NL9100038A

NL9100038A - Enzym-gekatalyseerde bereiding van optisch aktieve carbonzuren.

Info

Publication number: NL9100038A
Application number: NL9100038A
Authority: NL
Original assignee: Stamicarbon
Priority date: 1991-01-11
Filing date: 1991-01-11
Publication date: 1992-08-03
Also published as: US5248608A; CA2059075A1; JP3135653B2; DK0494716T3; JPH0530992A; ATE141952T1; EP0494716A2; EP0494716A3; DE69213033D1; ES2093764T3; EP0494716B1; DE69213033T2

Description

EN2YM-GEKATALYSEERDE BEREIDING VAN OPTISCH ARTIEVE CARBONZUREN

De uitvinding betreft een werkwijze voor de bereiding van een op de α-plaats gesubstitueerd, optisch aktief carbonzuur, door enzym-gekatalyseerde, enantioselektieve hydrolyse van een mengsel van de enantiomeren van het overeenkomstige amide en isolatie van het optisch aktieve carbonzuur.

α-Aminozuren, zowel natuurlijke als niet-natuurlijke, zijn belangrijke, veel toegepaste moleculen in de voedingsmiddelen industrie, de farmaceutische en agrochemische industrie etc. Optisch zuiver D-(-)-fenylglycine is een belangrijke bouwsteen voor de antibiotica ampicilline en cephalexine; terwijl D~(-)-parahydroxyfenylglcyine een intermediair is voor de bereiding van het antibioticum amoxicilline. Het natuurlijk aminozuur L-valine is zeer geschikt als precursor voor Cyclosporine-A fermentaties terwijl het D-enantiomeer een waardevol intermediate is voor fluvalinaat (insecticide). D-en L-homofenylalanine, eveneens niet-natuurlijke aminozuren, zijn zeer bruikbaar als building blocks in de synthese van diverse ACE-inhibitoren.

Gelijk α-aminozuren zijn ook a-alkyl-a-aminozuren interessant voor diverse industriëen.

L-a-methyl-3,4-dihydroxyfenylalanine, bijvoorbeeld, is een belangrijk farmacon voor bloeddrukverhoging.

, α-Ν-hydroxyaminozuren en/of derivaten daarvan, alsmede peptiden daarvan, bezitten in het algemeen biologische aktiviteit en veelal antibiotische en/of antitumor aktiviteit. E. Buehler en G.B. Brown (J. Org.

Chem. 32 (1967) 265) vermelden dat verscheidene N-hydroxy aminozuren componenten zijn van verschillende antibiotica die bij microbiologische fermentaties worden verkregen en deze auteurs noemen een aantal α-Ν-hydroxyaminozuren die zijn gewonnen uit in de natuur voorkomende peptiden.

Chirale α-hydroxyzuren zijn eveneens waardevolle molekulen voor de produktie van zowel farma-producten als agrochemicaliën: bijvoorbeeld hydroxypropionzuur (herbicides), α-hydroxyfenylboterzuur (ACE-inhibitoren) en amandelzuur (splitsingsmiddelen). Een bijkomend, niet onbelangrijk voordeel van deze splitsingstechnologie ingeval van α-hydroxyzuren is het feit dat optisch actieve α-hydroxyzuuramiden resteren die kunnen worden gereduceerd tot, voor de synthese van β-blockers, zeer interessante α-hydroxyaminen.

Enzym-gekatalyseerde, enantioselektieve hydrolyse van a-hydroxycarbonzuuramiden is beschreven in JP-A-6188894. In de hier beschreven werkwijze wordt gebruik gemaakt van een Aeromonas hydrophila (FERM P-7360) en van een Moraxella phenylperuvica (FERM P-7359). De substraten zijn daarbij beperkt tot a-hydroxycarbonzuuramiden.

Nadeel van deze werkwijze is dat de bereikte opbrengst en optische zuiverheid (enantiomere overmaat) relatief laag is. De bereikte optische zuiverheid is slechts 90-95%, terwijl voor veel toepassingen, met name in farmaceutica, een optische zuiverheid van ten minste 99% wordt gevraagd.

De uitvinding beoogt een werkwijze te verschaffen waarin het optisch aktieve carbonzuur en tevens het resterend carbonzuuramide worden verkregen met een enantiomere overmaat (e.e.) van meer dan 98% en waarbij tevens een hoge opbrengst wordt gerealiseerd.

Dit wordt volgens de uitvinding bereikt door racemische carbonzuuramiden die op de a-plaats gesubstitueerd zijn met een amino-, een hydroxy- of een N-hydroxyaminogroep te hydrolyseren waarbij als enzym een Ochrobactrum anthropi of een Klebsiella sp. wordt toegepast.

Gebleken is namelijk dat met behulp van een Ochrobactrum anthropi of een Klebsiella sp. het carbonzuur en het resterene carbonzuuramide met een hoge optische zuiverheid en hoge opbrengst worden verkregen terwijl bovendien de gerealiseerde aktiviteit van het microörganisme erg hoog is, hetgeen toepassing op commerciële schaal mogelijk maakt. Daarnaast is gebleken dat met het microörganisme volgens de uitvinding een zeer groot aantal α-gesubstitueerde carbonzuren met een opmerkelijke structurele variëteit met hoge selektiviteit en aktiviteit kan worden gehydrolyseerd. Bij voorkeur wordt Ochrobaetrum anthropi NCIB 40321 of Klebsiella sp. NCIB 40322 toegepast.

Voorbeelden van geschikte substraten zijn a-aminozuuramiden met 2-20 koolstofatomen zoals fenylglycineamide, para-hydroxyfenylglycineamide, valineamide, etc. De hydrolyse van bijvoorbeeld α-aminozuuramiden verloopt snel vergeleken met de hydrolyse in aanwezigheid van bekende amidasen (aminopeptidasen) zoals bijvoorbeeld van Pseudomonas putida. Een voordeel is eveneens dat de hydrolyseaktiviteit over een breed pH-gebied plaatsvindt. Andere geschikte substraten zijn bijvoorbeeld α-hydroxyzuuramiden en α-Ν-hydroxyaminozuuramiden. De carbonzuuramiden bevatten meestal 2-20 koolstofatomen en kunnen op de α-plaats nog een tweede substituent zoals bijvoorbeeld een alkylgroep, bevatten.

De enzymatische hydrolyse van a-N-hydroxyamino-zuuramiden is nog niet eerder in de literatuur beschreven. Een probleem dat zich voordoet bij dergelijke hydrolyseprocessen is dat het verkregen a-N-hydroxyaminozuur onder de basische condities, die meestal in dergelijke processen worden aangehouden, decarboxyleert. Aanvraagster heeft nu gevonden dat in de werkwijze volgens de uitvinding ook bij lage pH goede activiteiten worden gerealiseerd, terwijl dan geen of hoegenaamd geen decarboxylatie optreedt. Aangezien zuurstof werkt als een katalysator voor de chemische decarboxylatiereaktie wordt bij de hydrolyse van α-Ν-hydroxyzuuramiden het reactiemengsel bij voorkeur geflushed met molekulaire stikstof. De hydrolyse wordt dan uitgevoerd onder moleculaire stikstof.

De onderhavige uitvinding berust op een enantioselektieve enzymatische hydrolyse, waarbij met zeer grote voorkeur het ene enantiomeer van het substraat wordt gehydrolyseerd tot het overeenkomstige zuur, en het andere enantiomeer als amide resteert. In de praktijk bleek meestal het L-enantiomeer van het substraat te hydrolyseren, terwijl het D-enantiomeer als amide achterbleef.

De organismen die worden toegepast in de onderhavige werkwijze zijn Ochrobactrum anthropi en Klebsiella sp., in het bijzonder Ochrobactrum anthropi NCIB 40321 en Klebsiella sp. NCIB 40322. De produktie van deze organismen vindt plaats in beluchte media, die componenten zoals koolstofbron, stikstofbron, vitaminen, mineralen e.d. bevatten. Ter optimalisatie van de aktiviteit en selektiviteit van dergelijke enzympreparaten kan een kleine hoeveelheid van het te hydrolyseren amide of een andere geschikte inducer aan het groeimedium worden toegevoegd. De kweek kan zowel batch, fed-batch als continu worden uitgevoerd.

Dergelijke kweekmethoden zijn algemeen bekend en veelvuldig in octrooischriften en wetenschappelijke publicaties beschreven, zoals bijvoorbeeld in EP-A-244912, zodat een beschrijving van die kweekmethoden in dit kader overbodig is. Het enzympreparaat zoals dat bij de onderhavige uitvinding wordt gebruikt, wordt niet beperkt door zuiverheid e.d. en kan zowel een ruwe enzymoplossing als een gezuiverd enzym zijn, maar het kan ook bestaan uit (gepermeabiliseerde) cellen, die de gewenste aktiviteit bezitten, of uit een homogenaat van cellen met een dergelijke aktiviteit. Het enzym kan ook in geïmmobiliseerde vorm of in chemisch gemodificeerde vorm worden gebruikt. De uitvinding wordt op geen enkele wijze beperkt door de vorm waarin het enzym voor de onderhavige uitvinding wordt gebruikt. Binnen het kader van de uitvinding kan uiteraard ook een enzym worden gebruikt dat afkomstig is van een mutant of van een genetisch gemodificeerd microörganisme.

Enantioselektieve enzymatische hydrolyse is op zichzelf bekend. De enantioselektiviteit berust op een verschil in omzettingssnelheden van de verschillende enantiomeren. Gebleken is dat in de onderhavige werkwijze vrijwel uitsluitend één enantiomeer van het amide wordt gehydrolyseerd resulterend in een conversie van ongeveer 50 % en een e.e.produkt en e.e.substraat van ongeveer 100 %. Een extra voordeel van de werkwijze volgens de uitvinding is dan ook dat eveneens het resterende substraat, het andere enantiomeer van het carbonzuuramide, kan worden gewonnen.

Dit carbonzuuramide kan vervolgens op een bekende wijze, bijvoorbeeld gebruik makend van niet stereospecifieke enzymen, worden gehydrolyseerd tot het andere enantiomeer van het carbonzuur. De relatie tussen conversie en e.e. waarde is voor enantioselektieve, enzymatische hydrolyses beschreven door Qu-Ming Gu et. al. in Tetrahedron Letters 27 (1986) 5203 e.v. en meer algemeen door Ghing-Shih Chen et al. in J. Am. Chem. Soc. 104 (1982) 7294 e.v. De in die publikaties beschreven algemene leer van enantioselektieve omzettingen geldt ook voor de onderhavige werkwijze.

De bij de reaktie gebruikte cellen kunnen desgewenst worden afgescheiden en in een volgende omzetting opnieuw worden ingezet, zonder dat daardoor de aktiviteit noemenswaardig wordt beïnvloed.

De hydrolyse kan worden uitgevoerd door het amide bij het begin van, tijdens of na de kweek van het betreffende microörganisme aan het kweekmedium toe te voegen. Ook kunnen gecultiveerde cellen, bijvoorbeeld door centrifugeren, worden geoogst en bij het amide bevattend reactiemedium worden gevoegd. In dit geval kunnen zowel celsuspensies als gedroogde cellen, bijvoorbeeld gelyofiliseerde cellen, gesproeidroogde cellen, cellen die behandeld zijn met een organisch oplosmiddel, zoals bijvoorbeeld aceton of tolueen, worden gebruikt. Ook kapot gemaakte cellen of extracten van cellen kunnen worden gebruikt.

De reakties worden meestal uitgevoerd in een waterig milieu. Het is ook goed mogelijk deze hydrolysereakties in aanwezigheid van organische oplosmiddelen uit te voeren.

De reaktieomstandigheden voor dë hydrolyse zijn niet erg kritisch. Men voert de hydrolyse meestal uit in waterig milieu, maar ook kunnen mengsels van water met organische oplosmiddelen worden gebruikt. De pH wordt ingesteld met behulp van bijvoorbeeld KOH, NaOH of NH^OH op een waarde binnen het aktiviteitsgebied van het enzym, dat is meestal van 3 tot 11 en bij voorkeur van 4 tot 9,5. De hydrolyse wordt bovendien meestal uitgevoerd bij omgevingstemperatuur of bij weinig verhoogde temperatuur, dat wil zeggen tussen 20 en 85°C. Bij voorkeur wordt een temperatuur tussen 30 en 70°C aangehouden. Uiteraard kiest men de reaktieomstandigheden zo dat er-geen storende nevenreakties optreden.

De concentratie van het substraat kan binnen wijde grenzen variëren en bedraagt bijvoorbeeld 2,5 tot 500 g/1.

Om mogelijke nevenreakties met het substraat dan wel produkt te vermijden kan de conversie in afwezigheid van zuurstof worden uitgevoerd .bijvoorbeeld door te flushen met moleculaire stikstof.

Gebleken is dat met de werkwijze volgens de uitvinding, gebruik makend van de bovenbeschreven microörganismen een groot aantal α-gesubstitueerde carbonzuuramiden, met zeer hoge selektiviteit en aktiviteit kan worden gehydrolyseerd tot het overeenkomstige carbonzuur. In de praktijk is de mogelijkheid om dezelfde biokatalysator te gebruiken voor de bereiding van verschillende produkten van bijzonder voordeel omdat veelal de beoogde produkten elk slechts een gering afzetvolume vertegenwoordigen.

De uitvinding zal verder worden toegelicht aan de hand van de volgende voorbeelden, zonder evenwel daartoe te worden beperkt.

In deze voorbeelden zijn de analyses van de reactie producten, met name wat betreft de bepaling van de enantiomere overmaat (e.e.) uitgevoerd met een tweetal HPLC-methodieken waarbij, indien gewenst de selectiviteitswaarde van de reactie kan worden berekend met behulp van de formules van Ghing-Shih Chen et al. (J. Am. Chem. Soc. 104 (1982) 7294 e.v.). Zowel de α-Η-α-aminozuren als de a-alkyl-a-aminozuren en de overeenkomstige aminozuuramiden werden geanalyseerd zoals beschreven door A. Duchateau et al. (J. Chromatogr. 471 (1989) 263). De enantiomeersamenstelling van amandelzuur werd bepaald door beide enantiomeren te scheiden op een reversed phase kolom (Nucleosil 120-C^g) met ligand-uitwisselingschromatografie. Het gebruikte eluent werd als volgt bereid: 0,2 g triethylamine werd toegevoegd aan 1800 ml ^0 in een maatkolf van 2 L, vervolgens werd 0,8 g CuiCHgCOO^^^O en 1,38 g Ν,Ν-di-n-propyl-L-alanine toegevoegd. De pH werd met azijnzuur (1,8 mol/L) ingesteld op 5,3 en vervolgens werd de maatkolf aangevuld tot 2 liter met HjO. De verkregen oplossing werd gefiltreerd over een Sartorius membraanfilter (0,45 //m) en gemengd met acetonitril in de volgende verhouding : 230 Cu-oplossing/ 20 acetonitril (v/v). Het debiet was 1,5 ml/min, en de temperatuur bedroeg 40°C. De componenten werden selektief gedetecteerd door middel van een post-column reaktie met een Fe2(SO^)2~reagens (500 mg Fe2(S04)2.nH20 in 600 ml H20, pH op 2,1 brengen met I^SO^/l^O (10/240)-oplossing). Detectie vond plaats met een UV-Vis detektor bij 420 nm. Wat betreft de conversiebepaling werd gebruik gemaakt van de voorgenoemde HPLC-methodieken, dan wel een reversed phase HPLC-systeem met uv-detectie, ofwel een ionselectieve ammoniak electrode waarmee het ammoniak dat vrijkomt tijdens de hydrolyse reactie werd gemeten.

Voorbeeld 1

Kweek van de biokat.

Het kweken van Ochrobactrum anthropi NCIB 40321 en Klebsiella sp. NCIB 40322 geschiedde in 2 L Erlenmeyers gevuld met 500 ml medium, welke onder roeren (150 rpm) werden geincubeerd bij 28°C. Het medium bevatte de volgende componenten: 10 g/L yeastcarbon base (Difco), 1,5 g/L DL-amandelzuuramide en 50 mM kaliumfosfaat buffer pH 7,0. Circa twintig uur na het enten werden de gekweekte cellen door middel van centrifugatie geoogst (10 min, 15000 g), gewassen met kaliumfosfaat buffer (50 mM, pH 7,0) en geresuspendeerd in dezelfde buffer. De aldus verkregen celsuspensie werd ofwel direct gebruikt voor de enzymatische hydrolyse ofwel eerst korte tijd diep gevroren (-20°C).

Voorbeeld 2

Hydrolyse van DL-fenylglycineamide.

Ochrobactrum anthropi NCIB 40321 werd gekweekt zoals beschreven in voorbeeld 1.

De aldus verkregen celsuspensie bevatte 50 mg drooggewicht per ml. 0,5 ml van deze celsuspensie werd toegevoegd aan 19,5 ml 100 mM kaliumfosfaat buffer pH 8.0 die 5,0 g/L DL-fenylglycine amide bevatte. Na incubatie gedurende 15 min (40°C, 150 rpm) was 50% van het toegevoegde amide gehydrolyseerd. HPLC analyses gaven aan dat alleen het L-amide was gehydrolyseerd. Het resterende reactiemengsel bevatte zowel L-fenylglycine als D-fenylglycineamide met een e.e. > 99,5%. Tijdens incubaties met L- en D-fenylglycineamide afzonderlijk werd alleen het L-fenylglycineamide gehydrolyseerd. Ammoniak accumuleerde in stoichiometrische hoeveelheden.

Voorbeeld 3

De enantioselectieve hydrolyse van DL-amandelzuuramide.

Ochrobactrum anthropi NCIB 40321 en Klebsiella sp NCIB 40322 werden gekweekt zoals beschreven in voorbeeld 1. Gelijk voorbeeld 2 bevatte de verkregen celsuspensie van Ochrobactrum 50 mg drooggewicht/ml en de Klebsiella cellen 48 mg drooggewicht/ml. Van deze celsuspensies werd 2,0 ml toegevoegd aan 18 ml 100 mM kaliumfosfaat buffer pH 7,0 die 1,0 g/L DL-amandelzuuramide bevatte. Na incubatie gedurende 70 min (28°C, 150 rpm) werd de incubatie gestopt en het reactiemengsel geanalyseerd. De conversie werd zowel met HPLC als met de ion-selectieve ammoniak electrode bepaald.

De resultaten staan weergegeven in Tabel 1.

Tabel 1

Voorbeeld 4

Hydrolysesnelheid als functie van pH.

Op dezelfde manier als in voorbeeld 3 werd met Ochrobactrum anthropi NCIB 40321 cellen de hydrolyse-aktiviteit van DL-amandelzuuramide als functie van de pH onderzocht. De incubatie werd uitgevoerd bij 60°C. De volgende buffers (100 mM) werden gebruikt: kaliumfosfaat buffer (Δ); Tris/HCl buffer (*); glycine/NaOH buffer (.). De resultaten staan weergegeven in Figuur 1. Een aktiviteit van 100 % komt overeen met een hydrolysesnelheid van 140 nmol -1 -1 min (mg drooggewicht)

Voorbeeld 5

Hydrolysesnelheid als functie van temperatuur.

Op dezelfde manier als in voorbeeld 3 werd met

Ochrobactrum anthropi NCIB 40321 cellen de hydrolyse- aktiviteit van DL-amandelzuuramide als functie van de

temperatuur onderzocht. De incubatie werd uitgevoerd bij pH

8,5 (100 mM Tris/HCl). De resultaten staan weergegeven in

Figuur 2. Een aktiviteit van 100 % correspondeert met een -1 -1 hydrolysesnelheid van 175 nmol min (mg drooggewicht) Voorbeeld 6

Substraat en/of produkt inhibitie.

Op dezelfde manier als in voorbeeld 3 werd met Ochrobactrum anthropi NCIB 40321 cellen de hydrolyse aktiviteit van DL-amandelzuuramide als functie van zowel de amandelzuuramide als de amandelzuurconcentratie onderzocht. In de aanwezigheid van 100 g/1 amandelzuur was de aktiviteit vrijwel gelijk aan de aktiviteit zoals gemeten in voorbeeld 3. In de aanwezigheid van 100 g/L amandelzuuramide was de aktiviteit 25% lager dan de aktiviteit zoals gemeten in voorbeeld 3.

Voorbeeld 7

De enantioselectieve hydrolyse van a-N-hydroxyfenylglycine-amide.

Op dezelfde manier als in voorbeeld 1 werd Ochrobactrum anthropi NCIB 40321 gekweekt. 19,5 ml 100 mM kaliumfosfaat buffer pH 6,0, bevattende 2,0 g/L DL-a-N-hydroxyfenylglycineamide werd geflushed met moleculaire stikstof. Vervolgens werd 0,5 ml Ochrobactrum celsuspensie (50 mg drooggewicht per ml) aan dit reaktiemedium toegevoegd, nogmaals geflushed met moleculaire stikstof, en het incubatiemengsel al schuddend (150 rpm) geïncubeerd bij 40°C. Na 60 min was 50% aan het DL-amide gehydrolyseerd (HPLC-analyse en ammoniak bepaling). Na 120 min en 180 min werden exact dezelfde concentraties amide en ammoniak gemeten. Een incubatie met D- en L-a-N-hydroxyfenylglycineamide afzonderlijk liet zien dat alleen het L-amide werd gehydrolyseerd.

Voorbeeld 8

De enantioselectieve hydrolyse van a-methylfenyl-glycineamide.

Aan 18 ml 100 mM kaliumfosfaat buffer (pH 8,0) die 2,0 g/L a-methylfenylglycineamide bevatte werd 2,0 ml Ochrobactrum anthropi NCIB 40321 celsuspensie (50 mg drooggewicht per ml) toegevoegd. Na incubatie gedurende 60 min (40°C, 150 rpm) was 50% van het amide gehydrolyseerd. Analyse van het resterende reactiemengsel wees uit dat zowel L-a-methylfenylglycine als D-a-methylfenylglycineamide aanwezig waren met een e.e. van > 99%.

Voorbeeld 9

De enantioselectieve hydrolyse van valineamide.

Op dezelfde manier.als in voorbeeld 8 werd een incubatie uitgevoerd met DL-valineamide. Analyse van het resterend reactiemengsel na 4 uur gaf aan dat L-valine met een e.e. van 98,5% geproduceerd was en D-valineamide met een e.e. van > 99% resteerde.

Voorbeeld 10

De enantioselectieve hydrolyse van a-methylvalineamide.

Op dezelfde manier als in voorbeeld 8 werd een incubatie uitgevoerd met DL-<x-methylvalineamide. Analyse van het resterende reactiemengsel na 8 uur gaf aan dat zowel L-a-methylvaline als D-a-methylvalineamide met een e.e. > 99,5% in het reactiemengsel aanwezig waren.

Claims

1. Werkwijze voor de bereiding van een optisch aktief carbonzuur door enzymatische, enantioselektieve hydrolyse van een mengsel van de enantiomeren van het overeenkomstige amide en isolatie van het optisch aktieve zuur, met het kenmerk, dat een racemisch carbonzuuramide dat op de α-plaats gesubstitueerd is met een amino-, een hydroxy- of een N-hydroxyaminogroep, wordt gehydrolyseerd waarbij als enzym een Ochrobactrum anthropi of een Klebsiella sp. wordt toegepast.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat als enzym Ochrobactrum anthropi NCIB 40321 of Klebsiella sp. NCIB 40322 wordt toegepast.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat de hydrolyse wordt uitgevoerd bij een pH tussen 4 en 9,5.

4. Werkwijze volgens een der conclusies 1-3, met het kenmerk, dat de hydrolyse wordt uitgevoerd bij een temperatuur tussen 30 en 70*C.

5. Werkwijze volgens een der conclusies 1-4, met het kenmerk, dat als substraat een α-aminozuuramide wordt toegepast.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat als α-aminozuuramide een α-alkyl-a-aminozuuramide wordt toegepast.

7. Werkwijze volgens een der conclusies 1-4, met het kenmerk, dat als substraat een a-N-hydroxyaminozuuramide wordt toegepast.

8. Werkwijze volgens een der conclusies 1-4, met het kenmerk, dat als substraat een α-hydroxyzuuramide wordt toegepast.

9. Werkwijze voor het bereiden van een optisch aktief carbonzuuramide waarbij in een werkwijze volgens een der conclusies 1-8 het resterende carbonzuuramide wordt gewonnen.

10. Werkwijze zoals beschreven en toegelicht aan de hand de hand van de voorbeelden.

11. Optisch aktieve α-gesubstitueerde carbonzuren en carbonzuuramiden verkregen met de werkwijze volgens een der conclusies 1-10.