JP4094232B2 - 新規なアミダーゼ遺伝子 - Google Patents
新規なアミダーゼ遺伝子 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4094232B2 JP4094232B2 JP2000612433A JP2000612433A JP4094232B2 JP 4094232 B2 JP4094232 B2 JP 4094232B2 JP 2000612433 A JP2000612433 A JP 2000612433A JP 2000612433 A JP2000612433 A JP 2000612433A JP 4094232 B2 JP4094232 B2 JP 4094232B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- protein
- gene
- acid amide
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 title claims description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 76
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 34
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 33
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 claims description 29
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 claims description 27
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 26
- 150000001370 alpha-amino acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 25
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 24
- 229940061720 alpha hydroxy acid Drugs 0.000 claims description 23
- 150000001280 alpha hydroxy acids Chemical class 0.000 claims description 22
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 20
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 20
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 17
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 15
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 12
- JVTAAEKCZFNVCJ-REOHCLBHSA-N L-lactic acid Chemical compound C[C@H](O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- SXQFCVDSOLSHOQ-UHFFFAOYSA-N lactamide Chemical compound CC(O)C(N)=O SXQFCVDSOLSHOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- QCVCCWSPZIUXEA-SCSAIBSYSA-N (2s)-2-amino-3,3-dimethylbutanamide Chemical compound CC(C)(C)[C@H](N)C(N)=O QCVCCWSPZIUXEA-SCSAIBSYSA-N 0.000 claims description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 5
- 150000007649 L alpha amino acids Chemical class 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 42
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 24
- 239000002585 base Substances 0.000 description 17
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 12
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 9
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 229910002570 KH2PO4-Na2HPO4 Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N serine phosphoethanolamine Chemical compound [NH3+]CCOP([O-])(=O)OCC([NH3+])C([O-])=O UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M ampicillin sodium Chemical compound [Na+].C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C([O-])=O)(C)C)=CC=CC=C1 KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M 0.000 description 3
- 229960001931 ampicillin sodium Drugs 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 3
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001371 alpha-amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- -1 lactate amide Chemical class 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- NPDBDJFLKKQMCM-UHFFFAOYSA-N tert-butylglycine Chemical compound CC(C)(C)C(N)C(O)=O NPDBDJFLKKQMCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 2
- NPDBDJFLKKQMCM-SCSAIBSYSA-N (2s)-2-amino-3,3-dimethylbutanoic acid Chemical compound CC(C)(C)[C@H](N)C(O)=O NPDBDJFLKKQMCM-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- SXOUIMVOMIGLHO-AATRIKPKSA-N (E)-3-(indol-2-yl)acrylic acid Chemical compound C1=CC=C2NC(/C=C/C(=O)O)=CC2=C1 SXOUIMVOMIGLHO-AATRIKPKSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 102000004092 Amidohydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000531 Amidohydrolases Proteins 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 241000257469 Asterias Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010076804 DNA Restriction Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588697 Enterobacter cloacae Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 108010026752 Formamidase Proteins 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 101150094690 GAL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100021736 Galectin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100024637 Galectin-10 Human genes 0.000 description 1
- 101001011019 Gallus gallus Gallinacin-10 Proteins 0.000 description 1
- 101001011021 Gallus gallus Gallinacin-12 Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- FORGMRSGVSYZQR-YFKPBYRVSA-N L-leucinamide Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(N)=O FORGMRSGVSYZQR-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 241000863391 Methylophilus Species 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 108010048241 acetamidase Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 150000001261 hydroxy acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- PLVPPLCLBIEYEA-UHFFFAOYSA-N indoleacrylic acid Natural products C1=CC=C2C(C=CC(=O)O)=CNC2=C1 PLVPPLCLBIEYEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GVALZJMUIHGIMD-UHFFFAOYSA-H magnesium phosphate Chemical compound [Mg+2].[Mg+2].[Mg+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O GVALZJMUIHGIMD-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000004137 magnesium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229960002261 magnesium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 229910000157 magnesium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010994 magnesium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QLNJFJADRCOGBJ-UHFFFAOYSA-N propionamide Chemical compound CCC(N)=O QLNJFJADRCOGBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940080818 propionamide Drugs 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
本発明は、α−アミノ酸アミド及びα−ヒドロキシ酸アミドを立体選択的に加水分解するアミダーゼ活性を有する新規なタンパク質及び該タンパク質をコードする遺伝子に関する。
背景技術
微生物あるいは微生物由来の酵素をα−アミノ酸アミド及びα−ヒドロキシ酸アミドの加水分解触媒として用いることにより、光学活性なα−アミノ酸やα−ヒドロキシ酸を製造できることが知られている。例えば、光学活性なα−アミノ酸については、特開昭61−293394号公報、特開昭62−55097号公報、光学活性なα−ヒドロキシ酸については、特開平2−84198号公報等が挙げられる。
発明の開示
遺伝子組換えの方法でクローン化されたアミダーゼ遺伝子は、菌体内に多コピー存在させることができるため、微生物の触媒能力を従来の方法と比べ飛躍的に増大させることができる。
本発明者らは、より高い触媒活性を有する微生物触媒を調製する目的で、α−アミノ酸アミド及びα−ヒドロキシ酸アミドを立体選択的に加水分解するアミダーゼ遺伝子のクローニングを行い、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
(1)以下の(a)又は(b)のタンパク質。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1個若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、α−アミノ酸アミド及びα−ヒドロキシ酸アミドを立体選択的に加水分解するアミダーゼ活性を有するタンパク質。
(2)(1)記載のタンパク質をコードする遺伝子。
(3)配列番号2で表される塩基配列を含む、(2)記載の遺伝子。
(4)配列番号2で表される塩基配列又はそのフラグメントとハイブリダイズし、且つ、α−アミノ酸アミド及びα−ヒドロキシ酸アミドを立体選択的に加水分解するアミダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
(5)(2)〜(4)のいずれか1つに記載の遺伝子をベクターに連結した組換えベクター。
(6)(5)記載の組換えベクターを宿主微生物に導入した形質転換体。
(7)(6)記載の形質転換体を培養することを含む、アミダーゼ活性を有するタンパク質を産生させる方法。
上記形質転換体を培養して得られるアミダーゼ活性を有するタンパク質は、α−アミノ酸アミドに作用させることにより対応する光学活性α−アミノ酸を、また、α−ヒドロキシ酸アミドに作用させることにより対応する光学活性α−ヒドロキシ酸を製造することができる。
本明細書は、本願において主張する優先権の基礎である日本国特許出願第11−109328号の明細書及び/又は図面に記載される内容を包含する。
発明を実施するための最良の形態
以下に、本発明を詳細に説明する。
1.本発明のタンパク質及び遺伝子
本発明のタンパク質は、配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質であり、α−アミノ酸アミド及びα−ヒドロキシ酸アミドを立体選択的に加水分解するアミダーゼ活性を有する。このようなアミダーゼ活性により、本発明のタンパク質は、α−アミノ酸アミドに作用させることにより対応する光学活性α−アミノ酸を、また、α−ヒドロキシ酸アミドに作用させることにより対応する光学活性α−ヒドロキシ酸を製造することができる。前記α−アミノ酸アミドはいずれのものであってもよく、特に限定されないが、好ましくはtert−ロイシンアミドである。前記α−アミノ酸アミドがtert−ロイシンアミドである場合には、上記加水分解の結果として生じるのはD体又はL体のtert−ロイシン、好ましくはL−tert−ロイシンである。前記α−ヒドロキシ酸アミドはいずれのものであってもよく、特に限定されないが、好ましくは乳酸アミドである。前記α−ヒドロキシ酸アミドが乳酸アミドである場合には、上記加水分解の結果として生じるのはD体又はL体の乳酸、好ましくはL−乳酸である。従って、上記アミダーゼ活性は、好ましくはtert−ロイシンアミド及び乳酸アミドを立体選択的に加水分解するアミダーゼ活性であり、より好ましくはtert−ロイシンアミド及び乳酸アミドを立体選択的に加水分解して、それぞれL−tert−ロイシン及びL−乳酸を生成させるアミダーゼ活性である。
また、本発明のタンパク質のアミノ酸配列は配列番号1で表される配列に限定されるものではなく、上記アミダーゼ活性を有する限り、該アミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸の欠失、置換又は付加等の変異が生じていてもよい。変異するアミノ酸の数は特に制限されないが、好ましくは1〜30個、より好ましくは1〜数個、最も好ましくは1〜3個である。
上記のような本発明のタンパク質は、ペプチド合成法として知られる公知の方法を用いて調製することができ、また、本発明のタンパク質のアミノ酸配列をコードするDNAを用いて、遺伝子組換え技術により調製することもできる。この遺伝子組換え技術では、例えば、以下に詳述するように、本発明の遺伝子を含む組換えプラスミド(組換えベクター)で形質転換した形質転換体を培養することにより、本発明のタンパク質を調製することができる。
本発明の遺伝子は、上記の本発明のタンパク質をコードするものである。従って、その塩基配列は特定の配列に限定されるものではないが、好ましくは配列番号1で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、より好ましくは配列番号2で表される塩基配列である。本明細書中で用いられる「遺伝子」という用語は、遺伝情報をコードする核酸を意味する。該核酸はDNAであってもRNAであってもよいが、好ましくはDNAである。
本発明の遺伝子は、化学的合成法、PCR法又は当該塩基配列を有する遺伝子断片をプローブとして用いるハイブリダイゼーション法によって得ることができる。このような化学的合成法、PCR法及びハイブリダイゼーション法は、当業者に公知の方法によって行うことができる。PCR法及びハイブリダイゼーション法では、本発明の遺伝子を有する微生物(本発明におけるDNA供与体微生物)から得られるDNAライブラリーを用いることができる。該微生物は特定の属又は種に限定されるものではないが、例えば、前記特開昭62−55097号公報記載のエンテロバクター・クロアッセイ(Enterobacter cloacae)N−7901株(FERM BP−873;1985年8月16日付;工業技術院生命工学工業技術研究所,日本国茨城県つくば市東1−1−3)を挙げることができる。その菌学的性質は同公報に記載されている。上記PCR法は、例えば、上記DNAライブラリーを鋳型とし、配列番号2を参照して設計した適切なプライマーを用いて行うことができる。PCR法におけるその他の試薬、条件等は、当業者であれば適切に設定することができ、また、市販のキットを用いることもできる。上記ハイブリダイゼーション法は、例えば、上記DNAライブラリーに対し、配列番号2で表される塩基配列を有するプローブをハイブリダイズさせることにより行うことができる。ハイブリダイゼーション法としては、当業者に公知の方法、例えば、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法等が挙げられる。このときのハイブリダイズの条件は特に限定されないが、好ましくはストリンジェントな条件とする。このようなストリンジェントな条件は、例えば、コロニー又はプラーク由来のDNAを固定化したフィルターを用いて、0.5〜1MのNaCl存在下42〜68℃で(又は50%ホルムアミド存在下42℃で、又は水溶液中65〜68℃で)ハイブリダイゼーションを行った後、0.1〜2倍濃度のSSC(saline−sodium citrate)溶液(1倍濃度のSSC溶液の組成:150mM 塩化ナトリウム、15mM クエン酸ナトリウム)を用いて室温〜68℃でフィルターを洗浄することにより達成することができる。ハイブリダイゼーション法におけるその他の試薬、条件等は、当業者であれば適切に設定することができ、また、市販のキットを用いることもできる。化学的合成法としては、核酸の合成法として知られる方法であれば、いずれの方法を用いてもよい。化学的合成法によれば、所望の塩基配列を有する遺伝子を得ることが可能である。
なお、配列番号2で表される塩基配列を有するDNAを含むプラスミドpLA205で形質転換したエシェリシア・コリ JM109株(E.coli JM109/pLA205)は、工業技術院生命工学工業技術研究所(日本国茨城県つくば市東1−1−3)に、1999年1月26日付けで国際寄託されている(FERM BP−7132)。従って、配列番号2で表される塩基配列を有する本発明の遺伝子(DNA)は、この菌株に含まれるプラスミドpLA205から得ることができ、その他の本発明の遺伝子も、部位特異的変異誘発法(Nucleic Acids Res.10,6487−6500,1982)によって得ることができる。
さらに、本発明の遺伝子は、配列番号2で表される塩基配列又はそのフラグメントとハイブリダイズし、且つ、α−アミノ酸アミド及びα−ヒドロキシ酸アミドを立体選択的に加水分解するアミダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をも包含する。上記ハイブリダイズの条件は特に限定されないが、好ましくはストリンジェントな条件とする。ストリンジェントな条件は、例えば、0.5〜1MのNaCl存在下42〜68℃で(又は50%ホルムアミド存在下42℃で、又は水溶液中65〜68℃で)ハイブリダイゼーションを行った後、0.1〜2倍濃度のSSC(saline−sodium citrate)溶液(1倍濃度のSSC溶液の組成:150mM 塩化ナトリウム、15mM クエン酸ナトリウム)を用いて室温〜68℃でフィルターを洗浄することにより達成することができる。
さらに、本発明の遺伝子は、配列番号2で表される塩基配列と少なくとも90%以上、好ましくは95%以上、さらに好ましくは98%以上の相同性を有し、且つ、α−アミノ酸アミド及びα−ヒドロキシ酸アミドを立体選択的に加水分解するアミダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をも包含する。上記の相同性の数値は、配列解析ソフトウェアであるDNASIS(日立ソフトウェアエンジニアリング)を用いて、例えば、マキシマムマッチング法のコマンドを実行することにより求められる。その際のパラメータは、デフォルトの設定(初期設定)とする。
上記のような、配列番号1以外のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号2以外の塩基配列を有する遺伝子がコードするタンパク質が上記アミダーゼ活性を有するか否かは、例えば、対象となるタンパク質をコードする遺伝子を発現可能な状態で含有するエシェリシア・コリJM109株を上記アミダーゼ活性について試験することにより確認することができる。形質転換体の作製については後に詳述する。また、形質転換された上記菌株は、培養した後に菌を遠心分離にて集菌し、培養液と同量の50mM KH2PO4−Na2HPO4緩衝液(pH8.0)で2回洗浄した後、50mlの前記緩衝液に懸濁して菌体懸濁液としておく。
上記のアミダーゼ活性についての試験は、2重量%α−アミノ酸アミド又は2重量%α−ヒドロキシ酸アミドを含む上記緩衝液0.5ml、上記緩衝液0.3ml及び上記菌体懸濁液0.2mlからなる反応液を40℃で1時間振とうし、その上清を光学分割カラムを備えたHPLCにより分析して、対応する光学活性α−アミノ酸又は光学活性α−ヒドロキシ酸が検出されるかどうかを調べることにより行うことができる。上記α−アミノ酸アミドとしては所望のものを用いることができるが、好ましくはラセミ体tert−ロイシンアミドを用い、その場合の上記光学活性α−アミノ酸はD体又はL体のtert−ロイシン、好ましくはL−tert−ロイシンとなる。上記α−ヒドロキシ酸アミドとしては所望のものを用いることができるが、好ましくはラセミ体乳酸アミドを用い、その場合の上記光学活性α−ヒドロキシ酸はD体又はL体の乳酸、好ましくはL−乳酸となる。
2.組換えベクター及び形質転換体
(1)組換えベクターの作製
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の遺伝子(DNA)を連結(挿入)することにより作製することができる。
本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドDNA、ファージDNA等が挙げられる。プラスミドDNAは、大腸菌、アグロバクテリウム等の微生物からアルカリ抽出法(Birnboim,H.C.and Doly,J.1979.Nucleic Acid Res.7:1513)又はその変法により調製することができる。また、市販のプラスミドベクターとして、例えば、pBluescript II SK+(Stratagene社)、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119(宝酒造社)、pGEX4T−1(Pharmacia社)等を用いてもよい。これらのプラスミドは、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子等が含まれていることが好ましい。ファージベクターとしては、例えば、λgt11、M13mp18、M13mp19等が挙げられる。
ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、例えば、精製されたDNAを適当な制限酵素で消化し、適当なベクターDNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結することができる。このような操作は当技術分野において通常行われるものであり、当業者であれば、挿入すべきDNAの具体的な塩基配列に従って適切に行うことができる。
また、本発明の遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるように、すなわち発現可能なようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター及び本発明の遺伝子のほか、ターミネーター、リボソーム結合配列等を組み込んでもよい。このような操作は当技術分野において通常行われるものであり、当業者であれば適切に行うことができる。
(2)形質転換体の作製
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。
宿主としては、本発明の遺伝子を発現できるものであればよく、特に限定されるものではないが、例えば、細菌、酵母等が挙げられる。細菌としては、大腸菌(Escherichia coli)等のエッシェリシア属に属する細菌、及びバチルス・ズブチリス(Bachillus subtilis)等のバチルス属に属する細菌が挙げられる。酵母としては、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)が挙げられる。上記エッシェリシア・コリとしては、特に、JM109株、C600株、IFO3301株等が好ましい。
大腸菌等の細菌を宿主とする場合には、本発明の組換えベクターは、該宿主中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよく、例えば、Trpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーターなどの、大腸菌又はファージに由来するプロモーターを用いることができる。本発明の組換えベクターはさらに、プロモーターを制御する遺伝子を含んでもよい。
細菌への本発明の組換えベクターの導入方法としては、細菌にDNAを導入することのできる方法であればよく、特に限定されないが、例えば、カルシウムイオンを用いる方法(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 69:2110−2114,1972)等が挙げられる。
酵母を宿主として用いる場合には、発現ベクターとしては、例えば、YEp13、YEp24、YCp50等が用いられる。この場合に使用するプロモーターとしては、酵母中で発現できるものであればよく、特に限定されないが、例えば、gal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター等が挙げられる。
酵母への本発明の組換えベクターの導入方法としては、酵母にDNAを導入することのできる方法であればよく、特に限定されないが、例えば、エレクトロポレーション(Methods.Enzymol.,194:182−187,1990)、スフェロプラスト法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:1929−1933,1978)、酢酸リチウム法(J.bacteriol.,153:163−168,1983)等が挙げられる。
なお、配列番号2で表される塩基配列を有するDNAを含むプラスミドpLA205で形質転換したエシェリシア・コリ JM109株(E.coli JM109/pLA205)は、工業技術院生命工学工業技術研究所(日本国茨城県つくば市東1−1−3)に、1999年1月26日付けで国際寄託されている(FERM BP−7132)。
3.本発明のタンパク質(アミダーゼ)の生産
本発明のタンパク質(アミダーゼ)は、上述のようにして作製した形質転換体を培地に培養し、その培養物から採取することができる。
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法によって行われる。大腸菌や酵母等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸類、及び又はエタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。
無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
微生物を宿主として得られた形質転換体の培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、約28℃で48〜60時間行う。培養期間中、pHは7.0〜7.5に保持する。pHの調整は、無機酸又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を培地に加えてもよい。
プロモーターとして誘導性プロモーターを有する発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデユーサーを培地に添加してもよい。例えば、Lacプロモーターを有する発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、イソプロピル−β−D−チオガラクトシルピラノシド(IPTG)等を、Trpプロモーターを有する発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、インドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
培養後、本発明のタンパク質を培養物から採取する。該タンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕等することにより、該タンパク質を採取することができる。また、該タンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用して、又は遠心分離等により菌体若しくは細胞を除去した後に、該酵素を採取することができる。該酵素の採取は、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等を、単独で又は適宜組合せて用いることにより行うことができる。
以上のようにして得られたタンパク質が上記アミダーゼ活性を有することの確認は、一般的な酵素化学反応、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動等の電気泳動法、抗原抗体反応等の免疫学的方法などにより行うことができる。
以下、実施例として、エンテロバクター・クロアッセイ N−7901株のアミダーゼ遺伝子のエシェリシア・コリJM109株へのクローニングについて示す。
実施例1
(1)エンテロバクター・クロアッセイN−7901染色体DNAの調製とDNAライブラリーの作製:
Saito and Miura(Biochem.Biophys.Acta 72,619(1963)参照)の方法によりエンテロバクター・クロアッセイ N−7901株の染色体DNAを分離し、これを制限酵素Sau3AIで部分分解後、常法によって遺伝子断片を分取し、ベクタープラスミドpUC118にライゲーションして、組換え体DNAのライブラリーを作製した。
(2)形質転換体の作製及び組換え体DNAの選別:
(1)で調製した組換え体ライブラリーによる形質転換体を宿主微生物としてエシェリシア・コリ JM109株を用いて塩化カルシウム法(J.Mol.Biol.,53,154(1970))により作製し、その中からアミダーゼ活性を示すようになったものを選別した。選別は以下のようにして行った。
アンピシリンナトリウム(50μg/ml)を含むLB培地で形質転換体を培養した後、培養液をグリセロールを炭素源とし、ロイシンアミドあるいは乳酸アミドを窒素源とする寒天培地に塗布した。37℃で1〜3日間培養して生じたコロニーを単離し、アンピシリンナトリウム(50μg/ml)、IPTG(1mM)を含むLB培地で37℃にて1夜培養した。培養液から遠心分離で菌体を集めた後、菌体を50mM KH2PO4−Na2HPO4緩衝液(pH8.0)で洗浄し、同緩衝液に菌体を懸濁した。この菌体懸濁液を1%乳酸アミドを含む50mM KH2PO4−Na2HPO4緩衝液(pH8.0)に懸濁し、30℃にてインキュベートした。一定時間後、生成するL−乳酸を高速液体クロマトグラフィー(カラム:スミキラルOA−5000、住友化学社製;溶離液:1mM硫酸銅水溶液;流速:1.0ml/分;検出:UV254nm)にて定量した。L−乳酸を生成する形質転換体からプラスミドpLA002を得た(図1)。
(3)制限酵素地図の作製とアミダーゼ遺伝子の位置の決定:
(2)で得られたプラスミドについて、常法に従い、制限酵素地図を作製した。その後、より小さなDNA断片をもつプラスミドを作製した。これらのプラスミドによって(2)と同様にして形質転換した株のアミダーゼ活性の有無によって目的遺伝子の含まれていることを確認した。プラスミド作製の経過を図2に示す。
すなわち、pLA002のEcoRI−SalI断片(3.4kb)をpUC119にライゲーションしてpLA201を作製し、さらに、このプラスミドからのBamHI−BamHI断片(2.6kb)をpUC118にライゲーションしてpLA202を作製した。pLA202のPstI−PstI断片を削除(0.7kb)することにより、pLA205を得た。pLA205からさらに様々な断片を削除したプラスミドを作製して、これらによって形質転換した株のアミダーゼ活性の有無を調べて、目的遺伝子の含まれている箇所を推定した(図2)。
(4)塩基配列の決定:
(3)で得られたpLA205のBamHI−NaeI部分(1.4kb)のDNAの塩基配列をファルマシアDNAシーケンサーALFIIを用いて決定した。その結果、配列番号3に示される塩基配列が得られ、配列番号1に示されるアミノ酸配列をもつオープンリーディングフレーム(配列番号2)が見出された。プラスミドpLA205の制限酵素地図及びアミダーゼの存在位置を図3に示した。
アミノ酸配列データーベースSWISS PROTとの比較により、本遺伝子は、既知のアミダーゼ、具体的には、マイコバクテリウム属細菌由来のアセトアミダーゼ(J.Gen.Microbiol.,139,575(1993))、メチロフィラス属細菌由来のホルムアミダーゼ(Eur.J.Biochem.,240,314(1996))とアミノ酸配列レベルで28〜30%の低いホモロジーを有しており、酵素の基質特異性が全く異なる。また、アミノ酸アミドな立体選択的に加水分解する既知の酵素とのホモロジーはほとんどなく、従って、本酵素は新規なアミダーゼであると考えられた。
なお、配列番号2で表される塩基配列を有するDNAを含むプラスミドpLA205で形質転換したエシェリシア・コリ JM109株(E.coli JM109/pLA205)は、工業技術院生命工学工業技術研究所(日本国茨城県つくば市東1−1−3)に、1999年1月26日付けで国際寄託されている(FERM BP−7132)。
実施例2
(1)E.coli JM109/pLA205株の培養
1%バクトトリプトン、0.5%バクトイーストエキス、0.5%NaCl、0.05%MgSO4・7H2O、0.02%MnSO4・4〜6H2O、0.002%ZnSO4・7H2O、0.002%CaCl2・2H2Oからなる培地(pH 7.2)100mlを500ml容三角フラスコに入れてオートクレーブ滅菌した後、アンピシリンナトリウム(50μg/ml)を添加し、E.coli JM109/pLA205を植菌して、37℃にて19時間振盪培養した。
(2)エンテロバクター・クロアッセイN−7901株の培養
比較のため当該株の培養を行った。
1%シュークロース、0.5%肉エキス、0.5%プロピオンアミド、0.01%MgSO4・7H2O、0.001%MnSO4・4〜6H2O、0.001%CaCl2・2H2O、0.001%FeSO4・7H2O、0.0001%ZnSO4・7H2O、からなる培地(pH 6.0)100mlを500ml容三角フラスコに入れてオートクレーブ滅菌した後、エンテロバクター・クロアッセイ N−7901株を植菌して、30℃にて2日間振盪培養した。
(3)アミダーゼの産生及び該活性の確認
培養後、それぞれの菌体を遠心分離にて集菌し、培養液と同量の50mM KH2PO4−Na2HPO4緩衝液(pH8.0)で2回洗浄した後、50mlの同緩衝液に懸濁し、菌体懸濁液とした。2%ラセミ体tert−ロイシンアミド0.5ml、50mM KH2PO4−Na2HPO4緩衝液(pH8.0)0.3ml、菌体懸濁液0.2mlからなる反応液を40℃で1時間振盪した。反応液から遠心分離によって、菌体を除いた後、HPLC(カラム:スミキラルOA−5000、住友化学社製;溶離液:2mM硫酸鋼水溶液/MeOH(85:15);流速:1.0ml/分;検出:UV254nm)にて分析した。それぞれの菌体の酵素活性を比較した(表1)。
なお、表1中、Uは、L−tert−ロイシンの生成する速度(μモル/分)であり、アミダーゼ活性は、反応液中に含まれる乾燥菌体重量あたりの数値として表した。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、参照によりその全体を本明細書に組み入れるものとする。
産業上の利用の可能性
本発明によれば、遺伝子組換の方法でクローン化されたアミダーゼ遺伝子を菌体内に多数存在させることができるため、従来の方法に比して飛躍的に触媒能力を増大させた微生物の提供ができ、これにより、α−アミノ酸アミド及びα−ヒドロキシ酸アミドから効率的に光学活性なα−アミノ酸やα−ヒドロキシ酸を製造できる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図1は、pLA002の制限酵素地図を示す。
図2は、pLA002からpLA205に至るプラスミド作製過程を示す。
図3は、pLA205の制限酵素地図を示す。
Claims (7)
- 下記(a)〜(d)のいずれかの遺伝子を含む組換えベクター。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、α−アミノ酸アミド及びα−ヒドロキシ酸アミドを立体選択的に加水分解するアミダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
(c)配列番号2で表される塩基配列を含む遺伝子
(d)配列番号2で表される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、α−アミノ酸アミド及びα−ヒドロキシ酸アミドを立体選択的に加水分解するアミダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子 - FERM BP-7132で特定されるエシェリア・コリ JM109株に保持されている組換えベクターpLA205。
- 請求項1又は2記載の組換えベクターを宿主微生物に導入した形質転換体。
- FERM BP-7132で特定される請求項3記載の形質転換体。
- 請求項3又は4記載の形質転換体を培養することを含む、アミダーゼ活性を有するタンパク質を産生させる方法。
- 請求項3又は4記載の形質転換体をα−アミノ酸アミド又はα−ヒドロキシ酸アミドに作用させることにより、対応するL−α−アミノ酸又はL−α−ヒドロキシ酸を製造する方法。
- 請求項3又は4記載の形質転換体をtert−ロイシンアミド又は乳酸アミドに作用させることにより、対応するL−tert−ロイシン又はL−乳酸を製造する方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP10932899 | 1999-04-16 | ||
PCT/JP2000/002492 WO2000063354A1 (fr) | 1999-04-16 | 2000-04-17 | Nouveau gene amidase |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2005256734A Division JP4069129B2 (ja) | 1999-04-16 | 2005-09-05 | 新規なアミダーゼ遺伝子 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP4094232B2 true JP4094232B2 (ja) | 2008-06-04 |
Family
ID=14507451
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000612433A Expired - Fee Related JP4094232B2 (ja) | 1999-04-16 | 2000-04-17 | 新規なアミダーゼ遺伝子 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6617139B1 (ja) |
EP (1) | EP1174499B1 (ja) |
JP (1) | JP4094232B2 (ja) |
DE (1) | DE60042364D1 (ja) |
WO (1) | WO2000063354A1 (ja) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1555416A (zh) * | 2001-07-23 | 2004-12-15 | Dsm Ip �Ʋ�����˾ | 编码对映选择性酰胺酶的核酸序列 |
WO2003020929A1 (fr) * | 2001-08-28 | 2003-03-13 | Mitsubishi Rayon Co., Ltd. | Nouveau gene d'amide hydrolase |
US7192560B2 (en) * | 2001-12-20 | 2007-03-20 | 3M Innovative Properties Company | Methods and devices for removal of organic molecules from biological mixtures using anion exchange |
CN1989246B (zh) * | 2004-07-22 | 2011-03-09 | 三菱瓦斯化学株式会社 | L-氨基酸酰胺不对称水解酶及其编码dna |
US20060160198A1 (en) * | 2004-12-22 | 2006-07-20 | Xu Li | Method for the production of glycolic acid from ammonium glycolate by direct deammoniation |
JP5190207B2 (ja) * | 2007-03-01 | 2013-04-24 | 三菱レイヨン株式会社 | 亜鉛又はその塩を含むアミダーゼの保存剤、活性賦活剤及び失活予防剤 |
JP5138271B2 (ja) * | 2007-05-16 | 2013-02-06 | 三菱レイヨン株式会社 | 高活性アミダーゼ酵素液およびその調製方法 |
US20120329107A1 (en) * | 2009-12-04 | 2012-12-27 | Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc. | Method for preparing optically active amino acids and optically active amino acid amides |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5215897A (en) * | 1985-09-04 | 1993-06-01 | Nitto Chemical Industries Co., Ltd. | Process for producing L-amino acids |
JP2623345B2 (ja) * | 1988-06-27 | 1997-06-25 | 旭化成工業株式会社 | 光学活性なα―置換有機酸の製造方法 |
FR2655660B1 (fr) * | 1989-12-11 | 1992-03-20 | Rhone Poulenc Sante | Nouveaux polypeptides, sequences d'adn permettant leur expression, procede de preparation et leur utilisation. |
NL9100038A (nl) | 1991-01-11 | 1992-08-03 | Stamicarbon | Enzym-gekatalyseerde bereiding van optisch aktieve carbonzuren. |
EP0853663A1 (en) * | 1995-10-06 | 1998-07-22 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Nucleic acid fragments encoding stereospecific nitrile hydratase and amidase enzymes and recombinant microorganisms expressing those enzymes useful for the production of chiral amides and acides |
ATE397088T1 (de) * | 1996-07-10 | 2008-06-15 | Lonza Ag | Verfahren zur herstellung von (s)- oder (r)-3,3,3-trifluor-2-hydroxy-2-methylpropionsaü e |
-
2000
- 2000-04-17 US US09/958,969 patent/US6617139B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-04-17 DE DE60042364T patent/DE60042364D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-04-17 WO PCT/JP2000/002492 patent/WO2000063354A1/ja active Application Filing
- 2000-04-17 JP JP2000612433A patent/JP4094232B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-04-17 EP EP00915558A patent/EP1174499B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1174499B1 (en) | 2009-06-10 |
US6617139B1 (en) | 2003-09-09 |
WO2000063354A1 (fr) | 2000-10-26 |
DE60042364D1 (de) | 2009-07-23 |
EP1174499A1 (en) | 2002-01-23 |
EP1174499A4 (en) | 2002-10-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP3669390B2 (ja) | バチルス属細菌由来のトランスグルタミナーゼ | |
JP4510351B2 (ja) | 新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、およびその利用法 | |
US5629190A (en) | Polypeptides possessing a nitrilase activity and method of converting nitriles to carboxylates by means of said polypeptides | |
US7056709B2 (en) | Isolation and expression of a gene for a nitrilase from Acidovorax faclilis 72W | |
JP2010284170A (ja) | 新規アルドラーゼおよび置換α−ケト酸の製造方法 | |
US7582454B2 (en) | 5-substituted hydantoin racemase, DNA coding for the racemase, and processes for producing optically active amino acids | |
JPWO2010053161A1 (ja) | 改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ | |
CA2103616A1 (en) | Polypeptides possessing a nitrilase activity, dna sequence coding for said polypeptides, expression cassettes and host microorganisms enabling them to be obtained, and method of converting nitriles to carboxylates by means of said polypeptides | |
JP4094232B2 (ja) | 新規なアミダーゼ遺伝子 | |
JP3408737B2 (ja) | ニトリルヒドラターゼの活性化に関与するタンパク質及びそれをコードする遺伝子 | |
US6531308B2 (en) | Ketoreductase gene and protein from yeast | |
JP3380133B2 (ja) | 新規なニトリルヒドラターゼ | |
JP4529338B2 (ja) | ヒダントイナーゼをコードするdna、n−カルバミル−l−アミノ酸ハイドロラーゼをコードするdna、組み換えdna、形質転換された細胞、タンパク質の製造方法および光学活性アミノ酸の製造方法 | |
JP4561009B2 (ja) | D−ヒダントインハイドロラーゼをコードするdna、n−カルバミル−d−アミノ酸ハイドロラーゼをコードするdna、該遺伝子を含む組み換えdna、該組み換えdnaにより形質転換された細胞、該形質転換細胞を用いるタンパク質の製造方法、および、d−アミノ酸の製造方法 | |
JP4216719B2 (ja) | ハロゲン化合物耐性新規ギ酸脱水素酵素及びその製造方法 | |
JP4069129B2 (ja) | 新規なアミダーゼ遺伝子 | |
JP4287144B2 (ja) | 新規ギ酸脱水素酵素及びその製造方法 | |
JP2010187658A (ja) | D−フェニルセリンデアミナーゼ及びその利用 | |
CA2056326A1 (en) | Enzymic process for the synthesis of ammonium adipate | |
JP4880859B2 (ja) | 新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、およびその利用法 | |
JP4139773B2 (ja) | 新規なアミド加水分解酵素遺伝子 | |
JP4676627B2 (ja) | 改変型アミノ酸アミダーゼとそれを用いたd−アミノ酸の製造方法 | |
JP4485734B2 (ja) | 5置換ヒダントインラセマーゼ、これをコードするdna、組み換えdna、形質転換された細胞および光学活性アミノ酸の製造方法 | |
JP4274767B2 (ja) | (r)−体のアミド結合を選択的に加水分解するアミダーゼ遺伝子及びその利用 | |
JP4561021B2 (ja) | 5置換ヒダントインラセマーゼ、これをコードするdna、組み換えdna、形質転換された細胞および光学活性アミノ酸の製造方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050315 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050513 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050705 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050905 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20051018 |
|
A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20051118 |
|
RD13 | Notification of appointment of power of sub attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7433 Effective date: 20071120 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20071213 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20071129 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20080305 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110314 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110314 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120314 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120314 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130314 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130314 Year of fee payment: 5 |
|
S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130314 Year of fee payment: 5 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130314 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140314 Year of fee payment: 6 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |