CN100471950C

CN100471950C - 具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的多肽和编码该多肽的核酸

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Publication number: CN100471950C
Application number: CNB038189984A
Authority: CN
Inventors: W·H·J·博伊斯坦; P·C·拉伊马克斯-弗兰肯; T·森克; G·J·W·厄维林克; P·格里普斯特拉
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2002-06-14
Filing date: 2003-06-13
Publication date: 2009-03-25
Anticipated expiration: 2023-06-13
Also published as: DE60313866D1; US7371555B2; CN1675371A; JP4402587B2; JP2005529611A; AU2003238717A1; WO2003106691A1; ES2285128T3; EP1513946B1; DE60313866T2; US20040248274A1; EP1513946A1; ATE362544T1

Abstract

本发明涉及具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的分离多肽和编码该多肽的核酸。本发明也涉及包含本发明核酸的载体和宿主细胞。本发明也涉及生成并利用本发明多肽的方法。本发明也涉及分离具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的多肽的方法，分离编码该多肽的核酸的方法和分离包含了具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的多肽的微生物的方法。本发明还涉及包含了具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的多肽的新微生物。

Description

具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的多肽和编码该多肽的核酸

α-H-α-氨基酸酰胺是容易获得的化合物，在药物和α-H-α-氨基酸的生产中是重要的前体。例如，通过对映选择性酶水解α-H-α-氨基酸酰胺的一种对映体，可以随机选择的特定对映体过量值(ee)从D-和L-α-H-α-氨基酸酰胺的混合物中获得对映体富集的α-H-α-氨基酸。在制备对映体富集的α-H-α-氨基酸的过程中，同时使α-H-α-氨基酸酰胺外消旋化将非常有利，因为这样使α-H-α-氨基酸酰胺完全转化为所属的光学活性α-H-α-氨基酸成为可能。同样，在其它过程中通常也希望使α-H-α-氨基酸酰胺外消旋化。因酶促外消旋化优于化学外消旋化(温和的反应条件，有利于环境等)，人们已做出很多尝试以鉴定具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的微生物并分离具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的多肽和编码该活性的基因。

对本发明的目的而言，α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性被定义为催化式1所示对映体富集的α-H-α-氨基酸酰胺的外消旋化的能力，

其中R¹表示1-20个C原子的任选取代的烷基或3-20个C原子(包括取代基的C原子)的任选取代的(杂)芳基，R²、R³和R⁴分别表示H或1-20个C原子的任选取代的烷基或3-20个C原子(包括取代基的C原子)的任选取代的(杂)芳基，其中R¹可与R²形成环和/或R³可与R⁴连同与它们相连的碳和/或氮原子一起形成环。各环均优选是5-8员环。优选的，R¹、R²、R³或R⁴分别表示1-10个C原子的烷基或3-10个C原子(包括取代基的C原子)的(杂)芳基。烷基或(杂)芳基的取代基可选自：羟基、烷氧基、巯基、硫代烷基、烷基、羧基、氨基、亚氨基、硝基、卤素、氨甲酰基、氰基、酰基、过氧基、磺基或磷酸基。式1所示α-H-α-氨基酸酰胺的实例为：脯氨酸酰胺、亮氨酸酰胺、谷氨酸酰胺、苯丙氨酸酰胺、t-亮氨酸酰胺、蛋氨酸酰胺、色氨酸酰胺、亮氨酰-甘氨酸、缬氨酰-甘氨酸、缬氨酰-丙氨酸、亮氨酰-丙氨酸。

α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶指具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的多肽。

α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性可通过与下述方法相似的方法测定，即测定消旋酶作用于除α-H-α-氨基酸酰胺以外的化合物的外消旋活性的方法。该方法是本领域技术人员已知的。例如，通过测定L-α-H-α-氨基酸酰胺或D-α-H-α-氨基酸酰胺的对映体过量值的减少，可测定α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性。

Fukumura et al.，1977，Agric.Biol.Chem.，vol.41，p1509-1510公开了从Achromobacter obae中分离α-氨基-ε-己内酰胺消旋酶的方法；编码该酶的核酸序列和该酶的氨基酸序列公开于Naoko et al.，1987，Biochemistry of vitamin B6，p449-452。对其酶活性而言，分离自Achromobacter obae的α-氨基-ε-己内酰胺消旋酶需要吡哆醛-5-磷酸作为辅因子(Ahmed et al.，1983，Agric.Biol.Chem.，vol　47，p1887-1893)。

已知分离自Achromobacter obae的α-氨基-ε-己内酰胺消旋酶专门催化α-氨基-ε-己内酰胺的外消旋化。采用下列底物检验分离自Achromobacter obae的α-氨基-ε-己内酰胺消旋酶的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性，底物即式1所示α-H-α-氨基酸酰胺：L-色氨酸酰胺、L-亮氨酸酰胺、L-亮氨酰-甘氨酸、L-缬氨酰-甘氨酸、L-缬氨酰-L-丙氨酸、L-亮氨酰-L-丙氨酸，但即使采用过量的酶仍未发现其具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性(Ahmed et al.，1983，Agric.Biol.Chem.，vol 47，p1887-1893)。

EP-A-383403公开了克雷伯氏杆菌属和相关菌属中的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性，EP-B1-378592公开了节杆菌种ATCC 31652(DSM4639)和棒杆菌种ATCC 31662(DSM 4640)中的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性。不过，利用这些出版物所公开的微生物并未检测到外消旋作用。因此，不能认为文献EP-A-383403和EP-B1-378592是现有技术。

所以，尽管人们为发现α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶已做了大量工作，但迄今为止，仍未公开任何一种α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶。

本发明则提供了这种α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶。

申请人也意外发现了分离显示了α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的微生物的合适方法，其中含微生物的样品是通过采用D-α-氨基-ε-己内酰胺或D-和L-α-氨基-ε-己内酰胺的混合物作为一种或唯一氮源而得以富集，并从而发现培养物经检验具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性。

实现该方法的合适途径举例如下；可将该方法进一步称为富集法。为获得本发明多肽，在含有可作为一种或唯一氮源的D-α-氨基-ε-己内酰胺或D-和L-α-氨基-ε-己内酰胺的混合物的合适生长培养基中或培养基上培养含微生物的样品，如环境样品，例如土壤样品或废水样品，直至可检测生长为止。

可将样品直接添加在以D-α-氨基-ε-己内酰胺或D-和L-α-氨基-ε-己内酰胺的混合物作为一种或唯一氮源的合适生长培养基上/培养基中。也有其它途径使样品施加于培养基，例如通过加入洗涤样品所用洗液的滤液。

在含有作为唯一氮源的D-α-氨基-ε-己内酰胺或D-和L-α-氨基-ε-己内酰胺的混合物的合适生长培养基中或培养基上培养环境样品即为所谓的富集法，Fukumura等人利用该富集法分离了α-氨基-ε-己内酰胺消旋酶，并描述于1977，Agric.Biol.Chem.，vol 41，p1321-1325中。优选的富集法是通过将培养的微生物一次或多次转移至‘新鲜’合适生长培养基中或培养基上，直至获得单一培养物(与混合培养物相反)而得以实现，其中合适生长培养基中含有可作为唯一氮源的D-α-氨基-ε-己内酰胺或D-和L-α-氨基-ε-己内酰胺的混合物。典型地应于4或5次转移后获得单一培养物。

添加除D-或D-和L-α-氨基-ε-己内酰胺的混合物以外的其它氮源可能是有利的，例如，帮助培养物开始生长。不过，对好的富集而言，所含D-α-氨基-ε-己内酰胺或D-和L-α-氨基-ε-己内酰胺的混合物的量应使具有转化D-和/或L-α-氨基-ε-己内酰胺能力的微生物可持续生长，而其它微生物则不能持续生长。

本领域的技术人员已知如何选择培养条件，例如培养条件可能取决于环境样品的来源和/或所需过程的所需条件。

检验富集法所获微生物的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性。该α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性检验可直接针对培养微生物接种平板后所获菌落的完整细胞或可通透细胞进行。可选地，将所获菌落分别培养在含有可作为一种或唯一氮源的D-α-氨基-ε-己内酰胺或D-和L-α-氨基-ε-己内酰胺的混合物的合适生长培养基中，从中制备无细胞提取物后，检验α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性。

无细胞提取物可根据本领域技术人员已知的标准方法制备，例如通过超声处理、弗氏压碎器等。细胞通透化可根据本领域技术人员已知的标准方法，例如通过添加少量甲苯实现。合适生长培养基实际上是含有可作为一种或唯一氮源的D-α-氨基-ε-己内酰胺或D-和L-α-氨基-ε-己内酰胺的混合物的所有培养基。合适生长培养基是本领域技术人员熟知的。可由例如本领域技术人员在Sambrook，J.，Fritsh，E.F.，和Maniatis，T.Molecular Cloing：A Laboratory Manual.2nd，ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborLaobratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989的指导下合成。

α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性检验优选针对单一培养物进行，但也可针对混合培养物进行。

本发明的一种优选实施方案中，检验富集法所获混合和/或单一培养物将L-α-氨基-ε-己内酰胺和D-α-氨基-ε-己内酰胺作为一种或唯一氮源，并加以利用的能力。

因此，本发明也涉及分离显示了α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的微生物的方法，该方法包括：

a)在一个或多个转移步骤内，在含有可作为一种或唯一氮源的D-α-氨基-ε-己内酰胺或D-和L-α-氨基-ε-己内酰胺的混合物的合适生长培养基中或培养基上培养含微生物的样品。

b)检验由此所获微生物的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性。

令人意外的是发现富集法适用于分离显示了α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的微生物。更为意外的是该富集法选择的是α-氨基-ε-己内酰胺消旋酶活性，而并非α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性。因此，本发明也涉及利用该方法可获得的具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的新微生物(包含多肽)。

通过该方式可分离若干种微生物，例如可能从下列属中分离微生物：土壤杆菌属(Agrobacterium)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、节杆菌属(Arthrobacter)、微球菌属(Micrococcus)、金杆菌属(Aureobacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、红球菌属(Rhodococcus)、短杆菌属(Brevibacterium)、红色杆菌属(Rubrobacter)、诺卡氏菌属(Nocardioides)、地杆菌属(Terrabacter)。

利用该富集法分离了显示α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的微生物菌株的一些单一培养物，并在布达佩斯条约下，于2002年5月8日将这些微生物保藏于国立工业和海洋微生物保藏有限公司(NCIMB)，Aberdeen，Scotland：发根土壤杆菌Na(Agrobacterium rhizogenesNa)的保藏号为NCIMB 41127、发根土壤杆菌Bi(Agrobacteriumrhizogenes Bi)的保藏号为NCIMB 41128、烟草节杆菌(Arthrobacter nicotianae)的保藏号为NCIMB 41126、人苍白杆菌IA(Ochrobactrum anthropi IA)的保藏号为NCIMB 41129。

从富集法所获的分离微生物中，分离出编码具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的多肽的核酸是可能的，克隆并表达该核酸从而生成本发明多肽也是可能的。核酸序列的分离、后续再克隆及其表达均可根据本领域技术人员已知的标准方法进行。

因此，本发明也涉及分离编码具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的多肽的核酸序列的方法，该方法包括以下步骤：

a)在一个或多个转移步骤内，在含有可作为其中一种或唯一氮源的D-α-氨基-ε-己内酰胺或D-和L-α-氨基-ε-己内酰胺的混合物的合适生长培养基中或培养基上培养含微生物的样品。

b)检验所获微生物的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性。

c)以本身为本领域已知的手段从所获微生物中分离编码α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶的核酸序列。

从具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的微生物中分离编码具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的多肽的核酸序列可通过例如，从具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的微生物中制备DNA文库、cDNA文库或表达文库，(部分)纯化具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的多肽，并随后通过反求遗传学或利用核酸阵列而得以实现。这些技术均是本领域技术人员已知的。例如，制备DNA或cDNA文库后，可通过利用探针或PCR引物，基于同源基因的序列信息或具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的多肽的序列信息，选择编码具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的多肽的核酸。例如，制备表达文库后，可通过α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性测定，通过利用本发明的富集法或通过利用由针对具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的多肽的抗体，选择具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的文库的克隆。例如，通过纯化具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的多肽，对其(部分)测序，并基于具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的多肽的序列信息分离所需核酸序列，例如利用探针或PCR引物，可实现反求遗传学。例如，如果通过比较具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的微生物于两种特定条件下的表达模式，已知了其基因组序列，便可利用DNA阵列推导编码具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的多肽的核酸序列，其中上述两种特定条件分别是使微生物不显示α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的条件和使其显示α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的条件。

本发明的一种实施方案中，编码α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶的核酸序列是通过下述步骤得以分离的。

第一步，从通过富集法所获的微生物中分离总DNA，并制备基因文库，使其表达于合适宿主内的合适载体中(如实施例所述)。第二步，检验含有带插入片段(该插入片段为分离自上述微生物的一段DNA)载体的基因文库的克隆催化α-H-α-氨基酸酰胺外消旋化的能力。例如，可根据实施例所述方法检验克隆的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性。

后续步骤中，测定具有催化α-H-α-氨基酸酰胺外消旋化能力的克隆中载体的插入片段的核酸序列，并从该测定的核酸序列中鉴定出可读框后，在合适载体和合适宿主内再克隆和表达该可读框，并再次检验其α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性。通过在合适宿主内的合适载体中表达编码α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的可读框，可生成本发明具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的多肽。

利用富集法和对上述核酸序列的后续分离，获得了编码特定菌株来源的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶的核酸序列，该菌株被鉴定为人苍白杆菌IA(Ochrobactrum anthropi IA)，由NCIMB保藏，保藏号为NCIMB 41129。该核酸序列如SEQ ID NO：1所示。相应多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。已发现氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶在广泛的pH和温度范围内均具有活性。利用该富集法，也获得了编码另一特定菌株来源的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶的核酸序列(SEQ ID NO：8)，该菌株被鉴定为烟草节杆菌(Arthrobacter nicotianae)，由NCIMB保藏，且保藏号为NCIMB41126。相应多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。

本发明也涉及通过上述方法可获得的编码具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的多肽的核酸序列。

利用标准分子生物学技术也可分离编码本发明具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的多肽的核酸序列，如具有SEQIDNO：1或SEQ ID NO：8所示序列的核酸序列，此处提供了其序列信息。例如，以SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：8所示核酸序列的全部或一部分作为杂交探针，可利用标准杂交和克隆技术(例如Sambrook，J.，Fritsh，E.F.，和Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual.2nd，ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY，1989所描述的技术)分离本发明的核酸序列。

此外，通过聚合酶链反应(PCR)，采用基于SEQ ID NO：1或SEQID NO：2所包含的序列信息设计的合成寡核苷酸引物，分别为SEQ IDNO：8或SEQ ID NO：9，可分离包含全部或一部分SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：8的核酸序列。

根据标准(RT)-PCR扩增技术，以例如基因组DNA、cDNA或可选的mRNA为模板，并采用合适的寡核苷酸引物，可扩增本发明的核酸序列。所扩增的核酸可被克隆进合适载体中，并由DNA序列分析表征。

此外，与本发明核酸序列对应或可与其杂交的寡核苷酸可通过标准合成技术，例如利用自动DNA合成仪制备。

应当注意的是本发明也包括编码具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的多肽的核酸的突变体，与从天然存在的宿主分离而来的相应多肽相比，该突变体具有一种或多种突变。制造突变的方法是本领域技术人员已知的，例如通过随机诱变(例如通过易错PCR或UV辐射)、定点诱变等。

本发明也涉及生成具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的多肽的方法，该方法包括以下步骤：

a)在一个或多个转移步骤内，在含有作为一种或唯一氮源的D-α-氨基-ε-己内酰胺或D-和L-α-氨基-ε-己内酰胺的混合物的合适生长培养基中或培养基上培养含微生物的样品。

b)检验所获微生物的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性。

d)在合适宿主中表达该核酸序列，以生成具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的多肽。

表达编码本发明多肽的核酸序列可通过例如，在合适载体中克隆该核酸，并将其导入合适宿主后，根据本领域技术人员已知的标准克隆和表达技术(例如Sambrook，J.，Fritsh，E.F.，和Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual.2^nd，ed.，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1989所描述的技术)(过量)表达该序列，从而生成本发明多肽。因此，本发明也涉及包含本发明核酸序列的载体。

可选地，为生成本发明多肽，可将编码本发明多肽的核酸序列整合进宿主细胞基因组内，并使其(过量)表达。该操作可根据本领域技术人员已知方法进行。因此，本发明也涉及包含并表达本发明核酸序列的宿主细胞，优选含有特定载体的宿主细胞，该载体包含本发明核酸序列。

可选地，通过例如，将合适启动子放置于本发明核酸序列的上游，通过将本发明核酸序列的一个或多个拷贝整合进其天然宿主的基因组中，优选地通过使本发明核酸在其天然宿主内的合适载体中表达，可使本发明多肽在其天然宿主内过量表达，上述方法均是本领域技术人员已知的。

合适的宿主指本领域技术人员已知的通常用于克隆和表达的宿主。合适大肠杆菌宿主菌株的实例为：TOP10F’、TOP10、DH10B、DH5α、HB101、W3110、BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS。

合适的载体指本领域技术人员已知的通常用于克隆和表达的载体。用于在大肠杆菌中表达的合适载体实例见，例如Makrides，S.C.，1996，Microbiological Reviews，p.512-538中的表1。优选的载体含有位于克隆位点上游的启动子，该启动子可于宿主已生长至表达具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的相应多肽后打开，其中上述克隆位点含有编码具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的多肽的核酸序列。可打开和关闭的启动子是本领域技术人员已知的，例如，lac启动子、araBAD启动子、T7启动子、trc启动子、tac启动子、trp启动子和aroH启动子。

因此本发明涉及通过上述方法可获得的具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的多肽。

本发明的一种优选实施方案中，本发明涉及具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性，并与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列存在至少大约35％、优选的是至少大约40％、更为优选的是至少大约50％、还要更为优选的是至少大约55％、尤其是至少大约65％、更为尤其的是大约75％、还要更为尤其的是至少大约85％、还要更为尤其的是至少大约90％、还要更为尤其的是至少大约95％、最为尤其的是至少大约97％同一性程度的分离多肽。

本发明的另一种优选实施方案中，本发明涉及具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性，并与SEQ ID NO：9所示氨基酸序列存在至少大约50％、优选的是至少大约60％、更为优选的是至少大约70％、还要更为优选的是至少大约80、尤其是至少大约90％、更为尤其的是大约95％、最为尤其的是至少大约97％同一性程度的分离多肽。

对本发明的用途而言，两个氨基酸序列之间的同一性程度是通过blastp逐对比对算法(NCBI)，利用同一性表和下列对比参数测定的：错配＝-3、罚分＝-3、空位延伸＝1、匹配奖分＝1、Gapx-droff＝50、预计值＝10、字长＝3。

本发明也涉及具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性，并由可于低严格性条件下、优选中等严格性条件下、更为优选高严格性条件下、最为优选极高严格性条件下与编码序列SEQ ID NO：1或其互补链，或编码序列SEQ ID NO：8或其互补链杂交的核酸序列所编码的分离多肽。

杂交实验可通过本领域技术人员熟知的多种方法实现。在这些不同方法中选择合适方法的通用准则可见于例如，Sambrook，J.，Fritsh，E.F.，和Maniatis，T.Molecular Cloning：A LaboratoryManual.2nd，ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中的第9章。

杂交条件的严格性指进行包括实际杂交和洗涤步骤的杂交的条件。洗涤步骤被用于洗去未与固定在例如，硝酸纤维素滤膜上的目标核酸杂交的核酸。杂交条件的严格性可通过例如，改变洗涤溶液的盐浓度和/或通过改变洗涤步骤的温度(洗涤温度)而得以改变。通过降低洗涤溶液的盐浓度或提高洗涤温度，可提高杂交的严格性。对本申请的用途而言，杂交在大约45℃，于6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)溶液中进行大约12小时。50℃，在1×SSC、0.1％ SDS中进行2次持续30分钟的洗涤步骤是低严格性的实例，55℃则是中等严格性的实例，60℃是高严格性的实例，65℃是极高严格性的实例。

本发明也涉及具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性，并显示具有与针对由氨基酸序列SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：9的片段的抗体的免疫学交叉反应性的分离多肽。

免疫学交叉反应性可利用针对具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的本发明分离多肽的至少一个表位的抗体，或与该表位反应的抗体测定。可能为单克隆或多克隆的抗体可通过本领域的已知方法生成，例如Hudson等人的Practical Immunology，第三版(1989)，BlackwellScientific Publications所描述的方法。免疫化学交叉反应性可采用本领域已知的方法测定，其中一个实例是如Hudson等人的Practical Immunology，第三版(1989)，Blackwell ScientificPublications所描述的蛋白质印迹法。

本发明也涉及本发明多肽的片段，该片段具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性，并含有至少100个氨基酸，优选125-350个氨基酸，更为优选的200-300个氨基酸。

本发明也涉及通过表达与一个或多个编码标记多肽的核酸序列可操作性地连接，并编码本发明多肽的核酸序列，而获得的融合蛋白。可操作性地连接指该核酸序列的连接可使其表达时生成本发明多肽，其中该多肽的N-和/或C-末端具有标记多肽。该标记多肽具有多种用途，例如，可将其用于提高融合蛋白的稳定性或可溶性，可将其作为分泌信号应用，该信号可将融合蛋白引导至细胞的特定区室，或者利用它以利于融合蛋白的纯化。被用于帮助纯化融合蛋白的标记多肽的一个实例是六组氨酸肽。具有六组氨酸标记的融合蛋白的纯化方法在例如，Gentz et al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.86，p.821-824中有所描述。根据供应商提供的操作流程，例如，可将具有六组氨酸标记的融合蛋白导入pQE载体(Qiagen，Inc.)中。

本发明也涉及编码本发明具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的多肽的核酸序列。这些核酸序列可如上所述通过富集法和对所需核酸的后续分离而获得。

根据本发明，α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶和显示α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的微生物均可应用于对映体富集的α-H-α-氨基酸酰胺外消旋化的过程中。因此，本发明涉及对映体富集的α-H-α-氨基酸酰胺的外消旋化过程，其中外消旋化是在本发明多肽或本发明微生物的存在条件下进行。

在从D-和L-α-H-α-氨基酸酰胺的混合物制备对映体富集的α-H-α-氨基酸的过程中，或在从相应D-α-H-α-氨基酸酰胺制备L-α-H-α-氨基酸的过程中，或在从相应L-α-H-α-氨基酸酰胺制备D-α-H-α-氨基酸的过程中，可适当地将本发明α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶与对映选择性酰胺酶结合应用。在上述过程中利用α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶将(理论上)致使α-H-α-氨基酸酰胺100％转化为相应的对映体富集的α-H-α-氨基酸(100％收率)。因此，本发明也涉及在从D-和L-α-H-α-氨基酸酰胺的混合物制备对映体富集的α-H-α-氨基酸的过程中，或在从相应D-α-H-α-氨基酸酰胺制备L-α-H-α-氨基酸的过程中，或在从相应L-α-H-α-氨基酸酰胺制备D-α-H-α-氨基酸的过程中，本发明α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶与对映选择性酰胺酶的结合应用。本发明也涉及从相应D-和L-α-H-α-氨基酸酰胺的混合物制备对映体富集的α-H-α-氨基酸的过程，或从相应D-α-H-α-氨基酸酰胺制备L-αα-H-α-氨基酸的过程，或从相应的L-α-H-α-氨基酸酰胺制备D-α-H-α-氨基酸的过程，其中上述过程在对映选择性酰胺酶和根据本发明具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的多肽，或根据本发明显示α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的微生物的存在条件下进行。

优选地，在上述过程中，对映选择性酰胺酶具有至少90％对映选择性，更为优选的是至少95％对映选择性，还要更为优选的是至少98％对映选择性，最为优选的是至少99％对映选择性。对本发明而言，酰胺酶(例如D-酰胺酶)的90％对映选择性被定义为该酰胺酶将DL-α-H-α-氨基酸酰胺的外消旋混合物转化为90％α-H-α-氨基酸的一种对映体(例如D-α-H-α-氨基酸)和10％α-H-α-氨基酸的另一种对映体(例如L-α-H-α-氨基酸)，α-H-α-氨基酸酰胺混合物的总转化率为50％。95％对映选择性(例如95％D-和5％L-α-H-α-氨基酸)对应E值为58.4(e.e.90％)。98％对映选择性(例如98％D-和2％L-α-H-α-氨基酸)对应E值为193.6(e.e.96％)。99％对映选择性(例如99％D-和1％L-α-H-α-氨基酸)对应E值为458.2(e.e.98％)。

对α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性而言，加入辅因子，例如吡哆醛-5-磷酸在某些时候可能是有利的。

在该过程中，优选的本发明α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶并不显示α-H-α-氨基酸消旋酶活性，即催化D-α-H-α-氨基酸和L-α-H-α-氨基酸外消旋化的能力。

通过下述实施例例证本发明。但这些实施例对本发明不构成限制。

实施例

一般操作

标准分子克隆技术，如质粒DNA分离、凝胶电泳、核酸的酶限制修饰、大肠杆菌转化等均如Sambrook et al.，1989，“MolecularCloning：a laboratory manual”，Cold spring HarborLaboratories，Cold Spring Harbor，NY所描述方法或供应商的说明书进行。如无另外指出，标准分子克隆酶，如限制性内切核酸酶、T4 DNA连接酶等均获自Invitrogen(Breda，The Netherless)。合成寡脱氧核苷酸获自Sigma-Genosys(Cambridge，UK)和Invitrogen(Paisley，Scotland，UK)。DNA序列分析是利用BaseClear(Leiden，The Netherlands)通过采用染料标记的双脱氧-终止子的链终止法进行。

实施例1

富集法

该富集操作中，将-80℃保存的不同土壤和污泥样品直接用于接种50ml液体培养基A(酵母碳基质(Difco，11.7g/l)、KH₂PO4(6.7g/l)、K₂HPO4(8.9g/l)、pH7.0)，该培养基含有作为唯一氮源的外消旋DL-α-氨基-ε-己内酰胺(2g/l)。每烧瓶接种一刮勺接种物。28℃、200rpm条件下培养各烧瓶。

大约2天后，在所有烧瓶中均观测到良好生长。所有培养物中的土壤颗粒沉降后，在含有2g/l DL-α-氨基-ε-己内酰胺的培养基A中制备1:1,500稀释液，并于28℃、200rpm条件下温育。获得充分生长后，从各烧瓶取样，以测定培养液中L-和D-α-氨基-ε-己内酰胺的浓度。将这些样品离心，并经由0.45μM滤器过滤上清液以除去所有细胞。随后通过HPLC分析这些样品。该HPLC方法将邻苯二醛与D-3-巯基-2-甲基丙酸结合应用，作为手性试剂，用于分离两种α-氨基-ε-己内酰胺对映体(Duchateau et al.，1992，J.Chromatogr.，vol.623，p237-245)。

只选择特定烧瓶，即培养物的生长利用了α-氨基-ε-己内酰胺的两种对映体的烧瓶进行后续步骤。将这些培养物的不同稀释液接种于含培养基A的平板上，该培养基A含有作为唯一氮源的2g/l DL-α-氨基-ε-己内酰胺，28℃温育各平板。随机选择菌落，将其重新分离在相同类型的选择性平板上，以获得单一培养物。随后将各单一培养物的一个菌落转移进5ml含2g/l DL-α-氨基-ε-己内酰胺的培养基A中。28℃、200rpm条件下培养3天后，完全如上所述，分析所获培养物利用D-和L-α-氨基-ε-己内酰胺的情况。将可利用D-和L-α-氨基-ε-己内酰胺二者的单一培养物保存于-80℃的20％(v/v)甘油中。

最后，检验上述单一培养物来源细胞的α-氨基-ε-己内酰胺消旋酶活性。于28℃、200rpm条件下，在含有DL-α-氨基-ε-己内酰胺(2g/l)的培养基A中培养3天后，离心收获细胞，采用20mM HEPES-NaOH缓冲液(pH7.7)洗涤并冻干。

随后从上述各单一培养物来源的冻干细胞中各取100mg，加入由10mM HEPES-NaOH缓冲液(pH7.7)、甲苯(2.5v/v％)、吡哆醛-5-磷酸(20μM)和L-α-氨基-ε-己内酰胺(2.5m％)组成的反应混合物中。采用化学空白(实验混合物不含冻干细胞)作为阴性对照。40℃温育所有反应混合物(包括空白)大约72小时，通过加入9倍体积的1M H₃PO₄终止反应。借助于0.45μM滤器过滤除去细胞后，通过上述HPLC方法分析上述反应混合物，以测定D-和L-α-氨基-ε-己内酰胺的浓度。最后，将可从L-α-氨基-ε-己内酰胺底物形成D-α-氨基-ε-己内酰胺的单一培养物送至NCIMB用于菌株鉴定。

Nb.化学空白经测定不含D-α-氨基-ε-己内酰胺。

菌株鉴定

由上所获可使L-α-氨基-ε-己内酰胺外消旋的其中一种单一培养物被NCIMB鉴定为人苍白杆菌菌株，于布达佩斯条约下由NCIMB作为人苍白杆菌IA保藏，保藏号为NCIMB 41129。鉴定结果如表1所示。

表1：国立工业和海洋微生物保藏有限公司(NCIMB LTD)对分离物IA的菌株鉴定结果。鉴定编号ID4036。

分离物代码	IA
分离物代码	IA	培养温度(℃)	30
革兰氏染色	-	培养温度(℃)	30
革兰氏染色	-	孢子	-
游动性	+	孢子	-
游动性	+	菌落形态(LB培养基上生长2天后)	圆形、规则、全缘、平滑、有光泽、低凸、浅黄色、不透明。1毫米直径
37℃生长	+	菌落形态(LB培养基上生长2天后)	圆形、规则、全缘、平滑、有光泽、低凸、浅黄色、不透明。1毫米直径
37℃生长	+	45℃生长	-
过氧化氢酶	+	45℃生长	-
过氧化氢酶	+	氧化酶	+
葡萄糖OF中的发酵	氧化的	氧化酶	+
葡萄糖OF中的发酵	氧化的	API 20NE试验结果：
NO<sub>3</sub>还原	+	API 20NE试验结果：
NO<sub>3</sub>还原	+	吲哚还原	-

葡萄糖来源的酸	-
葡萄糖来源的酸	-	精氨酸二羟化酶	-
脲酶	+	精氨酸二羟化酶	-
脲酶	+	七叶苷水解	-
明胶水解	-	七叶苷水解	-
明胶水解	-	β-半乳糖苷酶	-
葡萄糖同化	+	β-半乳糖苷酶	-
葡萄糖同化	+	阿拉伯糖同化	+
甘露糖同化	+	阿拉伯糖同化	+
甘露糖同化	+	甘露醇同化	+
N-乙酰-葡糖胺同化	+	甘露醇同化	+
N-乙酰-葡糖胺同化	+	麦芽糖同化	-
葡糖酸同化	-	麦芽糖同化	-
葡糖酸同化	-	癸酸同化	-
己二酸同化	-	癸酸同化	-
己二酸同化	-	苹果酸同化	+
分离物代码	IA	苹果酸同化	+
分离物代码	IA	柠檬酸同化	+
苯乙酸同化	-	柠檬酸同化	+
苯乙酸同化	-	细胞色素氧化酶	+
进一步生化试验结果		细胞色素氧化酶	+
进一步生化试验结果		酸产生于：
葡萄糖ASS<sup>a</sup>	+	酸产生于：
葡萄糖ASS<sup>a</sup>	+	卫矛醇ASS	+
侧金盏糖醇ASS	+	卫矛醇ASS	+
侧金盏糖醇ASS	+	棉子糖ASS	-
木糖OF	+	棉子糖ASS	-
木糖OF	+	甘氨酸CSU<sup>b</sup>	+
亚硝酸盐还原为N<sub>2</sub>	+	甘氨酸CSU<sup>b</sup>	+
亚硝酸盐还原为N<sub>2</sub>	+	PPA	+
Simmons柠檬酸盐	-	PPA	+

吐温80水解	-
吐温80水解	-	酪氨酸分解	-
H<sub>2</sub>S产出(PbAc)	+	酪氨酸分解	-

^a：ASS，氨盐糖

^b：CSU，碳源利用

冻干的人苍白杆菌IA细胞的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性测定

在含有唯一氮源，即DL-α-氨基-ε-己内酰胺(2g/l)的培养基A中培养人苍白杆菌IA细胞。28℃、200rpm条件下培养3天后(OD_620nm＝4.7)，离心收获细胞，在pH7.7、20mM的HEPES-NaOH缓冲液中洗涤，并冻干。

将冻干细胞用于证实α-H-α-氨基酸酰胺外消旋酶活性。实验混合物由10mM的HEPES-NaOH缓冲液(pH7.7)组成，该缓冲液含甲苯(2.5v/v％)、吡哆醛-5-磷酸(20μM)、D-或L-亮氨酸酰胺(2.5m％)，某些情况中还包含EDTA(20mM)。每次实验采用150mg冻干细胞。采用化学空白(实验混合物不含人苍白杆菌IA细胞)作为阴性对照。40℃温育所有反应混合物(包括空白)大约72小时，通过加入9倍体积的1M H₃PO₄终止反应。最后，通过HPLC分析反应混合物，以测定D-和L-亮氨酸酰胺的浓度。该HPLC方法将邻苯二醛与D-3-巯基-2-甲基丙酸结合应用，作为手性试剂，用于对映分离上述氨基化合物(Duchateau et al.，1992，J.Chromatogr.，vol.623，p237-245)。

在许多反应中，加入EDTA可抑制人苍白杆菌IA细胞中存在的L-和/或D-特异性酰胺酶。通过抑制该酰胺酶，L-和/或D-氨基酸酰胺便不会或仅部分转化为相应氨基酸，从而能够通过检测其它氨基酸酰胺对映体，证实氨基酸酰胺消旋酶活性。有EDTA参与的反应(No.3&4)清晰地显示人苍白杆菌IA细胞具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性，因为D-亮氨酸酰胺被转化为L-亮氨酸酰胺，且反之亦然。化学空白未显示该外消旋化反应。

无EDTA参与的情况中，酰胺酶将底物和/或产物α-H-α-氨基酸酰胺转化为α-H-α-氨基酸，从而避免直接将其它α-H-α-氨基酸酰胺对映体作为外消旋化产物而直接检测。不过，从D-亮氨酸酰胺开始，无EDTA参与的反应也清晰地证实人苍白杆菌IA中存在α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性，因为该底物被转化为大量L-亮氨酸，对照实验排除了经由D-亮氨酸形成L-亮氨酸，因为人苍白杆菌IA不能将亮氨酸外消旋化。化学空白中未检测到由D-亮氨酸酰胺形成L-亮氨酸。

表2：冻干的人苍白杆菌IA细胞中的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性

No	底物	EDTA(20mM)	D-亮氨酸酰胺(m％)	L-亮氨酸酰胺(m％)	D-亮氨酸(m％)	L-亮氨酸(m％)
No	底物	EDTA(20mM)	D-亮氨酸酰胺(m％)	L-亮氨酸酰胺(m％)	D-亮氨酸(m％)	L-亮氨酸(m％)	1	D-亮氨酸酰胺	-	0.22	<0.001	0.015	0.044
2	L-亮氨酸酰胺	-	<0.001	<0.001	0.001	0.21	1	D-亮氨酸酰胺	-	0.22	<0.001	0.015	0.044
2	L-亮氨酸酰胺	-	<0.001	<0.001	0.001	0.21	3	D-亮氨酸酰胺	+	0.24	0.032	0.007	0.008
4	L-亮氨酸酰胺	+	0.021	0.15	0.003	0.058	3	D-亮氨酸酰胺	+	0.24	0.032	0.007	0.008

所示浓度为在反应混合物中测定的浓度，与原始反应混合物相比，被稀释了10倍。

实施例2

富集法

将不同场所来源、大约30g新鲜土壤样品重新悬浮于50ml补充有唯一氮源，即2g/1D-α-氨基-ε-己内酰胺的培养基A中，4℃、200rpm条件下振荡30分钟。借助于滤纸过滤悬液，除去土壤颗粒。通过下述两种不同方法从所获滤液中选择可将D-α-氨基-ε-己内酰胺作为氮源利用的菌株。

●从不同滤液中各取5ml转移至空的100ml烧瓶中。28℃、200rpm条件下温育所有烧瓶，直至OD_600nm达大约2.5。随后在含2g/l D-α-氨基-ε-己内酰胺的新鲜培养基A中1∶100稀释培养物，再次进行培养步骤。上述稀释和再培养步骤重复3次以上。随后将良好生长培养物的不同稀释液接种于培养基A平板上，该培养基含有唯一氮源，即2g/lD-α-氨基-ε-己内酰胺，28℃温育。随机选择菌落，并再分离至相同选择性平板上5次，获得纯单一培养物。最后，将上述单一培养物保存于-80℃、20％(v/v)甘油中。

●作为可选富集方案，将所有滤液的不同稀释液直接接种于含唯一氮源，即2g/l D-α-氨基-ε-己内酰胺的培养基A平板上。28℃温育2天后，几乎所有平板均出现第一批菌落。更多天至3周后，获得大量形态不同的菌落。随机选择形态不同的菌落，并再分离至相同选择性平板上5次，获得纯单一培养物。最后，将上述单一培养物保存于-80℃、20％(v/v)甘油中。

最后，检验上述单一培养物来源细胞的α-氨基-ε-己内酰胺消旋酶活性。于28℃、200rpm条件下，在800ml含2g/l D-α-氨基-ε-己内酰胺的培养基A中培养上述细胞后，离心(20分钟，5,000×g，4℃)收获细胞，并将其重新悬浮于40ml超声处理缓冲液(NaCl，16g/l；KCl，0.74g/l；Na₂HPO4，0.27g/l；葡萄糖，2g/l；HEPES，10g/l，pH7.0)中。随后，通过利用MSE的Soniprep 150超声处理，振幅为20微米，10分钟一个循环，时间间隔为10秒(即10秒超声处理，10秒冷却)，并冷却于冰/丙酮中，使细胞裂解。每一循环结束后，显微观察细胞，当50-70％的细胞破碎时终止超声处理操作。

随后，将D-α-氨基-ε-己内酰胺和吡哆醛-5-磷酸加入各单一培养物的裂解细胞悬液中，浓度分别为5g/l和0.01mM。于20℃、20rpm条件下温育1.5小时后，将2ml样品转移进1ml、1M H3PO4中。离心并借助于0.22μM滤器过滤，除去所有颗粒后，采用实施例1所述操作流程，通过HPLC测定各样品中D-和L-α-氨基-ε-己内酰胺的浓度。最后，将可从D-α-氨基-ε-己内酰胺底物形成L-α-氨基-ε-己内酰胺的单一培养物送至NCIMB，用于菌株鉴定。

菌株鉴定

上述所获单一培养物由NCIMB经过16S rDNA序列测定后被鉴定为发根土壤杆菌Bi和发根土壤杆菌Na和烟草节杆菌。上述16S rDNA测定结果如下所示。在布达佩斯条约下将上述微生物保藏于NCIMB。发根土壤杆菌Na的保藏号为NCIMB 41127，发根土壤杆菌Bi的保藏号为NCIMB 41128，烟草节杆菌的保藏号为NCIMB 41126。

16S rDNA序列分析

方法

DNA提取：利用Prepman纯化试剂盒提取DNA，并保存于冰上直至使用。

聚合酶链反应：利用通用真细菌引物扩增16S核糖体DNA基因，并通过1％琼脂糖凝胶电泳分析。

DNA产物纯化：通过自旋柱离心纯化500bp片段，并将其重新悬浮于无菌蒸馏水中。

DNA测序：采用双脱氧链终止法(Sanger et al.，1997)对纯化的DNA产物自动测序。

通过数据库对照进行的序列分析：将16S rDNA基因的序列与核酸序列数据库对照。

结果

序列表部分提供了发根土壤杆菌Na NCIMB 41127的16S rDNA序列(SEQ ID NO：5)、发根土壤杆菌Bi NCIMB 41128的16S rDNA序列(SEQ ID NO：4)和烟草节杆菌NCIMB 41126的16S rDNA序列(SEQID NO：3)。

发根土壤杆菌Na、发根土壤杆菌Bi和烟草节杆菌的裂解细胞的 α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性测定

裂解细胞的制备

上述三种菌株在含2g/l D-α-氨基-ε-己内酰胺的培养基A中的生长结束后，12.000×g离心收获细胞。将离心后的上清液倾析并测定沉淀的湿重。以1：2的比例(湿重细胞沉淀：毫升缓冲液)，向沉淀加入超声处理缓冲液(NaCl，16g/l；KCl，0.74g/l；Na₂HPO₄，0.27g/l；葡萄糖，2g/l；HEPES，10g/l，pH7.0)。细胞收获与超声处理之间的保存期间，将沉淀冷冻于-86℃的超声处理缓冲液中。

利用MSE的Soniprep 150超声处理，最大振幅为20微米，10分钟一个周期，时间间隔为10秒(即10秒超声处理，10秒冷却)，并将样品冷却于冰/丙酮中。每10分钟显微观察细胞。当>70％的细胞破碎时终止超声处理操作。

采用裂解细胞进行的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性检验

分别从三种菌株中各取1ml裂解细胞，培养在添加有辅因子，即吡哆醛-5-磷酸(0.01mM)和底物D-亮氨酸酰胺(60.8mM)、pH7.7的HEPES-NaOH缓冲液(20mM)中，总体积为10ml(0.79w/w％ D-亮氨酸酰胺)。0和139小时后各取样1ml(测定其准确重量)，并通过加入1ml甲醇终止这些样品中的反应(也测定其准确重量；可计算稀释倍数)。将终止的反应混合物离心，以除去颗粒。将上清液冷冻于-86℃，直至根据实施例1所述方法进行HPLC分析。

制备空白反应混合物，以相同方式取样和终止反应，但未添加底物以及裂解细胞，仅添加有HEPES-NaOH缓冲液(20mM，pH7.7)。

结果如表3所示。

表3.发根土壤杆菌Na、发根土壤杆菌Bi和烟草节杆菌的裂解细胞的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性测定

样品代码	培养时间(小时)	D-亮氨酸(w/w％)	L-亮氨酸(w/w％)	L-亮氨酸酰胺(Mw％)
样品代码	培养时间(小时)	D-亮氨酸(w/w％)	L-亮氨酸(w/w％)	L-亮氨酸酰胺(Mw％)	烟草节杆菌	139	0.002	0.068	0.56
发根土壤杆菌Na	139	0.036	0.078	0.51	烟草节杆菌	139	0.002	0.068	0.56
发根土壤杆菌Na	139	0.036	0.078	0.51	发根土壤杆菌Bi	139	0.013	0.025	0.61

由该表可知在发根土壤杆菌Na、发根土壤杆菌Bi和烟草节杆菌的裂解细胞中均存在α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性，因为D-亮氨酸酰胺被转化为L-亮氨酸；化学空白中未检测出该转化。在化学空白中，即使139小时后也未能检测到D-亮氨酸或L-亮氨酸；D-亮氨酸酰胺的浓度恒定(0.7w/w％)，说明D-亮氨酸酰胺在所用反应条件下非常稳定。

实施例3

人苍白杆菌IA来源的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶基因的分离

表达文库构建

为获得单菌落，将甘油保存的人苍白杆菌IA划线接种在含唯一氮源，即0.5％(w/v)DL-α-氨基-ε-己内酰胺的酵母碳基质平板上，28℃培养。将单菌落转移至150ml LB液体培养基中，28℃、剧烈振荡条件下生长至OD_620nm为0.9。随后离心收获细胞并于-20℃冷冻。

解冻细胞后，根据针对细菌的Qiagen基因组DNA纯化操作，利用Qiagen Genomic-tip 100/G tips分离总DNA。标准Qiagen操作流程存在下述改动：

●使细胞溶解的第一个温育步骤是在无蛋白酶K的条件下37℃进行2小时，随后加入两倍建议量的蛋白酶K，并于50℃继续温育溶液2小时。

●将溶菌产物应用于Qiagen tips之前，先进行离心步骤(10分钟，5,000×g，4℃)使颗粒物质沉淀。

●将来源自150ml培养物中的细胞的溶菌产物上样于3G/100柱。

随后采用Sau3AI以每微克DNA加入1/12U Sau3AI的量，部分消化由上所获的50μg染色体DNA 30分钟。将已消化DNA的一半上样在0.6％琼脂糖凝胶上，分离大小为4-10kb的DNA片段，并再次溶解在20μl、pH8.0、10mM的Tris-HCl缓冲液中。

根据Invitrogen提供的操作流程，通过采用BamH I消化1μgpZErO-2(Invitrogen，Groningen，The Netherlands)，以制备载体。

采用T4 DNA连接酶将线性化载体DNA(50ng)与人苍白杆菌IA染色体DNA片段(10μl)连接(根据Invitrogen提供的操作流程)。随后，采用NaAc/乙醇使连接混合物沉淀，并将其重新悬浮于20μlTE缓冲液中。根据供应商提供的操作流程，利用BioRad基因脉冲发生器(条件：2.5kV、25μF、100Ω、0.1cm比色皿、40μl细胞悬液)，取1μl上述溶液用于进行电感受态大肠杆菌DH10B细胞(LifeTechnologies)的电穿孔。将转化体接种于含50mg/l卡那霉素的LB培养基平板上，并于28℃温育24小时。获得菌落总数超过12,000个，可形成初级基因文库。将全部12,000个菌落混合于补充有50mg/l卡那霉素的LB培养基中。将所获细胞悬液的一部分用于根据QiaPrep操作(Qiagen)分离总质粒。将该“质粒形式的文库”保存于-20℃直至进一步的使用。在剩余部分的细胞悬液中加入终浓度为20％(v/v)的甘油。将所获悬液分为等分试样，保存于-80℃，作为初级基因文库。

L-氨肽酶辅助溶液的制备

用于α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶筛选操作的L-氨肽酶辅助溶液制备自含质粒pTrcLAP的重组大肠杆菌菌株。大肠杆菌表达载体pTrcLAP含有受trc启动子控制的恶臭假单胞菌Pseudomonas putida ATCC12633 pepA基因。有关该恶臭假单胞菌L-氨肽酶编码基因的详细资料可见于T.Sonke，B.Kaptein，W.H.J.Boesten，Q.B.Broxterman，H.E.Schoemaker，J.Kamphuis，F.Formaggio，C.Toniolo，F.J.T.Rutjes in Stereoselective Biocatalysis(Ed.：R.N.Patel).Dekker，New York..2000，pp.23-58。

将大肠杆菌TOP 10/pTrcLAP的新鲜过夜培养物用于接种200ml含0.4mM IPTG和100mg/l氨苄青霉素的LB培养基。30℃生长过夜后，离心沉淀细胞，并将其重新悬浮于4ml、pH7.5、50mM的Tris-HCl中，一次性通过弗氏细胞压碎器(4ml弗氏压碎器细胞所用压力为140Mpa)破坏细胞后，离心(45分钟，40,000×g，4℃)收集固体颗粒。将沉淀重新悬浮于2ml含100mM MgSO4、pH7.5的Tris-HCl中。4℃、温和搅拌悬液30分钟。离心(45分钟，40，000×g，4℃)除去颗粒后，将澄清溶液分为等分试样，保存于-20℃，以供筛选实验使用。

筛选

将“质粒形式文库”溶液于水中稀释1,000倍。取1μl该质粒溶液用于转化电感受态大肠杆菌TOP10细胞(Invitrogen)，并将转化体接种于含50mg/l卡那霉素的LB培养基平板上。28-30℃温育2天后，所获菌落的大小足以被转移至微量滴定板内200μl含50mg/l卡那霉素的液体筛选培养基(蛋白胨16g/l；酵母提取物3g/l；NaCl 5g/l；甘油2g/l；pH7.3)中。培养物于28-30℃生长2天。随后，通过将微量滴定板各孔所含溶液中的几微升转移至新微量滴定板中，以制备该微量滴定板的复制物，其中新微量滴定板中含固体(0.8％琼脂)LB培养基，且补充有50mg/l卡那霉素。28-30℃温育上述平板16-20小时后，将其保存于4℃，作为主平板。离心(10分钟、1,500×g，室温)收获剩余部分细胞悬液中的细胞，采用pH7.5、50mM的Tris-HCl缓冲液洗涤两次，最后，重新悬浮于50μl、pH7.5、50mM的Tris-HCl缓冲液中。

通过加入50μl底物溶液使筛选反应开始，该底物溶液含有分别溶于pH7.5、50mM的Tris-HCl中的140mM D-苯丙氨酸酰胺、D-亮氨酸酰胺和D-缬氨酸酰胺的混合物与2mM MnCl₂。将微量滴定板置于摇床上，30℃温育20小时后，加入2μl L-氨肽酶辅助溶液(制备方法见较早的章节)。30℃继续温育1.5小时后，加入100μl、0.15M的HCl终止所有反应。

随后，通过从上述混合物中各取7μl，转移至新微量滴定板中，该板各加样孔内均含93μl GDH试剂，测定所有反应混合物中的铵浓度。该GDH试剂在每100ml、pH8.0、150mM的Tris-HCl中含有43mg NADH、116mg α-酮戊二酸、11.8mg ADP和1200U谷氨酸脱氢酶(Sigma)。37℃温育15分钟后，利用Spectramax plus微量滴定板读数器(Molecular Devices，Sunnyvale，California，USA)测定各孔的OD340nm。克隆的OD340nm低于含该克隆的微量滴定板平均值减去相同微量滴定板的三倍标准差所得数值时，该克隆被认为是潜在的阳性克隆。

在被筛选的11,272个克隆中，有32个克隆被鉴定为潜在阳性克隆。

潜在阳性克隆的证实

在筛选过程中鉴定的全部32个潜在阳性克隆中，采用主平板来源的材料接种3ml含50mg/l卡那霉素的液体筛选培养基。30℃生长2天后，从上述细胞培养物中各取2ml离心，收集细胞。随后于pH7.5、25mM的Tris-HCl缓冲液中洗涤细胞沉淀4次。接着，将细胞沉淀重新悬浮于100μl底物溶液中，该底物溶液含有溶于pH7.5、50mM的Tris-HCl中的70mM D-苯丙氨酸酰胺、D-亮氨酸酰胺或D-缬氨酸酰胺，还含有1mM MnCl₂。30℃温育20小时后，加入100μl、0.15M的HCl以终止反应，通过实施例1所述HPLC方法分析反应混合物。

在筛选过程中鉴定的32个潜在阳性克隆中，有一个克隆显示从D-亮氨酸酰胺显著形成了L-亮氨酸。该克隆的7.7kb质粒上含有人苍白杆菌IA的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶基因。可以从下述事实中得出该结论，即将该质粒转化进大肠杆菌TOP10细胞，必然使转化细胞将D-亮氨酸酰胺转化为L-亮氨酸。该质粒被命名为pOa(1)PLV49B10，对其测序，显示了α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶基因的完整核苷酸序列。该基因的序列在下文所示SEQ ID NO：1中如核苷酸98-1417所列(包括TAA终止密码子)，其中该SEQ ID NO：1编码SEQ ID NO：2所示蛋白质。

实施例3A：

烟草节杆菌NCIMB 41126夹源的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶基因的分离

表达文库构建

将甘油保存的烟草节杆菌NCIMB 41126接种于含单一氮源，即0.2％(w/v)D-α-氨基-ε-己内酰胺的酵母碳基质平板上，28℃温育3-4天，获得要求大小的分散菌落。将单菌落转移至50ml LB培养基中，28℃、剧烈振荡条件下生长过夜。其生长期的最后半小时内，加入羧苄青霉素(终浓度200μg/ml)以削弱细胞壁。离心收获细胞，将所获沉淀重新悬浮于含50mM EDTA的5ml、pH8.0、50mM Tris-HCl中。加入100μl溶菌酶(100mg/ml)和25μl蛋白酶K(20mg/ml)后，37℃温育悬液30分钟。随后加入6ml(核裂解溶液)(Promega Corporation，Madison，USA)，80℃温育15分钟。最后，65℃温育溶液直至完全裂解。37℃，RNase处理(终浓度4μg/ml)30分钟后，加入2ml(蛋白质沉淀溶液)(Promega Corporation，Madison，USA)，涡旋混合溶液20秒后将其冰浴。离心(10′；4,500×g，4℃)后，将上清液转移至0.1倍体积NaAc(3M，pH5)与2倍体积无水乙醇的混合物中。将沉淀的基因组DNA吸入无菌移液管中，转移至含有2ml、10mMTris-HCl(pH8)的试管中。gDNA溶解后，测定A_260nm和A_280nm的结果显示大约2.3mg优质gDNA已得到分离。琼脂糖凝胶电泳证实所分离的gDNA不含rRNA，且其尺寸大于15kb。

37℃，采用Sau3AI以每微克DNA加入1/24U Sau3AI的量，部分消化50μg gDNA 30分钟。将已消化DNA的一部分上样在预制的0.6％琼脂糖凝胶上，并利用QIAquick提取试剂盒(Qiagen)从该凝胶中分离大小为4-10kb的DNA片段，通过NaAc/乙醇沉淀将其富集，并重新溶解于10μl、pH8.0、10mM的Tris-HCl缓冲液中。

采用BamH I并根据供应商提供的操作流程，消化1μg pZErO-2(Invitrogen，Breda，The Netherlands)，制备载体DNA。

在16℃和2.5U T4 DNA连接酶作用1小时的条件下，线性化载体DNA(10ng)与烟草节杆菌NCIMB 41126gDNA片段(2.5μl)连接，总体积为10μl。随后，采用NaAc/乙醇使连接混合物沉淀，并将其重新悬浮于5μl TE缓冲液中。根据供应商提供的操作流程，利用BioRad基因脉冲发生器(条件：2.5kY、25μF、100Ω、0.1cm比色皿、40μl细胞悬液)，取2.5μl上述溶液用于进行电感受态大肠杆菌DH10B细胞(Life Technologies)的电穿孔。将转化体接种于含50mg/l卡那霉素的LB培养基平板上，并于28℃温育24小时。获得共计大约100,000个菌落，可形成初级基因文库。将全部100,000个菌落混合于补充有50mg/l卡那霉素的LB培养基中。将所获细胞悬液的一部分用于根据QiaPrep操作(Qiagen)分离总质粒。将该“质粒形式的文库”保存于-20℃直至进一步使用。在剩余部分细胞悬液中加入终浓度为8％(v/v)的甘油。将所获悬液分为等分试样，保存于-80℃，作为初级基因文库。

筛选

采用实施例3所述的操作流程，从烟草节杆菌NCIMB 41126文库中筛选出含α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶的克隆，但采用的是略有改动的底物溶液。除实施例3提及的所有组成外，该筛选所用底物溶液还含有20μM吡哆醛-5-磷酸。

对烟草节杆菌NCIMB 41126文库中共计10,691个克隆进行筛选。鉴定其中的2个克隆为潜在阳性克隆。

潜在阳性克隆的证实

根据实施例3所述的操作流程，验证上述两个潜在阳性克隆，但所用3种底物溶液均含有10μM吡哆醛-5-磷酸。

该实验证实上述两个克隆均可将D-亮氨酸酰胺显著转化为L-亮氨酸，将D-缬氨酸显著转化为L-缬氨酸。如实施例1所述，这些转化证实这些克隆中存在α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性。将两个克隆来源的质粒导入大肠杆菌TOP10细胞的再转化实验显示该α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性是质粒编码的，因为所有受检重组细胞均可将D-亮氨酸酰胺转化为L-亮氨酸，将D-缬氨酸转化为L-缬氨酸。

随后，对上述两个阳性克隆来源的质粒进行限制酶分析。分析结果清晰地显示两种重组质粒均含有重叠插入片段。因此，仅对其中一种质粒，即pAn(1)PLV36D6测序。对总大小为7.1kb的该质粒的核苷酸序列分析的结果显示了α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶基因的完整核苷酸序列。该基因的序列在下文所示SEQ ID NO：8中如核苷酸80-1417所列(包括TGA终止密码子)，其中该SEQ ID NO：8编码SEQ ID NO：9所示蛋白质。如下所示，也可能从SEQ ID NO：8中的核苷酸41位(GTG)开始表达活性α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶。

实施例4

质粒DKEC-AZAR的构建

采用PCR，将人苍白杆菌IA的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶基因亚克隆进大肠杆菌表达载体pKECaroP中。除了pKECaroP含有通过功能衍生的pSC101，且大肠杆菌aroH启动子取代了trp启动子以外，表达载体pKECaroP与通过WO 00/66751所述构建方法获得的构建体pKECtrp相似。α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶可读框是采用5’-GCCTCACATATGCAAACACCGCTTTCATTGCG-3’[SEQ ID NO：6]作为正向引物(具有单划线所示Nde I裂解位点)，以5’-GCCTCACCCGGGTTACCACATCATAAAATGGGCGACATC-3’[SEQ ID NO：7]作为反向引物(具有单划线所示Xma I裂解位点)，并采用质粒pOa(1)PLV49B10为模板而得以扩增的。利用PCR SuperMix HighFidelity(Life Technologies)，并根据供应商提供的操作流程进行的PCR获得了单一片段。扩增片段的正确大小(1.341bp)是通过琼脂糖凝胶电泳证实的。

利用QIAquickPCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化上述扩增片段后，将该片段克隆进载体

4Blunt-TOPO(Invitrogen)中。随后将该克隆混合物用于转化One Shot^TM化学感受态大肠杆菌TOP10细胞(Invitrogen)。通过将全部转化混合物接种于含100μg/ml羧苄青霉素的LB平板上，28℃过夜温育以选择重组细胞。

于5ml含100μg/ml羧苄青霉素的LB培养基中过夜培养6个菌落来源的材料，并利用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen)分离质粒DNA。采用限制酶Nde I和Xma I消化，证实上述6个菌落中有5个菌落含有需要的重组载体。

将5个正确克隆的质粒DNA混合并由Nde I和Xma I消化至完全。将全部消化混合物上样在预制的1％琼脂糖凝胶上，以分离不同片段。随后利用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)，从凝胶中分离出正确片段(1,322bp)，并将其保存于-20℃直至进一步将其作为插入片段使用。

采用Nde I和Xma I消化质粒pKECaroP至完全，如分析性琼脂糖凝胶电泳所示，获得了2,850和3,036bp的两个片段。加热灭活Nde I和Xma I限制酶(20分钟，65℃)后，向混合物中加入Bsa I，将不需要的2,850bp片段切割为两个较小片段。将完全消化的混合物上样在1％预制琼脂糖凝胶上，随后利用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)分离需要的3,036bp片段，并将其保存于-20℃直至进一步将其作为载体片段使用。

采用T4 DNA连接酶将载体与插入片段连接，并将所获连接混合物用于转化One Shot^TM化学感受态大肠杆菌TOP10细胞。将转化混合物接种于含50μg/ml卡那霉素的LB平板上，28℃温育直至出现足够大的菌落。

利用PCR SuperMix(Life Technologies)和上述特定引物([SEQID NO：6]和[SEQ ID NO：7])进行菌落-PCR，以筛选含正确重组载体的菌落。采用12个PCR阳性来源的材料接种12支试管，每支试管均加有5ml含50μg/ml卡那霉素的LB培养基。利用QIAprep SpinMiniprep试剂盒分离质粒DNA。采用限制酶Hind III消化，从全部12个质粒获得1,731和2,627bp的两个片段，证实12个菌落均含有需要的重组载体。

将上述12个阳性克隆中的5个克隆培养在25ml补充有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中。28℃温育过夜后，离心收获细胞，并采用实施例2所用的相同超声处理缓冲液洗涤。将细胞沉淀重新悬浮在超声处理缓冲液中(湿重细胞与超声处理缓冲液的比例为1：10)后，通过超声处理裂解细胞。离心除去颗粒，便获得粗制细胞提取物。

通过下述方法检验上述所获5种粗制细胞提取物的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性，即将0.5ml粗制细胞提取物与4.5ml底物溶液混合，该底物溶液由含有0.01mM吡哆醛-5-磷酸和66mM D-亮氨酸酰胺、pH7.7、22.2mM的HEPES-NaOH缓冲液组成。室温温育反应。0、18和44小时后取样，并转移至等体积的1M H₃PO₄中，以终止反应。根据实施例1所述的方法，通过HPLC分析上述样品。

对上述5个克隆中被称为大肠杆菌/pKEC_AZAR_3和大肠杆菌/pKEC_AZAR_11的两个克隆的粗制提取物检测时，发现在18和44小时的样品中所检测到的L-亮氨酸和L-亮氨酸酰胺显著多于0小时样品。最后，对pKEC_AZAR_3和pKEC_AZAR_11的核苷酸测序的结果显示了α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶基因的正确核苷酸序列，以及在上述两种重组质粒中的侧翼载体部分。

实施例4A

质粒pBADAn36D6-DEST的构建

采用PCR和GATEWAY克隆化技术(Invitrogen)，将烟草节杆菌NCIMB 41126的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶基因亚克隆进大肠杆菌表达载体pBAD/Myc-His-DEST中。α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶可读框是以5’-GGGG

AGGAGGAATTAACCATGAGTACGCCGCGTTGCGGGGAG-3’[SEQIDNO：10]为正向引物(具有单划线所示Shine-Delgarno位点，斜体所示ATG起始密码子和双划线所示attB1位点)，以5’-GGGG

TCACCAACCAGCATAGGGAGCGATCTG-3’[SEQ ID NO：11]为反向引物(具有斜体所示终止密码子和双划线所示attB2位点)，并以质粒pAn(1)PLV36D6为模板而得以首次PCR扩增的。对质粒pAn(1)PLV36D6的鉴定方法如实施例3A所述。PCR是采用Expand高保真聚合酶(Roche Applied Science，Mannheim，Germany)，根据供应商提供的操作流程进行的，获得了单一片段。该扩增片段的正确大小(1,449bp)是通过琼脂糖凝胶电泳证实的。

利用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)，从预制琼脂糖凝胶中纯化出扩增片段后，以该片段为底物用于所谓的BP体外重组反应，该反应是根据供应商的GATEWAY手册(Invitrogen)进行的。attB-PCR片段与pDONR207供体载体之间的重组，以及随后将所获混合物转化进大肠杆菌DH5α感受态细胞(Invitrogen)中，获得了ENTRY克隆pAn36D6-ENTRY。通过将全部转化混合物接种于含7μg/ml艮他霉素的2*TY平板上，37℃过夜温育，以选择重组细胞。将其培养在含7μg/ml艮他霉素的2*TY培养基中16小时后，利用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen)从几个单菌落中分离质粒DNA。分别采用限制酶PvuII、Nsp I(New England Biolabs，Frankfurt，Germany)和BssSI(New England Biolabs，Frankfurt，Germany)消化，证实所有受检菌落均含有需要的重组载体。随后，对上述正确克隆中的4个克隆的attB-PCR插入片段测序。基于SEQ ID NO：8和所用两个PCR引物，对全部4个pAn36D6-ENTRY质粒测序的结果证实含有需要的序列。

随后，采用一个正确的pAn36D6-ENTRY克隆和pBAD/Myc-His-DEST，通过所谓LR体外重组反应，将含有PCR片段的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶导入指定载体pBAD/Myc-His-DEST(见下文)中。该反应也是根据供应商提供的操作方法进行的。将重组混合物用于转化OneShot^TM化学感受态大肠杆菌TOP10细胞(Invitrogen)。通过将全部转化混合物接种于含100μg/ml氨苄青霉素的2*TY平板上，并于37℃温育过夜，以选择重组细胞。在含100μg/ml氨苄青霉素的2*TY培养基中过夜温育几个菌落后，利用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen)分离质粒DNA。分别采用限制酶Acc I和Rsr II(New EnglandBiolabs，Frankfurt，Germany)消化，证实所有菌落均含有需要的重组载体pBADAn36D6-DEST。

采用大肠杆菌TOP10/pBADAn36D6-DEST菌株的单菌落接种50ml补充有100μg/ml羧苄青霉素的2×TY培养基。28℃过夜温育后，取500μl该培养物用于接种500ml补充有100μg/ml羧苄青霉素和0.005％阿拉伯糖的2*TY培养基。28℃过夜温育后，离心(15分钟，6,200×g，4℃)收获细胞，并在含有pH7.5、20mM HEPES-NaOH，20μM吡哆醛-5-磷酸和1.3mM二硫苏糖醇的溶液中洗涤。将细胞沉淀重新悬浮于相同缓冲溶液(湿重细胞与超声处理缓冲液的比例为1∶3)中后，利用MSE的Soniprep 150以最大振幅超声处理10分钟，时间间隔为10秒(即10秒超声处理，10秒冷却)，并冷却于冰/丙酮中。离心除去颗粒，获得粗制细胞提取物。最后，将蔗糖加入无细胞提取物中，使终浓度为0.25M。

通过将0.5ml细胞提取物与9.5ml底物溶液混合，检验其消旋酶活性。37℃温育反应。以固定时间间隔取样，并转移至等体积的1M H₃PO₄中，以终止反应。根据实施例1所述方法，通过HPLC分析上述样品。

该实验显示底物在20分钟内被完全外消旋化。因此，结论是烟草节杆菌NCIMB 41126的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶由SEQ ID NO：8所示可读框编码。

实施例4B

GATEWAY指定载体pBAD/Myc-His-DEST的构建

通过将cat/ccdB盒导入商业可提供的大肠杆菌表达载体pBAD/Myc-HisC中，制备可用于在大肠杆菌中表达烟草节杆菌NCIMB41126来源的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶的指定载体pBAD/Myc-His-DEST。cat/ccdB组件是通过以5’-AAGAAGACCGGATCCTAC

TTTCTCCATACCCGTTT-TTTGGGCTAACACAAGTTTGTACAAAAAAGCTGAAC-3’[SEQ ID NO：12]为正向引物(具有双划线所示启动子序列、单划线所示Bpi I识别和裂解位点和斜体所示attR序列)，以5’-TTGTTCTACGTAACCACTTTGTACAAGAAAGCTGAAC-3’[SEQ IDNO：13]为反向引物(具有单划线所示SnaB I裂解位点和斜体所示attR序列)，并以载体pDEST15(Invitrogen)为模板扩增的。采用Expand高保真聚合酶(Roche Applied Science，Mnnheim，Germany)，并根据供应商提供的操作流程进行的PCR获得了单一片段。该扩增片段的正确大小(1792bp)通过琼脂糖凝胶电泳证实。利用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)从预制琼脂糖凝胶中纯化扩增片段后，采用BpiI(MBI Fermentas，St.Leon-Rot，Germany)(可导致一个互补于BamH I的突出端)和SnaB I(New England Biolabs，Frankfurt，Germany)消化该片段至完全，并利用T4 DNA连接酶将其连接进大肠杆菌表达载体pBAD/Myc-HisC(Invitrogen)中，该表达载体已经过BamH I和SnaB I消化。随后将连接混合物用于转化化学感受态大肠杆菌DB3.1细胞(Invitrogen)。通过将全部转化混合物接种在含35μg/ml氯霉素的2*TY平板上，37℃温育过夜，以选择重组细胞。从三个单菌落中分离重组体质粒后，对插入片段测序。被证实含有需要的插入片段的上述克隆中的一个克隆被命名为pBAD/Myc-His-DEST。尽管在质粒pBAD/Myc-His-DEST的测序部分的核苷酸序列与参考序列(Invitrogen-pDEST15的核苷酸序列)之间观测到7个缩短，但pBAD/Myc-His-DEST的所有基本特征(氯霉素抗性，ccdB选择和attR重组)仍然完全起作用。

实施例5

以D-亮氨酸酰胺为底物并以含人苍白杆菌IA来源的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶基因的完整大肠杆菌细胞为生物催化剂进行的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性检验

细胞的制备

将含有质粒pOA(1)PLV49B10的大肠杆菌DH10B的单菌落转移至含卡那霉素(50mg/l)的LB培养基中，制备预培养物。28℃、200rpm条件下温育过夜后，将该预培养物用于接种含有500ml 2*TY培养基(10g/l酵母提取物、16g/l蛋白胨、5g/l NaCl)和卡那霉素(50mg/l)的烧瓶。28℃、200rpm条件下生长过夜(OD_620nm＝4.4)后，离心(15分钟，6,200×g，4℃)收获细胞，并采用pH7.7、50mM的HEPES-NaOH缓冲液洗涤。

为了在活性检验中能够测定大肠杆菌宿主载体体系的背景活性，通过相同操作(大肠杆菌DH10B/pZErO-GEPuv-wrong-orientation)培养含基于pZErO-2的构建体的大肠杆菌DH10B菌株，该构建体在与载体所带lac启动子相反的方向上含有插入的突变绿色荧光蛋白(GFPuv)编码基因。过夜培养该重组大肠杆菌菌株，使其OD_620nm达3.8。

随后，对两个培养物来源的细胞沉淀进行洗涤，并重新悬浮于25ml、pH7.7、50mM的HEPES-NaOH缓冲液中。再次离心各细胞悬液的2ml等分试样，并将沉淀保存于-20℃，直至下述活性检验进行时使用。将上述细胞悬液的剩余部分保存于-20℃，供实施例6使用。

针对D-亮氨酸酰胺的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性

为测定大肠杆菌/pOA(1)PLV49B10和大肠杆菌对照的活性，将上述细胞沉淀解冻，并采用pH7.7、50mM的HEPES-NaOH缓冲液将其重新悬浮至1ml总体积。随后，制备10ml反应混合物，使其均含有50mMHEPES-NaOH缓冲液(pH7.7)、10μM吡哆醛-5-磷酸(PLP)、2.5wt％D-亮氨酸酰胺，如适用，还可含有20mM EDTA以抑制大肠杆菌酰胺酶活性，以及0.5ml大肠杆菌/pOA(1)PLV49B10和大肠杆菌DH10B/pZErO-GEPuv-wrong-orientation细胞悬液或水(用于化学空白)。通过加入细胞起动反应。于30℃、175rpm条件下温育反应混合物。加入细胞后立即(t＝0小时)和27和43小时后取样，其中通过离心除去细胞，并随后经过0.22μM过滤，终止反应。最后，将已过滤样品保存于-20℃，以供如下所述的手性HPLC分析。

柱：Sumika的Sumichiral OA5000(150×4.6mm I.D.，5μ)+保护柱

洗脱液：85v/v％ 2mM CuSO₄+15v/v％甲醇

流速：1.0ml/min

柱温：40℃

上样体积：5μM

检测：与邻苯二醛和2-巯基乙醇完成柱后反应后进行荧光检测(波长ex＝338nm和em>420nm)

该实验结果如表4所示。

表4.大肠杆菌DH10B/pOA(1)PLV49B10和大肠杆菌空白(大肠杆菌DH10B/pZErO-GFPuv-wrong-orientation)针对D-亮氨酸酰胺的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性。

菌株	20mMEDTA	培养时间(小时)	D-亮氨酸酰胺(wt％)	L-亮氨酸酰胺(wt％)	D-亮氨酸(wt％)	L-亮氨酸(wt％)
菌株	20mMEDTA	培养时间(小时)	D-亮氨酸酰胺(wt％)	L-亮氨酸酰胺(wt％)	D-亮氨酸(wt％)	L-亮氨酸(wt％)	B	-	0	2.67	n.d.	n.d.	n.d.
B	-	27	2.51	n.d.	0.003	0.005	B	-	0	2.67	n.d.	n.d.	n.d.
B	-	27	2.51	n.d.	0.003	0.005	B	-	43	2.63	0.060	0.005	0.004
A	-	0	2.63	n.d.	n.d.	n.d.	B	-	43	2.63	0.060	0.005	0.004
A	-	0	2.63	n.d.	n.d.	n.d.	A	-	27	1.03	0.170	0.009	1.71
A	-	43	0.512	0.063	0.017	2.12	A	-	27	1.03	0.170	0.009	1.71
A	-	43	0.512	0.063	0.017	2.12	A	+	0	2.61	n.d.	n.d.	n.d.
A	+	27	1.77	0.555	0.003	0.313	A	+	0	2.61	n.d.	n.d.	n.d.
A	+	27	1.77	0.555	0.003	0.313	A	+	43	1.59	0.772	0.006	0.345

n.d.：不可检测

菌株A：大肠杆菌DH10B/pOA(1)PLV49B10

菌株B：大肠杆菌DH10B/pZErO-GFPuv-wrong-orientation

表4中的数据清晰地显示大肠杆菌DH10B/pZErO-GFPuv-wrong-orientation不能转化D-亮氨酸酰胺。即使反应43小时后，反应混合物所含D-亮氨酸酰胺的量仍与反应开始时的量相同。这也是所有化学空白的情况(数据未显示)。

另一方面，采用大肠杆菌DH10B/pOA(1)PLV49B10细胞时，D-亮氨酸酰胺的量则随时间显著减少。不添加EDTA时，该底物被转化为相对少量的L-亮氨酸酰胺和大量的L-亮氨酸。添加EDTA时，则获得了更高浓度的L-亮氨酸酰胺，因为螯合化合物EDTA部分地抑制了大肠杆菌的酰胺酶活性，从而降低了L-亮氨酸酰胺到L-亮氨酸的转化率。

该实验所获结果证实大肠杆菌DH10B/pOA(1)PLV49B10细胞具有针对D-亮氨酸酰胺的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性。此外，还显示通过将该α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶与L-选择性酰胺酶/氨肽酶结合(如大肠杆菌DH10B所示)，可将D-α-H-α-氨基酸酰胺转化为L-α-H-α-氨基酸。

实施例6

以DL-亮氨酸酰胺为底物并以含人苍白杆菌IA来源的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶基因的完整大肠杆菌细胞为生物催化剂进行的α-H-α- 氨基酸酰胺消旋酶活性检验

采用实施例5(细胞的制备)的大肠杆菌DH10B/pOA(1)PLV49B10和大肠杆菌DH10B/pZErO-GFPuv-wrong-orientation细胞悬液。为测定二者针对外消旋DL-亮氨酸酰胺的活性，除采用2.5wt％ DL-亮氨酸酰胺，且所有反应均略去EDTA，以及反应开始于2ml细胞悬液外，如实施例5制备相同反应混合物。反应开始后立即(t＝0小时)和8和24小时后取样。

该实验结果如表5所示。

表5.大肠杆菌DH10B/pOA(1)PLV49B10和大肠杆菌空白(大肠杆菌DH10B/pZErO-GFPuv-wrong-orientation)针对DL-亮氨酸酰胺的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性。

样本编码	培养时间(小时)	D-亮氨酸酰胺(wt％)	L-亮氨酸酰胺(wt％)	D-亮氨酸(wt％)	L-亮氨酸(wt％)	e.e.<sup>a</sup><sub>L-亮氨酸</sub>(％)
样本编码	培养时间(小时)	D-亮氨酸酰胺(wt％)	L-亮氨酸酰胺(wt％)	D-亮氨酸(wt％)	L-亮氨酸(wt％)	e.e.<sup>a</sup><sub>L-亮氨酸</sub>(％)	B	0	1.13	1.15	0.001	0.004	-
B	8	1.15	0.12	0.001	1.43	99.9	B	0	1.13	1.15	0.001	0.004	-
B	8	1.15	0.12	0.001	1.43	99.9	B	24	1.23	n.d.	0.002	1.48	99.7
A	0	1.19	1.25	0.001	0.003	-	B	24	1.23	n.d.	0.002	1.48	99.7
A	0	1.19	1.25	0.001	0.003	-	A	8	1.24	0.33	0.004	1.45	99.4
A	24	0.43	0.14	0.028	2.25	97.5	A	8	1.24	0.33	0.004	1.45	99.4

n.d.：不可检测

a：利用公式计算的L-酸的e.e.值(对映异构体过量值)：

_e.e._L-酸＝[(L-酸-ID-酸)/(L-酸+D-酸)]×100％

菌株A：大肠杆菌DH10B/pOA(1)PLV49B10

菌株B：大肠杆菌DH10B/pZErO-GFPuv-wrong-orientation

表5中的数据清晰地显示大肠杆菌空白细胞(大肠杆菌DH10B/pZErO-GFPuv-wrong-orientation)仅可将L-亮氨酸酰胺转化为L-亮氨酸，且对映异构体过量值大于95％。D-亮氨酸酰胺则未被触及，从而使其最大收率仅为50％。

采用含α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶编码基因的大肠杆菌DH10B/pOA(1)PLV49B10细胞时，L-和D-亮氨酸酰胺均被显著转化为L-亮氨酸，使收率大于50％，并最大达100％。此外，所获L-亮氨酸的对映异构过量值也很好地大于95％。

该实验证明通过将人苍白杆菌IA来源的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶与L-选择性酰胺酶/氨肽酶结合(如大肠杆菌DH10B所示)，可以大于50％的收率将DL-α-H-α-氨基酸酰胺转化为L-α-H-α-氨基酸。

实施例7

采用大肠杆菌TOP10/pKEC AZAR 3来源的无细胞提取物对人苍白杆菌IA来源的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶的底物特异性测定

无细胞提取物的制备

以每个烧瓶10μl甘油保存菌的接种量，接种2个含100ml 2*TY培养基(10g/l酵母提取物、16g/l蛋白胨、5g/l NaCl)的锥形瓶，制备大肠杆菌TOP10/pKEC_AZAR_3的两个预培养物(见实施例4)，其中2*TY培养基含50mg/l卡那霉素。28℃、200rpm条件下培养过夜，混合预培养物，并随后用于接种2个均含1L相同培养基的锥形瓶。同样28℃、200rpm条件下温育上述锥形瓶16-18小时。离心(15分钟，6,200×g，4℃)收获细胞，并采用pH7.5、20mM的HEPES-NaOH洗涤，混合，称重，并重新悬浮于含pH7.5、20mM的HEPES-NaOH，20μM吡哆醛-5-磷酸，和1.3mM二硫苏糖醇的溶液中，湿重细胞与溶液比例为1∶3。随后，通过利用MSE的Soniprep 150以最大振幅超声处理10分钟，且时间间隔为10秒(即10秒超声处理，10秒冷却)，并冷却于冰/丙酮中，使细胞裂解。离心除去颗粒后，将蔗糖加入无细胞提取物中，至终浓度0.25M。将所获无细胞提取物(CFE)分为等分试样，保存于-20℃。以完全相同途径处理大肠杆菌TOP10/pBAD/Myc-HisC(Invitrogen)，并将其作为阴性对照。

底物特异性的测定

通过测定上述CFE针对大量对映异构纯氨基酸酰胺的消旋酶活性，以测定人苍白杆菌IA来源的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶的底物特异性。10ml反应混合物(包括CFE)均含有pH8.0、50mM的HEPES-NaOH，20μM吡哆醛-5-磷酸，0.4mg/ml BSA，1mM二硫苏糖醇，20mM EDTA和75mM的一种受检氨基酸酰胺。通过加入大肠杆菌TOP10/pKEC_AZAR_3或大肠杆菌TOP10/pBAD/Myc-HisC(空白)的1ml解冻的CFE起动反应，并于37℃温育。以固定时间间隔取样1ml，并转移至含有终止反应所用1ml、1M H₃PO₄的小瓶中。将样品充分稀释于pH9.4、0.4M的硼酸盐缓冲液中，根据下述方法，采用HPLC分析所获混合物，测定两种氨基酸和两种氨基酸酰胺对映体的准确浓度。

柱：Inertsil ODS-3 150×4.6mm I.D.

洗脱液A：50mM乙酸钠，pH6.0，乙酸/乙腈 95/5 v/v％

洗脱液B：50mM乙酸钠，pH6.0，乙酸/乙腈 30/70 v/v％

梯度：时间(分钟) 洗脱液A(v/v％) 洗脱液B(v/v％)

0 100 0

28 0 100

33 0 100

33.1 100 0

41(终止时间)

流速：1.0ml/min

柱温：40℃

上样体积：20μl

检测：与邻苯二醛和D-3-巯基-2-甲基丙酸完成柱前反应后进行荧光检测(波长ex＝338nm和em>420nm)

柱前试剂：

试剂A：50mM邻苯二甲酸酐(170mg/25ml MeOH/水50/50)

试剂B：113mg D-S-苯甲酰-3-巯基-2-甲基丙酸溶于1ml、1M NaOH中。加入9ml MeOH/水50/50，并采用1M H₃PO₄调节至pH7.0试剂C：0.25M H₃PO₄

衍生化操作：

35μl 试剂A

35μl 试剂B

210μl样品溶液(样品溶于pH9.4、0.4M的硼酸盐缓冲液)

140μl 试剂C

反应时间：5分钟

由渐进曲线的线性部分计算不同受检底物的最初活性，其中将转化率对时间作图。采用渐进曲线的线性部分可确保计算仅采用在底物浓度仍然十分高的时间点所取的样品。转化率通过下述方法计算，即用经由消旋酶反应形成的氨基酸和氨基酸酰胺的量(因而具有与底物分子相反的立体化学)除以两种氨基酸对映体与两种氨基酸酰胺对映体的总量。以该方式，可对计算的转化率做出如下校正，即校正酰胺底物和/或由反应混合物中未完全受EDTA抑制的酰胺酶/氨肽酶所生成产物的潜在水解。

采用大肠杆菌TOP10/pBAD/Myc-HisC的CFE时，所采用的对映纯α-H-α-氨基酸酰胺底物均未被外消旋化。大肠杆菌TOP10显然不含α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶。采用大肠杆菌TOP10/pKEC_AZAR_3来源CFE的实验结果如表6所示。

表6.大肠杆菌TOP10/pKEC_AZAR_3来源的CFE针对不同对映异构纯α-H-α-氨基酸酰胺的相对最初活性

^a相对于针对D-亮氨酸酰胺的活性得出的所有最初活性

表6所示结果清晰地显示大肠杆菌TOP10/pKEC_AZAR_3来源的CFE不仅可将亮氨酸酰胺外消旋化，也可将其它α-H-α-氨基酸酰胺外消旋化。由于该重组菌株含有人苍白杆菌IA来源的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶基因，因此其广泛的底物特异性可以仅归因于该基因所编码的消旋酶。

实施例8

人苍白杆菌IA来源的部分纯化的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶的底物特异性测定

部分纯化

从大肠杆菌DH10B/pOa(1)PLV49B10中部分纯化人苍白杆菌IA来源的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶。为获得足够的细胞物质用于纯化，以10升规模发酵该重组菌株。首先，通过采用该菌株的10μl甘油保存菌接种500ml含50mg/卡那霉素的2*TY培养基，制备接种培养物。28℃、170rpm条件下温育22小时后，获得OD620nm为2.2。随后将完全接种培养基转移至含9升2*TY培养基的发酵罐(ISF-200型，Infors，Bottmingen，Switzerland)中，其中培养基中含50mg/l卡那霉素。pH通过添加5N H₃PO₄和/或5N KOH控制在7.0，pO₂通过改变通气(每分钟1-2升空气)和搅拌速度(250-750rpm)人工调节。28℃运转发酵罐19小时，使细胞悬液的OD_620nm达5.7。离心(15分钟，12,000×g，4℃)收获细胞，在pH7、20mM的HEPES-NaOH中洗涤一次，并以湿细胞沉淀(大约125g)形式保存于-20℃。

解冻细胞沉淀后，将细胞重新悬浮于含2.66mM MgCl₂的缓冲液A(pH7.5、20mM的HEPES-NaOH，1.3mM二硫苏糖醇，20μM吡哆醛-5-磷酸)中。每克湿重细胞加入3克缓冲液A。裂解前立即在细胞悬液中加benzonase(30U/克湿重细胞-Merck KGaA，Darmstadt，Germany)。一次性通过匀浆器(Haskel，NJ1600HD15型，Wese1，Germany)，使细胞裂解，操作压为1,500bar。随后通过离心(30分钟，34,000×g，4℃)除去颗粒，将所获无细胞提取物(CFE)分为等分试样，保存于-20℃。

所有后续纯化步骤均于4℃进行。第一个纯化步骤是40％饱和度的硫酸铵沉淀。该步骤通过将80％饱和的(NH₄)₂SO₄溶液逐滴加入等体积CFE中而得以实现。缓慢振摇浑浊溶液1.5小时后，离心(30分钟，15,000×g)收集沉淀蛋白质。将蛋白质沉淀溶解在缓冲液A中，并应用在下一个纯化步骤中。

为实现第二个纯化步骤，即阴离子交换色谱，必须将硫酸铵沉淀后的蛋白质溶液脱盐。因此，将蛋白质溶液分为几份，每份2.5ml，上样于经由pH8.0、20mM的Tris-HCl(缓冲液B)平衡过的PD-10脱盐柱(Amersham Biosciences，Roosendaal，The Netherlands)。每根PD-10柱应用3.5ml缓冲液B，以洗脱蛋白质。将脱盐蛋白质溶液上样于经由缓冲液B平衡过的Mono Q HR 10/10柱(AmershamBiosciences，Roosendaal，The Netherlands)。该柱的操作流速为4ml/min，收集4ml馏分。采用含1M NaCl的100ml缓冲液B，线性梯度为0-100％，可从该柱中洗脱α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶。应用大约0.34M NaCl时洗脱α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶，并收集该活性级分。

随后将含α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶的蛋白质溶液上样于经由含1M NaCl的缓冲液B平衡过的HiLoad 26/60 Superdex 200制备级梯度凝胶过滤柱(Amersham Biosciences，Roosendaal，TheNetherlands)。采用平衡缓冲液以3ml/min流速洗脱α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶。收集3ml级分。混合具有消旋酶活性的级分，在将其分为等分试样并保存于-20℃之前加入蔗糖至0.25M浓度。

采用该纯化流程，从大肠杆菌DH10B/pOa(1)PLV49B10 CFE中部分纯化了人苍白杆菌IA的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶，总收率为19％。在还原条件下利用NuPAGE系统(Invitrogen)，并采用MES缓冲液进行的SDS-PAGE结果显示凝胶过滤后的制剂中大约50％的蛋白质由该消旋酶组成。

底物特异性测定

人苍白杆菌IA α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶的底物特异性是采用通过上述流程所获部分纯化的酶制剂测定的。通过将772μl、pH8.0、66.6mM的HEPES-NaOH，10μl、0.1M二硫苏糖醇，18μl含20mg/ml BSA和1mM吡哆醛-5-磷酸的溶液，和100μl、pH8.0、0.75M的底物溶液混合，制备总体积为1ml的反应混合物。37℃平衡5分钟后，通过加入100μl酶溶液起动反应。于37℃、无振荡条件下温育反应混合物。固定时间间隔后取样50μl，并转移进含有终止反应所用的950μl、1MH₃PO₄的小瓶中。将该样品充分稀释于pH9.4、0.4M的硼酸盐缓冲液后，根据实施例7所述方法，采用HPLC分析所获混合物，以确定两种氨基酸酰胺对映体的准确浓度。

由渐进曲线的线性部分计算不同受检底物的最初活性，其中形成的氨基酸酰胺对映体的量(因而具有与底物分子相反的立体化学)对反应时间作图。该实验结果如表7所示。

表7.人苍白杆菌IA来源的部分纯化的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶针对不同对映异构纯α-H-α-氨基酸酰胺的相对最初活性

^a相对于针对L-亮氨酸酰胺的活性得出的所有最初活性

表7中的数据清晰地显示人苍白杆菌IA来源的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶具有不严格的底物特异性，因为该活性被发现既针对具有短和长烷基侧链，且其C_β原子可被任意取代的氨基酸酰胺，也针对具有芳基侧链的氨基酸酰胺。

实施例9

利用大肠杆菌DH10B/pAn(1)PLV36D06来源的无细胞提取物对烟草节杆菌NCIMB 41126来源的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶的底物特异性测定

无细胞提取物的制备

如实施例7所述针对大肠杆菌TOP10/pKEC_AZAR_3的方法制备大肠杆菌DH10B/pAn(1)PLV36D06的CFE。

底物特异性测定

在将大肠杆菌DH10B/pAn(1)PLV36D06来源的CFE应用于采用不同对映异构纯α-H-α-氨基酸酰胺进行的反应，以测定烟草节杆菌α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶的底物特异性之前，通过采用抑制剂混合物预处理，以抑制该CFE中的大肠杆菌酰胺酶/氨肽酶。将一片完全小蛋白酶抑制剂混合物片剂(Roche Applied Science，Mannheim，Germany)溶解于9ml CFE后，室温温育1小时。接着，制备体积均为10ml的反应混合物(包括CFE)，使其含有pH8.0、50mM的HEPES-NaOH，20μM吡哆醛-5-磷酸，0.4mg/ml BSA，1mM二硫苏糖醇和75mM的一种受检氨基酸酰胺。通过加入大肠杆菌DH10B/pAn(1)PLV36D06或大肠杆菌TOP10/pBAD/Myc-HisC(空白)的1ml预处理CFE起动反应，并于37℃温育。以固定时间间隔取样1ml，并转移至含有终止反应所用1ml、1M H₃PO₄的小瓶中。将样品充分稀释于pH9.4、0.4M的硼酸盐缓冲液后，根据实施例7所述方法，采用HPLC分析所获混合物，以测定两种氨基酸和两种氨基酸酰胺对映体的准确浓度。CFE针对不同底物α-H-α-氨基酸酰胺的最初活性的计算方法也如实施例7所述，包括校正酰胺底物和/或不完全受抑制剂混合物预温育CFE抑制的酰胺酶/氨肽酶的产物的潜在水解。

如实施例7所示，大肠杆菌TOP10/pBAD/Myc-HisC的预处理CFE也未显示所采用对映纯α-H-α-氨基酸酰胺底物的任何外消旋化。采用大肠杆菌TOP10/pAn(1)PLV36D06来源的CFE的实验结果如表8所示。

表8.大肠杆菌DH10B/pAn(1)PLV36D06来源的CFE针对同对映异构纯α-H-α-氨基酸酰胺的相对最初活性

^a相对于针对D-亮氨酸酰胺的活性得出的所有最初活性

表8所示结果无疑证实了烟草节杆菌NCIMB 41126的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶不仅具有针对亮氨酸酰胺的活性，也具有针对其它α-H-α-氨基酸酰胺的活性。

实施例10

以DL-2-氨基丁酸酰胺为底物并采用含人苍白杆菌IA来源的α- H-α-氨基酸酰胺消旋酶的大肠杆菌DH10B/pOa(1)PLV49B10的CFE进行的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性检验

无细胞提取物的制备

以与实施例7相似的方法培养大肠杆菌DH10B/pOa(1)PLV49B10，并制备无细胞提取物。该情况中，也以完全相同的方式处理大肠杆菌TOP10/pBAD/Myc-HisC，作为阴性对照。

针对DL-2-氨基丁酸酰胺的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶/活性

为测定大肠杆菌DH10B/pOa(1)PLV49B10和大肠杆菌TOP10/pBAD/Myc-HisC来源CFE的活性，制备体积均为10ml的反应混合物，使其含有pH8.0、50mM的HEPES-NaOH，20μM吡哆醛-5-磷酸，0.4mg/ml BSA，1mM二硫苏糖醇和75mM DL-2-氨基丁酸酰胺。通过加入大肠杆菌DH10B/pAn(1)PLV49B10或大肠杆菌TOP10/pBAD/Myc-HisC(空白)的1ml解冻的CFE，起动反应，并于37℃温育21.5小时。以固定时间间隔取样1ml，并转移至含有终止反应所用1ml MeOH的小瓶中。根据下述流程，采用HPLC分析上述样品，测定L-和D-2-氨基丁酸和L-和D-2-氨基丁酸酰胺的浓度。

柱：Sumika的Sumichiral OA5000(150×4.6mm I.D.，5μ)+保护柱

洗脱液：4mM CuSO₄溶于水

流速：1ml/min

柱温：10℃

上样体积：6μl

检测：与添加EDTA的0.4M硼酸盐缓冲液中的邻苯二醛和2-巯基乙醇完成柱后反应后，进行荧光检测

(波长ex＝338nm和em>420nm)

该实验结果如表9所示。

表9.大肠杆菌DH10B/pOA(1)PLV49B10和大肠杆菌空白(大肠杆菌TOP10/pBAD/Myc-HisC)来源的CFE针对DL-2-氨基丁酸(Abu)酰胺的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性

样本代码	温育时间(小时)	D-Abu氨酸(mM)	L-Abu氨酸(mM)	D-Abu(mM)	L-Abu(mM)	转化率<sup>a</sup>(％)	e.e.<sub>L-Abu</sub>(％)
样本代码	温育时间(小时)	D-Abu氨酸(mM)	L-Abu氨酸(mM)	D-Abu(mM)	L-Abu(mM)	转化率<sup>a</sup>(％)	e.e.<sub>L-Abu</sub>(％)	B	0	41.1	37.5	0.0	2.1	2.6	100
B	0.75	43.2	26.1	0.0	14.4	17.2	100	B	0	41.1	37.5	0.0	2.1	2.6	100
B	0.75	43.2	26.1	0.0	14.4	17.2	100	B	2	42.2	7.2	0.0	30.5	38.2	100
B	4.65	38.9	0.1	0.3	39.4	50.1	98.5	B	2	42.2	7.2	0.0	30.5	38.2	100
B	4.65	38.9	0.1	0.3	39.4	50.1	98.5	B	8.25	42.4	0.1	0.7	40.9	48.7	96.7
B	21.5	40.9	0.1	1.7	38.3	47.4	91.7	B	8.25	42.4	0.1	0.7	40.9	48.7	96.7
B	21.5	40.9	0.1	1.7	38.3	47.4	91.7	A	0	42.3	40.5	0.0	1.4	1.6	100
A	0.75	39.6	29.3	0.0	12.3	15.2	100	A	0	42.3	40.5	0.0	1.4	1.6	100
A	0.75	39.6	29.3	0.0	12.3	15.2	100	A	2	34.7	17.8	0.0	29.1	35.7	100
A	4.65	20.8	11.5	0.1	52.3	61.8	99.6	A	2	34.7	17.8	0.0	29.1	35.7	100
A	4.65	20.8	11.5	0.1	52.3	61.8	99.6	A	8.25	12.4	8.6	0.5	64.9	75.1	98.5
A	21.5	6.7	5.8	1.4	71.7	83.9	96.3	A	8.25	12.4	8.6	0.5	64.9	75.1	98.5

^a利用下列公式计算的L-酸的转化率：

转化率＝[L-酸/(L-酸+D-酸+L-酰胺+D-酰胺)]×100％

菌株A：大肠杆菌DH10B/pOA(1)PLV49B10

菌株B：大肠杆菌TOP10/pBAD/Myc-HisC

表9中的数据清晰地显示采用大肠杆菌空白细胞(大肠杆菌TOP10/pBAD/Myc-HisC)来源的CFE所获最大转化率不超过50％。因为这些细胞不具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性，仅转化L-氨基丁酸酰胺，而不触及其它底物对映体。所以该情况中的最大理论收率仅为50％，是(酶的)动力学拆分反应的标准。该组最后两个时间点的数据显示，当L-底物浓度接近0时，大肠杆菌TOP10来源的L-酰胺酶/氨肽酶也缓慢转化D-氨基丁酸酰胺，结果反应21.5个小时后L-氨基丁酸的对映异构体过量值为91.7％.

采用含有人苍白杆菌IA来源α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶的大肠杆菌DH10B/pOA(1)PLV49B10的CFE时，也清晰地显示D-氨基丁酸酰胺被转化了，导致21.5小时后L-氨基丁酸的总转化率为85.4％。整个反应期间，反应混合物中所获L-氨基丁酸的对映异构体过量值仍然超过95％。这是通过α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶的作用，反应末期较高的L-氨基丁酸酰胺浓度造成的。

该实验证明通过将人苍白杆菌IA来源的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶与L-选择性酰胺酶/氨肽酶(例如存在于大肠杆菌TOP10细胞来源的CFE中)结合，可以超过50％的收率将DL-α-H-α-氨基酸酰胺转化为L-α-H-α-氨基酸酰胺，且对映异构体过量值极好。

实施例11

以DL-2-氨基丁酸酰胺为底物并结合恶臭假单胞菌ATCC 12633来源的L-氨肽酶采用大肠杆菌DH10B/pOa(1)PLV49B10来源的CFE进行的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性检验

该实验中，采用实施例11中的大肠杆菌DH10B/pOA(1)PLV49B10CFE。并结合含有恶臭假单胞菌ATCC 12633来源L-氨肽酶的制剂。该酶是与作为L-氨肽酶辅助溶液应用于筛选人苍白杆菌IA和烟草节杆菌NCIMB 41126基因文库(实施例3和3A)的酶相同的L-对映选择性酶。

制备10ml反应混合物(总体积包括酶制剂)，使其含有pH8.0、50mM的HEPES-NaOH，20μM吡哆醛-5-磷酸，0.4mg/ml BSA，1mM二硫苏糖醇和75mM DL-2-氨基丁酸酰胺。通过加入大肠杆菌DH10B/pOa(1)PLV49B10的0.4ml解冻的CFE和0.17ml含恶臭假单胞菌ATCC 12633来源的L-氨肽酶的溶液，起动反应。并于37℃温育该反应混合物18小时。以特定时间间隔取样1ml，并转移至含有终止反应所用1ml MeOH的小瓶中。根据实施例11的操作流程，采用HPLC分析上述样品，测定L-和D-2-氨基丁酸和L-和D-2-氨基丁酸酰胺的浓度。该实验结果如表10所示。

表10大肠杆菌DH10B/pOA(1)PLV49B10来源的CFE与恶臭假单胞菌ATCC12633来源的L-氨肽酶的组合针对DL-2-氨基丁酸(Abu)酰胺的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性

培养时间(小时)	D-Abu酰胺(mM)	L-Abu酰胺(mM)	D-Abu(mM)	L-Abu(mM)	转化率<sup>a</sup>(％)	e.e.<sub>L-Abu</sub>(％)
培养时间(小时)	D-Abu酰胺(mM)	L-Abu酰胺(mM)	D-Abu(mM)	L-Abu(mM)	转化率<sup>a</sup>(％)	e.e.<sub>L-Abu</sub>(％)	0	36.2	34.1	0.0	0.5	0.7	100
0.5	34.6	22.2	0.0	11.7	17.1	100	0	36.2	34.1	0.0	0.5	0.7	100
0.5	34.6	22.2	0.0	11.7	17.1	100	1.0	36.4	7.3	0.1	32.2	42.4	99.4
1.5	33.0	2.7	0.0	38.5	51.9	100	1.0	36.4	7.3	0.1	32.2	42.4	99.4
1.5	33.0	2.7	0.0	38.5	51.9	100	2.0	30.4	1.7	0.0	41.9	56.7	100
18	0.4	0.0	1.6	70.8	97.3	95.7	2.0	30.4	1.7	0.0	41.9	56.7	100

表10中的数据显示通过将人苍白杆菌IA来源的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶与恶臭假单胞菌ATCC 12633来源的L-氨肽酶组合，可获得L-2-氨基丁酸的极高转化率(97.3％)。获得的该转化率非常接近动态动力学拆分可获得的最大理论值(即100％)。此外，L-2-氨基丁酸的对映异构体过量值仍然大于95％。

实施例12

以DL-2-氨基-5-[1，3]二氧戊环-2-基-戊酸酰胺为底物并组合恶臭假单胞菌ATCC 12633来源的L-氨肽酶采用大肠杆菌DH10B/ pOa(1)PLV49B10来源的CFE进行的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性检验

以非常相似的安排，针对更为复杂的底物DL-2-氨基-5-[1，3]二氧戊环-2-基-戊酸酰胺，测定人苍白杆菌IA来源的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶与恶臭假单胞菌ATCC 12633来源的L-氨肽酶的组合活性。该酰胺的分子结构可见实施例8中的底物表。该实验采用大肠杆菌DH10B/pOa(1)PLV49B10来源的1ml解冻的CFE，连同1ml含有恶臭假单胞菌ATCC 12633来源的L-氨肽酶的溶液。反应120小时。根据下述流程，采用HPLC分析上述样品，测定L-和D-2-氨基-5-[1，3]二氧戊环-2-基-戊酸和L-和D-2-氨基-5-[1，3]二氧戊环-2-基-戊酸酰胺的浓度。

柱：Crownether Cr(-)(150mm×4.0mm ID)

洗脱液：高氯酸溶于水，pH＝1.0

流速：1.2ml/min

柱温：18℃

上样体积：20μl

检测：与0.4M硼酸盐缓冲液中的邻苯二醛和2-巯基乙醇完成柱后反应后，进行荧光检测

(波长ex＝338nm和em>420nm)

该实验结果如表11所示。

表11.大肠杆菌DH10B/pOA(1)PLV49B10来源的CFE恶臭假单胞菌ATCC 12633来源的L-氨肽酶的组合针对DL-2-氨基-5-[1，3]二氧戊环-2-基-戊酸酰胺的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性

培养时间(小时)	D-Abu酰胺(mM)	L-Abu酰胺(mM)	D-Abu(mM)	L-Abu(mM)	转化率<sup>a</sup>(％)	e.e.<sub>L-Abu</sub>(％)
培养时间(小时)	D-Abu酰胺(mM)	L-Abu酰胺(mM)	D-Abu(mM)	L-Abu(mM)	转化率<sup>a</sup>(％)	e.e.<sub>L-Abu</sub>(％)	0	36.6	36.5	0.0	4.3	5.6	100
3.6	35.7	2.7	0.0	37.6	49.5	100	0	36.6	36.5	0.0	4.3	5.6	100
3.6	35.7	2.7	0.0	37.6	49.5	100	22.1	29.9	1.0	0.1	40.3	56.6	99.5
532	27.4	0.1	0.1	43.5	61.1	99.5	22.1	29.9	1.0	0.1	40.3	56.6	99.5
532	27.4	0.1	0.1	43.5	61.1	99.5	120.2	23.7	0.1	0.4	46.0	65.5	98.2

表11中的数据显示通过将人苍白杆菌IA来源的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶与恶臭假单胞菌ATCC 12633来源的L-氨肽酶组合，在120小时的反应中可获得从DL-2-氨基-5-[1，3]二氧戊环-2-基-戊酸酰胺到L-酸大于65％的转化率。所形成L-酸的对映异构体过量值高于98％。

该实验结果证明对含有官能化侧链的更复杂α-H-α-氨基酸酰胺而言，通过将人苍白杆菌IA来源的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶与L-选择性酰胺酶/氨肽酶(例如恶臭假单胞菌ATCC 12633来源的L-氨肽酶)组合，动态动力学拆分也是可能的。

序列表

<110>DSM IP Assets B.V.

<120>具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的多肽和编码该多肽的核酸

<130>20595WO

<160>13

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1501

<212>DNA

<213>人苍白杆菌IA NCIMB 41129

<220>

<221>CDS

<222>(98)..(1417)

<223>氨基酸酰胺消旋酶编码序列

<400>1

<210>2

<211>439

<212>PRT

<213>人苍白杆菌IA NCIMB　41129

<400>2

<210>3

<211>436

<212>DNA

<213>烟草节杆菌 NCIMB41126

<400>3

<210>4

<211>400

<212>DNA

<213>发根土壤杆菌Bi NCIMB 41128

<400>4

<210>5

<211>381

<212>DNA

<213>发根土壤杆菌Na NCIMB 41127

<400>5

<210>6

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成DNA

<400>6

<210>7

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成DNA

<400>7

<210>8

<211>1454

<212>DNA

<213>烟草节杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(80)..(1417)

<223>氨基酸酰胺消旋酶编码序列

<400>8

<210>9

<211>445

<212>PRT

<213>烟草节杆菌 NCIMB 41126

<400>9

<210>10

<211>67

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成DNA

<400>10

<210>11

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成DNA

<400>11

<210>12

<211>100

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成DNA

<400>12

<210>13

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成DNA

<400>13

Claims

1.具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性，并与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列存在至少55％同一性程度的分离多肽。

2.如权利要求1所述的分离多肽，与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列存在至少75％的同一性程度。

3.如权利要求1或2所述的分离多肽，与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列存在至少95％的同一性程度。

4.具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性，并与SEQ ID NO：9所示氨基酸序列存在至少50％同一性程度的分离多肽。

5.如权利要求4所述的分离多肽，与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列存在至少70％的同一性程度。

6.如权利要求4或5所述的分离多肽，与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列存在至少95％的同一性程度。

7.具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的分离多肽，由可于低严格性条件下，与SEQ ID NO：1或其互补链或与SEQ ID NO：8或其互补链杂交的核酸序列编码。

8.如权利要求7所述的分离多肽，由可于中等严格性条件下，与SEQ ID NO：1或其互补链或与SEQ ID NO：8或其互补链杂交的核酸序列编码。

9.具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的分离多肽，显示与针对SEQID NO：2或SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的片段的抗体具有免疫学交叉反应性。

10.具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的分离多肽或其至少含100个氨基酸的片段。

11.如权利要求10所述的分离多肽或其片段，所述片段含125-350个氨基酸。

12.如权利要求10或11所述的分离多肽或其片段，所述片段含200-300个氨基酸。

13.通过表达编码权利要求1-12中任意一项的多肽的核酸序列而制备的分离融合蛋白，所述核酸序列可操作地连接于一个或多个编码标记多肽的核酸序列。

14.编码权利要求1-12中任意一项的多肽或权利要求13的融合蛋白的核酸序列。

15.包含权利要求14的核酸序列的载体。

16.包含并表达权利要求14的核酸序列或权利要求15的载体的宿主细胞。

17.分离显示α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的微生物的方法，包括下述步骤：

a)在一个或多个转移步骤内，在含有作为一种或唯一氮源的D-α-氨基-∈-己内酰胺或D-和L-α-氨基-∈-己内酰胺的混合物的合适生长培养基中或培养基上培养含微生物的样品，

b)检验所获微生物的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性。

18.通过权利要求17的方法可获得的显示α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的分离微生物。

19.权利要求18所述的分离微生物，其选自保藏号为NCIMB41127的发根土壤杆菌Na(Agrobacterium rhizogenes Na)、保藏号为NCIMB

41128的发根土壤杆菌Bi(Agrobacterium rhizogenes Bi)、保藏号为NCIMB41126的烟草节杆菌(Arthrobacter nicotianae)、保藏号为NCIMB41129的人苍白杆菌IA(Ochrobactrum anthropi IA)。

20.分离编码具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的多肽的核酸序列的方法，包括下述步骤：

b)检验所获微生物的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性，

c)以本身为本领域已知的手段从所获微生物中分离该核酸序列，

21.通过权利要求20的方法获得的编码具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的多肽的分离核酸序列。

22.用于生成具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的多肽的方法，包括下述步骤：

a)在一个或多个转移步骤内，在含有作为一种或唯一氮源的D-α-氨基-∈-己内酰胺或D-和L-α-氨基-∈-己内酰胺的混合物的合适生长培养基中或培养基上培养含样品微生物的样品，

b)检验所获微生物的α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性，

c)以本身为本领域已知的手段从所获微生物中分离核酸序列，

23.通过权利要求22的方法获得的具有α-H-α-氨基酸酰胺消旋酶活性的多肽。

24.使对映体富集的α-H-α-氨基酸酰胺外消旋化的方法，其中该外消旋化作用是在权利要求1-13或23中任意一项的多肽存在条件下、在权利要求16的宿主细胞存在条件下或权利要求18或19的微生物存在条件下进行的。

25.由相应的D-和L-α-H-α-氨基酸酰胺的混合物制备对映体富集的α-H-α-氨基酸，或由相应的D-α-H-α-氨基酸酰胺制备L-α-H-α-氨基酸，或由相应的L-α-H-α-氨基酸酰胺制备D-α-H-α-氨基酸的方法，其中该方法是在对映选择性酰胺酶的存在条件下，和权利要求1-13或23中任意一项的多肽存在条件下，或在权利要求16的宿主细胞存在条件下或权利要求18或19的微生物存在条件下进行的。