコードするＤＮＡのみではなく、当然ながら、パ
スツレラ属細菌の染色体ＤＮＡから単離されたＨＲａｓ
ｅをコードするＤＮＡに人工的に変異を加えたＤＮＡで
あっても、ＨＲａｓｅをコードする場合には、本発明の
ＤＮＡである。人工的に変異を加える方法として頻繁に
用いられるものとして、Method. in Enzymol.,154 (198
7)に記載されている部位特異的変異導入法がある。
【００３５】また、配列表配列番号１に記載の塩基配列
とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配
列を有し、５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有する
タンパク質をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡであ
る。ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる
特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリ
ッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値
化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高
いＤＮＡ同士、例えば５０％以上、より好ましくは８０
％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有する
ＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い
ＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常
のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６
０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、６０
℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、さらに好ましく
は６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する
塩濃度でハイブリダイズする条件があげられる。また、
「５置換ヒダントインラセマーゼ活性」とは、５置換ヒ
ダントイン化合物をラセミ化する活性であればよい。た
だし、配列表の配列番号１に記載の塩基配列とストリン
ジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列の場合に
は、５０℃、ｐＨ８の条件下で配列表の配列番号２に記
載のアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上の
酵素活性を保持していることが望ましい。
とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配
列を有し、５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有する
タンパク質をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡであ
る。ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる
特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリ
ッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値
化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高
いＤＮＡ同士、例えば５０％以上、より好ましくは８０
％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有する
ＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い
ＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常
のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６
０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、６０
℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、さらに好ましく
は６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する
塩濃度でハイブリダイズする条件があげられる。また、
「５置換ヒダントインラセマーゼ活性」とは、５置換ヒ
ダントイン化合物をラセミ化する活性であればよい。た
だし、配列表の配列番号１に記載の塩基配列とストリン
ジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列の場合に
は、５０℃、ｐＨ８の条件下で配列表の配列番号２に記
載のアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上の
酵素活性を保持していることが望ましい。
【００３６】さらに、配列表の配列番号１に記載のＤＮ
ＡがコードするＨＲａｓｅと実質的に同一のタンパク質
をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡである。すなわ
ち、（a）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を
コードするＤＮＡ、（b）配列表の配列番号２に記載の
アミノ酸配列において1または数個のアミノ酸残基の置
換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列を
有し、５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタン
パク質をコードするＤＮＡ、も本発明のＤＮＡに含まれ
る。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質
の立体構造や、５置換ヒダントインラセマーゼ活性を大
きく損なわない範囲のものであり、具体的には、２〜５
０個、好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２〜１
０個である。また、「５置換ヒダントインラセマーゼ活
性」とは、前述のとおり、５置換ヒダントイン化合物を
ラセミ化する活性を意味する。ただし、（b）配列表の
配列番号２に記載のアミノ酸配列において１または数個
のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を
含むアミノ酸配列の場合には、５０℃、ｐＨ８の条件下
で配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタ
ンパク質の半分程度以上の酵素活性を保持していること
が望ましい。
ＡがコードするＨＲａｓｅと実質的に同一のタンパク質
をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡである。すなわ
ち、（a）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を
コードするＤＮＡ、（b）配列表の配列番号２に記載の
アミノ酸配列において1または数個のアミノ酸残基の置
換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列を
有し、５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタン
パク質をコードするＤＮＡ、も本発明のＤＮＡに含まれ
る。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質
の立体構造や、５置換ヒダントインラセマーゼ活性を大
きく損なわない範囲のものであり、具体的には、２〜５
０個、好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２〜１
０個である。また、「５置換ヒダントインラセマーゼ活
性」とは、前述のとおり、５置換ヒダントイン化合物を
ラセミ化する活性を意味する。ただし、（b）配列表の
配列番号２に記載のアミノ酸配列において１または数個
のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を
含むアミノ酸配列の場合には、５０℃、ｐＨ８の条件下
で配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタ
ンパク質の半分程度以上の酵素活性を保持していること
が望ましい。
【００３７】（2）ＨＲａｓｅの活性測定等
つぎに、精製されたパスツレラ属細菌由来ＨＲａｓｅの
活性測定等について説明する。
活性測定等について説明する。
【００３８】本発明のＨＲａｓｅは前述した遺伝子の単
離と解析より明らかにされるように、代表的には配列表
配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する。しかし、本
発明は、配列番号２に記載のアミノ酸配列と実質的に同
じアミノ酸配列を有し、かつ５置換ヒダントインラセマ
ーゼ活性を有するタンパク質も含むものである。より具
体的には、本発明は、配列表の配列番号２に記載のアミ
ノ酸配列において1または数個のアミノ酸残基の置換、
欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列を有
し、かつ５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタ
ンパク質をも含むものである。さらに、配列表配列番号
２のアミノ酸配列およびこれと実質的に同じアミノ酸配
列を有するタンパク質であれば、複数の酵素活性を有す
る複合的なタンパク質であってもよい。
離と解析より明らかにされるように、代表的には配列表
配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する。しかし、本
発明は、配列番号２に記載のアミノ酸配列と実質的に同
じアミノ酸配列を有し、かつ５置換ヒダントインラセマ
ーゼ活性を有するタンパク質も含むものである。より具
体的には、本発明は、配列表の配列番号２に記載のアミ
ノ酸配列において1または数個のアミノ酸残基の置換、
欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列を有
し、かつ５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタ
ンパク質をも含むものである。さらに、配列表配列番号
２のアミノ酸配列およびこれと実質的に同じアミノ酸配
列を有するタンパク質であれば、複数の酵素活性を有す
る複合的なタンパク質であってもよい。
【００３９】すなわち、本発明のＨＲａｓｅは、下記
(a)または(b)のアミノ酸配列を有し、５置換ヒダントイ
ンラセマーゼ活性を有するタンパク質である。 （a）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列 （b）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
て１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列 ここで、「数個」および「５置換ヒダントインラセマー
ゼ活性」の定義は上記（1）ＨＲａｓｅをコードするＤ
ＮＡの項の説明と同義である。
(a)または(b)のアミノ酸配列を有し、５置換ヒダントイ
ンラセマーゼ活性を有するタンパク質である。 （a）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列 （b）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
て１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列 ここで、「数個」および「５置換ヒダントインラセマー
ゼ活性」の定義は上記（1）ＨＲａｓｅをコードするＤ
ＮＡの項の説明と同義である。
【００４０】本発明のＨＲａｓｅは、５置換ヒダントイ
ン化合物のラセミ化反応を触媒する。
ン化合物のラセミ化反応を触媒する。
【００４１】本発明のＨＲａｓｅのＨＲａｓｅ活性の測
定は、光学活性なＤ−、またはＬ−５置換ヒダントイン
化合物を基質とし、ラセミ化度をこれらの旋光度の変化
を測定する、または、光学分割カラムを用いた高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定することに
より行うことが可能である。
定は、光学活性なＤ−、またはＬ−５置換ヒダントイン
化合物を基質とし、ラセミ化度をこれらの旋光度の変化
を測定する、または、光学分割カラムを用いた高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定することに
より行うことが可能である。
【００４２】具体的には、１２０ ｍｇ／ｄｌ Ｌ−また
はＤ−ベンジルヒダントイン（ＢＨ）、５０ mM リン酸
−カリウム緩衝液（ＫＰＢ） (ｐＨ ８．０)、５ mM ジ
チオスレイトール（ＤＴＴ）およびＨＲａｓｅ酵素溶液
を含む反応液を３７℃で３０分間インキュベートした
後、９倍容の１．１ mM ＣｕＳＯ4、１１．１ mM Ｈ3Ｐ
Ｏ4溶液を添加することにより反応を停止させる。２
０，０００ｇ×１０分の遠心により沈澱を取り除いた
後、ＨＰＬＣにてラセミ化したＢＨ量を定量し、ラセミ
化活性を見積もる。なお、酵素活性の単位として、この
条件にて１分に１μｍｏｌのＢＨをラセミ化する酵素活
性をもって１Ｕと定義する。
はＤ−ベンジルヒダントイン（ＢＨ）、５０ mM リン酸
−カリウム緩衝液（ＫＰＢ） (ｐＨ ８．０)、５ mM ジ
チオスレイトール（ＤＴＴ）およびＨＲａｓｅ酵素溶液
を含む反応液を３７℃で３０分間インキュベートした
後、９倍容の１．１ mM ＣｕＳＯ4、１１．１ mM Ｈ3Ｐ
Ｏ4溶液を添加することにより反応を停止させる。２
０，０００ｇ×１０分の遠心により沈澱を取り除いた
後、ＨＰＬＣにてラセミ化したＢＨ量を定量し、ラセミ
化活性を見積もる。なお、酵素活性の単位として、この
条件にて１分に１μｍｏｌのＢＨをラセミ化する酵素活
性をもって１Ｕと定義する。
【００４３】ＨＰＬＣを用いた分析光学活性ＢＨの定量
分析はダイセル化学ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＷＨ ０．４６
ｃｍφ×２５ｃｍを用いて行うことができる。分析条件
の具体例は以下の通り。 移動相：５％ (ｖ／ｖ) methanol, １ mM ＣｕＳＯ4カラム 温度：５０℃ 流速：１．５ ml/分 検出：ＵＶ210 この条件において、Ｄ−ＢＨ (リテンションタイム４．
２分)、Ｌ−ＢＨ （同５．３ 分）に溶出する。
分析はダイセル化学ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＷＨ ０．４６
ｃｍφ×２５ｃｍを用いて行うことができる。分析条件
の具体例は以下の通り。 移動相：５％ (ｖ／ｖ) methanol, １ mM ＣｕＳＯ4カラム 温度：５０℃ 流速：１．５ ml/分 検出：ＵＶ210 この条件において、Ｄ−ＢＨ (リテンションタイム４．
２分)、Ｌ−ＢＨ （同５．３ 分）に溶出する。
【００４４】（3）ＨＲａｓｅの製造方法
次に本発明のＨＲａｓｅの製造方法について説明する。
本発明のＨＲａｓｅの製造方法としては、(3-1) 微生物
培養によりＨＲａｓｅを生成蓄積させる方法と、(3-2)
組み換えＤＮＡ技術によりＨＲａｓｅを生成する形質転
換体を作成し、当該形質転換体を培養することにより当
該タンパク質を生成蓄積させる方法の２つがある。
本発明のＨＲａｓｅの製造方法としては、(3-1) 微生物
培養によりＨＲａｓｅを生成蓄積させる方法と、(3-2)
組み換えＤＮＡ技術によりＨＲａｓｅを生成する形質転
換体を作成し、当該形質転換体を培養することにより当
該タンパク質を生成蓄積させる方法の２つがある。
【００４５】(3-1) 微生物培養により生成蓄積する方法
微生物培養により生成蓄積する方法において、ＨＲａｓ
ｅの取得源となる微生物としてはパスツレラ(Pasteurel
la)属に属する微生物があげられる。好適なものとして
は、パスツレラ ニューモトロピカ（Pasteurella pneu
motropica）ＡＪ１１２２１株などがあげられる。
ｅの取得源となる微生物としてはパスツレラ(Pasteurel
la)属に属する微生物があげられる。好適なものとして
は、パスツレラ ニューモトロピカ（Pasteurella pneu
motropica）ＡＪ１１２２１株などがあげられる。
【００４６】パスツレラ属に属する微生物の培養形態は
液体培養、固体培養いずれも可能であるが、工業的に有
利な方法は、深部通気撹拌培養法である。栄養培地の栄
養源としては、微生物培養に通常用いられる炭素源、窒
素源、無機塩およびその他の微量栄養源を使用できる。
使用菌株が利用できる栄養源であればすべてを使用でき
る。
液体培養、固体培養いずれも可能であるが、工業的に有
利な方法は、深部通気撹拌培養法である。栄養培地の栄
養源としては、微生物培養に通常用いられる炭素源、窒
素源、無機塩およびその他の微量栄養源を使用できる。
使用菌株が利用できる栄養源であればすべてを使用でき
る。
【００４７】通気条件としては、好気条件を採用する。
培養温度としては、菌が発育し、ＨＲａｓｅが生産され
る範囲であればよい。従って、厳密な条件は無いが、通
常１０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃である。培養
時間は、その他の培養条件に応じて変化する。例えば、
ＨＲａｓｅが最も生産される時間まで培養すればよく、
通常５時間〜７日間、好ましくは１０時間〜３日間程度
である。
培養温度としては、菌が発育し、ＨＲａｓｅが生産され
る範囲であればよい。従って、厳密な条件は無いが、通
常１０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃である。培養
時間は、その他の培養条件に応じて変化する。例えば、
ＨＲａｓｅが最も生産される時間まで培養すればよく、
通常５時間〜７日間、好ましくは１０時間〜３日間程度
である。
【００４８】培養後菌体を遠心分離（たとえば、１０，
０００×ｇ、１０分）により集菌する。当該酵素は菌体
中に存在するので、この菌体を破砕、または溶菌させる
ことにより、酵素の可溶化を行う。菌体破砕には、超音
波破砕、フレンチプレス破砕、ガラスビーズ破砕等の方
法を用いることができ、また溶菌させる場合には、卵白
リゾチームや、ペプチダーゼ処理またはこれらを適宜組
み合わせた方法が用いられる。
０００×ｇ、１０分）により集菌する。当該酵素は菌体
中に存在するので、この菌体を破砕、または溶菌させる
ことにより、酵素の可溶化を行う。菌体破砕には、超音
波破砕、フレンチプレス破砕、ガラスビーズ破砕等の方
法を用いることができ、また溶菌させる場合には、卵白
リゾチームや、ペプチダーゼ処理またはこれらを適宜組
み合わせた方法が用いられる。
【００４９】パスツレラ属細菌由来ＨＲａｓｅを精製す
る場合、酵素可溶化液を出発材料として精製することに
なるが、未破砕あるいは未溶菌残査が存在するようであ
れば、可溶化液を再度遠心分離操作に供し、沈殿する残
査を除いた方が、精製に有利である。
る場合、酵素可溶化液を出発材料として精製することに
なるが、未破砕あるいは未溶菌残査が存在するようであ
れば、可溶化液を再度遠心分離操作に供し、沈殿する残
査を除いた方が、精製に有利である。
【００５０】酵素の精製には、通常酵素の精製を行うた
めに用いられる全ての常法、例えば硫安塩析法、ゲル濾
過法、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水クロマト
グラフィー法等を採用することができる。その結果、よ
り比活性が高いＨＲａｓｅ含有画分を得ることができ
る。
めに用いられる全ての常法、例えば硫安塩析法、ゲル濾
過法、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水クロマト
グラフィー法等を採用することができる。その結果、よ
り比活性が高いＨＲａｓｅ含有画分を得ることができ
る。
【００５１】(3-2)組み換えＤＮＡ技術による製法
次に、組み換えＤＮＡ技術によってＨＲａｓｅを製造す
る方法について説明する。組み換えＤＮＡ技術を利用し
て酵素、生理活性物質等の有用タンパク質を製造する例
は数多く知られており、組み換えＤＮＡ技術を用いるこ
とで、天然に微量に存在する有用タンパク質を大量生産
できる。
る方法について説明する。組み換えＤＮＡ技術を利用し
て酵素、生理活性物質等の有用タンパク質を製造する例
は数多く知られており、組み換えＤＮＡ技術を用いるこ
とで、天然に微量に存在する有用タンパク質を大量生産
できる。
【００５２】図２は、本発明のＨＲａｓｅの製造工程の
フローチャートである。先ず、本発明のＨＲａｓｅをコ
ードするＤＮＡを調製する(ステップＳ１)。次に、調製
したＤＮＡをベクターＤＮＡと接続して組み換えＤＮＡ
を作製し(ステップＳ２)、該組み換えＤＮＡによって細
胞を形質転換して形質転換体を作製する(ステップＳ
３)。続いて、該形質転換体を培地中で培養し、培地中
および／または細胞中にＨＲａｓｅを生成蓄積させる
(ステップＳ４)。その後、ステップＳ５に進み、該酵素
を回収・精製することによって精製ＨＲａｓｅを製造す
る。
フローチャートである。先ず、本発明のＨＲａｓｅをコ
ードするＤＮＡを調製する(ステップＳ１)。次に、調製
したＤＮＡをベクターＤＮＡと接続して組み換えＤＮＡ
を作製し(ステップＳ２)、該組み換えＤＮＡによって細
胞を形質転換して形質転換体を作製する(ステップＳ
３)。続いて、該形質転換体を培地中で培養し、培地中
および／または細胞中にＨＲａｓｅを生成蓄積させる
(ステップＳ４)。その後、ステップＳ５に進み、該酵素
を回収・精製することによって精製ＨＲａｓｅを製造す
る。
【００５３】また、ステップＳ５で生産した精製ＨＲａ
ｓｅまたはステップＳ４のＨＲａｓｅが蓄積された培地
をアミノ酸の合成に用いることで、目的とする光学活性
アミノ酸を大量に製造することができる(ステップＳ
６)。
ｓｅまたはステップＳ４のＨＲａｓｅが蓄積された培地
をアミノ酸の合成に用いることで、目的とする光学活性
アミノ酸を大量に製造することができる(ステップＳ
６)。
【００５４】なお、ベクターＤＮＡと接続されるＤＮＡ
は、本発明のＨＲａｓｅが発現可能であればよい。
は、本発明のＨＲａｓｅが発現可能であればよい。
【００５５】ここで、ベクターＤＮＡに接続されるＨＲ
ａｓｅ遺伝子としては、上述の (a)配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮ
Ａ、(b)配列表の配列番号１に記載の塩基配列と相補的
な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件で
ハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡ、(c)配列
表の配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａ、(d)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列にお
いて１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿
入、付加または逆位を含むアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡ、などを使用できる。
ａｓｅ遺伝子としては、上述の (a)配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮ
Ａ、(b)配列表の配列番号１に記載の塩基配列と相補的
な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件で
ハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡ、(c)配列
表の配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａ、(d)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列にお
いて１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿
入、付加または逆位を含むアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡ、などを使用できる。
【００５６】タンパク質を組み換えＤＮＡ技術を用いて
大量生産する場合、該タンパク質を生産する形質転換体
内で該タンパク質が会合し、タンパク質の封入体（incl
usion body）を形成させることが好ましい。この発現生
産方法の利点は、目的のタンパク質を菌体内に存在する
プロテアーゼによる消化から保護する点および目的のタ
ンパク質を菌体破砕に続く遠心分離操作によって簡単に
精製できる点等である。
大量生産する場合、該タンパク質を生産する形質転換体
内で該タンパク質が会合し、タンパク質の封入体（incl
usion body）を形成させることが好ましい。この発現生
産方法の利点は、目的のタンパク質を菌体内に存在する
プロテアーゼによる消化から保護する点および目的のタ
ンパク質を菌体破砕に続く遠心分離操作によって簡単に
精製できる点等である。
【００５７】このようにして得られるタンパク質封入体
は、タンパク質変性剤により可溶化され、主にその変性
剤を除去することによる活性再生操作を経た後、正しく
折り畳まれた生理的に活性なタンパク質に変換される。
例えば、ヒトインターロイキン−２の活性再生（特開昭
６１−２５７９３１号公報）等多くの例がある。
は、タンパク質変性剤により可溶化され、主にその変性
剤を除去することによる活性再生操作を経た後、正しく
折り畳まれた生理的に活性なタンパク質に変換される。
例えば、ヒトインターロイキン−２の活性再生（特開昭
６１−２５７９３１号公報）等多くの例がある。
【００５８】タンパク質封入体から活性型タンパク質を
得るためには、可溶化・活性再生等の一連の操作が必要
であり、直接活性型タンパク質を生産する場合よりも操
作が複雑になる。しかし、菌体の生育に影響を及ぼすよ
うなタンパク質を菌体内で大量に生産させる場合は、不
活性なタンパク質封入体として菌体内に蓄積させること
により、その影響を抑えることができる。
得るためには、可溶化・活性再生等の一連の操作が必要
であり、直接活性型タンパク質を生産する場合よりも操
作が複雑になる。しかし、菌体の生育に影響を及ぼすよ
うなタンパク質を菌体内で大量に生産させる場合は、不
活性なタンパク質封入体として菌体内に蓄積させること
により、その影響を抑えることができる。
【００５９】目的タンパク質を封入体として大量生産さ
せる方法として、強力なプロモータの制御下、目的のタ
ンパク質を単独で発現させる方法の他、大量発現するこ
とが知られているタンパク質との融合タンパク質として
発現させる方法がある。
せる方法として、強力なプロモータの制御下、目的のタ
ンパク質を単独で発現させる方法の他、大量発現するこ
とが知られているタンパク質との融合タンパク質として
発現させる方法がある。
【００６０】さらに、融合タンパク質として発現させた
後に、目的のタンパク質を切り出すため、制限プロテア
ーゼの認識配列を適当な位置に配しておくことも有効で
ある。
後に、目的のタンパク質を切り出すため、制限プロテア
ーゼの認識配列を適当な位置に配しておくことも有効で
ある。
【００６１】タンパク質を組み換えＤＮＡ技術を用いて
大量生産する場合、形質転換される宿主細胞としては、
細菌細胞、放線菌細胞、酵母細胞、カビ細胞、植物細
胞、動物細胞等を用いることができるが、一般に大腸
菌、好ましくはエシェリヒア コリが用いられる。大腸
菌を用いてタンパク質を大量生産する技術について数多
くの知見があるためである。以下、形質転換された大腸
菌を用いてＨＲａｓｅを製造する方法を説明する。
大量生産する場合、形質転換される宿主細胞としては、
細菌細胞、放線菌細胞、酵母細胞、カビ細胞、植物細
胞、動物細胞等を用いることができるが、一般に大腸
菌、好ましくはエシェリヒア コリが用いられる。大腸
菌を用いてタンパク質を大量生産する技術について数多
くの知見があるためである。以下、形質転換された大腸
菌を用いてＨＲａｓｅを製造する方法を説明する。
【００６２】ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡを発現させ
るプロモータとしては、通常大腸菌における異種タンパ
ク質生産に用いられるプロモータを使用することがで
き、例えば、Ｔ７プロモータ、ｔｒｐプロモータ、ｌａ
ｃプロモータ、ｔａｃプロモータ、ＰＬプロモータ等の
強力なプロモータが挙げられる。
るプロモータとしては、通常大腸菌における異種タンパ
ク質生産に用いられるプロモータを使用することがで
き、例えば、Ｔ７プロモータ、ｔｒｐプロモータ、ｌａ
ｃプロモータ、ｔａｃプロモータ、ＰＬプロモータ等の
強力なプロモータが挙げられる。
【００６３】ＨＲａｓｅを融合タンパク質封入体として
生産させるためには、ＨＲａｓｅ遺伝子の上流あるいは
下流に、他のタンパク質、好ましくは親水性であるペプ
チドをコードする遺伝子を連結して、融合タンパク質遺
伝子とする。このような他のタンパク質をコードする遺
伝子としては、融合タンパク質の蓄積量を増加させ、変
性・再生工程後に融合タンパク質の溶解性を高めるもの
であればよく、例えば、Ｔ７ｇｅｎｅ １０、β−ガラ
クトシダーゼ遺伝子、デヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、イ
ンターフェロンγ遺伝子、インターロイキン−２遺伝
子、プロキモシン遺伝子等が候補として挙げられる。
生産させるためには、ＨＲａｓｅ遺伝子の上流あるいは
下流に、他のタンパク質、好ましくは親水性であるペプ
チドをコードする遺伝子を連結して、融合タンパク質遺
伝子とする。このような他のタンパク質をコードする遺
伝子としては、融合タンパク質の蓄積量を増加させ、変
性・再生工程後に融合タンパク質の溶解性を高めるもの
であればよく、例えば、Ｔ７ｇｅｎｅ １０、β−ガラ
クトシダーゼ遺伝子、デヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、イ
ンターフェロンγ遺伝子、インターロイキン−２遺伝
子、プロキモシン遺伝子等が候補として挙げられる。
【００６４】これらの遺伝子とＨＲａｓｅをコードする
遺伝子とを連結する際には、コドンの読み取りフレーム
が一致するようにする。適当な制限酵素部位で連結する
か、あるいは適当な配列の合成ＤＮＡを利用すればよ
い。
遺伝子とを連結する際には、コドンの読み取りフレーム
が一致するようにする。適当な制限酵素部位で連結する
か、あるいは適当な配列の合成ＤＮＡを利用すればよ
い。
【００６５】また、生産量を増大させるためには、融合
タンパク質遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネ
ーターを連結することが好ましい。このターミネータと
しては、Ｔ７ターミネータ、ｆｄファージターミネー
タ、Ｔ４ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子の
ターミネータ、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネータ等
が挙げられる。
タンパク質遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネ
ーターを連結することが好ましい。このターミネータと
しては、Ｔ７ターミネータ、ｆｄファージターミネー
タ、Ｔ４ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子の
ターミネータ、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネータ等
が挙げられる。
【００６６】ＨＲａｓｅまたはＨＲａｓｅと他のタンパ
ク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を大腸菌に
導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピ
ー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を
有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢ
Ｒ３２２系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられ
る。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿
入、付加または逆位などによってプラスミドに改変を施
したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異
剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異な
どによる改変をも含む。
ク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を大腸菌に
導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピ
ー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を
有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢ
Ｒ３２２系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられ
る。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿
入、付加または逆位などによってプラスミドに改変を施
したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異
剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異な
どによる改変をも含む。
【００６７】また、形質転換体を選別するために、該ベ
クターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有する
ことが好ましい。このようなプラスミドとして、強力な
プロモーターを持つ発現ベクターが市販されている（ｐ
ＵＣ系（宝酒造（株）製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテ
ック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック製）ほ
か）。
クターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有する
ことが好ましい。このようなプラスミドとして、強力な
プロモーターを持つ発現ベクターが市販されている（ｐ
ＵＣ系（宝酒造（株）製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテ
ック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック製）ほ
か）。
【００６８】プロモータ、ＨＲａｓｅまたはＨＲａｓｅ
と他のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝
子、ターミネータの順に連結したＤＮＡ断片と、ベクタ
ーＤＮＡとを連結して組み換えＤＮＡを得る。
と他のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝
子、ターミネータの順に連結したＤＮＡ断片と、ベクタ
ーＤＮＡとを連結して組み換えＤＮＡを得る。
【００６９】該組み換えＤＮＡを用いて大腸菌を形質転
換し、この大腸菌を培養すると、ＨＲａｓｅまたはＨＲ
ａｓｅと他のタンパク質との融合タンパク質が発現生産
される。形質転換される宿主は、異種遺伝子の発現に通
常用いられる株を使用することができるが、エシェリヒ
ア コリ ＪＭ１０９株，特にＪＭ１０９（ＤＥ３）株
が好ましい。形質転換を行う方法、および形質転換体を
選別する方法はMolecular Cloning, 2nd edition, Cold
Spring Harbor press (1989)等に記載されている。
換し、この大腸菌を培養すると、ＨＲａｓｅまたはＨＲ
ａｓｅと他のタンパク質との融合タンパク質が発現生産
される。形質転換される宿主は、異種遺伝子の発現に通
常用いられる株を使用することができるが、エシェリヒ
ア コリ ＪＭ１０９株，特にＪＭ１０９（ＤＥ３）株
が好ましい。形質転換を行う方法、および形質転換体を
選別する方法はMolecular Cloning, 2nd edition, Cold
Spring Harbor press (1989)等に記載されている。
【００７０】融合タンパク質として発現させた場合、血
液凝固因子Ｘａ、カリクレインなどの、ＨＲａｓｅ内に
存在しない配列を認識配列とする制限プロテアーゼを用
いてＨＲａｓｅを切り出せるようにしてもよい。
液凝固因子Ｘａ、カリクレインなどの、ＨＲａｓｅ内に
存在しない配列を認識配列とする制限プロテアーゼを用
いてＨＲａｓｅを切り出せるようにしてもよい。
【００７１】生産培地としては、Ｍ９−カザミノ酸培
地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる
培地を用いてもよい。また、培養条件、生産誘導条件
は、用いたベクターのマーカー、プロモータ、宿主菌等
の種類に応じて適宜選択する。
地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる
培地を用いてもよい。また、培養条件、生産誘導条件
は、用いたベクターのマーカー、プロモータ、宿主菌等
の種類に応じて適宜選択する。
【００７２】ＨＲａｓｅまたはＨＲａｓｅと他のタンパ
ク質との融合タンパク質を回収するには、以下の方法な
どがある。ＨＲａｓｅあるいはその融合タンパク質が菌
体内に可溶化されていれば、菌体を回収した後、菌体を
破砕あるいは溶菌させ、粗酵素液として使用できる。さ
らに、必要に応じて、通常の沈澱、濾過、カラムクロマ
トグラフィー等の手法によりＨＲａｓｅあるいはその融
合タンパク質を精製して用いることも可能である。この
場合、ＨＲａｓｅあるいは融合タンパク質の抗体を利用
した精製法も利用できる。
ク質との融合タンパク質を回収するには、以下の方法な
どがある。ＨＲａｓｅあるいはその融合タンパク質が菌
体内に可溶化されていれば、菌体を回収した後、菌体を
破砕あるいは溶菌させ、粗酵素液として使用できる。さ
らに、必要に応じて、通常の沈澱、濾過、カラムクロマ
トグラフィー等の手法によりＨＲａｓｅあるいはその融
合タンパク質を精製して用いることも可能である。この
場合、ＨＲａｓｅあるいは融合タンパク質の抗体を利用
した精製法も利用できる。
【００７３】タンパク質封入体が形成される場合には、
変性剤でこれを可溶化する。菌体タンパク質とともに可
溶化してもよいが、以降の精製操作を考慮すると、封入
体を取り出して、これを可溶化するのが好ましい。封入
体を菌体から回収するには、従来公知の方法で行えばよ
い。例えば、菌体を破壊し、遠心分離操作等によって封
入体を回収する。タンパク質封入体を可溶化させる変性
剤としては、グアニジン塩酸（例えば、６Ｍ、ｐＨ５〜
８）や尿素（例えば８Ｍ）などが挙げられる。
変性剤でこれを可溶化する。菌体タンパク質とともに可
溶化してもよいが、以降の精製操作を考慮すると、封入
体を取り出して、これを可溶化するのが好ましい。封入
体を菌体から回収するには、従来公知の方法で行えばよ
い。例えば、菌体を破壊し、遠心分離操作等によって封
入体を回収する。タンパク質封入体を可溶化させる変性
剤としては、グアニジン塩酸（例えば、６Ｍ、ｐＨ５〜
８）や尿素（例えば８Ｍ）などが挙げられる。
【００７４】これらの変性剤を透析等により除くと、活
性を有するタンパク質として再生される。透析に用いる
透析溶液としては、トリス塩酸緩衝液やリン酸緩衝液な
どを用いればよく、濃度としては２０ｍＭ〜０．５Ｍ、
ｐＨとしては５〜８が挙げられる。
性を有するタンパク質として再生される。透析に用いる
透析溶液としては、トリス塩酸緩衝液やリン酸緩衝液な
どを用いればよく、濃度としては２０ｍＭ〜０．５Ｍ、
ｐＨとしては５〜８が挙げられる。
【００７５】再生工程時のタンパク濃度は、５００μｇ
／ｍｌ程度以下に抑えるのが好ましい。再生したＨＲａ
ｓｅが自己架橋を行うのを抑えるために、透析温度は５
℃以下であることが好ましい。また、変性剤除去の方法
として、この透析法のほか、希釈法、限外濾過法などが
あり、いずれを用いても活性の再生が期待できる。
／ｍｌ程度以下に抑えるのが好ましい。再生したＨＲａ
ｓｅが自己架橋を行うのを抑えるために、透析温度は５
℃以下であることが好ましい。また、変性剤除去の方法
として、この透析法のほか、希釈法、限外濾過法などが
あり、いずれを用いても活性の再生が期待できる。
【００７６】ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡとして、配
列表配列番号１に示されるＤＮＡを用いた場合には配列
番号２に記載のアミノ酸配列を有するＨＲａｓｅが生産
される。
列表配列番号１に示されるＤＮＡを用いた場合には配列
番号２に記載のアミノ酸配列を有するＨＲａｓｅが生産
される。
【００７７】［ＩＩ］ ＨＲａｓｅを用いた光学活性ア
ミノ酸の製法 次に、本発明のＨＲａｓｅを用いて、５置換ヒダントイ
ン化合物から光学活性アミノ酸を製造する方法について
述べる。
ミノ酸の製法 次に、本発明のＨＲａｓｅを用いて、５置換ヒダントイ
ン化合物から光学活性アミノ酸を製造する方法について
述べる。
【００７８】光学活性アミノ酸製造反応に用いる本発明
のＨＲａｓｅとしては、下記(a)または(b)のアミノ酸配
列を有し、ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパ
ク質が挙げられる。 （a）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列、（b）
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において1ま
たは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加また
は逆位を含むアミノ酸配列。
のＨＲａｓｅとしては、下記(a)または(b)のアミノ酸配
列を有し、ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパ
ク質が挙げられる。 （a）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列、（b）
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において1ま
たは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加また
は逆位を含むアミノ酸配列。
【００７９】上記ＨＲａｓｅとしては、（１）パスツレ
ラ属細菌を培養して得たＨＲａｓｅを用いてもよいし、
（２）組み換えＤＮＡ技術によりパスツレラ属細菌由来
のＨＲａｓｅを生成する形質転換体を作成し、当該形質
転換体を培養して得たＨＲａｓｅを用いてもよい。
ラ属細菌を培養して得たＨＲａｓｅを用いてもよいし、
（２）組み換えＤＮＡ技術によりパスツレラ属細菌由来
のＨＲａｓｅを生成する形質転換体を作成し、当該形質
転換体を培養して得たＨＲａｓｅを用いてもよい。
【００８０】パスツレラ属細菌または組み換えＤＮＡに
よって形質転換された細胞を用いて、ＨＲａｓｅを製造
する場合、培養しながら、培養液中に直接基質を添加し
てもよいし、培養液より分離された菌体、洗浄菌体など
いずれも使用可能である。また、菌体を破砕あるいは溶
菌させた菌体処理物をそのまま用いてもよいし、当該菌
体処理物からＨＲａｓｅを回収し、粗酵素液として使用
してもよいし、さらに、酵素を精製して用いてもよい。
すなわち、ＨＲａｓｅ活性を有する画分であれば、酵素
と当該酵素含有物全てを使用することが可能である。こ
こで「酵素含有物」とは、当該酵素を含むものであれば
よく、具体的には培養物、培養菌体、洗浄菌体、菌体を
破砕あるいは、溶菌させた菌体処理物、粗酵素液、精製
酵素などを含む。
よって形質転換された細胞を用いて、ＨＲａｓｅを製造
する場合、培養しながら、培養液中に直接基質を添加し
てもよいし、培養液より分離された菌体、洗浄菌体など
いずれも使用可能である。また、菌体を破砕あるいは溶
菌させた菌体処理物をそのまま用いてもよいし、当該菌
体処理物からＨＲａｓｅを回収し、粗酵素液として使用
してもよいし、さらに、酵素を精製して用いてもよい。
すなわち、ＨＲａｓｅ活性を有する画分であれば、酵素
と当該酵素含有物全てを使用することが可能である。こ
こで「酵素含有物」とは、当該酵素を含むものであれば
よく、具体的には培養物、培養菌体、洗浄菌体、菌体を
破砕あるいは、溶菌させた菌体処理物、粗酵素液、精製
酵素などを含む。
【００８１】本発明のＨＲａｓｅの他、
５置換ヒダントイン化合物に作用し、当該物質を加水
分解することによりＮ−カルバミルアミノ酸を生成する
反応を触媒するヒダントイナーゼ（ＨＨａｓｅ）、 生成したＮ−カルバミルアミノ酸に作用し、当該物質
を加水分解することにより光学活性アミノ酸を生成する
反応を触媒するＮ−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼ
（ＣＨａｓｅ）、 の２つの酵素を用いることにより、光学活性アミノ酸を
製造することができる。光学活性アミノ酸を製造するに
あたっては、ＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅのうち少なく
とも一方に、光学選択的に基質に作用するものを用いれ
ばよい。
分解することによりＮ−カルバミルアミノ酸を生成する
反応を触媒するヒダントイナーゼ（ＨＨａｓｅ）、 生成したＮ−カルバミルアミノ酸に作用し、当該物質
を加水分解することにより光学活性アミノ酸を生成する
反応を触媒するＮ−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼ
（ＣＨａｓｅ）、 の２つの酵素を用いることにより、光学活性アミノ酸を
製造することができる。光学活性アミノ酸を製造するに
あたっては、ＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅのうち少なく
とも一方に、光学選択的に基質に作用するものを用いれ
ばよい。
【００８２】例えば、５置換ヒダントイン化合物を加水
分解するＨＨａｓｅの光学選択性が高い場合には、光学
選択性の高いＨＨａｓｅと本発明のＨＲａｓｅとを５置
換ヒダントイン化合物に作用させることにより、高収率
（ＨＲａｓｅの作用によりモル収率５０％以上）で光学
活性のＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸またはＮ−カルバ
ミル−Ｄ−アミノ酸の一方のみを生成させることができ
る。この場合は、引き続きＣＨａｓｅまたは当該酵素含
有物を作用させることにより光学活性を維持したまま光
学活性アミノ酸を製造することができる。なお、光学選
択的ＨＨａｓｅと共に光学選択的ＣＨａｓｅを用いる場
合には、Ｌ−またはＤ−について同じ光学選択性を有す
るものを用いる。また、光学選択的ＨＨａｓｅによって
生成したＮ−カルバミルアミノ酸に、亜硝酸などの化学
的加水分解剤を用い、化学的に加水分解処理を施すこと
により、光学活性を維持したまま、高収率で光学活性ア
ミノ酸を製造することもできる（微生物酵素系と化学反
応系との組み合わせによる方法）。なお、化学的加水分
解剤というときの「化学的加水分解」とは、酵素ではな
い化学薬品の作用によって加水分解するという意味であ
る。
分解するＨＨａｓｅの光学選択性が高い場合には、光学
選択性の高いＨＨａｓｅと本発明のＨＲａｓｅとを５置
換ヒダントイン化合物に作用させることにより、高収率
（ＨＲａｓｅの作用によりモル収率５０％以上）で光学
活性のＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸またはＮ−カルバ
ミル−Ｄ−アミノ酸の一方のみを生成させることができ
る。この場合は、引き続きＣＨａｓｅまたは当該酵素含
有物を作用させることにより光学活性を維持したまま光
学活性アミノ酸を製造することができる。なお、光学選
択的ＨＨａｓｅと共に光学選択的ＣＨａｓｅを用いる場
合には、Ｌ−またはＤ−について同じ光学選択性を有す
るものを用いる。また、光学選択的ＨＨａｓｅによって
生成したＮ−カルバミルアミノ酸に、亜硝酸などの化学
的加水分解剤を用い、化学的に加水分解処理を施すこと
により、光学活性を維持したまま、高収率で光学活性ア
ミノ酸を製造することもできる（微生物酵素系と化学反
応系との組み合わせによる方法）。なお、化学的加水分
解剤というときの「化学的加水分解」とは、酵素ではな
い化学薬品の作用によって加水分解するという意味であ
る。
【００８３】５置換ヒダントイン化合物を光学選択的に
加水分解するＨＨａｓｅは次のようにして入手できる。
たとえば、Ｎ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸を生成するＤ
−ＨＨａｓｅを有する菌としては、バチルス属細菌に耐
熱性の酵素の存在が知られており、例としてバチルス
ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilu
s)ＡＴＣＣ３１１９５等からＨＨａｓｅまたは、ＨＨａ
ｓｅ含有画分を調製すればよい(Appl.Microbiol. Biot
echnol.４３巻 ２７０ページ、１９９５年)。ＡＴＣＣ
３１１９５株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション（American Type Culture Collection、住所
12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U
nited States of America）から入手することができ
る。また、Ｌ体ヒダントイン化合物に特異的に作用する
Ｌ−ＨＨａｓｅは、例えばバチルスエスピー（Bacillus
sp.）ＡＪ１２２９９株にその存在が知られている（特
開昭６３−２４８９４号公報）。バチルス エスピー
ＡＪ１２２９９株は、１９８６年７月５日に通商産業省
工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番
号ＦＥＲＭ−Ｐ８８３７が付与され、２００１年６月２
７日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託セ
ンターにブタペスト条約に基づき移管され、受託番号Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ-７６４６が付与された微生物である。
加水分解するＨＨａｓｅは次のようにして入手できる。
たとえば、Ｎ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸を生成するＤ
−ＨＨａｓｅを有する菌としては、バチルス属細菌に耐
熱性の酵素の存在が知られており、例としてバチルス
ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilu
s)ＡＴＣＣ３１１９５等からＨＨａｓｅまたは、ＨＨａ
ｓｅ含有画分を調製すればよい(Appl.Microbiol. Biot
echnol.４３巻 ２７０ページ、１９９５年)。ＡＴＣＣ
３１１９５株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション（American Type Culture Collection、住所
12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U
nited States of America）から入手することができ
る。また、Ｌ体ヒダントイン化合物に特異的に作用する
Ｌ−ＨＨａｓｅは、例えばバチルスエスピー（Bacillus
sp.）ＡＪ１２２９９株にその存在が知られている（特
開昭６３−２４８９４号公報）。バチルス エスピー
ＡＪ１２２９９株は、１９８６年７月５日に通商産業省
工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番
号ＦＥＲＭ−Ｐ８８３７が付与され、２００１年６月２
７日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託セ
ンターにブタペスト条約に基づき移管され、受託番号Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ-７６４６が付与された微生物である。
【００８４】ＨＨａｓｅに光学選択的加水分解活性がな
くとも、ＣＨａｓｅに光学選択性があれば、生成アミノ
酸はＤ−もしくはＬ−の光学活性体となる。この場合、
反応液中には未反応のエナンチオマーであるＮ−カルバ
ミルアミノ酸、すなわちＣＨａｓｅがＮ−カルバミル−
Ｌ−アミノ酸を選択的に分解しＬ−アミノ酸を生成させ
る場合にはＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸が、また逆に
Ｄ−アミノ酸を生成させる場合にはＮ−カルバミル−Ｌ
−アミノ酸が、それぞれ残存することが想定される。し
かしながら、このような場合においてＨＨａｓｅは、残
存することになる未反応エナンチオマーのＮ−カルバミ
ルアミノ酸を脱水縮合させ、再度５置換ヒダントイン化
合物を生成させる逆反応をもわずかながら触媒するの
で、ＨＲａｓｅ、ＨＨａｓｅ、光学選択性の高いＣＨａ
ｓｅの３種の酵素、もしくは３種の酵素含有物により、
高収率（ＨＲａｓｅの作用によりモル収率５０％以上）
で光学活性アミノ酸を製造することが可能となる。
くとも、ＣＨａｓｅに光学選択性があれば、生成アミノ
酸はＤ−もしくはＬ−の光学活性体となる。この場合、
反応液中には未反応のエナンチオマーであるＮ−カルバ
ミルアミノ酸、すなわちＣＨａｓｅがＮ−カルバミル−
Ｌ−アミノ酸を選択的に分解しＬ−アミノ酸を生成させ
る場合にはＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸が、また逆に
Ｄ−アミノ酸を生成させる場合にはＮ−カルバミル−Ｌ
−アミノ酸が、それぞれ残存することが想定される。し
かしながら、このような場合においてＨＨａｓｅは、残
存することになる未反応エナンチオマーのＮ−カルバミ
ルアミノ酸を脱水縮合させ、再度５置換ヒダントイン化
合物を生成させる逆反応をもわずかながら触媒するの
で、ＨＲａｓｅ、ＨＨａｓｅ、光学選択性の高いＣＨａ
ｓｅの３種の酵素、もしくは３種の酵素含有物により、
高収率（ＨＲａｓｅの作用によりモル収率５０％以上）
で光学活性アミノ酸を製造することが可能となる。
【００８５】光学選択性のないＨＨａｓｅは、マイクロ
バクテリウム リクエファシエンス（Microbacterium l
iquefaciens）ＡＪ３９１２株のほか、例えばアースロ
バクター オーレセンス（Arthrobacter aurescens）に
その存在が知られている（J.Biotechnol.６１巻、１ペ
ージ、１９９８年）。
バクテリウム リクエファシエンス（Microbacterium l
iquefaciens）ＡＪ３９１２株のほか、例えばアースロ
バクター オーレセンス（Arthrobacter aurescens）に
その存在が知られている（J.Biotechnol.６１巻、１ペ
ージ、１９９８年）。
【００８６】Ｎ−カルバミルアミノ酸をＤ体選択的に加
水分解するＣＨａｓｅは、たとえばシュードモナス エ
スピー（Pseudomonas sp. ）ＡＪ １１２２０株にその
存在が知られている(特公昭５６−００３０３４号公
報)。再同定の結果、シュードモナス エスピー（Pseud
omonas sp. ）ＡＪ １１２２０株は、アグロバクテリウ
ム エスピー（Agrobacterium sp. ）に属することが判
明している。アグロバクテリウム エスピー ＡＪ １１
２２０株は１９７７年１２月２０日に通商産業省工業技
術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号ＦＥ
ＲＭ−Ｐ４３４７が付与され、２００１年６月２７日に
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター
にブタペスト条約に基づき移管され、受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ-７６４５が付与された微生物である。またＮ−
カルバミルアミノ酸をＬ体選択的に加水分解するＣＨａ
ｓｅは、たとえばフラボバクテリウム エスピー.（Fla
vobacterium sp.）ＡＪ３９１２株（特公昭５６−００
８７４９号公報）、バチルスエスピー.(Bacillus sp.)
ＡＪ１２２９９株にその存在が知られている。フラボバ
クテリウム エスピー. ＡＪ３９１２株は、上述の通り
現在ではマイクロバクテリウム リクエファシエンス
（Microbacterium liquefaciens ）ＡＪ３９１２株（Ｆ
ＥＲＭ−Ｐ３１３３）に分類されているが、１９７５年
６月２７日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研
究所に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３が付与
され、２００１年６月２７日に独立行政法人産業技術総
合研究所特許生物寄託センターにブタペスト条約に基づ
き移管され、受託番号ＦＥＲＭＢＰ-７６４３が付与さ
れた微生物である。またバチルス エスピーＡＪ１２２
９９株は、１９８６年７月５日に、通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号ＦＥＲ
Ｍ−Ｐ８８３７が付与され、２００１年６月２７日に独
立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに
ブタペスト条約に基づき移管され、受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ-７６４６が付与された微生物である。
水分解するＣＨａｓｅは、たとえばシュードモナス エ
スピー（Pseudomonas sp. ）ＡＪ １１２２０株にその
存在が知られている(特公昭５６−００３０３４号公
報)。再同定の結果、シュードモナス エスピー（Pseud
omonas sp. ）ＡＪ １１２２０株は、アグロバクテリウ
ム エスピー（Agrobacterium sp. ）に属することが判
明している。アグロバクテリウム エスピー ＡＪ １１
２２０株は１９７７年１２月２０日に通商産業省工業技
術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号ＦＥ
ＲＭ−Ｐ４３４７が付与され、２００１年６月２７日に
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター
にブタペスト条約に基づき移管され、受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ-７６４５が付与された微生物である。またＮ−
カルバミルアミノ酸をＬ体選択的に加水分解するＣＨａ
ｓｅは、たとえばフラボバクテリウム エスピー.（Fla
vobacterium sp.）ＡＪ３９１２株（特公昭５６−００
８７４９号公報）、バチルスエスピー.(Bacillus sp.)
ＡＪ１２２９９株にその存在が知られている。フラボバ
クテリウム エスピー. ＡＪ３９１２株は、上述の通り
現在ではマイクロバクテリウム リクエファシエンス
（Microbacterium liquefaciens ）ＡＪ３９１２株（Ｆ
ＥＲＭ−Ｐ３１３３）に分類されているが、１９７５年
６月２７日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研
究所に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３が付与
され、２００１年６月２７日に独立行政法人産業技術総
合研究所特許生物寄託センターにブタペスト条約に基づ
き移管され、受託番号ＦＥＲＭＢＰ-７６４３が付与さ
れた微生物である。またバチルス エスピーＡＪ１２２
９９株は、１９８６年７月５日に、通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号ＦＥＲ
Ｍ−Ｐ８８３７が付与され、２００１年６月２７日に独
立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに
ブタペスト条約に基づき移管され、受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ-７６４６が付与された微生物である。
【００８７】ＨＲａｓｅまたはＨＲａｓｅ含有画分の基
質としては、当該酵素の基質特異性においてラセミ化で
きる５置換ヒダントイン化合物であれば、いかなるもの
も使用できる。５置換ヒダントイン化合物の例として
は、ヒダントイン、５−メチルヒダントイン、５−ベン
ジルヒダントイン、５−（４−ヒドロキシベンジル）ヒ
ダントイン、５−インドリルメチルヒダントイン、５−
（３,４−ジヒドロキシベンジル）ヒダントイン、５−
（ｐ−ハイドロキシベンジル）ヒダントイン、５−
（３'−ピリジル）−メチルヒダントイン、５−メチル
チオエチルヒダントイン、５−イソプロピルヒダントイ
ン、５−イソブチルヒダントイン、５−ｓｅｃ−ブチル
ヒダントイン、５−カルボキシエチルヒダントイン、５
−カルボキシメチルヒダントイン、５−（４−アミノブ
チル）ヒダントイン、５−ヒドロキシメチルヒダントイ
ンなどに代表されるような天然型アミノ酸に対応する５
置換ヒダントイン化合物の他、５−フェニルヒダントイ
ン、５−（４−ヒドロキシフェニル）ヒダントイン、５
−メトキシメチルヒダントイン、５−ベンジロキシメチ
ルヒダントイン、５−（３,４−メチレンジオキシベン
ジル）ヒダントイン、ジヒドロウラシルなどに代表され
るような非天然型のアミノ酸若しくはその誘導体に対応
する５置換ヒダントインなどが挙げられる。
質としては、当該酵素の基質特異性においてラセミ化で
きる５置換ヒダントイン化合物であれば、いかなるもの
も使用できる。５置換ヒダントイン化合物の例として
は、ヒダントイン、５−メチルヒダントイン、５−ベン
ジルヒダントイン、５−（４−ヒドロキシベンジル）ヒ
ダントイン、５−インドリルメチルヒダントイン、５−
（３,４−ジヒドロキシベンジル）ヒダントイン、５−
（ｐ−ハイドロキシベンジル）ヒダントイン、５−
（３'−ピリジル）−メチルヒダントイン、５−メチル
チオエチルヒダントイン、５−イソプロピルヒダントイ
ン、５−イソブチルヒダントイン、５−ｓｅｃ−ブチル
ヒダントイン、５−カルボキシエチルヒダントイン、５
−カルボキシメチルヒダントイン、５−（４−アミノブ
チル）ヒダントイン、５−ヒドロキシメチルヒダントイ
ンなどに代表されるような天然型アミノ酸に対応する５
置換ヒダントイン化合物の他、５−フェニルヒダントイ
ン、５−（４−ヒドロキシフェニル）ヒダントイン、５
−メトキシメチルヒダントイン、５−ベンジロキシメチ
ルヒダントイン、５−（３,４−メチレンジオキシベン
ジル）ヒダントイン、ジヒドロウラシルなどに代表され
るような非天然型のアミノ酸若しくはその誘導体に対応
する５置換ヒダントインなどが挙げられる。
【００８８】なお、好ましいＨＲａｓｅ、ＨＨａｓｅお
よびＣＨａｓｅの組み合わせとして、配列表配列番号２
に記載のアミノ酸配列を有するＨＲａｓｅ、配列表配列
番号１２に記載のアミノ酸配列を有するＨＨａｓｅ、配
列表配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有するＣＨａ
ｓｅの組み合わせが挙げられる。これらの酵素いずれ
も、パスツレラ ニューモトロピカ（Pasteurella pneu
motropica）ＡＪ１１２２１株由来の酵素である。
よびＣＨａｓｅの組み合わせとして、配列表配列番号２
に記載のアミノ酸配列を有するＨＲａｓｅ、配列表配列
番号１２に記載のアミノ酸配列を有するＨＨａｓｅ、配
列表配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有するＣＨａ
ｓｅの組み合わせが挙げられる。これらの酵素いずれ
も、パスツレラ ニューモトロピカ（Pasteurella pneu
motropica）ＡＪ１１２２１株由来の酵素である。
【００８９】配列表配列番号２に記載のアミノ酸配列を
有するＨＲａｓｅ、配列表配列番号１２に記載のアミノ
酸配列を有するＨＨａｓｅおよび配列表配列番号１４に
記載のアミノ酸配列を有するＣＨａｓｅを組み合わせて
用いる場合、これらのＤ−アミノ酸の製造に係わるタン
パク質のすべてをコードする構造遺伝子群とベクターと
が接続されて得られる組み換えＤＮＡを用いて形質転換
された細胞を培養することによって得られたＨＲａｓ
ｅ、ＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅからなる混成タンパク
質を用いることもできる。当該混成タンパク質を用いた
場合、下記反応式（II）に示すように、混成タンパク質
に含まれるヒダントンラセマーゼが５置換ヒダントイン
化合物のラセミ化を触媒するので、ＤＬ体の５置換ヒダ
ントイン化合物から理論的にはモル収率１００％でＤ−
アミノ酸を製造することが可能となる。
有するＨＲａｓｅ、配列表配列番号１２に記載のアミノ
酸配列を有するＨＨａｓｅおよび配列表配列番号１４に
記載のアミノ酸配列を有するＣＨａｓｅを組み合わせて
用いる場合、これらのＤ−アミノ酸の製造に係わるタン
パク質のすべてをコードする構造遺伝子群とベクターと
が接続されて得られる組み換えＤＮＡを用いて形質転換
された細胞を培養することによって得られたＨＲａｓ
ｅ、ＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅからなる混成タンパク
質を用いることもできる。当該混成タンパク質を用いた
場合、下記反応式（II）に示すように、混成タンパク質
に含まれるヒダントンラセマーゼが５置換ヒダントイン
化合物のラセミ化を触媒するので、ＤＬ体の５置換ヒダ
ントイン化合物から理論的にはモル収率１００％でＤ−
アミノ酸を製造することが可能となる。
【００９０】
【化３】
【００９１】また、下記反応式（III）に例示するよう
に、Ｌ−ＣＨａｓｅ等を用いることにより、ＤＬ体の５
置換ヒダントイン化合物から理論的にはモル収率１００
％でＬ−アミノ酸を製造することも可能である。
に、Ｌ−ＣＨａｓｅ等を用いることにより、ＤＬ体の５
置換ヒダントイン化合物から理論的にはモル収率１００
％でＬ−アミノ酸を製造することも可能である。
【化４】
【００９２】なお、上記混成タンパク質を用いてＮ−カ
ルバミルアミノ酸を製造することも可能である。例え
ば、上記混成タンパク質にＬ−又はＤ−ＣＨａｓｅの阻
害剤等を添加して加水分解反応をＮ−カルバミルアミノ
酸で止めることにより、Ｎ−カルバミルアミノ酸を製造
できる。
ルバミルアミノ酸を製造することも可能である。例え
ば、上記混成タンパク質にＬ−又はＤ−ＣＨａｓｅの阻
害剤等を添加して加水分解反応をＮ−カルバミルアミノ
酸で止めることにより、Ｎ−カルバミルアミノ酸を製造
できる。
【００９３】パスツレラ属細菌または組み換えＤＮＡに
よって形質転換された細胞の培養液、分離菌体、洗浄菌
体、菌体処理物、当該菌体処理物から得られる粗酵素液
または精製酵素を用いてアミノ酸生成反応を進行させる
場合には、５置換ヒダントイン化合物と培養液、分離菌
体、洗浄菌体、菌体処理物、粗酵素液、または精製酵素
を含む反応液を２５〜４０℃の適当な温度に調整し、ｐ
Ｈ５〜９に保ちつつ、８時間〜５日静置または攪拌すれ
ばよい。
よって形質転換された細胞の培養液、分離菌体、洗浄菌
体、菌体処理物、当該菌体処理物から得られる粗酵素液
または精製酵素を用いてアミノ酸生成反応を進行させる
場合には、５置換ヒダントイン化合物と培養液、分離菌
体、洗浄菌体、菌体処理物、粗酵素液、または精製酵素
を含む反応液を２５〜４０℃の適当な温度に調整し、ｐ
Ｈ５〜９に保ちつつ、８時間〜５日静置または攪拌すれ
ばよい。
【００９４】また、パスツレラ属細菌または組み換えＤ
ＮＡによって形質転換された細胞を水溶性媒体中で培養
しながら、アミノ酸生成反応を進行させる場合には、５
置換ヒダントイン化合物を含み、かつ形質転換された細
胞の生育に必要な炭素源、窒素源、無機イオンなどの栄
養素を含む水溶性媒体が用いられる。さらにビタミン、
アミノ酸等の有機微量栄養素を添加すると望ましい結果
が得られる場合が多い。５置換ヒダントイン化合物は分
割添加してもよい。好気的条件下でｐＨ５〜９、温度２
５〜４０℃の適当な範囲に制御しつつ、８時間〜５日培
養することが好ましい。
ＮＡによって形質転換された細胞を水溶性媒体中で培養
しながら、アミノ酸生成反応を進行させる場合には、５
置換ヒダントイン化合物を含み、かつ形質転換された細
胞の生育に必要な炭素源、窒素源、無機イオンなどの栄
養素を含む水溶性媒体が用いられる。さらにビタミン、
アミノ酸等の有機微量栄養素を添加すると望ましい結果
が得られる場合が多い。５置換ヒダントイン化合物は分
割添加してもよい。好気的条件下でｐＨ５〜９、温度２
５〜４０℃の適当な範囲に制御しつつ、８時間〜５日培
養することが好ましい。
【００９５】生成したアミノ酸は、公知の手法により分
離精製することができる。例えば、イオン交換樹脂に接
触させて塩基性アミノ酸を吸着させ、これを溶離後晶析
する方法または溶離後、活性炭等による脱色濾過し晶析
する方法等が挙げられる。
離精製することができる。例えば、イオン交換樹脂に接
触させて塩基性アミノ酸を吸着させ、これを溶離後晶析
する方法または溶離後、活性炭等による脱色濾過し晶析
する方法等が挙げられる。
【００９６】
【実施例】以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定され
るものではない。なお、実施例における５置換ヒダント
イン化合物、Ｎ−カルバミルアミノ酸、およびアミノ酸
の定量および光学純度測定には、ダイセル化学工業製光
学分割カラムCHIRALPAK WHを利用したＨＰＬＣを用い
た。分析条件は以下のとおりである。 カラム：ダイセル化学CHIRALPAK WH ０．４６ｃｍφ×
２５ｃｍ 移動相：５％ (ｖ／ｖ) methanol, １ｍＭＣｕＳＯ4 カラム温度：５０℃ 流速：１．５ ｍｌ/分 検出：ＵＶ210
に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定され
るものではない。なお、実施例における５置換ヒダント
イン化合物、Ｎ−カルバミルアミノ酸、およびアミノ酸
の定量および光学純度測定には、ダイセル化学工業製光
学分割カラムCHIRALPAK WHを利用したＨＰＬＣを用い
た。分析条件は以下のとおりである。 カラム：ダイセル化学CHIRALPAK WH ０．４６ｃｍφ×
２５ｃｍ 移動相：５％ (ｖ／ｖ) methanol, １ｍＭＣｕＳＯ4 カラム温度：５０℃ 流速：１．５ ｍｌ/分 検出：ＵＶ210
【００９７】（実施例１）ＡＪ１１２２１菌におけるヒ
ダントインラセマーゼ活性の検出 １．菌体の培養 パスツレラ ニューモトロピカ（Pasteurella pneumotr
opica）ＡＪ１１２２１株およびシュードモナス エスピ
ー（Pseudomonas sp.）ＡＪ１１２２０株（現在は、ア
グロバクテリウム エスピー ＡＪ１１２２０（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−７６４５）株として寄託）をＣＭ２Ｇ寒天培
地（グルコース０．５％、酵母エキス１．０％、ペプト
ン１．０％、ＮａＣｌ ０．５％、寒天２％、ｐＨ７．
０）上で３０℃、２４時間培養し、リフレッシュした。
これを５０ｍｌの誘導培地（グルコース０．５％、硫酸
アンモニウム０．５％、ＫＨ2ＰＯ4 ０．１％、Ｋ2Ｈ
ＰＯ4 ０．３％、ＭｇＳＯ4 ０．０５％、酵母エキス
１．０％、ペプトン１．０％、ＦｅＳＯ4 ０．００１
％、ＭｎＳＯ4 ０．００１％、シアノエチルヒダントイ
ン０．２％、炭酸カルシウム２．０％、ｐＨ７．０）を
張り込んだ５００ ｍｌ容の坂口フラスコに１白金耳植
菌し、３０℃、１６時間好気的に振とう培養した。培養
終了後、集菌、洗浄を行い、菌体を５ｍｌの０．１Ｍ
ＫＰＢ (ｐＨ ７．５)に懸濁した。
ダントインラセマーゼ活性の検出 １．菌体の培養 パスツレラ ニューモトロピカ（Pasteurella pneumotr
opica）ＡＪ１１２２１株およびシュードモナス エスピ
ー（Pseudomonas sp.）ＡＪ１１２２０株（現在は、ア
グロバクテリウム エスピー ＡＪ１１２２０（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−７６４５）株として寄託）をＣＭ２Ｇ寒天培
地（グルコース０．５％、酵母エキス１．０％、ペプト
ン１．０％、ＮａＣｌ ０．５％、寒天２％、ｐＨ７．
０）上で３０℃、２４時間培養し、リフレッシュした。
これを５０ｍｌの誘導培地（グルコース０．５％、硫酸
アンモニウム０．５％、ＫＨ2ＰＯ4 ０．１％、Ｋ2Ｈ
ＰＯ4 ０．３％、ＭｇＳＯ4 ０．０５％、酵母エキス
１．０％、ペプトン１．０％、ＦｅＳＯ4 ０．００１
％、ＭｎＳＯ4 ０．００１％、シアノエチルヒダントイ
ン０．２％、炭酸カルシウム２．０％、ｐＨ７．０）を
張り込んだ５００ ｍｌ容の坂口フラスコに１白金耳植
菌し、３０℃、１６時間好気的に振とう培養した。培養
終了後、集菌、洗浄を行い、菌体を５ｍｌの０．１Ｍ
ＫＰＢ (ｐＨ ７．５)に懸濁した。
【００９８】２．洗浄菌体法によるヒダントインラセマ
ーゼ活性の検出 上記のように調製して得られた洗浄菌体を、０．１２ｇ
／ｄｌのＤ−５−ベンジルヒダントイン（Ｄ−ＢＨ）も
しくはＬ−５−ベンジルヒダントイン（Ｌ−ＢＨ）を含
む０．１ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．５）に、それぞれの洗
浄菌体が１ｇ／ｄｌとなるように添加して３０℃で反応
させた。反応２２時間後にサンプリングし、２０，００
０ｇ×１０分の遠心分離操作により沈澱を取り除いた
後、遠心上清をＨＰＬＣで解析することにより、生成し
たＤ−フェニルアラニンを定量した。
ーゼ活性の検出 上記のように調製して得られた洗浄菌体を、０．１２ｇ
／ｄｌのＤ−５−ベンジルヒダントイン（Ｄ−ＢＨ）も
しくはＬ−５−ベンジルヒダントイン（Ｌ−ＢＨ）を含
む０．１ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．５）に、それぞれの洗
浄菌体が１ｇ／ｄｌとなるように添加して３０℃で反応
させた。反応２２時間後にサンプリングし、２０，００
０ｇ×１０分の遠心分離操作により沈澱を取り除いた
後、遠心上清をＨＰＬＣで解析することにより、生成し
たＤ−フェニルアラニンを定量した。
【００９９】なお、上記パスツレラ ニューモトロピカ
（Pasteurella pneumotropica）ＡＪ１１２２１株はＤ
−ヒダントイナーゼ活性およびＤ−カルバミルアミノ酸
ハイドロラーゼ活性を有する菌株であり、シュードモナ
ス エスピー（Pseudomonas sp.）ＡＪ１１２２０株は、
ヒダントイナーゼ活性およびＤ−カルバミルアミノ酸ハ
イドロラーゼ活性を有する菌株である。
（Pasteurella pneumotropica）ＡＪ１１２２１株はＤ
−ヒダントイナーゼ活性およびＤ−カルバミルアミノ酸
ハイドロラーゼ活性を有する菌株であり、シュードモナ
ス エスピー（Pseudomonas sp.）ＡＪ１１２２０株は、
ヒダントイナーゼ活性およびＤ−カルバミルアミノ酸ハ
イドロラーゼ活性を有する菌株である。
【０１００】その結果を表１に示した。この表に示され
るように、シュードモナス エスピー（Pseudomonas s
p.）ＡＪ１１２２０株の洗浄菌体を用いた場合には、Ｄ
−５−ベンジルヒダントインからのみＤ−フェニルアラ
ニンを生成させることができ、Ｌ−５−ベンジルヒダン
トインからはほとんどＤ−フェニルアラニンが生成しな
かった。この結果より、自発的なベンジルヒダントイン
のラセミ化はごくわずかであることが示された。これに
対して、パスツレラ ニューモトロピカ（Pasteurella
pneumotropica）ＡＪ１１２２１株の洗浄菌体を用いた
場合には、Ｄ−５−ベンジルヒダントインからのみなら
ず、Ｌ−５−ベンジルヒダントインからも効率良くＤ−
フェニルアラニンを生成させることができた。以上の結
果より、パスツレラ ニューモトロピカ（Pasteurella
pneumotropica）ＡＪ１１２２１株がヒダントインラセ
マーゼ活性を有することが示された。
るように、シュードモナス エスピー（Pseudomonas s
p.）ＡＪ１１２２０株の洗浄菌体を用いた場合には、Ｄ
−５−ベンジルヒダントインからのみＤ−フェニルアラ
ニンを生成させることができ、Ｌ−５−ベンジルヒダン
トインからはほとんどＤ−フェニルアラニンが生成しな
かった。この結果より、自発的なベンジルヒダントイン
のラセミ化はごくわずかであることが示された。これに
対して、パスツレラ ニューモトロピカ（Pasteurella
pneumotropica）ＡＪ１１２２１株の洗浄菌体を用いた
場合には、Ｄ−５−ベンジルヒダントインからのみなら
ず、Ｌ−５−ベンジルヒダントインからも効率良くＤ−
フェニルアラニンを生成させることができた。以上の結
果より、パスツレラ ニューモトロピカ（Pasteurella
pneumotropica）ＡＪ１１２２１株がヒダントインラセ
マーゼ活性を有することが示された。
【０１０１】
【表１】
【０１０２】（実施例２）ＡＪ１１２２１菌由来のヒダ
ントインラセマーゼ遺伝子の単離 １．菌体の取得 パスツレラ ニューモトロピカ（Pasteurella pneumotr
opica）ＡＪ１１２２１株をＣＭ２Ｇ寒天培地（グルコ
ース０．５％、酵母エキス１．０％、ペプトン１．０
％、ＮａＣｌ ０．５％、寒天２％、ｐＨ７．０）上で
３０℃、２４時間培養し、リフレッシュした。これを５
０ｍｌのＣＭ２Ｇ液体培地を張り込んだ５００ ｍｌ容
の坂口フラスコに１白金耳植菌し、３０℃、１６時間好
気的に振とう培養した。
ントインラセマーゼ遺伝子の単離 １．菌体の取得 パスツレラ ニューモトロピカ（Pasteurella pneumotr
opica）ＡＪ１１２２１株をＣＭ２Ｇ寒天培地（グルコ
ース０．５％、酵母エキス１．０％、ペプトン１．０
％、ＮａＣｌ ０．５％、寒天２％、ｐＨ７．０）上で
３０℃、２４時間培養し、リフレッシュした。これを５
０ｍｌのＣＭ２Ｇ液体培地を張り込んだ５００ ｍｌ容
の坂口フラスコに１白金耳植菌し、３０℃、１６時間好
気的に振とう培養した。
【０１０３】２．菌体からの染色体ＤＮＡの取得
培養液５０ｍｌを遠心分離操作（１２，０００×ｇ、４
℃、１５分間）に供し、集菌した。この菌体を１０ｍｌ
の５０:２０ ＴＥ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ
８．０)、２０ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁して洗浄し、遠心
分離操作により、菌体を回収した後、再びこの菌体を１
０ｍｌの５０:２０ ＴＥに懸濁した。さらに、この懸濁
液に０．５ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液、１ｍ
ｌの１０％ ＳＤＳ溶液を加えた後、５５℃で２０分間
インキュベートした。インキュベート後、１倍容の１
０:１ ＴＥ飽和のフェノールを加えて除タンパクを行っ
た。分離した水層に対して、１倍容の２−プロパノール
を加えてＤＮＡを沈澱させ、回収した。沈澱したＤＮＡ
を０．５ｍｌ ５０:２０ ＴＥに溶解した後、５μlの１
０ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ、５μlの１０ｍｇ／ｍｌ Pro
teinaseＫを加えて、５５℃で２時間反応させた。反応
後、１倍容の１０:１ ＴＥ飽和のフェノールで除タンパ
クを行った。さらに、分離した水層に対して、１倍容の
２４:１ クロロホルム／イソアミルアルコールを加えて
攪拌し、水層を回収した。この操作をさらに２回行った
後に得られた水層に、終濃度０．４Ｍとなるように３Ｍ
酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ ５．２）を加え、さらに２
倍容のエタノールを加えた。沈澱となって生じたＤＮＡ
を回収し、７０％エタノールで洗浄、乾燥させ、１ｍｌ
の１０:１ ＴＥに溶解させた。
℃、１５分間）に供し、集菌した。この菌体を１０ｍｌ
の５０:２０ ＴＥ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ
８．０)、２０ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁して洗浄し、遠心
分離操作により、菌体を回収した後、再びこの菌体を１
０ｍｌの５０:２０ ＴＥに懸濁した。さらに、この懸濁
液に０．５ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液、１ｍ
ｌの１０％ ＳＤＳ溶液を加えた後、５５℃で２０分間
インキュベートした。インキュベート後、１倍容の１
０:１ ＴＥ飽和のフェノールを加えて除タンパクを行っ
た。分離した水層に対して、１倍容の２−プロパノール
を加えてＤＮＡを沈澱させ、回収した。沈澱したＤＮＡ
を０．５ｍｌ ５０:２０ ＴＥに溶解した後、５μlの１
０ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ、５μlの１０ｍｇ／ｍｌ Pro
teinaseＫを加えて、５５℃で２時間反応させた。反応
後、１倍容の１０:１ ＴＥ飽和のフェノールで除タンパ
クを行った。さらに、分離した水層に対して、１倍容の
２４:１ クロロホルム／イソアミルアルコールを加えて
攪拌し、水層を回収した。この操作をさらに２回行った
後に得られた水層に、終濃度０．４Ｍとなるように３Ｍ
酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ ５．２）を加え、さらに２
倍容のエタノールを加えた。沈澱となって生じたＤＮＡ
を回収し、７０％エタノールで洗浄、乾燥させ、１ｍｌ
の１０:１ ＴＥに溶解させた。
【０１０４】３．ヒダントインラセマーゼ遺伝子の単離
まず、パスツレラ ニューモトロピカ（Pasteurella pn
eumotropica）ＡＪ１１２２１株の染色体ＤＮＡ２００
μｇに制限酵素Ｓａｕ３Ａ Ｉを１Ｕ添加し、３７℃に
て１５分間反応させて部分消化した。次に、このＤＮＡ
からアガロース電気泳動にて２．５〜８ｋｂｐの断片を
回収し、ここで取得された約２．８ｋｂのＳａｕ３Ａ
Ｉ断片（図１の）に、Ｄ−ＣＨａｓｅをコードする遺
伝子が含まれることを確認した。この約２．８ｋｂの断
片のうち、Ｄ−ＣＨａｓｅ遺伝子の下流領域約７５０塩
基について相同性検索を行ったところ、Ｄ−ＣＨａｓｅ
遺伝子の終止コドンより数えて１７０番目の塩基からＳ
ａｕ３Ａ Ｉサイトまでにわたり、マイクロバクテリウ
ム リクエファシエンス（Microbacterium liquefacien
s）ＡＪ３９１２株由来のヒダントインラセマーゼ（特
願２００１−２７８７３９号記載）との相同性が確認さ
れた。そこで、この配列がヒダントインラセマーゼ遺伝
子の一部であると考え、この配列を用いてヒダントイン
ラセマーゼ遺伝子全長を取得することを試みた。
eumotropica）ＡＪ１１２２１株の染色体ＤＮＡ２００
μｇに制限酵素Ｓａｕ３Ａ Ｉを１Ｕ添加し、３７℃に
て１５分間反応させて部分消化した。次に、このＤＮＡ
からアガロース電気泳動にて２．５〜８ｋｂｐの断片を
回収し、ここで取得された約２．８ｋｂのＳａｕ３Ａ
Ｉ断片（図１の）に、Ｄ−ＣＨａｓｅをコードする遺
伝子が含まれることを確認した。この約２．８ｋｂの断
片のうち、Ｄ−ＣＨａｓｅ遺伝子の下流領域約７５０塩
基について相同性検索を行ったところ、Ｄ−ＣＨａｓｅ
遺伝子の終止コドンより数えて１７０番目の塩基からＳ
ａｕ３Ａ Ｉサイトまでにわたり、マイクロバクテリウ
ム リクエファシエンス（Microbacterium liquefacien
s）ＡＪ３９１２株由来のヒダントインラセマーゼ（特
願２００１−２７８７３９号記載）との相同性が確認さ
れた。そこで、この配列がヒダントインラセマーゼ遺伝
子の一部であると考え、この配列を用いてヒダントイン
ラセマーゼ遺伝子全長を取得することを試みた。
【０１０５】まず、ヒダントインラセマーゼ遺伝子の全
長取得のために、サザンハイブリダイゼーションを行っ
た。パスツレラ ニューモトロピカ（Pasteurella pneu
motropica）ＡＪ１１２２１株の染色体ＤＮＡを鋳型と
して用い、表２に示すオリゴヌクレオチドをプライマー
としてＰＣＲにより増幅した断片（約４７０ｂｐ）を、
プローブとして用いた。該増幅断片を約５０ｎｇ／μｌ
に調整し、このＤＮＡ溶液１６μｌをDIG High Prime
（Boehringer Mannheim）のプロトコールに準じて３７
℃で２４ 時間インキュベートすることによりDIG標識
し、プローブとした。
長取得のために、サザンハイブリダイゼーションを行っ
た。パスツレラ ニューモトロピカ（Pasteurella pneu
motropica）ＡＪ１１２２１株の染色体ＤＮＡを鋳型と
して用い、表２に示すオリゴヌクレオチドをプライマー
としてＰＣＲにより増幅した断片（約４７０ｂｐ）を、
プローブとして用いた。該増幅断片を約５０ｎｇ／μｌ
に調整し、このＤＮＡ溶液１６μｌをDIG High Prime
（Boehringer Mannheim）のプロトコールに準じて３７
℃で２４ 時間インキュベートすることによりDIG標識
し、プローブとした。
【０１０６】
【表２】
【０１０７】染色体ＤＮＡ １μgを各種制限酵素の組合
わせで完全消化し、０．８％アガロースゲルで電気泳動
した後に、ナイロンメンブレン（Boehringer Mannheim,
Nylon membranes positively charged）にブロッティ
ングした。以下定法に従ってサザンハイブリダイゼーシ
ョンを行った。ハイブリダイゼーションはDIG Easy Hyb
（Boehringer Mannheim）を用いて行い、５０℃、３０
分間プレハイブリダイゼーションを行った後にプローブ
を添加して、５０℃、１８時間ハイブリダイゼーション
させた。検出はDIG Nucleotide Detection Kit（Boehri
nger Mannheim）を用いて行った。
わせで完全消化し、０．８％アガロースゲルで電気泳動
した後に、ナイロンメンブレン（Boehringer Mannheim,
Nylon membranes positively charged）にブロッティ
ングした。以下定法に従ってサザンハイブリダイゼーシ
ョンを行った。ハイブリダイゼーションはDIG Easy Hyb
（Boehringer Mannheim）を用いて行い、５０℃、３０
分間プレハイブリダイゼーションを行った後にプローブ
を添加して、５０℃、１８時間ハイブリダイゼーション
させた。検出はDIG Nucleotide Detection Kit（Boehri
nger Mannheim）を用いて行った。
【０１０８】その結果、Ｓａｌ Ｉの切断物（図１の
）において約１．６ｋｂの位置にバンドが検出され
た。そこで、該切断物より１．６ｋｂ付近の断片を回収
してｐＵＣ１８に連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９に
てライブラリー（５００株）を作製した後、コロニーハ
イブリダイゼーションを行った。コロニーをナイロンメ
ンブレンフィルター（Boehringer Mannheim, Nylon mem
branes for colony and plaque hybridization）に転写
し、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイ
ブリダイゼーションはDIG Easy Hybを用いて行い、４２
℃、３０分間プレハイブリダイゼーションを行った後
に、上述のDIG標識プローブを添加し、４２℃、１８時
間ハイブリダイゼーションさせた。検出はDIG Nucleoti
de Detection Kitを用いて行い、３株のポジティブクロ
ーンを選抜した。
）において約１．６ｋｂの位置にバンドが検出され
た。そこで、該切断物より１．６ｋｂ付近の断片を回収
してｐＵＣ１８に連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９に
てライブラリー（５００株）を作製した後、コロニーハ
イブリダイゼーションを行った。コロニーをナイロンメ
ンブレンフィルター（Boehringer Mannheim, Nylon mem
branes for colony and plaque hybridization）に転写
し、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイ
ブリダイゼーションはDIG Easy Hybを用いて行い、４２
℃、３０分間プレハイブリダイゼーションを行った後
に、上述のDIG標識プローブを添加し、４２℃、１８時
間ハイブリダイゼーションさせた。検出はDIG Nucleoti
de Detection Kitを用いて行い、３株のポジティブクロ
ーンを選抜した。
【０１０９】選抜したクローンが保有するプラスミドを
Molecular Cloning, 2nd edition,Cold Spring Harbor
press (１９８９)に記載される方法に従って調製し、挿
入断片の塩基配列を決定した。その結果、Ｄ−ＣＨａｓ
ｅ遺伝子の下流に、約０．７ｋｂからなるオープンリー
ディングフレーム（ＯＲＦ）が存在しており、ヒダント
インラセマーゼ遺伝子であると推定された。ヒダントイ
ンラセマーゼ遺伝子全長の塩基配列を配列表の配列番号
１に、対応するアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示
した。得られたヒダントインラセマーゼ遺伝子はマイク
ロバクテリウム リクエファシエンス（Microbacterium
liquefaciens）ＡＪ３９１２株由来のヒダントインラ
セマーゼ（特願２００１−２７８７３９号記載）とアミ
ノ酸配列において４３％の相同性を示した。
Molecular Cloning, 2nd edition,Cold Spring Harbor
press (１９８９)に記載される方法に従って調製し、挿
入断片の塩基配列を決定した。その結果、Ｄ−ＣＨａｓ
ｅ遺伝子の下流に、約０．７ｋｂからなるオープンリー
ディングフレーム（ＯＲＦ）が存在しており、ヒダント
インラセマーゼ遺伝子であると推定された。ヒダントイ
ンラセマーゼ遺伝子全長の塩基配列を配列表の配列番号
１に、対応するアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示
した。得られたヒダントインラセマーゼ遺伝子はマイク
ロバクテリウム リクエファシエンス（Microbacterium
liquefaciens）ＡＪ３９１２株由来のヒダントインラ
セマーゼ（特願２００１−２７８７３９号記載）とアミ
ノ酸配列において４３％の相同性を示した。
【０１１０】（実施例３）ヒダントインラセマーゼ遺伝
子のＥ．ｃｏｌｉにおける発現 １．発現プラスミドの構築 取得した遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで発現させるために、ｐ
ＵＣ１８のｌａｃプロモーターの下流にヒダントインラ
セマーゼ遺伝子を連結したプラスミドｐＵＣＨＲ２を以
下のようにして構築した。まず、パスツレラ ニューモ
トロピカ（Pasteurella pneumotropica）ＡＪ１１２２
１株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、表２に示すオリゴヌク
レオチドをプライマーとしてＰＣＲによりヒダントイン
ラセマーゼ遺伝子を増幅した。この断片をＥｃｏＲ
Ｉ、ＢａｍＨ Ｉにて処理し、ｐＵＣ１８のＥｃｏＲ
Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ切断物とライゲーションした後、Ｅ．
ｃｏｌｉＪＭ１０９ に導入した。アンピシリン耐性株
の中から目的のプラスミドを持った株を選択し、発現プ
ラスミドｐＵＣＨＲ２と命名した。また、発現プラスミ
ドｐＵＣＨＲ２を有するＥ．Ｃｏｌｉ形質転換体をＪＭ
１０９／ｐＵＣＨＲ２と命名した。
子のＥ．ｃｏｌｉにおける発現 １．発現プラスミドの構築 取得した遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで発現させるために、ｐ
ＵＣ１８のｌａｃプロモーターの下流にヒダントインラ
セマーゼ遺伝子を連結したプラスミドｐＵＣＨＲ２を以
下のようにして構築した。まず、パスツレラ ニューモ
トロピカ（Pasteurella pneumotropica）ＡＪ１１２２
１株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、表２に示すオリゴヌク
レオチドをプライマーとしてＰＣＲによりヒダントイン
ラセマーゼ遺伝子を増幅した。この断片をＥｃｏＲ
Ｉ、ＢａｍＨ Ｉにて処理し、ｐＵＣ１８のＥｃｏＲ
Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ切断物とライゲーションした後、Ｅ．
ｃｏｌｉＪＭ１０９ に導入した。アンピシリン耐性株
の中から目的のプラスミドを持った株を選択し、発現プ
ラスミドｐＵＣＨＲ２と命名した。また、発現プラスミ
ドｐＵＣＨＲ２を有するＥ．Ｃｏｌｉ形質転換体をＪＭ
１０９／ｐＵＣＨＲ２と命名した。
【０１１１】
【表３】
【０１１２】２．無細胞抽出液の調製
ｐＵＣＨＲ２を持つＥ．ｃｏｌｉ形質転換体ＪＭ１０９
／ｐＵＣＨＲ２を０．１ｍｇ／ｍｌ アンピシリンを含
むＬＢ培地で３７℃、１６時間シード培養した。ＬＢ培
地５０ｍｌを張り込んだ５００ｍｌ容坂口フラスコにこ
のシード培養液を１ｍｌ添加し、３７℃にて本培養を行
った。一部の培地について、培養開始２．５時間後に、
終濃度１ｍＭとなるようにイソプロピル１-チオ-β-Ｄ-
ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに４時
間培養を行った。培養終了後、集菌、洗浄を行い、菌体
を５ｍｌの５０ｍＭ ＫＰＢ (ｐＨ ７．５)に懸濁し、
０．１ｍｍφ glass beadsとともに３分間（３０秒×６
回、９０秒のインターバル）ビーズビーターにて破砕し
た。溶液を回収し、２０，０００ｇ×１０分の遠心分離
操作を行い、その上清を無細胞抽出液とした。
／ｐＵＣＨＲ２を０．１ｍｇ／ｍｌ アンピシリンを含
むＬＢ培地で３７℃、１６時間シード培養した。ＬＢ培
地５０ｍｌを張り込んだ５００ｍｌ容坂口フラスコにこ
のシード培養液を１ｍｌ添加し、３７℃にて本培養を行
った。一部の培地について、培養開始２．５時間後に、
終濃度１ｍＭとなるようにイソプロピル１-チオ-β-Ｄ-
ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに４時
間培養を行った。培養終了後、集菌、洗浄を行い、菌体
を５ｍｌの５０ｍＭ ＫＰＢ (ｐＨ ７．５)に懸濁し、
０．１ｍｍφ glass beadsとともに３分間（３０秒×６
回、９０秒のインターバル）ビーズビーターにて破砕し
た。溶液を回収し、２０，０００ｇ×１０分の遠心分離
操作を行い、その上清を無細胞抽出液とした。
【０１１３】３．ヒダントインラセマーゼ活性測定
ヒダントインラセマーゼ活性の測定は、０．１２ｇ／ｄ
ｌ Ｄ−５−ベンジルヒダントイン（Ｄ−ＢＨ）もしく
はＬ−５−ベンジルヒダントイン（Ｌ−ＢＨ）、５０ｍ
Ｍ ＫＰＢ (ｐＨ ７．５)および酵素溶液を含む反応液
を３７℃で３０分インキュベートした後、９倍容の１．
１ｍＭ ＣｕＳＯ4、１１．１ｍＭ Ｈ3ＰＯ4を添加し、
２０，０００ｇ×１０分の遠心分離操作により沈澱を取
り除いた上清を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）にて解析することによった。なお、酵素溶液として
は上記のようにして得た無細胞抽出液を用いた。また、
酵素活性の単位としては、この条件にて１分間に１μｍ
ｏｌのベンジルヒダントインをラセミ化する酵素活性を
もって１Ｕと定義した。
ｌ Ｄ−５−ベンジルヒダントイン（Ｄ−ＢＨ）もしく
はＬ−５−ベンジルヒダントイン（Ｌ−ＢＨ）、５０ｍ
Ｍ ＫＰＢ (ｐＨ ７．５)および酵素溶液を含む反応液
を３７℃で３０分インキュベートした後、９倍容の１．
１ｍＭ ＣｕＳＯ4、１１．１ｍＭ Ｈ3ＰＯ4を添加し、
２０，０００ｇ×１０分の遠心分離操作により沈澱を取
り除いた上清を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）にて解析することによった。なお、酵素溶液として
は上記のようにして得た無細胞抽出液を用いた。また、
酵素活性の単位としては、この条件にて１分間に１μｍ
ｏｌのベンジルヒダントインをラセミ化する酵素活性を
もって１Ｕと定義した。
【０１１４】その結果を表４に示す。ｐＵＣＨＲ２を用
いて形質転換した株においてベンジルヒダントインのラ
セミ化活性が確認されたことより、この遺伝子がパスツ
レラニューモトロピカ（Pasteurella pneumotropica）
ＡＪ１１２２１株由来のヒダントインラセマーゼ遺伝子
であり、Ｅ．ｃｏｌｉの菌体内で効率良く発現されてい
ることを確認した。
いて形質転換した株においてベンジルヒダントインのラ
セミ化活性が確認されたことより、この遺伝子がパスツ
レラニューモトロピカ（Pasteurella pneumotropica）
ＡＪ１１２２１株由来のヒダントインラセマーゼ遺伝子
であり、Ｅ．ｃｏｌｉの菌体内で効率良く発現されてい
ることを確認した。
【０１１５】
【表４】
【０１１６】（実施例４）Ｅ．ｃｏｌｉ洗浄菌体を用い
たベンジルヒダントインのラセミ化反応 ０．１２ｇ／ｄｌ (５．２ｍＭ) Ｄ-５-ベンジルヒダン
トインもしくはＬ-５-ベンジルヒダントイン、０．１Ｍ
ＫＰＢ (ｐＨ ７．５)、０．０１ｇ／ｄｌのＪＭ１０
９／ｐＵＣＨＲ２洗浄菌体を混合し、３７℃で反応させ
た。反応液の一部を経時的にサンプリングし、遠心上清
をＨＰＬＣで解析した。
たベンジルヒダントインのラセミ化反応 ０．１２ｇ／ｄｌ (５．２ｍＭ) Ｄ-５-ベンジルヒダン
トインもしくはＬ-５-ベンジルヒダントイン、０．１Ｍ
ＫＰＢ (ｐＨ ７．５)、０．０１ｇ／ｄｌのＪＭ１０
９／ｐＵＣＨＲ２洗浄菌体を混合し、３７℃で反応させ
た。反応液の一部を経時的にサンプリングし、遠心上清
をＨＰＬＣで解析した。
【０１１７】その結果を表５に示した。この表に示され
るように、ヒダントインラセマーゼ遺伝子を発現させた
Ｅ．ｃｏｌｉ洗浄菌体を用いることにより、効率良くベ
ンジルヒダントインをラセミ化させることができた。
るように、ヒダントインラセマーゼ遺伝子を発現させた
Ｅ．ｃｏｌｉ洗浄菌体を用いることにより、効率良くベ
ンジルヒダントインをラセミ化させることができた。
【０１１８】
【表５】
【０１１９】（実施例５）Ｄ−ヒダントイナーゼおよび
Ｎ−カルバミルアミノ酸−Ｄ−ハイドロラーゼとの組み
合わせによるＤ−フェニルアラニンの生産 Ｄ−ＨＨａｓｅ遺伝子およびＤ−ＣＨａｓｅ遺伝子の両
遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで発現させるために、ｐＵＣ１８
のｌａｃプロモーターの下流に両遺伝子を連結したプラ
スミドｐＵＣ４１３ＨおよびｐＵＣ４１３Ｃを以下のよ
うにして構築した。まず、パスツレラ ニューモトロピ
カ(Pasteurella pneumotropica)ＡＪ１１２２１株の染
色体ＤＮＡを鋳型とし、表６に示すオリゴヌクレオチド
をプライマーとしてＰＣＲにより各遺伝子を増幅した。
これらの断片を、それぞれＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ、
ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩにて処理し、ｐＵＣ１８のＸｂａ
Ｉ／ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ切断物とラ
イゲーションした後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ に導入
した。アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを
持った株を選択し、それぞれのプラスミドを発現プラス
ミドｐＵＣ４１３ＨおよびｐＵＣ４１３Ｃと命名した。
Ｎ−カルバミルアミノ酸−Ｄ−ハイドロラーゼとの組み
合わせによるＤ−フェニルアラニンの生産 Ｄ−ＨＨａｓｅ遺伝子およびＤ−ＣＨａｓｅ遺伝子の両
遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで発現させるために、ｐＵＣ１８
のｌａｃプロモーターの下流に両遺伝子を連結したプラ
スミドｐＵＣ４１３ＨおよびｐＵＣ４１３Ｃを以下のよ
うにして構築した。まず、パスツレラ ニューモトロピ
カ(Pasteurella pneumotropica)ＡＪ１１２２１株の染
色体ＤＮＡを鋳型とし、表６に示すオリゴヌクレオチド
をプライマーとしてＰＣＲにより各遺伝子を増幅した。
これらの断片を、それぞれＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ、
ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩにて処理し、ｐＵＣ１８のＸｂａ
Ｉ／ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ切断物とラ
イゲーションした後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ に導入
した。アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを
持った株を選択し、それぞれのプラスミドを発現プラス
ミドｐＵＣ４１３ＨおよびｐＵＣ４１３Ｃと命名した。
【０１２０】
【表６】
【０１２１】Ｄ−ＨＨａｓｅ遺伝子搭載プラスミドｐＵ
Ｃ４１３Ｈを持つＥ．ｃｏｌｉ形質転換体（ＪＭ１０９
／ｐＵＣ４１３Ｈ）およびＤ−ＣＨａｓｅ遺伝子搭載プ
ラスミドｐＵＣ４１３Ｃを持つＥ．ｃｏｌｉ形質転換体
（ＪＭ１０９／ｐＵＣ４１３Ｃ）を０．１ｍｇ／ｍｌア
ンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃、１６時間シード培
養した。ＬＢ培地５０ｍｌを張り込んだ５００ｍｌ容坂
口フラスコにこれらのシード培養液を１ｍｌ添加し、３
７℃にて本培養を行った。培養開始２．５時間後に、終
濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに４時
間培養を行った。培養終了後、集菌、洗浄を行い、洗浄
菌体を調製した。また、実施例３と同様にしてＪＭ１０
９／ｐＵＣＨＲ２の洗浄菌体を調製し、上記Ｄ−ＨＨａ
ｓｅ遺伝子発現株およびＤ−ＣＨａｓｅ遺伝子発現株の
洗浄菌体とともに１ｇ／ｄｌのＤＬ−５−ベンジルヒダ
ントインを含む０．１ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．５）にそ
れぞれ１ｇ／ｄｌとなるように添加して３７℃で反応さ
せた。反応２４時間後にサンプリングし、遠心上清をＨ
ＰＬＣで解析することにより、生成したＤ−フェニルア
ラニンを定量した。
Ｃ４１３Ｈを持つＥ．ｃｏｌｉ形質転換体（ＪＭ１０９
／ｐＵＣ４１３Ｈ）およびＤ−ＣＨａｓｅ遺伝子搭載プ
ラスミドｐＵＣ４１３Ｃを持つＥ．ｃｏｌｉ形質転換体
（ＪＭ１０９／ｐＵＣ４１３Ｃ）を０．１ｍｇ／ｍｌア
ンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃、１６時間シード培
養した。ＬＢ培地５０ｍｌを張り込んだ５００ｍｌ容坂
口フラスコにこれらのシード培養液を１ｍｌ添加し、３
７℃にて本培養を行った。培養開始２．５時間後に、終
濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに４時
間培養を行った。培養終了後、集菌、洗浄を行い、洗浄
菌体を調製した。また、実施例３と同様にしてＪＭ１０
９／ｐＵＣＨＲ２の洗浄菌体を調製し、上記Ｄ−ＨＨａ
ｓｅ遺伝子発現株およびＤ−ＣＨａｓｅ遺伝子発現株の
洗浄菌体とともに１ｇ／ｄｌのＤＬ−５−ベンジルヒダ
ントインを含む０．１ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．５）にそ
れぞれ１ｇ／ｄｌとなるように添加して３７℃で反応さ
せた。反応２４時間後にサンプリングし、遠心上清をＨ
ＰＬＣで解析することにより、生成したＤ−フェニルア
ラニンを定量した。
【０１２２】その結果を表７に示した。この表に示され
るように、ヒダントインラセマーゼ遺伝子、Ｄ−ＨＨａ
ｓｅ遺伝子およびＤ−ＣＨａｓｅ遺伝子を発現させた
Ｅ．ｃｏｌｉ洗浄菌体を用いることにより、ＤＬ体のベ
ンジルヒダントインから効率良くＤ−フェニルアラニン
を生成させることができた。
るように、ヒダントインラセマーゼ遺伝子、Ｄ−ＨＨａ
ｓｅ遺伝子およびＤ−ＣＨａｓｅ遺伝子を発現させた
Ｅ．ｃｏｌｉ洗浄菌体を用いることにより、ＤＬ体のベ
ンジルヒダントインから効率良くＤ−フェニルアラニン
を生成させることができた。
【０１２３】
【表７】
【０１２４】
【発明の効果】本発明によって、新規なヒダントインラ
セマーゼの遺伝子を大腸菌などの宿主において安定に大
量に発現させることが可能である。したがって、このよ
うな形質転換体から該酵素を容易に調製することがで
き、該形質転換体やその抽出液、精製酵素等を用いるこ
とによって各種５置換ヒダントイン化合物のラセミ化を
効率良く行うことができる。また、各種ヒダントイナー
ゼ、カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼなどと組み合わ
せて用いることにより、医薬品、化学工業品、食品添加
物等の製造に有用なＤ−アミノ酸やＬ−アミノ酸を効率
良く生産できる。
セマーゼの遺伝子を大腸菌などの宿主において安定に大
量に発現させることが可能である。したがって、このよ
うな形質転換体から該酵素を容易に調製することがで
き、該形質転換体やその抽出液、精製酵素等を用いるこ
とによって各種５置換ヒダントイン化合物のラセミ化を
効率良く行うことができる。また、各種ヒダントイナー
ゼ、カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼなどと組み合わ
せて用いることにより、医薬品、化学工業品、食品添加
物等の製造に有用なＤ−アミノ酸やＬ−アミノ酸を効率
良く生産できる。
【０１２５】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> 味の素株式会社
Ajinomoto Co., Inc.
<120> ５置換ヒダントインラセマーゼ、これをコードするＤＮＡ、組み換えＤＮ
Ａ、形質転換された細胞および光学活性アミノ酸の製造方法
<130> PAMA-13350
<140>
<141>
<160> 14
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 747
<212> DNA
<213> Pasteurella pneumotropica
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(747)
<223> HRase
<400> 1
atg aag atc aag gtg atc aac ccg aac acc acc tgg tcc atg acc gag 48
Met Lys Ile Lys Val Ile Asn Pro Asn Thr Thr Trp Ser Met Thr Glu
1 5 10 15
aag atc ggc gag gcg gcg cga cgc gtg gcg gcg ccc ggc acc gag atc 96
Lys Ile Gly Glu Ala Ala Arg Arg Val Ala Ala Pro Gly Thr Glu Ile
20 25 30
gtc gcc gtg tcg ccg gca atg ggc ccg gtc tcg atc gag ggc ttc tat 144
Val Ala Val Ser Pro Ala Met Gly Pro Val Ser Ile Glu Gly Phe Tyr
35 40 45
gac gag gcc ttc gcc gcc atc ggc gtc atc gac gaa gtg cgg aag ggc 192
Asp Glu Ala Phe Ala Ala Ile Gly Val Ile Asp Glu Val Arg Lys Gly
50 55 60
gag gaa gag ggc tgc gac ggc tat gtc atc gcc tgc ttc ggc gat ccg 240
Glu Glu Glu Gly Cys Asp Gly Tyr Val Ile Ala Cys Phe Gly Asp Pro
65 70 75 80
ggc ctg ctg gcg gcg cgc gag atc gcg cgc gga ccg gtc gtc ggc atc 288
Gly Leu Leu Ala Ala Arg Glu Ile Ala Arg Gly Pro Val Val Gly Ile
85 90 95
gcc gag gcg gcc atg cat gcg gcg agc ctg atc ggc aac ggc ttc acc 336
Ala Glu Ala Ala Met His Ala Ala Ser Leu Ile Gly Asn Gly Phe Thr
100 105 110
atc gtc tcg atg ctg gag cgg acg cgg gcg acg atg gaa cac ctc gtg 384
Ile Val Ser Met Leu Glu Arg Thr Arg Ala Thr Met Glu His Leu Val
115 120 125
cac gcc tat ggc atg agc cac aag tgc cgc aac atc cgc atg acc gac 432
His Ala Tyr Gly Met Ser His Lys Cys Arg Asn Ile Arg Met Thr Asp
130 135 140
ctg ccg gtg ctg gaa ctg gaa aag gaa ggc tcg aac gcg cag gcg atc 480
Leu Pro Val Leu Glu Leu Glu Lys Glu Gly Ser Asn Ala Gln Ala Ile
145 150 155 160
atc atc gag gaa tgc cgc cgc gcg ctg gaa gag gac cat tcc gac gcg 528
Ile Ile Glu Glu Cys Arg Arg Ala Leu Glu Glu Asp His Ser Asp Ala
165 170 175
gtg ctg ctc ggc tgc ggc ggc atg tcg gac ctg atg gcg ctc atc acc 576
Val Leu Leu Gly Cys Gly Gly Met Ser Asp Leu Met Ala Leu Ile Thr
180 185 190
cgc gag atc ggc gcg ccg gcg atc gac ggc gtt tcg tcg ggc gtc aag 624
Arg Glu Ile Gly Ala Pro Ala Ile Asp Gly Val Ser Ser Gly Val Lys
195 200 205
ctg gtc gag gcc ctg gtt tcg ctc ggc ctc ggc acc tcg aag cgg cag 672
Leu Val Glu Ala Leu Val Ser Leu Gly Leu Gly Thr Ser Lys Arg Gln
210 215 220
gcc tac gcc tat ccg gtc gag aag acc tac acc gga agc ttc agc caa 720
Ala Tyr Ala Tyr Pro Val Glu Lys Thr Tyr Thr Gly Ser Phe Ser Gln
225 230 235 240
ttt tcc gtt ccg gcc gcg aat gtc tga 747
Phe Ser Val Pro Ala Ala Asn Val
245
<210> 2
<211> 248
<212> PRT
<213> Pasteurella pneumotropica
<400> 2
Met Lys Ile Lys Val Ile Asn Pro Asn Thr Thr Trp Ser Met Thr Glu
1 5 10 15
Lys Ile Gly Glu Ala Ala Arg Arg Val Ala Ala Pro Gly Thr Glu Ile
20 25 30
Val Ala Val Ser Pro Ala Met Gly Pro Val Ser Ile Glu Gly Phe Tyr
35 40 45
Asp Glu Ala Phe Ala Ala Ile Gly Val Ile Asp Glu Val Arg Lys Gly
50 55 60
Glu Glu Glu Gly Cys Asp Gly Tyr Val Ile Ala Cys Phe Gly Asp Pro
65 70 75 80
Gly Leu Leu Ala Ala Arg Glu Ile Ala Arg Gly Pro Val Val Gly Ile
85 90 95
Ala Glu Ala Ala Met His Ala Ala Ser Leu Ile Gly Asn Gly Phe Thr
100 105 110
Ile Val Ser Met Leu Glu Arg Thr Arg Ala Thr Met Glu His Leu Val
115 120 125
His Ala Tyr Gly Met Ser His Lys Cys Arg Asn Ile Arg Met Thr Asp
130 135 140
Leu Pro Val Leu Glu Leu Glu Lys Glu Gly Ser Asn Ala Gln Ala Ile
145 150 155 160
Ile Ile Glu Glu Cys Arg Arg Ala Leu Glu Glu Asp His Ser Asp Ala
165 170 175
Val Leu Leu Gly Cys Gly Gly Met Ser Asp Leu Met Ala Leu Ile Thr
180 185 190
Arg Glu Ile Gly Ala Pro Ala Ile Asp Gly Val Ser Ser Gly Val Lys
195 200 205
Leu Val Glu Ala Leu Val Ser Leu Gly Leu Gly Thr Ser Lys Arg Gln
210 215 220
Ala Tyr Ala Tyr Pro Val Glu Lys Thr Tyr Thr Gly Ser Phe Ser Gln
225 230 235 240
Phe Ser Val Pro Ala Ala Asn Val
245
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer(3)
<400> 3
ggtctcgatc gagggcttct atgacga 27
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer(4)
<400> 4
atctcgcggg tgatgatcgc catca 25
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer(5)
<400> 5
cgcgaattca acccgaggaa ccccgatgaa 30
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer(6)
<400> 6
cgcggatccc gcccatcgtc tcagacatt 29
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer(7)
<400> 7
cgctctagag ggagactgac gatggatctc atcgt 35
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer(8)
<400> 8
cgcaagcttc ctctgacgcg gcgaatg 27
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer(9)
<400> 9
cgcgaattcc atcgaaccag ggaggatttt gga 33
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer(10)
<400> 10
cgctctagac gcccgctagc ggacctgtt 29
<210> 11
<211> 1389
<212> DNA
<213> Pasteurella pneumotropica
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1389)
<223> D-HHase
<400> 11
atg gat ctc atc gtc aag aac gga acg atc gtc acc gcc gcc ggc att 48
Met Asp Leu Ile Val Lys Asn Gly Thr Ile Val Thr Ala Ala Gly Ile
1 5 10 15
tcg cgc gcg gat ctc ggc gtc agg gac ggc aag atc gtc cag atc ggc 96
Ser Arg Ala Asp Leu Gly Val Arg Asp Gly Lys Ile Val Gln Ile Gly
20 25 30
ggc gat ctc ggc gag gcg gcg cgc acg atc gac gcg acc ggc cgc tat 144
Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ala Arg Thr Ile Asp Ala Thr Gly Arg Tyr
35 40 45
gtc atg ccg ggc ggc gtc gac gtc cac acc cat atc gac tcc aac aac 192
Val Met Pro Gly Gly Val Asp Val His Thr His Ile Asp Ser Asn Asn
50 55 60
atg gag acg aag tcg gcg gac gat ttc cgg acc ggc acg atc gcg gcg 240
Met Glu Thr Lys Ser Ala Asp Asp Phe Arg Thr Gly Thr Ile Ala Ala
65 70 75 80
gcc tgt ggc ggc acg acg acg atc gtc gat ttc tgc gcc cag gac cgg 288
Ala Cys Gly Gly Thr Thr Thr Ile Val Asp Phe Cys Ala Gln Asp Arg
85 90 95
ggc ggc acg ctc gcc gag gcg atc gcc aaa tgg gac ggg cgg gcg gcc 336
Gly Gly Thr Leu Ala Glu Ala Ile Ala Lys Trp Asp Gly Arg Ala Ala
100 105 110
ggc aag gcg gcg atc gac tac ggc tac cat gtc atc gtg ctc gac atg 384
Gly Lys Ala Ala Ile Asp Tyr Gly Tyr His Val Ile Val Leu Asp Met
115 120 125
aat ccc ggc gtg ttc gag gag ttg ctg acg ctg ccg gag cgt ggc att 432
Asn Pro Gly Val Phe Glu Glu Leu Leu Thr Leu Pro Glu Arg Gly Ile
130 135 140
ccc tcc ttc aag gtg ttc atg gcc tat cgc ggc atg aac atg atc gac 480
Pro Ser Phe Lys Val Phe Met Ala Tyr Arg Gly Met Asn Met Ile Asp
145 150 155 160
gac gtc acc ctg ctg aag acg ctg gag cag gcc aag cgc tcg ggg gcg 528
Asp Val Thr Leu Leu Lys Thr Leu Glu Gln Ala Lys Arg Ser Gly Ala
165 170 175
ctg gtc atg gtc cat gcc gag aac ggt gat gcg gcg gat ttc ctg cgc 576
Leu Val Met Val His Ala Glu Asn Gly Asp Ala Ala Asp Phe Leu Arg
180 185 190
gac aag ttc gtc gcc gag ggc aag acc tcg ccg aaa tac cac gcg ctc 624
Asp Lys Phe Val Ala Glu Gly Lys Thr Ser Pro Lys Tyr His Ala Leu
195 200 205
agc cgg ccg ccg cgg gtc gag gcc gag gcg acc gcg cgc gcc atc gcg 672
Ser Arg Pro Pro Arg Val Glu Ala Glu Ala Thr Ala Arg Ala Ile Ala
210 215 220
atg gcc gag atc gtc ggc acc tcg atc tac atc gtg cac ctg acc tgc 720
Met Ala Glu Ile Val Gly Thr Ser Ile Tyr Ile Val His Leu Thr Cys
225 230 235 240
gag gag gcg ctg gag gaa ctg atg cgc gcc aag gcg cgc ggc gtc gac 768
Glu Glu Ala Leu Glu Glu Leu Met Arg Ala Lys Ala Arg Gly Val Asp
245 250 255
gcg ctg gcc gag acc tgc acg cag tat ctc tac ctg acc aag gac gac 816
Ala Leu Ala Glu Thr Cys Thr Gln Tyr Leu Tyr Leu Thr Lys Asp Asp
260 265 270
ctc gac cgg ccg ggc ttc gag ggg gcg aag ttc gtc ttc acg ccg ccg 864
Leu Asp Arg Pro Gly Phe Glu Gly Ala Lys Phe Val Phe Thr Pro Pro
275 280 285
ccg cgc gag gtc aag gac cag gaa atc ctc tgg gag gcg ctg gcc aac 912
Pro Arg Glu Val Lys Asp Gln Glu Ile Leu Trp Glu Ala Leu Ala Asn
290 295 300
cgc gtg ttc gag acg gtg tcg tcc gat cac tgc tcc tgg ctc tac aag 960
Arg Val Phe Glu Thr Val Ser Ser Asp His Cys Ser Trp Leu Tyr Lys
305 310 315 320
ggc cac aag gat gag ggc ctg cac gat ttc cgg ctg atc ccg aac ggg 1008
Gly His Lys Asp Glu Gly Leu His Asp Phe Arg Leu Ile Pro Asn Gly
325 330 335
gcg ccc ggc gtc gag gag cgg atg atg atg gtc tac cag ggc gtc aac 1056
Ala Pro Gly Val Glu Glu Arg Met Met Met Val Tyr Gln Gly Val Asn
340 345 350
cag ggc cgc atc tcg ctg acc cag ttc gtc gac ctg gtg gcg acg cgg 1104
Gln Gly Arg Ile Ser Leu Thr Gln Phe Val Asp Leu Val Ala Thr Arg
355 360 365
ccg gcg cag gtg ttc ggc atg ttc ccg cag aag ggc acc atc gcc gtc 1152
Pro Ala Gln Val Phe Gly Met Phe Pro Gln Lys Gly Thr Ile Ala Val
370 375 380
ggc tcc gac gcc gac ctc gtc atc tgg gac ccg gag gcg acg atg acg 1200
Gly Ser Asp Ala Asp Leu Val Ile Trp Asp Pro Glu Ala Thr Met Thr
385 390 395 400
atc acc cag tcg gcg atg aac aac gcg atg gac tac tcg acc tat gag 1248
Ile Thr Gln Ser Ala Met Asn Asn Ala Met Asp Tyr Ser Thr Tyr Glu
405 410 415
ggc cag gcc gtc aag gga atg ccc acg acg gtg gtg ctg cgc ggc aag 1296
Gly Gln Ala Val Lys Gly Met Pro Thr Thr Val Val Leu Arg Gly Lys
420 425 430
gtc atc gtc gag gat cgc aac tat gtc ggc acg ccc ggc gaa ggg cgt 1344
Val Ile Val Glu Asp Arg Asn Tyr Val Gly Thr Pro Gly Glu Gly Arg
435 440 445
ttc ctg cgg cgc gag cgc tac gcg cgt tcc ccg aag ctc gcc tga 1389
Phe Leu Arg Arg Glu Arg Tyr Ala Arg Ser Pro Lys Leu Ala
450 455 460
<210> 12
<211> 462
<212> PRT
<213> Pasteurella pneumotropica
<400> 12
Met Asp Leu Ile Val Lys Asn Gly Thr Ile Val Thr Ala Ala Gly Ile
1 5 10 15
Ser Arg Ala Asp Leu Gly Val Arg Asp Gly Lys Ile Val Gln Ile Gly
20 25 30
Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ala Arg Thr Ile Asp Ala Thr Gly Arg Tyr
35 40 45
Val Met Pro Gly Gly Val Asp Val His Thr His Ile Asp Ser Asn Asn
50 55 60
Met Glu Thr Lys Ser Ala Asp Asp Phe Arg Thr Gly Thr Ile Ala Ala
65 70 75 80
Ala Cys Gly Gly Thr Thr Thr Ile Val Asp Phe Cys Ala Gln Asp Arg
85 90 95
Gly Gly Thr Leu Ala Glu Ala Ile Ala Lys Trp Asp Gly Arg Ala Ala
100 105 110
Gly Lys Ala Ala Ile Asp Tyr Gly Tyr His Val Ile Val Leu Asp Met
115 120 125
Asn Pro Gly Val Phe Glu Glu Leu Leu Thr Leu Pro Glu Arg Gly Ile
130 135 140
Pro Ser Phe Lys Val Phe Met Ala Tyr Arg Gly Met Asn Met Ile Asp
145 150 155 160
Asp Val Thr Leu Leu Lys Thr Leu Glu Gln Ala Lys Arg Ser Gly Ala
165 170 175
Leu Val Met Val His Ala Glu Asn Gly Asp Ala Ala Asp Phe Leu Arg
180 185 190
Asp Lys Phe Val Ala Glu Gly Lys Thr Ser Pro Lys Tyr His Ala Leu
195 200 205
Ser Arg Pro Pro Arg Val Glu Ala Glu Ala Thr Ala Arg Ala Ile Ala
210 215 220
Met Ala Glu Ile Val Gly Thr Ser Ile Tyr Ile Val His Leu Thr Cys
225 230 235 240
Glu Glu Ala Leu Glu Glu Leu Met Arg Ala Lys Ala Arg Gly Val Asp
245 250 255
Ala Leu Ala Glu Thr Cys Thr Gln Tyr Leu Tyr Leu Thr Lys Asp Asp
260 265 270
Leu Asp Arg Pro Gly Phe Glu Gly Ala Lys Phe Val Phe Thr Pro Pro
275 280 285
Pro Arg Glu Val Lys Asp Gln Glu Ile Leu Trp Glu Ala Leu Ala Asn
290 295 300
Arg Val Phe Glu Thr Val Ser Ser Asp His Cys Ser Trp Leu Tyr Lys
305 310 315 320
Gly His Lys Asp Glu Gly Leu His Asp Phe Arg Leu Ile Pro Asn Gly
325 330 335
Ala Pro Gly Val Glu Glu Arg Met Met Met Val Tyr Gln Gly Val Asn
340 345 350
Gln Gly Arg Ile Ser Leu Thr Gln Phe Val Asp Leu Val Ala Thr Arg
355 360 365
Pro Ala Gln Val Phe Gly Met Phe Pro Gln Lys Gly Thr Ile Ala Val
370 375 380
Gly Ser Asp Ala Asp Leu Val Ile Trp Asp Pro Glu Ala Thr Met Thr
385 390 395 400
Ile Thr Gln Ser Ala Met Asn Asn Ala Met Asp Tyr Ser Thr Tyr Glu
405 410 415
Gly Gln Ala Val Lys Gly Met Pro Thr Thr Val Val Leu Arg Gly Lys
420 425 430
Val Ile Val Glu Asp Arg Asn Tyr Val Gly Thr Pro Gly Glu Gly Arg
435 440 445
Phe Leu Arg Arg Glu Arg Tyr Ala Arg Ser Pro Lys Leu Ala
450 455 460
<210> 13
<211> 964
<212> DNA
<213> Pasteurella pneumotropica
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(924)
<223> D-CHase
<400> 13
atg agc agg aag atg att ctc gcc gtt ggc cag cag ggg ccg atc cag 48
Met Ser Arg Lys Met Ile Leu Ala Val Gly Gln Gln Gly Pro Ile Gln
1 5 10 15
cgc gcc gat acg cgc gag cag gtc gtc gcg cgg ctg atc gag atg ctg 96
Arg Ala Asp Thr Arg Glu Gln Val Val Ala Arg Leu Ile Glu Met Leu
20 25 30
aag gaa gcg aag gcg cgc aac gcc gat ttc gtc gtc ttc ccc gag ctc 144
Lys Glu Ala Lys Ala Arg Asn Ala Asp Phe Val Val Phe Pro Glu Leu
35 40 45
gcc ctg acc acc ttc ttc ccg cgc tgg tac ttc acc gac gag gcg gag 192
Ala Leu Thr Thr Phe Phe Pro Arg Trp Tyr Phe Thr Asp Glu Ala Glu
50 55 60
ctc gac ttc ttc tac gaa acg gag atg ccg ggg ccg gca acg cgc ccg 240
Leu Asp Phe Phe Tyr Glu Thr Glu Met Pro Gly Pro Ala Thr Arg Pro
65 70 75 80
ctg ttc gag aag gcg acc gag ctc ggc atc ggc ttc acc atc tcc ttc 288
Leu Phe Glu Lys Ala Thr Glu Leu Gly Ile Gly Phe Thr Ile Ser Phe
85 90 95
gcc gag ctg gtg atg gag ggg acg acc aag cgg cgc ttc aac acc tcg 336
Ala Glu Leu Val Met Glu Gly Thr Thr Lys Arg Arg Phe Asn Thr Ser
100 105 110
ctg gcg atc gac aag tcc ggc cgg gtc gcc ggc aag tac cgc aag atc 384
Leu Ala Ile Asp Lys Ser Gly Arg Val Ala Gly Lys Tyr Arg Lys Ile
115 120 125
cat ctc ccc ggc cac aag gaa tac gag gcc tac cgg ccg ttc cag cac 432
His Leu Pro Gly His Lys Glu Tyr Glu Ala Tyr Arg Pro Phe Gln His
130 135 140
ctc gag aag cgc tat ttc gag agc ggc gac ctc ggc ttc cag gtc aac 480
Leu Glu Lys Arg Tyr Phe Glu Ser Gly Asp Leu Gly Phe Gln Val Asn
145 150 155 160
gac gtc gac ggc gcc aag ctc ggc atg ttc atc tgc aac gac cgc cgc 528
Asp Val Asp Gly Ala Lys Leu Gly Met Phe Ile Cys Asn Asp Arg Arg
165 170 175
tgg ccg gag acc tgg cgc gtc atg ggc ctc aag ggc gcc gag atc atc 576
Trp Pro Glu Thr Trp Arg Val Met Gly Leu Lys Gly Ala Glu Ile Ile
180 185 190
tgc ggc ggc tac aac acg ccg ctg cac aac ccg ccc gtg ccg cag cat 624
Cys Gly Gly Tyr Asn Thr Pro Leu His Asn Pro Pro Val Pro Gln His
195 200 205
gac cag ctg agc tcg ttc cac cac ctg ctg tcg atg cag gcc ggg gcg 672
Asp Gln Leu Ser Ser Phe His His Leu Leu Ser Met Gln Ala Gly Ala
210 215 220
tac cag aac ggc gcc tgg gcg gcg gct gcc ggc aag gtc ggc atc gag 720
Tyr Gln Asn Gly Ala Trp Ala Ala Ala Ala Gly Lys Val Gly Ile Glu
225 230 235 240
gaa ggc tgc atg ctg ctc ggc cat tcc tgc atc gtg gcg ccg aca ggc 768
Glu Gly Cys Met Leu Leu Gly His Ser Cys Ile Val Ala Pro Thr Gly
245 250 255
gag ctc gtc gcc atg acc aac acg ctc gag gac gag gtg atc acc gcc 816
Glu Leu Val Ala Met Thr Asn Thr Leu Glu Asp Glu Val Ile Thr Ala
260 265 270
gcc gtc gac ctc gat cgc tgc cgc gag atc cgc gag aac atc ttc aac 864
Ala Val Asp Leu Asp Arg Cys Arg Glu Ile Arg Glu Asn Ile Phe Asn
275 280 285
ttc gcc ctg cac cgc gaa ccg aag aac tac gcg atc atc gcg gaa gaa 912
Phe Ala Leu His Arg Glu Pro Lys Asn Tyr Ala Ile Ile Ala Glu Glu
290 295 300
cag gtc cgc tag cgggcgtcgc cgggctcggc ggccggggtg atcggcgtga 964
Gln Val Arg
305
<210> 14
<211> 307
<212> PRT
<213> Pasteurella pneumotropica
<400> 14
Met Ser Arg Lys Met Ile Leu Ala Val Gly Gln Gln Gly Pro Ile Gln
1 5 10 15
Arg Ala Asp Thr Arg Glu Gln Val Val Ala Arg Leu Ile Glu Met Leu
20 25 30
Lys Glu Ala Lys Ala Arg Asn Ala Asp Phe Val Val Phe Pro Glu Leu
35 40 45
Ala Leu Thr Thr Phe Phe Pro Arg Trp Tyr Phe Thr Asp Glu Ala Glu
50 55 60
Leu Asp Phe Phe Tyr Glu Thr Glu Met Pro Gly Pro Ala Thr Arg Pro
65 70 75 80
Leu Phe Glu Lys Ala Thr Glu Leu Gly Ile Gly Phe Thr Ile Ser Phe
85 90 95
Ala Glu Leu Val Met Glu Gly Thr Thr Lys Arg Arg Phe Asn Thr Ser
100 105 110
Leu Ala Ile Asp Lys Ser Gly Arg Val Ala Gly Lys Tyr Arg Lys Ile
115 120 125
His Leu Pro Gly His Lys Glu Tyr Glu Ala Tyr Arg Pro Phe Gln His
130 135 140
Leu Glu Lys Arg Tyr Phe Glu Ser Gly Asp Leu Gly Phe Gln Val Asn
145 150 155 160
Asp Val Asp Gly Ala Lys Leu Gly Met Phe Ile Cys Asn Asp Arg Arg
165 170 175
Trp Pro Glu Thr Trp Arg Val Met Gly Leu Lys Gly Ala Glu Ile Ile
180 185 190
Cys Gly Gly Tyr Asn Thr Pro Leu His Asn Pro Pro Val Pro Gln His
195 200 205
Asp Gln Leu Ser Ser Phe His His Leu Leu Ser Met Gln Ala Gly Ala
210 215 220
Tyr Gln Asn Gly Ala Trp Ala Ala Ala Ala Gly Lys Val Gly Ile Glu
225 230 235 240
Glu Gly Cys Met Leu Leu Gly His Ser Cys Ile Val Ala Pro Thr Gly
245 250 255
Glu Leu Val Ala Met Thr Asn Thr Leu Glu Asp Glu Val Ile Thr Ala
260 265 270
Ala Val Asp Leu Asp Arg Cys Arg Glu Ile Arg Glu Asn Ile Phe Asn
275 280 285
Phe Ala Leu His Arg Glu Pro Lys Asn Tyr Ala Ile Ile Ala Glu Glu
290 295 300
Gln Val Arg
305
【図１】ＡＪ１１２２１株のＤ−ヒダントイナーゼ、Ｄ
−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼ、およびヒダント
インラセマーゼをコードする遺伝子群の構造を示す図で
ある。
−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼ、およびヒダント
インラセマーゼをコードする遺伝子群の構造を示す図で
ある。
【図２】本発明のヒダントインラセマーゼの製造工程を
示すフローチャートである。
示すフローチャートである。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【書類名】 受託番号変更届
【整理番号】 ＰＡＭＡ−１３３５０
【提出日】 平成１４年９月１２日
【旧寄託機関の名称】 通商産業省工業技術院生命工
学工業技術研究所
学工業技術研究所
【旧受託番号】 ＦＥＲＭ −Ｐ ４３４８
【新寄託機関の名称】 独立行政法人産業技術総合研
究所 特許生物寄託セン ター
究所 特許生物寄託セン ター
【新受託番号】 ＦＥＲＭ ＢＰ− ８０６４
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｐ 13/02 Ｃ１２Ｐ 13/04
13/04 41/00 Ａ
41/00 Ｃ１２Ｒ 1:19
//(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(72)発明者 渡部 乙比古
神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の
素株式会社アミノサイエンス研究所内
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 AA05 AA07 AA11
BA07 BA11 BA71 CA03 DA06
EA04 GA11 GA19 GA27
4B050 CC03 DD02 EE01 LL01 LL02
LL03 LL05
4B064 AE02 AE03 CA21 CB06 CB30
CC01 CD12 CD13 DA01 DA10
DA11 DA13
4B065 AA01Y AA26X AB01 AC14
BA02 BA25 BB01 BC03 BC26
CA17 CA27 CA31 CA41 CA43
CA44 CA46
4H006 AA02 AC80 NB00
Claims (13)
- 【請求項１】 下記(a)または(b)のアミノ酸配列を有
し、５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパ
ク質。 (a)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列 (b)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において
１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加
または逆位を含むアミノ酸配列 - 【請求項２】 パスツレラ属細菌を培養して得た菌体を
破砕または溶菌後、精製処理を行うことにより取得され
るパスツレラ属細菌由来の５置換ヒダントインラセマー
ゼ画分。 - 【請求項３】 請求項１に記載の５置換ヒダントインラ
セマーゼ活性を有するタンパク質または請求項２に記載
の５置換ヒダントインラセマーゼ画分を、光学活性５置
換ヒダントイン化合物に作用させることを特徴とする光
学活性５置換ヒダントイン化合物のラセミ化方法。 - 【請求項４】 請求項１に記載の５置換ヒダントインラ
セマーゼ活性を有するタンパク質または請求項２に記載
の５置換ヒダントインラセマーゼ画分、および、５置換
ヒダントイン化合物を光学選択的に加水分解する酵素ま
たは当該酵素含有物を、５置換ヒダントイン化合物に作
用させることを特徴とするＮ−カルバミルアミノ酸の製
造方法。 - 【請求項５】 下記(ii)および(iii)のうち少なくとも
一方が光学選択的に基質を加水分解する酵素または酵素
含有物であり、下記(i）、(ii)および(iii)を５置換ヒ
ダントイン化合物に作用させることを特徴とする光学活
性アミノ酸の製造方法。 (i)請求項１に記載の５置換ヒダントインラセマーゼ活
性を有するタンパク質または請求項２に記載の５置換ヒ
ダントインラセマーゼ画分 (ii)５置換ヒダントイン化合物を加水分解する酵素また
は当該酵素含有物 (iii)Ｎ−カルバミルアミノ酸を加水分解する酵素また
は当該酵素含有物 - 【請求項６】 請求項１に記載の５置換ヒダントインラ
セマーゼ活性を有するタンパク質または請求項２に記載
の５置換ヒダントインラセマーゼ画分と、５置換ヒダン
トイン化合物を光学選択的に加水分解する酵素または当
該酵素含有物と、Ｎ−カルバミルアミノ酸を化学的に加
水分解する化学的加水分解剤とを、５置換ヒダントイン
化合物に作用させることを特徴とする光学活性アミノ酸
の製造方法。 - 【請求項７】 下記(a)または(b)の塩基配列を有し、５
置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質を
コードするＤＮＡ。 (a)配列表の配列番号１に記載の塩基配列 (b)配列表の配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩
基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイ
ブリダイズする塩基配列 - 【請求項８】 下記(c)または(d)のアミノ酸配列を有し
５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質
をコードするＤＮＡ。 (c)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列 (d)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において
１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加
または逆位を含むアミノ酸配列 - 【請求項９】 請求項７または８のいずれかに記載のＤ
ＮＡとベクターＤＮＡとが接続されて得られる組み換え
ＤＮＡ。 - 【請求項１０】 前記ベクターＤＮＡは、ｐＵＣ系プラ
スミド、ｐＢＲ３２２系プラスミドまたはその誘導体で
あることを特徴とする請求項９に記載の組み換えＤＮ
Ａ。 - 【請求項１１】 請求項９または１０に記載の組み換え
ＤＮＡによって形質転換された細胞。 - 【請求項１２】 前記細胞は、エシェリヒア コリであ
ることを特徴とする請求項１１に記載の細胞。 - 【請求項１３】 請求項１１または１２に記載の細胞を
培地中で培養し、培地中および／または細胞中に５置換
ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質を蓄積
させることを特徴とする５置換ヒダントインラセマーゼ
活性を有するタンパク質の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002013553A JP2003210177A (ja) | 2002-01-22 | 2002-01-22 | ５置換ヒダントインラセマーゼ、これをコードするｄｎａ、組み換えｄｎａ、形質転換された細胞および光学活性アミノ酸の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002013553A JP2003210177A (ja) | 2002-01-22 | 2002-01-22 | ５置換ヒダントインラセマーゼ、これをコードするｄｎａ、組み換えｄｎａ、形質転換された細胞および光学活性アミノ酸の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003210177A true JP2003210177A (ja) | 2003-07-29 |
Family
ID=27650484
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002013553A Pending JP2003210177A (ja) | 2002-01-22 | 2002-01-22 | ５置換ヒダントインラセマーゼ、これをコードするｄｎａ、組み換えｄｎａ、形質転換された細胞および光学活性アミノ酸の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003210177A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1852510A1 (en) * | 2005-01-31 | 2007-11-07 | Kaneka Corporation | 5-substituted hydantoin racemase, dna encoding the same, recombinant dna, transformed cell, and process for production of optically active n-carbamylamino acid or optically active amino acid |
-
2002
- 2002-01-22 JP JP2002013553A patent/JP2003210177A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1852510A1 (en) * | 2005-01-31 | 2007-11-07 | Kaneka Corporation | 5-substituted hydantoin racemase, dna encoding the same, recombinant dna, transformed cell, and process for production of optically active n-carbamylamino acid or optically active amino acid |
| EP1852510A4 (en) * | 2005-01-31 | 2009-11-11 | Kaneka Corp | 5-SUBSTITUTED HYDANTOIN RACEMASE, DNA ENCODING THE SAME, RECOMBINANT DNA, TRANSFORMING CELL, AND PROCESS FOR SYNTHESIZING OPTICALLY ACTIVE N-CARBAMYLAMINE ACID OR OPTICALLY ACTIVE AMINO ACID |
| US7709235B2 (en) | 2005-01-31 | 2010-05-04 | Kaneka Corporation | 5-Substituted hydantoin racemase, DNA encoding the same, recombinant DNA, transformed cell, and process for production of optically active N-carbamylamino acid or optically active amino acid |
| JP5096911B2 (ja) * | 2005-01-31 | 2012-12-12 | 株式会社カネカ | ５−置換ヒダントインラセマーゼ、これをコードするｄｎａ、組換えｄｎａ、形質転換された細胞、および、光学活性ｎ−カルバミルアミノ酸または光学活性アミノ酸の製造方法 |
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