DE102004013842A1

DE102004013842A1 - Nitrilhydratasen aus Metagenombibliotheken

Info

Publication number: DE102004013842A1
Application number: DE102004013842A
Authority: DE
Inventors: Stefan Dr. Verseck; Klaus Dr. Liebeton; Jürgen Dr. Eck
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: BRAIN Biotech AG
Priority date: 2004-03-20
Filing date: 2004-03-20
Publication date: 2005-10-13
Also published as: DK2369010T3; WO2005090595A3; WO2005090595A2; EP1730300A2; EP2369010B1; US7872100B2; US20080171389A1; DK1730300T3; DK2369009T3; EP2369010A3; EP1730300B1; EP2369010A2; CA2557476A1; EP2369009B1; EP2369009A3; SG157384A1; ZA200607776B; EP2369009A2; CA2557476C

Abstract

Die vorliegende Erfindung befasst sich mit der Herstellung neuer Nitrilhydratasen. Diese werden vorzugsweise aus nicht kultivierbaren Organismen über ein PCR-basiertes Screening in DNA-Metagenombibliotheken mit speziellen degenerierten Primern erhalten.

Description

Die vorliegende Erfindung ist auf spezielle degenerierte Primer gerichtet. Diese werden vorzugsweise in einem Verfahren zur Herstellung von Nitrilhydratasen eingesetzt. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher auch die durch das unter Zuhilfenahme der Primer durchgeführte Verfahren hergestellten Nitrilhydratasen und weitere für deren Aktivität benötigte Proteine. Ebenso bilden die diese Proteinsequenzen codierenden Nukleinsäuren und diese aufweisenden Expressionssysteme einen weiteren Gegenstand der Anmeldung. Die Verwendung der Nitrilhydratasen und der zugrundeliegenden Nukleinsäuresequenzen bilden einen weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung.
Die Strukturklassen der Amide und Carbonsäuren gewinnen mehr und mehr an Bedeutung als Vorstufen von Feinchemikalien. Spezielle Aminoamide und (proteinogene und nicht-proteinogene) Aminosäuren sind Schlüsselintermediate für die Synthese von pharmazeutischen und agrochemischen Produkten, als auch im Lebensmittelbereich. Insbesondere enantiomerenreine Amide und Aminosäuren spielen eine immer größer werdende Rolle in den oben genannten Anwendungsbereichen.
Aminonitril-Vorstufen, wie sie für die Herstellung der oben angegebenen Verbindungsklassen benötigt werden, sind in racemischer Form leicht über die so genannte Streckersynthese zugänglich. Die so gewonnenen Nitrile können anschließend mittels chemischer oder enzymatischer Verseifung in die entsprechenden Amide und Carbonsäuren überführt werden.
Es sind drei Enzyme bekannt, die an der enzymatischen Hydrolyse von Nitrilen beteiligt sein können. Nitrilasen setzen eine Nitril-Funktion direkt zur Säure um, wohingegen Nitrilhydratasen (E.C. 4.2.1.84) hier das entsprechende Amid bilden. Dieses kann durch eine Amidase (E.C. 3.5.1.4) abschließend in die entsprechende Carbonsäure umgesetzt werden (Schema 1).
Schema 1:
Die Verseifung von Nitrilen zu den entsprechenden Amiden und Säuren mittels isolierter Enzyme oder Ganz-Zell-Katalysatoren hilft große Mengen Salz zu sparen, welche ansonsten bei dem Neutralisierungsschritt nach der chemischen Verseifung von Nitrilen anfallen würden. Aus diesem Grund stellt die enzymatische Verseifung von Nitrilen zu z.B. Aminoamiden und/oder Aminosäuren ein nachhaltigeres Produktionsverfahren dar.
Nitrilhydratasen bestehen in ihrer aktiven Form aus 2 nicht-homologen α- und β-Untereinheiten. Diese bilden Heterodimere, Tetramere, und bei Rhodococcus rhodochrous J1 wurden sogar Decamere nachgewiesen. Die α- und β-Untereinheiten besitzen ungefähr die gleiche Größe, haben aber sonst keine Ähnlichkeiten untereinander. Nitrilhydratasen sind Metalloproteine die Fe3⁺ oder Co3⁺-Ionen enthalten (Bunch A. W. (1998), Nitriles, in: Biotechnology, Volume 8a, Biotransformations I, Chapter 6, Eds.: Rehm HJ, Reed G, Wiley-VCH, p. 277-324; Shearer J, Kung IY, Lovell S, Kaminsky W, Kovacs JA (2001) Why is there a "inert" metal center in the active site of nitrile hydratase? Reactivity and ligand dissociation from a fivecoordinate Co(III) nitrile hydratase model. J Am Chem Soc 123: 463-468; Kobayashi M, Shimizu S (2000) Nitrile hydrolases. Current Opinion in Chemical Biology 4: 95-102).
Eine der größten Herausforderungen bisher ist die heterologe Darstellung von Nitrilhydratasen in einem geeigneten Wirt, bevorzugt in E. coli. Dieses Gram negative Bakterium ist bekannt für seine hohen Expressionsraten heterologer Proteine. Ein weiterer Vorteil ist die Ausbeute an Biomasse in Hoch-Zelldichte-Fermentationen mit E. coli. Hierbei können Produktivitäten von über 100 g Biotrockenmasse (BTM) in 24 bis 44 Stunden erreicht werden (Lee SY (1996) High cell-density culture of Escherichia coli. TIBTECH 14:98-105; Riesenberg D, Guthke R (1999) High-cell-density cultivation of microorganisms. Appl Microbiol Biotechnol 51:422-430).
Die meisten Nitrilhydratase-Sequenzen der α- und β-Untereinheit sind aus der Gattung Rhodococcus bekannt. Aber gerade die Expression der Nitrilhydratasen aus dieser Gattung in E. coli war bisher nur unter besonderen Schwierigkeiten möglich (Ikehata O, Nishiyama M, Horinouchi S, Beppu T (1989) Primary structure of nitrile hydratase deduced from the nucleotide sequence of a Rhodococcus species and ist expression in Escherichia coli. Eur J Biochem 181: 563-570).
In der Literatur sind Expressionssysteme für Nitrilhydratasen beschrieben deren spezifische Aktivitäten zwischen 4,2 und 12,2 U/mg Gesamtprotein für Co-abhängige Nitrilhydratasen aus R. rhodochrous J1 (Kobayasjhi M, Nishiyama M, Nagasawa T, Horinouchi S, Beppu T, Yamada H (1991) Cloning, nucleotide sequence and expression in Escherichia coli of two cobalt-containing nitrole hydratase genes from Rhodococcus rhodochrous. Biochim Biophys Acta 1129: 23-33) und 452 U/mg Gesamtprotein für eine eisenabhängige Nitrilhydratase aus Rhodococcus spec. N-771 liegen (Njori M, Yohda M, Odaka M, Matsushita Y, Tsujimura M, Yoshida T, Dohmae N, Takio K Endo I (1999) Functunal expression of Nitrile hydratases in E. coli: Requirement of a nitrile hydratase activator and a post-translational modification of a ligand cysteine. J Biochem 125: 696-704), was ungefähr ca. 248 U/mg BTM (Biotrockenmasse) entspricht (Kalkulation nach Goodsell DS (1991) Inside a cell. TIBS 16: 203-206). Interessanterweise konnte die letztgenannte Aktivität mit Nitrilhydratasen aus R. erythropolis, welche nahe verwandt sind mit Rhodococcus spec. N-711, mit ähnlichen Vektorsystemen und Anordnungen der Strukturgene nicht nachvollzogen werden. Es bestand daher immer noch ein Bedarf an Verfahren und Systemen welche es gestatten, die ins Auge gefassten Enzyme in für technische Maßstäbe ausreichender Art und Weise zur Verfügung zu stellen.
Bisher beschriebene Methoden des Screenings nach Nitrilhydratasen beschränkten sich auf die Isolierung von Mikroorganismen, die eine entsprechende Enzymaktivität aufweisen. Diese Mikroorganismen wurden entweder aus bestehenden Stammsammlungen entnommen, oder in so genannten Anreicherungsmedien selektiv angezogen (Colquhoun JA, Heald SC, Li L, Tamaoka J, Kato C, Horikoshi K and Bull AT (1998a) Taxonomy and biotransformation activities of some deep-sea actinomycetes. Extremophiles 2: 269-277; Colquhoun JA, Mexson J, Goodfellow M, Ward AC, Horikoshi K and Bull AT (1998b) Novel rhodococci and other mycolate actinomycetes from the deep sea. Antonie van Leeuwenhoek 74: 27-40).
Nachteilig an diesen Methoden ist, dass mit diesen Screening-Verfahren hauptsächlich Mikroorganismen der Gattungen Rhodococcus, Bacillus, Pseudomonas, o. ä. gefunden wurden und die Diversität der entsprechenden Nitrilhydratasen bezüglich Aktivität oder Substratspezifität damit auch eingeschränkt ist (Bunch A. W. (1998), Nitriles, in: Biotechnology, Volume 8a, Biotransformations I, Chapter 6, Eds.: Rehm H.J., Reed G., Wiley-VCH, p. 277-324; Cowan D, Cramp R, Pereira R, Graham D, Almathawa Q (1998) Biochemistry and biotechnology of mesophilic and thermophilic nitrile metabolising enzymes. Extremophiles 2: 207-216; Yamada H, Kobayashi M (1996) Nitrile hydratase and its application to industrial production of acrylamide. Biosci Biotechnol Biochem 60: 1391-141).
Derzeitige Schätzungen gehen davon aus, dass in der Regel nur 0,01 – 1% der Mikroorganismen eines Habitats kultivierbar sind und damit einem Screening nach der oben beschriebenen Methode zugeführt werden können (Amann RI, Ludwig W, Schleifer KH (1995) Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiol. Rev. 59: 143-169; Pace NR (1997) A molecular view of microbial diversity and the biosphere. Science 276: 734-740; Cowan DA (2000) Microbial genomes – the untapped resource. Trends Biotechnol. 18: 14-16). Die Bedeutung der "direkten Klonierung" von genomischer DNA möglichst aller Organismen einer Bodenprobe (das "Metagenom") und deren Zuführung in ein genetisches Screening in Form von Metagenom-Genbanken gewinnt daher für die Identifizierung neuer technischer Enzyme immer mehr an Bedeutung. Das genetische Screening nach Enzym-kodierenden Genen kann hierbei Sequenz-homolog auf Basis konservierter Sequenzmotive oder bei Vorliegen geeigneter Enzymtests/Indikatormedien auch Aktivitäts-homolog erfolgen (Lorenz P, Köhler B, Wolf M, Eck J, Zinke H (2000) Expression Cloning of Metagenome DNA from Soil. Biotechnol. 2000, Book of Abstr. Vol 2: 306).
Mittels eines PCR-basierten Screenings unter Verwendung degenerierter Primer konnten bereits Nitrilhydratasen aus metagenomischer DNA amplifiziert werden, wobei aber die Sequenzen naturgemäß sehr hohe Ähnlichkeiten (90 – 99%) zu bekannten Nitrilhydratasen aufwiesen (Precigou S, Goulas P, Duran R, (2001) Rapid and specific identification of nitrile hydratase encoding genes in soil samples by polymerase chain reaction, FEMS Microbiol. Letters 204: 155-161). Eine fundierte Beurteilung der in dieser Zitierstelle verwendeten Primer ist nicht möglich, da die Autoren die Sequenz der degenerierten Primer und deren Degenerationgrad nicht offen legen. Die hohe Ähnlichkeit der Sequenzen zu der Nitrilhydratasen aus Rhodococcus rhodochrous J1 H lässt vermuten, dass auch die Substratspezifität nicht deutlich anders ist als bei dem genannten Enzym.
Es bestand daher immer noch ein Bedarf an Verfahren und Systemen welche es gestatten, weitere der ins Auge gefassten Enzyme in für technische Maßstäbe ausreichender Art und Weise zur Verfügung zu stellen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war deshalb die Angabe eines weiteren Verfahrens zur Herstellung von Nitrilhydratasen. Insbesondere sollte das Verfahren im Stande sein, Nitrilhydratasen zu identifizieren, die in so genannten nicht kultivierbaren Organismen vorkommen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand in der Herstellung von gegenüber dem Stand der Technik verbesserten Nitrilhydratasen.
Diese und weitere nicht näher spezifizierte, sich jedoch aus dem Stand der Technik in naheliegender Weise ergebende Aufgaben werden durch die Angabe spezieller Primerbestandteile gemäß Anspruch 1 und deren Anwendung in einem Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 2 gelöst. Anspruch 3 bis 5 beziehen sich aufbevorzugte Ausführungsformen des gegenständlichen Verfahrens. Anspruch 6 schützt die erfindungsgemäßen Proteinsequenzen, Anspruch 7 ist auf die sie codierenden Nukleinsäuresequenzen gerichtet und Anspruch 8 betrifft die mit diesen Nukleinsäuresequenzen ausgestatteten Expressionssysteme. Anspruch 9 befasst sich mit erfindungsgemäß hergestellten neuen Nitrilhydratasen. Ansprüche 10 und 11 sind auf spezielle Verwendung gerichtet.
Voraussetzung für das Auffinden neuer Nitrilhydratasen ist die Angabe von Nukleinsäuresequenzen, die im Stande sind, als Sonde für Nitrilhydratase-Gene in DNA-Metagenombibleotheken zu dienen. Durch die Angabe von degenerierten Primerbestandteilen aus der Gruppe bestehend aus
A-01f : gcsmrsgcstgg (Seq. ID NO. 1)
B-01f : ggsctsccscc (Seq. ID NO. 2)
B-01r : ggsggsagscc (Seq. ID NO. 3)
C-01r : ggncgcwbsgg (Seq. ID NO. 4)
A-01f : gcnmrrgcntgg (Seq. ID NO. 5)
B-01f : ggnytnccncc (Seq. ID NO. 6)
B-01r : ggnggnarncc (Seq. ID NO. 7)
C-01r : gwngwrtccca (Seq. ID NO. 8)
A-01f : gcntggrynga (Seq. ID NO. 9)
B-01f : ggnytsccncc (Seq. ID NO. 10)
B-01r : ggnggsarncc (Seq. ID NO. 11)
C-01r : swnswrtccca (Seq. ID NO. 12)
gelangt der Fachmann völlig überraschend dafür aber nicht minder vorteilhaft zu besonderen Nukleinsäuresequenzen, die helfen, spezielle Sonden für das Fischen nach Nitrilhydratase-Genen in DNA-Metagenombibliotheken zu erstellen. Es sind dies degenerierte Nukleinsäuresequenzen, die auf der einen Seite spezifisch genug sind, nur Nitrilhydratase-Gene ausfindig zu machen, auf der andern Seite jedoch so unspezifisch sind, dass möglichst alle vorhandenen Nitrilhydratase-Gene erfasst werden. Deren Herstellung war zur Zeit der Erfindung aus dem Stand der Technik in naheliegenderweise nicht herleitbar.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung war demnach auch ein Verfahren zur Herstellung von Proteinsequenzen, welche notwendig zum Aufbau der Aktivität einer Nitrilhydratase sind, dergestalt, dass man

a) eine DNA-Metagenombibleothek eines Habitats erstellt,
b) diese mit mindestens jeweils einem forward(f)- und einem reverse(r)-Primer aufweisend eine degenerierte Nukleinsäuresequenz gemäß den Sequenzen 1 bis 12 kontaktiert,
c) eine PCR hiermit durchführt,
d) aus den erhaltenen Teilsequenzen die Volllängensequenzen der Nukleinsäuren codierend für Proteinsequenzen notwendig zum Aufbau der Aktivität einer Nitrilhydratase generiert und
e) diese in einen Gastorganismus kloniert und exprimiert.

Wie eingangs schon angemerkt, bestehen Nitrilhydratasen zumindest aus zwei verschiedenen Untereinheiten (α- und β-Untereinheit). Es kann jedoch sein, dass neben diesen zwei Untereinheiten weitere Proteinsequenzen notwendig sind, um eine Aktivität der Nitrilhydratasen zu gewährleisten. Unter Umständen ist das Vorhandensein bestimmter so genannter putativer „Aktivatoren" (z. B. Faltungsproteine etc.) notwendig, damit entsprechende Aktivitäten von Nitrilhydratasen zu Stande kommen. Die für diese Aktivatoren codierenden Nukleinsäuresequenzen befinden sich häufig in unmittelbarer Nähe der Nukleinsäuresequenzen kodierend für die entsprechenden Nitrilhydratase-Untereinheiten. Es ist demnach möglich, durch das Fischen nach Nukleinsäuresequenzen kodierend für Nitrilhydratasen alle die für die Aktivität der Nitrilhydratasen benötigten Proteinsequenzen mitzuerfassen. Laut erfindungsgemäßem Verfahren geht man von der Erstellung einer DNA-Metagenombibliothek eines bestimmten Habitats aus. Wie diese Bibliothek erstellt wird, ist dem Fachmann geläufig (Knietsch, AW, Tanja; BS; Henne, ADR (2003) Metagenomes of Complex Microbial Consortia Derived from Different Soils as Sources for Novel Genes Conferring Formation of Carbonyls from Short-Chain Polyols on Escherichia coli. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology 5(1): 46-56; Rondon, MR; August, PR; Bettermann AD; Brady, SF; Grossman, T H; Liles, MR; Loiacono, KA; Lynch, BA; MacNeil, IA; Mino,r C; Tiong, CL; Gilman, M; Osburne, MS; Clardy, J; Handelsman, J; Goodman, RM (2000) Cloning the soil metagenome: a strategy for accessing the genetic and functional diversity of uncultured microorganisms. Applied and environmental microbiology 66(6):2541-7). Diese wird im folgenden mit Primern versetzt, welche die erfindungsgemäß degenerierten Nukleinsäuresequenzen (Seq. ID No. 1-12) aufweisen. Anschließend wird eine PC-Reaktion durchgeführt, wobei Teilsequenzen der Nukleinsäuresequenzen kodierend für Nitrilhydratase-Untereinheiten erhalten werden. Ausgehend von diesen Teilsequenzen kann der Fachmann mittels Methoden des Standes der Technik auf die entsprechenden Volllängensequenzen der entsprechenden Nukleinsäuresequenzen schließen (Schloss, PD; Handelsman, J(2003) Biotechnological prospects from metagenomics. Current Opinion in Biotechnology, 14(3): 303-310; Rondon, MR; August, PR; Bettermann AD; Brady, SF; Grossman, T H; Liles, MR; Loiacono, KA; Lynch, BA; MacNeil, IA; Mino,r C; Tiong, CL; Gilman, M; Osburne, MS; Clardy, J; Handelsman, J; Goodman, RM (2000) Cloning the soil metagenome: a strategy for accessing the genetic and functional diversity of uncultured microorganisms. Applied and environmental microbiology 66(6):2541-7). Abschließend werden die gefundenen Nukleinsäuresequenzen in bestimmten Expressionssystemen rekombinant hergestellt. Dies ist dem Fachmann ebenfalls geläufig (Lit. s.u.).
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen degenerierten Nukleinsäuresequenzen (Seq. ID No. 1-12) im vorliegenden Verfahren der Gestalt eingesetzt, dass man jeweils Primerpaare aus Primern aufweisend die Nukleinsäuresequenzen A-01f (Seq. ID No. 1, 5, 9) und B-01r (Seq. ID No. 3, 7, 11) oder C-01r (Seq. ID No. 4, 8, 12) sowie B-01f (Seq. ID No. 2, 6, 10) und C-01r (Seq. ID No. 4, 8, 12) bei der PCR einsetzt. Unter diesen Kombinationen werden die Nukleinsäuresequenzen kodierend für die Proteinsequenzen, welche notwendig für die Aktivität von Nitrilhydratase sind, in bevorzugter und effizienter Art und Weise detektiert.
Weiterhin ist bevorzugt, wenn den oben dargestellten degenerierten Primerbestandteilen gewisse andere Nukleinsäuresequenzen (z.B. „Stabilisierungbereiche") vorgeschaltet sind (Kwok S, Chang SY, Sninsky JJ, Wang A, 1995, "Design and use of mismatched and degenerate primers In: "PCR Primer, A laboratory Manual" Dieffenbach CW & Dveksler GS (Editors), Cold Spring Habor Laboratory Press, pp143-155; Compton T, 1990, "Degenerate Primers for DNA Amplification" In: "PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications", Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ (Editors) Academic Press, San Diego, pp39-45). In diesem Fall bestehen die bei der PC-Reaktion eingesetzten Primer aus degenerierten Nukleinsäuresequenzen der oben dargestellten Art (Sequenzen ID No. 1 bis 12) und den in den Sequenzen mit den ID No. 13 bis 23 erwähnten Nukleinsäuresequenzen. Ganz besonders bevorzugt ist daher ein Verfahren, bei dem den degenerierten Nukleinsäuresequenzen (Seq. ID No. 1-12) solche ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
GCCAAGGTCGTC (Seq. ID NO. 13)
GGCCGGTCCTG (Seq. ID NO. 14)
TCCTTGTACCAGGTC (Seq. ID NO. 15)
GCCCGCC (Seq. ID NO. 16)
GGCGCTAATGTTGTT (Seq. ID NO. 17)
TGGCCGGTTCTG (Seq. ID NO. 18)
CAAATTCTTTATACCAAGTC (Seq. ID NO. 19)
CCATATATCGCATTTCAGCT (Seq. ID NO. 20)
GGTCGTGGCCAAG (Seq. ID NO. 21)
GGCCGGTCCTG (Seq. ID NO. 22)
TCCTTGTACCAGGTC (Seq. ID NO. 23)
GCGCATTTCGGCG (Seq. ID NO. 234)
vorangestellt sind. Diese Sequenzen sind ebenfalls aus konservierten Regionen von Nitrilhydratasen abgeleitet und der Kodon-Verwendung von Organismen mit unterschiedlichem GC-Gehalt angepasst.
Ganz besonders vorteilhaft ist daher ein wie eingangs dargestelltes Verfahren, bei dem Primer eingesetzt werden, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus
GCCAAGGTCGTCgcsmrsgcstgg (Seq. ID NO. 25)
GGCCGGTCCTGggsctsccscc (Seq. ID NO. 26)
TCCTTGTACCAGGTCggsggsagscc (Seq. ID NO. 27)
GCCCGCCggncgcwbsgg (Seq. ID NO. 28)
GGCGCTAAAGTTGTTgcnmrrgcntgg (Seq. ID NO. 29)
TGGCCGGTTCTGggnytnccncc (Seq. ID NO. 30)
CAAATTCTTTATACCAAGTCggnggnarncc (Seq. ID NO. 31)
CCATATATCGCATTTCAGCTgwngwrtccca (Seq. ID NO. 32)
GGTCGTGGCCAAGgcntggrynga (Seq. ID NO. 33)
GGCCGGTCCTGggnytsccncc (Seq. ID NO. 34)
TCCTTGTACCAGGTCggnggsarncc (Seq. ID NO. 35)
GCGCATTTCGGCGswnswrtccca (Seq. ID NO. 36).
Mit Hilfe dieser Primer konnten in DNA-Metagenombibleotheken Nukleinsäuresequenzen kodierend für Nitrilhydratasen sowie weitere Gene für putative „Aktivatoren" nachgewiesen werden.
Demgemäß bildet einen nächsten Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Proteinsequenzen, welche notwendig zum Aufbau. der Aktivität einer Nitrilhydratase sind, wobei diese weniger als 100 Homologie, bevorzugt weniger als 97%, weiter bevorzugt weniger als 96%, noch weiter bevorzugt weniger als 95%, mehr bevorzugt weniger als 90%, ganz bevorzugt weniger als 85% und äußerst bevorzugt weniger als 80% Homologie, auf Aminosäureebene zu derartigen bekannten Proteinsequenzen besitzen und wobei die sie codierenden Nukleinsäuresequenzen aus Teilsequenzen generiert werden, die unter stringenten Bedingungen mit den erfindungsgemäßen Primern aufweisend die Nukleinsäuresequenzen mit den Sequenz ID No. 1 bis 12 ein positives Hybridisierungssignal geben.
Die positive Hybridisierung ist Voraussetzung dafür, dass entsprechende Nukleinsäuresequenzen mittels des PC-Reaktion basierten Screenings gefunden werden können. Aus diesem Nukleinsäuresequenzen können dann nach Verfahren, die dem Fachmann geläufig sind, die entsprechenden rekombinanten Proteinsequenzen erhalten werden.
Durch solche rekombinante Techniken gelangt man zu Organismen, welche in der Lage sind, die betrachtete Proteinsequenz in für einen technischen Prozeß ausreichender Menge zur Verfügung zu stellen. Die Herstellung der erfindungsgemäßen rec-Proteinsequenzen erfolgt nach dem Fachmann bekannten gentechnologischen Verfahren (Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Balbas, P. und Bolivar, F. (1990), Design and construction of expression plasmid vectors in E.coli, Methods Enzymol. 185, 14-37; Rodriguez, R.L. und Denhardt, D. T (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, 205-225, Butterworth, Stoneham). Bezüglich der allgemeinen Vorgehensweise (PCR, Klonierung, Expression etc.) sei auch auf folgende Literatur und das dort zitierte verwiesen Universal GenomeWalker^TM Kit User Manual, Clontech, 3/2000 und dort zitierte Literatur; Triglia T.; Peterson, M. G. und Kemp, D.J. (1988), A procedure for in vitro amplification of DNA segments that lie outside the boundaries of known sequences, Nucleic Acids Res. 16, 8186; Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Rodriguez, R.L. und Denhardt, D. T (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, Butterworth, Stoneham.
Einen nächsten Gegenstand der vorliegenden Erfindung bilden auch die entsprechenden Nukleinsäuresequenzen, welche für die eben gezeigten Proteinsequenzen kodieren. Es sind dies mithin alle, die im Umfang der Degeneration des genetischen Codes für die gleiche Proteinsequenz kodieren. Ebenfalls umfasst sind damit auch solche, welche eine Homologie auf Nukleinsäureebene zu den erfindungsgemäß gefundenen Nukleinsäuresequenzen von mindestens 70 Prozent besitzen oder entsprechende Fragmente dieser Nukleinsäuresequenzen, die wiederum für Proteinsequenzen codieren, die am Aufbau der Aktivität einer Nitrilhydratase beteiligt sind. Bevorzugt kodieren diese für Proteinsequenzen, die gegenüber den erfindungsgemäß gefundenen Proteinsequenzen verbessert sind.
Erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen sind z. B. die der ungeraden Seq. ID No. 37 bis 85. Es ist mit den gefundenen Nukleinsäuresequenzen – wie oben dargestellt – möglich, die erfindungsgemäßen Proteinsequenzen aus schnell wachsenden Wirtsorganismen, z.B. E. coli, in hohen Ausbeuten zu gewinnen.
Dies geschieht durch Einbau (Klonierung) der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen in spezielle Expressionssysteme, mit deren Hilfe die entsprechenden Proteinsequenzen aus bevorzugten Wirtsorganismen in rekombinanter Art und Weise gewonnen werden können. Einen nächsten Aspekt der vorliegenden Erfindung bildet deshalb ein (künstlich hergestelltes) Expressionssystem aufweisend eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen. Als Expressionssystem kommen prinzipiell alle dem Fachmann für diesen Zweck geläufigen Systeme in Frage. Vorzugsweise sind dies Plasmide oder Vektoren und Mikroorganismen.
Als Plasmide oder Vektoren kommen im Prinzip alle dem Fachmann für diesen Zweck zur Verfügung stehenden Ausführungsformen in Frage. Derartige Plasmide und Vektoren können z. B. von Studier und Mitarbeiter (Studier, W. F.; Rosenberg A. H.; Dunn J. J.; Dubendroff J. W.; (1990), Use of the T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes, Methods Enzymol. 185, 61-89) oder den Broschüren der Firmen Novagen, Promega, New England Biolabs, Clontech oder Gibco BRL entnommen werden. Weiter bevorzugte Plasmide und Vektoren können gefunden werden in: Glover, D. M. (1985), DNA cloning: a practical approach, Vol. I-III, IRL Press Ltd., Oxford; Rodriguez, R.L. und Denhardt, D. T (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179-204, Butterworth, Stoneham; Goeddel, D. V. (1990), Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol. 185, 3-7; Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
Plasmide, mit denen das die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen aufweisende Konstrukt in ganz bevorzugter Weise in den Wirtsorganismus kloniert werden kann, sind: pUC18 (Roche Biochemicals), pKK-177-3H (Roche Biochemicals), pBTac2 (Roche Biochemicals), pKK223-3 (Amersham Pharmacia Biotech), pKK-233-3 (Stratagene) oder pET (Novagen). Äußerst bevorzugt sind Plasmide der pET-Reihe.
Der rekombinante Mikroorganismus, in den die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen enthaltenen Plasmide bzw. Vektoren kloniert werden, dient wie gesagt zur Vermehrung und Gewinnung einer ausreichenden Menge der rekombinanten Proteinsequenz. Die Verfahren hierfür sind dem Fachmann wohlbekannt (Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Als Mikroorganismen können im Prinzip alle dem Fachmann für diesen Zweck in Frage kommenden Organismen wie z.B. Hefen wie Hansenula polymorpha, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Prokaryonten, wie E. coli, Bacillus subtilis oder Eukaryonten, wie Säugerzellen, Insektenzellen oder Pflanzenzellen herangezogen werden. Vorzugsweise sind E. coli-Stämme für diesen Zweck zu benutzen. Ganz besonders bevorzugt sind: E. coli XL1 Blue, NM 522, JM101, JM109, JM105, RR1, DH5α, TOP 10^– oder HB101, BL21, BL21 codon plus RIL, BL21 (DE3), oder BL21 (DE3) codon plus RIL.
Weiterhin eigenen sich die erfindungsgemäßen (geraden Seq. ID No. 37 bis 85) und darüber hinaus weiter verbesserten Nukleinsäuresequenzen, die für den Aufbau der Aktivität einer Nitrilhydratase notwendigen Proteinsequenzen codieren, bevorzugt zur Herstellung von sogenannten Ganzzellkatalysatoren. Derartige Ganzzellkatalysatoren sind prinzipiell rekombinante Mikroorganismen wie die eben angesprochenen. Diese weisen jedoch neben den klonierten Genen kodierend für eine Nitrilhydratase auch weitere für den Abbau von Nitrilen zu Säuren notwendigen Enzyme auf. Wie eingangs erläutert sind dies Enzyme, die eine Amidase-Aktivität aufweisen.
Als rekombinante Mikroorganismen der oben angesprochenen Art gelten deshalb auch Ganzzellkatalysatoren aufweisend mindestens ein kloniertes Gen für eine Proteinsequenz mit (D- oder L-)Amidaseaktivität und klonierte Gene kodierend für eine aktive Nitrilhydratase. Optional kann der Ganzzellkatalysator weitere Nukleinsäuresequenzen aufweisen, die für Enzyme kodieren, welche für den Abbau einer Nitril-Funktion in eine Säure-Funktion vorteilhaft sind. Es sind dies vor allem Enzyme ausgewählt aus der Gruppe der Proteinsequenzen mit α-Aminonitril-Racemaseaktivität, mit Cyanhydrin-Racemaseaktivität, mit α-Hydroxycarbonsäure-Racemaseaktivität oder mit (α- bzw. β-)-Aminosäureamid-Racemaseaktivität. Der erfindungsgemäße Ganzzellkatalysator produziert neben den erfindungsgemäßen Proteinsequenzen, die zum Aufbau einer Nitrilhydratase-Aktivität notwendig sind, vorzugsweise eine Proteinsequenz mit L-Amidaseaktivität aus Rhizobium, vorzugsweise R. huautlense DSM 14983 (WO2004/005517) oder mit D-Amidaseaktivität, z. B. die aus Variovorax ( EP 1318193 ).
Entsprechende Racemasen sind z.B. aus Pseudomonas putida und Rhodococcus sp. bekannt (Godtfredsen, S. E.; Clausen, K.; Ingvorsen, K.; Hermes, H. F.; Van Balken, J. A.; Meijer, E. M. (1989, EP 0 307 023 ; WO 8 901 525). Weitere Aminosäureamid-Racemase bei Klebsiella oxytoca sind beschrieben bei Hermes und Mitarbeiter (Hermes, H. F. M.; Peeters, W. P.; Peters, P. J. (1990), EP 0 383 403 ), sowie in Agrobacterium rhizogenes und Ochrobacterium anthropi (Boesten, W. H. J.; Raemakers-Franken, P. C.; Sonke, T.; Euverink, G. J. W.; WO 03106691). Der Vorteil des Einsatzes von entsprechenden Racemasen liegt in der Tatsache begründet, dass ein racemisches Nitril zu 100% in die entsprechende enantiomerenangereicherte Säure umgewandelt werden kann.
Vorzugsweise wird als Ganzzellkatalysator ein Organismus wie in der DE10155928 genannt als Wirtsorganismus eingesetzt. Der Vorteil eines derartigen Organismus ist die gleichzeitige Expression mehrerer Enzymsysteme, womit nur noch ein rec-Organismus für die Reaktion von einem leicht herstellbaren Nitril bzw. Cyanhydrin oder α-Aminonitril zur entsprechenden enantiomerenangereicherten Säure angezogen werden muß.
Um die Expression der ins Auge gefassten Nukleinsäuresequenzen im Hinblick auf die Umsetzungsgeschwindigkeiten der durch sie codierten Proteinsequenzen (Enzyme) abzustimmen, können die entsprechenden Nukleinsäuresequenzen auf unterschiedlichen Plasmiden mit unterschiedlichen Kopienzahlen untergebracht und/oder unterschiedlich starke Promotoren für eine unterschiedlich starke Expression der Nukleinsäuresequenzen verwendet werden. Bei derart abgestimmten Enzymsystemen tritt vorteilhafterweise eine Akkumulation einer ggf. inhibierend wirkenden Zwischenverbindung nicht auf und die betrachtete Reaktion kann in einer optimalen Gesamtgeschwindigkeit ablaufen. Dies ist dem Fachmann jedoch hinlänglich bekannt (Gellissen, G.; Piontek, M.; Dahlems, U.; Jenzelewski, V.; Gavagan, J. W.; DiCosimo, R.; Anton, D. L.; Janowicz, Z. A. (1996), Recombinant Hansenula polymorpha as a biocatalyst. Coexpression of the spinach glycolate oxidase (GO) and the S. cerevisiae catalase T (CTT1) gene, Appl. Microbiol. Biotechnol. 46, 46-54; Farwick, M.; London, M.; Dohmen, J.; Dahlems, U.; Gellissen, G.; Strasser, A. W.; DE19920712 ).
Mit dem vorliegenden Verfahren ist es demnach möglich, die α- und β-Untereinheiten von Nitrilhydratasen ausgehend von DNA-Metagenombibleotheken herzustellen. Demgemäß bildet einen weiteren Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Nitrilhydratasen aufweisend die erfindungsgemäßen Proteinsequenzen für α-Untereinheiten und β-Untereinheiten von Nitrilhydratase, welche sich aus den durch dieses Verfahren zugänglichen Nukleinsäuresequenzen kodierend für die erfindungsgemäßen α- und β-Untereinheiten herstellen lassen. Wie in den Beispielen gezeigt, ergeben sich dabei auch aktiven Nitrilhydratasen, wenn beliebige α-Untereinheiten mit beliebigen β-Untereinheiten kombiniert werden. Dadurch ist es möglich, die Diversifiziertheit von möglichen Nitrilhydratasen weiter zu steigern.
Weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung beziehen sich auf die Verwendung der durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellten Nukleinsäuresequenzen zur Erzeugung von verbesserten Proteinsequenzen notwendig zum Aufbau der Aktivität einer Nitrilhydratase. Wie der Fachmann bei der Verbesserung von Proteinsequenzen auf Basis der Änderung von Nukleinsäuresequenz vorgeht, ist allgemein bekannt. Dies geschieht im allgemeinen durch Anwendung von Mutagenese-Methoden. Als Mutagenese-Methoden kommen alle dem Fachmann für diesen Zweck zur Verfügung stehenden Methoden in Frage. Insbesondere sind dies die Sättigungsmutagenese, die Random-Mutagenesis, in vitro-Rekombinations-Methoden sowie Site-Directed-Mutagenesis (Eigen, M. und Gardiner, w. (1984), Evolutionary molecular engineering based on RNA replication, Pure Appl. Chem. 56, 967-978; Chen, K. und Arnold, F. (1991), Enzyme engineering for nonaqueous solvents: random mutagenesis to enhance activity of subtilisin E in polar organic media. Bio/Technology 9, 1073-1077; Horwitz, M. und Loeb, L. (1986), Promoters Selected From Random DNA-Sequences, Proc Natl Acad Sci USA 83, 7405-7409; Dube, D. und L. Loeb (1989), Mutants Generated By The Insertion Of Random Oligonucleotides Into The Active-Site Of The Beta-Lactamase Gene, Biochemistry 28, 5703-5707; Stemmer, P.C. (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370, 389-391 und Stemmer, P.C. (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution. Proc Natl Acad Sci USA 91, 10747-10751).
Die so erhaltenen neuen Nukleinsäuresequenzen werden nach den oben angegebenen Methoden in einen Wirtsorgansmus kloniert, exprimiert und die so hergestellten Proteinsequenzen mit geeigneten Screening-Methoden detektiert und anschließend isoliert. zur Detektion sind grundlegend alle möglichen Nachweisreaktionen für die gebildeten Moleküle geeignet. Nitrilhydratase-aktivitäten können in einem gekoppelten enzymatischen Test mit Amidasen nachgewiesen werden, wobei Ammonium als Nebenprodukt gebildet wird. Für deren Nachweis eignen sich grundlegend alle möglichen Nachweisreaktionen für Ammoniak bzw. Ammoniumionen wie Nessler-Reagenz (Vogel, A., I., (1989) Vogel's textbook of quantitative chemical analysis, John Wiley & Sons, Inc., 5^th ed., 679-698, New York) die Indophenolreaktion auch Berthelot'sche Reaktion genannt (Wagner, R., (1969) Neue Aspekte zur Stickstoffanalytik in der Wasserchemie, Vom Wasser, VCH-Verlag, Bd. 36, 263-318, Weinheim) insbesondere die enzymatische Bestimmung mittels der Glutamat-Dehydrogenase (Bergmeyer, H.,U., und Beutler, H.-O. (1985) Ammonia, in: Methods of Enzymatic Analysis, VCH-Verlag, 3^rd Edition, Vol. 8: 454-461, Weinheim) aber auch der Nachweis mit Ammonium-sensitiven Elektroden. Weiterhin dienen HPLC-Methoden zum Nachweis von Aminosäuren wie z.B. ein Derivativ-Verfahren auf der Basis von o-Pthaldialdehyd und N-Isobutyryl-Cystein zur Enantiomerentrennung von Aminosäuren (Brückner, H., Wittner R., und Godel H., (1991) Fully automated high-performance liquid chromatographic separation of DL-amino acids derivatized with o-Phthaldialdehyde together with N-isopropyl-cysteine. Application to food samples, Anal. Biochem. 144, 204-206). Das direkt durch die Nitrilhydratasereaktion gebildete Amid kann ebenfalls über HPLC-Methoden (z. B. inverse_Phase) nachgewiesen werden.
In einer letzten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung bezieht sich diese auf die Verwendung der erfindungsgemäßen Nitrilhydratasen zur Herstellung von organischen Säureamiden und Säuren, insbesondere enantiomerenangereicherten α-Hydroxysäuren bzw. α-Aminosäuren.
Für die Anwendung kann die ins Auge gefasste Nitrilhydratase in freier Form als homogen aufgereinigte Verbindungen oder als rekombinant hergestelltes Enzym verwendet werden. Weiterhin kann das Enzym auch als Bestandteil eines intakten Gastorganismus eingesetzt werden oder in Verbindung mit der aufgeschlossenen und beliebig hoch aufgereinigten Zellmasse des Wirtsorganismus.
Möglich ist ebenfalls die Verwendung des Enzyms in immobilisierter Form (Sharma B. P.; Bailey L. F. und Messing R. A. (1982), Immobilisierte Biomaterialiern – Techniken und Anwendungen, Angew. Chem. 94, 836-852). Vorteilhafterweise erfolgt die Immobilisierung durch Lyophilisation (Paradkar, V. M.; Dordick, J. S. (1994), Aqueous-Like Activity of α-Chymotrypsin Dissolved in Nearly Anhydrous Organic Solvents, J. Am. Chem. Soc. 116, 5009-5010; Mori, T.; Okahata, Y. (1997), A variety of lipicoated glycoside hydrolases as effective glycosyl transfer catalysts in homogeneous organic solvents, Tetrahedron Lett. 38, 1971-1974; Otamiri, M.; Adlercreutz, P.; Matthiasson, B. (1992), Complex formation between chymotrypsin and ethyl cellulose as a means to solbilize the enzyme in active form in toluene, Biocatalysis 6, 291- 305). Ganz besonders bevorzugt ist die Lyophilisation in Gegenwart von oberflächenaktiven Substanzen, wie Aerosol OT oder Polyvinylpyrrolidon oder Polyethylenglycol (PEG) oder Brij 52 (Diethylenglycol-mono-cetylether) (Kamiya, N.; Okazaki, S.-Y.; Goto, M. (1997), Surfactant-horseradish peroxidase complex catalytically active in anhydrous benzene, Biotechnol. Tech. 11, 375-378).
Äußerst bevorzugt ist die Immobilisierung an Eupergit^®, insbesondere Eupergit C^® und Eupergit 250L^® (Röhm) (Eupergit.RTM. C, a carrier for immobilization of enzymes of industrial potential. Katchalski-Katzir, E.; Kraemer, D. M. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic (2000), 10(1-3), 157-176).
Gleichfalls bevorzugt ist die Immobilisierung an Ni-NTA in Kombination mit dem His-Tag (Hexa-Histidin) ergänzten Polypeptid (Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Bornhorst, Joshua A.; Falke, Joseph J. Methods in Enzymology (2000), 326, 245-254).
Die Verwendung als CLECs ist ebenfalls denkbar (St. Clair, N.; Wang, Y.-F.; Margolin, A. L. (2000), Cofactor-bound cross-linked enzyme crystals (CLEC) of alcohol dehydrogenase, Angew. Chem. Int. Ed. 39, 380-383).
Durch diese Maßnahmen kann es gelingen aus Polypeptiden, welche durch organische Solventien instabil werden, solche zu generieren, die in Gemischen von wässrigen und organischen Lösungsmitteln bzw. ganz in Organik arbeiten können.
Die vorliegende Erfindung beschreibt die Gewinnung von Nitrilhydratasen und deren korrespondierende Gene durch die Erschließung der nicht-kultivierten mikrobiellen Diversität verschiedener Habitate mittels molekulargenetischer Methoden. Durch Verwendung degenerierter Primer werden beim PCR-basierten Durchmustern von DNA-Metagenombibliotheken Nitrilhydratase-Gene identifiziert und die Teilsequenz der so erhaltenen PCR-Produkte aufgeklärt. In einem Folgeschritt wird die vollständige DNA-Sequenz der Gene bestimmt, um nach Klonierung und heterologer Expression Enzymproben für Aktivitätsprofilierungen und Anwendungsuntersuchungen bereitzustellen.
Durch die rationale Auswahl von Bodenproben, die Nitrile enthalten könnten, für die Erstellung von Metagenom-Banken (DNA-Metagenombibliotheken) und die Fokussierung auf anwendungsrelevante Substrate im Rahmen von Anreicherungskulturen, kann eine Anreicherung von Nitril-umsetzenden Mikroorganismen erzielt werden. In jedem Falle liefert das genetische Screening in Metagenom-Banken ein Pool an entsprechenden Nitrilhydratase-Genen zur nachfolgenden Expression, der aber auch als Grundlage für eine Enzymoptimierung durch gerichtete Evolution dienen kann.
Zur Identifizierung neuer Nitrilhydratasen wurden Metagenombibliotheken aus fünf unterschiedlichen Habitaten und Standorten (Grasland, Wald, sandiges Ökosystemen, Biofilm) mit mehr als 83.000 Klonen durchmustert. Der Aufbau solcher Metagenombibliotheken ist dem Fachmann geläufig (Schloss, PD; Handelsman, J (2003) Biotechnological prospects from metagenomics. Current Opinion in Biotechnology, 14(3): 303-310; Knietsch, AW, Tanja; BS; Henne, ADR (2003) Metagenomes of Complex Microbial Consortia Derived from Different Soils as Sources for Novel Genes Conferring Formation of Carbonyls from Short-Chain Polyols on Escherichia coli. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology 5(1): 46-56; Rondon, MR; August, PR; Bettermann AD; Brady, SF; Grossman, T H; Liles, MR; Loiacono, KA; Lynch, BA; MacNeil, IA; Mino r C; Tiong, CL; Gilman, M; Osburne, MS; Clardy, J; Handelsman, J; Goodman, RM (2000 ) Cloning the soil metagenome: a strategy for accessing the genetic and functional diversity of uncultured microorganisms. Applied and environmental microbiology 666): 2541-7). Diese Klone enthalten zusammen etwa 3000 MBp DNA. Die DNA- Metagenombibliotheken wurden mit Hilfe von degenerierten Oligonukleotiden, abgeleitet von konservierten Primärstrukturmotiven bekannter Nitrilhydratasen, mittels eines PCR-Screenings nach neuen Nitrilhydratasen durchsucht. Als degenerierte Primer wurden solche gemäß den Sequenz ID No. 25 bis 36 benutzt.
Dabei können insbesondere jeweils die Primer mit dem Primerbestandteil A-01f mit den mit dem Primerbestandteilen B-01r (Größe des zu erwartenden PCR-produkts ca. 210 Bp) oder C-01r (Größe des zu erwartenden PCR-produkts ca. 350 Bp) und die primer mit dem Primerbestandteile B-01f mit dem mit dem Primerbestandteil C-01r (Größe des zu erwartenden PCR-produkts ca. 180 Bp) kombiniert werden. Insbesondere der degenerierte „Kern"-Teil der Primer (unterstrichen in Sequenz ID No. 25 bis 36) ist für das Identifizieren neuer Nitrilhydratasen von Bedeutung, während der nicht degenerierte Abschnitt variiert werden kann.
Die entsprechende PC-Reaktion kann nach bekannten Methoden durchgeführt werden. Bei der Verwendung besonderer Polymerasen ist die PCR nach Maßgabe der Herstellerangaben abzuändern.
In allen 5 Metagenombibliotheken konnten Klone identifiziert werden, die die Gene für Nitrilhydratasen tragen. Dem Fachmann sind Methoden bekannt, um mit der Teilsequenz der Nitrilhydratase-Gene den das Gen tragenden Klon zu identifizieren und die Volllängensequenz aufzuklären (Schloss, PD; Handelsman, J (2003) Biotechnological prospects from metagenomics. Current Opinion in Biotechnology, 14(3): 303-310; Duran, R; Nishiyama, M; Horinouchi, S; Beppy, T (1993) Characterization of nitrile hydratase genes cloned by DNA screeningfrom Rhodococcus erythropolis. Biosci Biotech Biochem 57(8): 1323-1328).
So konnte die Volllängensequenzen (Nukleinsäuresequenzen) für insgesamt 12 Gene von α-Untereinheiten sowie für 10 Gene von β-Untereinheiten bestimmt werden (1). Darüber hinaus wurde die Sequenz von drei Genen bestimmt, die für putative „Aktivatoren" von Nitrilhydratasen kodieren könnten.
Zur Darstellung der Nitrilhydratasen wurden die Gene der α- und β-Untereinheiten jeweils separat unter die Kontrolle des Promotors des Gens 10 des Phagen T7 gestellt. Dazu wurden die Vektoren pET22b bzw. pET26b (Novagen, CN Bioscience, Inc.) verwendet (5 und 6). Die Anwendung eines Zwei-Vektor-Expressionssytems erlaubte die Möglichkeit der einfachen Kombination der Nitrilhydratase-Untereinheiten verschiedener Enzyme. Entsprechende Konstrukte wurden im Stamm E. coli BL21 (DE3) CodonPlus RIL (Novagen, CN Bioscience, Inc.) exprimiert. Die Zellen wurden bei 26°C unter Verwendung von LB-Medium inkubiert und bei Erreichen einer Zelldichte von O.D.580 = 1.0 mit 0,5 mM IPTG induziert. Dem vereinzelt auftretenden Problem der Proteinaggregation nach Überexpression bei 37°C konnte durch Reduktion der Temperatur auf 26°C begegnet werden. Die Koexpression verschiedener Chaperone (Trigger-Faktor, GroEL/GroES und Dnak/DnaJ/GrpE) zeigte bei 26°C keinen zusätzlichen Effekt, der über den durch die Temperaturreduktion erzielten hinausging.
Die Ausbeuten hinsichtlich der Aktivität gegen Benzonitril variierten erheblich (2), wobei keine eindeutige Korrelation zwischen der dargestellten Proteinmenge und der erzeugten Aktivität nachzuweisen war. So war die Ausbeute für den Klon mit der Nitrilhydratase M49bD9 (Seq. ID No. 49/71) mit 30 U/g BTM relativ hoch, obwohl in der SDS-PAGE-Analyse keine Proteine für die Nitrilhydratase nachweisbar waren. Demgegenüber steht der Klon M12K24 (Seq. ID No. 39/63), für den eine Aktivität von etwa 2,5 U/g BTM bestimmt wurden, obwohl beide Untereinheiten relativ stark überexprimiert werden konnten und ein beträchtlicher Anteil in der löslichen Fraktion zu finden war. Die Höhe der Aktivität hängt also stark von dem jeweiligen Enzym ab.
Für verschiedene Nitrilhydratasen wurden in unmittelbarer Nähe zu den Genen für die Untereinheiten des Enzyms ein weiterer, kleiner offener Leserahmen beschrieben, der für eine Proteinsequenz kodiert, die an der Aktivierung der Nitrilhydratase beteiligt zu sein scheint. Diese Proteine wurden als P12K (Seq. ID No. 81/83) bzw. P14K (Seq. ID NO. 85) bezeichnet, da ihr Molekulkargewicht etwa 12 bzw. 14 kDa beträgt. Während einige Nitrilhydratasen auch ohne diese P12K-Homologen aktiv dargestellt werden konnten, war die Anwesenheit dieser Proteine für die aktive Expression anderer Nitrilhydratasen essentiell. Um den Einfluß von P12K-Homologen, deren Gene auch in drei Metagenom-Klonen gefunden wurden, auf die Expression der entsprechenden Nitrilhydratasen aber auch auf Nitrilhydratasen von anderen Klonen zu untersuchen, wurden zwei dieser Gene in den Vektor pBBR1MCS5 (Kovach et al., 1995, Four new derivatives of the broad host range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassetes, Gene 166: 175-176) kloniert und hier unter die Kontrolle des 1ac-Promotors gestellt. Die entsprechenden Konstrukte wurden mit pBBRS-P12K-M49bD9 und pBBR5-P12K-M3aG10 bezeichnet (6 und 7).
Die Expression der Nitrilhydratase-Gene M49bD9 (Seq. ID No. 49/71) und M3aG10 (Seq. ID No. 57/79) in Gegenwart der entsprechenden P12K-Homologen (Seq. ID No. 83 – M49bD9; Seq. ID No. 85 – M3aG10) erfolgte im Stamm E. coli BL21 CodonPlus RIL bei 26°C. In beiden Fällen konnten die Untereinheiten der Nitrilhydratasen deutlich überexprimiert werden.
Die Aktivität der Nitrilhydratasen des Klons M49bD9 (Seq. ID No. 49/71) wurde durch die Anwesenheit des P12K-Homologen (Seq. ID No. 83) etwa um den Faktor 27 auf ca. 830 U/g BTM gesteigert (Tabelle 1). Für das Enzym des Klons M3aG10 (Seq. ID No. 57/79) konnte unter diesen Bedingungen zum erstenmal Aktivität (ca. 23 U/g BTM) nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse belegen, dass die Anwesenheit der P12K-Homologen (Seq. ID No. 85) für die Erhöhung der Aktivitätsausbeute entscheidend kann.
Tabelle 1: Aktivität von Nitrilhydratasen nach Koexpression mit P12K-Homologen (Seq. ID No. 83 und 85)
Die Kombination von Untereinheiten aus verschiedenen Metagenom-Klonen eröffnet die Möglichkeit Nitrilhydratasen mit potentiell neuen Substratspezifitäten zu erzeugen. Durch die Kombination von α-Untereinheiten mit verschiedenen β-Untereinheiten würde eine große Diversität an Kombinationen neuer Nitrilhydratasen möglich werden. Bis dato ist eine solche Kombination von Untereinheiten aus nicht zusammengehörigen Nitrilhydratasen in der Literatur nicht bekannt.
Um diese Möglichkeit zu evaluieren, wurden die α-Untereinheiten der Klone M73dC9 und M15aA6 (Seq. ID No. 59 und 45), für die keine β-Untereinheiten gefunden werden konnten, mit der β-Untereinheit des Klons M12K24 (Seq. ID No. 63) im Stamm E. coli BL21 codon plus RIL exprimiert.
Während sich bei der Expression des Paars von a-M73dC9a/bM12K24 (Seq. ID No. 59 und 63) beide Untereinheiten etwa gleich stark darstellen ließen, scheint die α-Untereinheit des Klons M15aA6 (Seq. ID No. 45) besser exprimiert worden zu sein als die β-Untereinheit des Klons M12K24 (Seq. ID No. 63).
Die Kombination der α-Untereinheit des Klons M73dC9 (Seq. ID No. 59) und der β-Untereinheit des Klons M12K24 (Seq. ID No. 63) führte überraschenderweise zur Bildung einer aktiven Nitrilhydratase mit einer Aktivtiät von ca. 0,07 U/g BTM (3). Dieses Ergebnis belegt, daß es prinzipiell möglich ist, durch Kombination von Nitrilhydratase-Untereinheiten verschiedener Klone aktive Enzyme darzustellen. Dieses war zum Zeitpunkt der Erfindung aus dem Stand der Technik als solches nicht herleitbar.
Stringente Bedingungen: Der Ausdruck "unter stringenten Bedingungen" wird hierin wie bei Sambrook et al. (Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) beschrieben, verstanden. Bevorzugt liegt eine stringente Hybridisierung gemäß der vorliegenden Erfindung vor, wenn nach Waschen für eine Stunde mit 1 × SSC (150 mM Natriumchlorid, 15 mM Natriumcitrat, pH 7.0) und 0,1 % SDS (Natriumdodecylsulfat) bei 50 °C, bevorzugt bei 55 °C, mehr bevorzugt bei 62 °C und am meisten bevorzugt bei 68 °C und mehr bevorzugt für 1 Stunde mit 0,2 × SSC und 0,1 % SDS bei 50 °C, bevorzugter bei 55 °C, mehr bevorzugt bei 62 °C und am meisten bevorzugt bei 68 °C noch ein positives Hybridisierungssignal beobachtet wird.
Unter optisch angereicherten (enantiomerenangereicherten, enantiomer angereicherten) Verbindungen wird im Rahmen der Erfindung das Vorliegen einer optischen Antipode im Gemisch mit der anderen in > 50 mol-% verstanden.
Unter dem Begriff Nukleinsäuresequenzen werden alle Arten von einzelsträngiger und dazu komplementärer oder doppelsträngiger DNA (z.B. genomische, cDNA) als auch RNA (z.B. mRNA) oder Gemische derselben subsumiert.
Verbesserte Nukleinsäuresequenzen kodieren für verbesserte Proteinsequenzen. verbesserte Proteinsequenzen sind solche, bei denen eine Verbesserung im Hinblick auf die Aktivität und/oder Selektivität und/oder Stabilität gegenüber den Ursprungssequenzen zu verzeichnen ist. Erfindungsgemäß bedeutet dies, dass die Proteine aktiver und/oder selektiver bzw. weniger selektiv oder unter den verwendeten Reaktionsbedingungen stabiler sind. Während die Aktivität und die Stabilität der Proteine für die technische Anwendung naturgemäß möglichst hoch sein sollte, ist in Bezug auf die Selektivität dann von einer Verbesserung die Rede, wenn entweder die Substratselektivität abnimmt, die Enantioselektivität der Proteine jedoch gesteigert ist. Dies gilt ebenfalls für Proteine als Bestandteile von Nitrilhydratasen, sofern sie dem Enzym die entsprechenden verbesserten Eigenschaften verleihen helfen.
Von den beanspruchten Proteinsequenzen und den Nukleinsäuresequenzen werden erfindungsgemäß auch solche Sequenzen umfaßt, die eine Homologie (exclusive der natürlichen Degeneration) größer als 70% (in Bezug auf die Nukleinsäuresequenz) bzw. 80% (in Bezug auf die Proteinsequenzen), bevorzugt größer als 90%, 91%, 92%, 93% oder 94%, mehr bevorzugt größer als 95% oder 96% und besonders bevorzugt größer als 97%, 98% oder 99% zu einer dieser Sequenzen aufweisen, sofern die Wirkungsweise bzw. Zweck einer solchen Sequenz erhalten bleibt. Der Ausdruck "Homologie" (oder Identität) wie hierin verwendet, kann durch die Gleichung H (%) = [1 – V/X] × 100 definiert werden, worin H Homologie bedeutet, X die Gesamtzahl an Nukleobasen/Aminosäuren der Vergleichssequenz ist und V die Anzahl an unterschiedlichen Nukleobasen/Aminosäuren der zu betrachtenden Sequenz bezogen auf die Vergleichssequenz ist. Auf jeden Fall sind mit dem Begriff Nukleinsäuresequnezen, welche für Polypeptide codieren, alle Sequenzen umfaßt, die nach Maßgabe der Degeneration des genetischen Codes möglich erscheinen.
Beschreibung der Abbildungen:
1: Homologie unter den mittels eines genetischen Screenings gefundenen α- und β-Untereinheiten von Nitrilhydratasen.
2: Aktivität verschiedener Metagenom-Nitrilhydratasen gegen Benzonitil nach Expression in E. coli BL21 (DE3) codon plus RIL mit ☐ und ∎ ohne Koexpression des Triggerfaktors (n.b.: nicht bestimmt).
3: Aktivität von Nitrilhydratasen bei Kombination von Untereinheiten aus verschiedenen Metagenom-Klonen.
4: Die Vektorkarte zeigen die generelle Anordnung der α- Untereinheiten im Plasmid pET22 am Beispiel des Klones M49bD9.
5: Die Vektorkarte zeigen die generelle Anordnung der β- Untereinheiten im Plasmid pET26 am Beispiel des Klones M49bD9.
6: Die Vektorkarte zeigen die Anordnung des Proteins P12K des Klones M49bD9 im Plasmid pBBR5.
7: Die Vektorkarte zeigen die Anordnung des Proteins P12K des Klones M3aG10 im Plasmid pBBR5.
Experimenteller Teil:
Allgemeines PCR-Protokoll:
Kultivierung von Mikroorganismen
Die Kultivierung der E. coli Zellen und deren Aufbewahrung erfolgte nach Sambrock et al. (Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York).
PCR-Protokoll:
Ein typisches PCR-Protokoll ist im folgenden dargestellt, wobei ein Anpassen des Protokolls bei Verwendung einer anderer Polymerase nach Maßgabe der Herstellerangaben erforderlich wird.

25μl HotStarTaq-Mastermix, Qiagen (2,5 U Polymerase, 200 μM dNTPs, 1 × PCR-Puffer)

25 pmol Primer 01f

25 pmol Primer 01r

2 μl template-DNA (20 – 200 ng)

ad 50 μl A. dest
Programm:
Verdau mit Restriktionsenzymen
Die zu schneidende DNA wird mit 5 U Restriktionsenzym und den zugehörigen Puffer versehen und wenn nicht anders erforderlich bei 37°C inkubiert. Der Verdau chromosomaler DNA erfolgt mit 10 U Enzym. Die Inkubationsdauer beträgt 1,5 – 2,5 Stunden.
Behandlung mit alkalischer Phosphatase
Um zu verhindern, dass Vektoren, welche nur mit einer Restriktionsendonuklease geschnitten wurden, mit sich selbst religieren, wird mit Hilfe der alkalischen Phosphatase der am 5'-Ende überhängende Phosphatrest entfernt. Nur durch Insertion eines DNA-Fragments kann wieder zirkuläre DNA entstehen.
Der mit einer Restriktionsendonuklease geschnittene Vektor wird 15 min bei 65°C inkubiert, um die Restriktionsendonuklease abzustoppen. Anschließend wird der Dephosphorylierungspuffer zugegeben und mit 1 U alkalischer Phosphatase aus Schrimps wird 10 min bei 37°C inkubiert.
Das Enzym wird durch eine anschließende Gelelektrophorese von der Vektor-DNA abgetrennt.
Behandlung mit T4-DNA-Ligase
Für die Ligation werden Vektor und Insert im Verhältnis 1:3 eingesetzt. Das Volumen wird möglichst gering gewählt (7-20 μl) Der Ansatz wird in Ligationspuffer und in Anwesenheit von 1 U Ligase bei 16 °C über Nacht inkubiert.
Transformation
Zum Ligationsansatz werden 100 μl kompetente Zellen pipettiert und der Ansatz durch wiederholtes Aufziehen der Pipette gemischt. Nach 30 min Inkubation auf Eis wird ein Hitzeschockschritt bei 42 °C für 45 sec durchgeführt und wieder 2 min auf Eis inkubiert. Es werden 120-900 μl SOC-Medium zugegeben und der Ansatz wird 45 min bei 37°C unter Agitation inkubiert. Anschließend wird der Ansatz ausplattiert und bei 37°C über Nacht inkubiert.
Expression von Metagenom-Nitrilhydratasen
Die Expression der Konstrukte mit T7-Promotoren erfolgte nach folgendem Protokoll:
50 ml LB_amp100-Medium mit 2 mM Fe-Citrat und jeweils 50 μg/ml Kanamycin & Ampicillin wurde 1%ig mit einer Übernachtkultur angeimpft. Nach Erreichen einer OD₆₀₀ von ca. 0,5 wurde mit 1 mM IPTG (Isopropylthiogalactosid) die Expression der Nitrilhydratasen induziert. Die Ernte der Zellen erfolgte ca. 24 Stunden nach Induktion bei 26°C.
Aktivitätsnachweis mit Benzonitril als Substrat
Die Biotransformation wurde im 10 ml Maßstab durchgeführt mit ca. 100 mg Biofeuchtmasse (OD₆₀₀ = 5) im Kaliumphosphatpuffer (100 mM) pH 7,0. Die Inkubation erfolgte bei 30°C und die Substratkonzentration betrug ca. 5 mM Benzonitril. Die Probennahme erfolgte alle 5 – 10 min über einen Zeitraum von maximal 1 Stunde. Das Probenvolumen betrug 100 μl und die Reaktion wurde durch Zugabe von 10 μl 50%ige Phosphorsäure gestoppt.

Die Konzentrationen von Benzonitril und Benzamid wurden dann mittels HPLC bestimmt:

Säule:	RP18-Säule Phenomenex Hypersil ODS 5μ (mit Vorsäule)
Fließmittel:	10 mM K2HPO4, (pH 2.3)
Flußrate:	1 ml/min
Wellenlänge:	202 nm
Injektionsvolumen:	20 μl
Dauer HPLC	Lauf: 12-15 min

Die Berechnung der Aktivität erfolgte über die Kalkulation von einem μmol Umsatz nach einer Minute, was einem U (Unit entspricht). Spezifische Aktivitäten werden in U pro g BTM oder mg Protein angegeben.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Degenerierte Primerbestandteile aus der Gruppe bestehend aus A-01f : gcsmrsgcstgg (Seq. ID NO. 1) B-01f : ggsctsccscc (Seq. ID NO. 2) B-01r : ggsggsagscc (Seq. ID NO. 3) C-01r : ggncgcwbsgg (Seq. ID NO. 4) A-01f : gcnmrrgcntgg (Seq. ID NO. 5) B-01f : ggnytnccncc (Seq. ID NO. 6) B-01r : ggnggnarncc (Seq. ID NO. 7) C-01r : gwngwrtccca (Seq. ID NO. 8) A-01f : gcntggrynga (Seq. ID NO. 9) B-01f : ggnytsccncc (Seq. ID NO. 10) B-01r : ggnggsarncc (Seq. ID NO. 11) C-01r : swnswrtccca (Seq. ID NO. 12).
Verfahren zur Herstellung von Proteinsequenzen notwendig zum Aufbau der Aktivität einer Nitrilhydratase dergestalt, dass man a) eine DNA-Metagenombibleothek eines Habitats erstellt, b) diese mit mindestens jeweils einem forward(f)- und einem reverse(r)-Primer aufweisend eine degenerierte Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 kontaktiert, c) eine PCR hiermit durchführt, d) aus den erhaltenen Teilsequenzen die Volllängensequenzen der Nukleinsäuren codierend für Proteinsequenzen notwendig zum Aufbau der Aktivität einer Nitrilhydratase generiert und e) diese in einen Gastorganismus kloniert und exprimiert.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man jeweils Primerpaare aus Primern aufweisend die Nukleinsäuresequenzen A-01f und B-01r oder C-01r sowie B-01f und C-01r bei der PCR einsetzt.
Verfahren nach Anspruch 2 und/oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass den degenerierten Nukleinsäuresequenzen solche ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: GCCAAGGTCGTC (Seq. ID NO. 13) GGCCGGTCCTG (Seq. ID NO. 14) TCCTTGTACCAGGTC (Seq. ID NO. 15) GCCCGCC (Seq. ID NO. 16) GGCGCTAATGTTGTT (Seq. ID NO. 17) TGGCCGGTTCTG (Seq. ID NO. 18) CAAATTCTTTATACCAAGTC (Seq. ID NO. 19) CCATATATCGCATTTCAGCT (Seq. ID NO. 20) GGTCGTGGCCAAG (Seq. ID NO. 21) GGCCGGTCCTG (Seq. ID NO. 22) TCCTTGTACCAGGTC (Seq. ID NO. 23) GCGCATTTCGGCG (Seq. ID NO. 24) vorangestellt sind.
Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man Primer ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus GCCAAGGTCGTCgcsmrsgcstgg (Seq. ID NO. 25) GGCCGGTCCTGggsctsccscc (Seq. ID NO. 26) TCCTTGTACCAGGTCggsggsagscc (Seq. ID NO. 27) GCCCGCCggncgcwbsgg (Seq. ID NO. 28) GGCGCTAAAGTTGTTgcnmrrgcntgg (Seq. ID NO. 29) TGGCCGGTTCTGggnytnccncc (Seq. ID NO. 30) CAAATTCTTTATACCAAGTCggnggnarncc (Seq. ID NO. 31) CCATATATCGCATTTCAGCTgwngwrtccca (Seq. ID NO. 32) GGTCGTGGCCAAGgcntggrynga (Seq. ID NO. 33) GGCCGGTCCTGggnytsccncc (Seq. ID NO. 34) TCCTTGTACCAGGTCggnggsarncc (Seq. ID NO. 35) GCGCATTTCGGCGswnswrtccca (Seq. ID NO. 36) einsetzt.
Proteinsequenzen notwendig zum Aufbau der Aktivität einer Nitrilhydratase mit weniger als 100 Homologie auf Aminosäureebene zu derartigen bekannten Proteinsequenzen, wobei die sie codierenden Nukleinsäuresequenzen aus Teilsequenzen generiert werden, die unter stringenten Bedingungen mit den Primern aufweisend die Nukleinsäuresequenzen des Anspruchs 1 ein positives Hybridisierungssignal geben.
Nukleinsäuresequenz codierend für eine Proteinsequenz nach Anspruch 6.
Expressionssystem aufweisend eine oder mehrere Nukleinsäuresequenzen nach Anspruch 7.
Nitrilhydratase aufweisend Proteinsequenzen für α-Untereinheiten und β-Untereinheiten nach Anspruch 6.
Verwendung der Nukleinsäuresequenzen nach Anspruch 7 zur Erzeugung von verbesserten Proteinsequenzen notwendig zum Aufbau der Aktivität einer Nitrilhydratase.
Verwendung der Nitrilhydratasen nach Anspruch 9 zur Herstellung von organischen Säureamiden und Säuren.