JP6384748B2 - 新規(r)−ヒドロキシニトリルリアーゼ - Google Patents
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Description
(1) 配列番号3に示されるアミノ酸配列;
(2) 上記(1)に規定されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠損、置換および/または付加されたアミノ酸配列であり、且つ当該アミノ酸配列を有する(R)−ヒドロキシニトリルリアーゼのヒドロキシニトリルリアーゼ活性が、配列番号3に示されるアミノ酸配列を有する天然型(R)−ヒドロキシニトリルリアーゼと比較して維持されているか或いは高いアミノ酸配列;
(3) 上記(1)に規定されるアミノ酸配列に対して少なくとも30%の相同性を有するアミノ酸配列であり、且つ当該アミノ酸配列を有する(R)−ヒドロキシニトリルリアーゼのヒドロキシニトリルリアーゼ活性が、配列番号3に示されるアミノ酸配列を有する天然型(R)−ヒドロキシニトリルリアーゼと比較して維持されているか或いは高いアミノ酸配列。
(4) 配列番号2に示される塩基配列;
(5) 上記(4)に規定される塩基配列において、1または数個の塩基が欠損、置換および/または付加された塩基配列であり、且つ当該塩基配列によりコードされた(R)−ヒドロキシニトリルリアーゼのヒドロキシニトリルリアーゼ活性が、配列番号2に示される塩基配列によりコードされた天然型(R)−ヒドロキシニトリルリアーゼと比較して維持されているか或いは高い塩基配列;
(6) 上記(4)に規定される塩基配列に対して少なくとも30%の相同性を有する塩基配列であり、且つ当該塩基配列によりコードされた(R)−ヒドロキシニトリルリアーゼのヒドロキシニトリルリアーゼ活性が、配列番号2に示される塩基配列によりコードされた天然型(R)−ヒドロキシニトリルリアーゼと比較して維持されているか或いは高い塩基配列。
上記[8]に記載の形質転換体を培養して培養物を得る工程、および、
上記培養物から(R)−ヒドロキシニトリルリアーゼを精製する工程
を含むことを特徴とする方法。
本発明に係る(R)−ヒドロキシニトリルリアーゼは、上記(1)〜(3)の何れかのものである。
上記(R)−ヒドロキシニトリルリアーゼにおいて、「配列番号3に示すアミノ酸配列」は、ヤンバルトサカヤスデ(Chamberlinius hualienensis)由来の天然型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列である。ヤンバルトサカヤスデは、特に鹿児島県で周期的に異常発生し列車を止めるなどする一方で、駆除しようとするとシアン化水素を含むガスを放出して健康被害を及ぼすなど問題になっている。本発明者らは、ヤンバルトサカヤスデがシアン化水素を産生することに注目し、ヒドロキシニトリルリアーゼを有するのではと考えて実験を進めたところ、本発明に係る(R)−ヒドロキシニトリルリアーゼの単離精製に成功したものである。また、本発明に係る(R)−ヒドロキシニトリルリアーゼは、異常発生する一方で駆除方法が確立していないヤンバルトサカヤスデから単離精製できることから、本発明は、ヤンバルトサカヤスデの処理方法としても価値が高い。
本発明に係る遺伝子は、上記(R)−ヒドロキシニトリルリアーゼをコードするものである。
上記遺伝子(4)は、ヤンバルトサカヤスデ(Chamberlinius hualienensis)から単離精製された天然型(R)−ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子である。よって、上記遺伝子(4)も、ヤンバルトサカヤスデから調製したcDNAを鋳型としたPCRなどにより得てもよい。
本発明の組換えベクターを宿主に形質転換または形質導入することで、形質転換体を作製することができる。当該形質転換体も本発明の範囲に含まれる。
本発明の(R)−ヒドロキシニトリルリアーゼは、上記形質転換体を培養し、得られる培養物から精製することにより製造することができる。
(R)−ヒドロキシニトリルリアーゼは、シアニドドナー存在下でアルデヒドやケトンをシアノヒドリンに変換する合成反応を触媒し、また、その逆反応であるシアノヒドリンの分解反応を触媒する酵素である。
(1) (R)−ヒドロキシニトリルリアーゼの精製
ヤンバルトサカヤスデ(Chamberlinius hualienensis)を、鹿児島県にて、その異常発生が認められた2010年11月、2011年11月および2012年8月に捕獲した。捕獲したヤスデは、ドライアイスを入れた容器中で冷却し、使用するまで−80℃で保管した。図1は、生きているヤンバルトサカヤスデの写真である。
ヒドロキシニトリルリアーゼの酵素活性は、ベンズアルデヒドを基質とし、以下のとおりにして測定した。即ち、400mMクエン酸緩衝液(pH4.2,760μL)に、基質としてベンズアルデヒドの1.25M DMSO溶液(40μL)、適量の酵素液(最大100μL)を混合した。次に1M KCN(100μL)を加えて合成反応を開始し、22℃で5分間反応させた。反応後、反応液100μLを回収し、n−ヘキサン:2−プロパノール=85:15の混合液を加えて激しく撹拌し、4℃、16000gで3分間遠心分離した。有機層(500μL)を回収した。
得られた有機層(5μL)を、下記条件のHPLCで分析した。
カラム: キラルOJ−Hカラム(Daicel社製)
溶離液: n−ヘキサン:2−プロパノール=85:15
流速: 1mL/min
カラムオーブン温度: 30℃
検出: 254nm
保持時間: ベンズアルデヒド − 5.5分
(R)−マンデロニトリル − 12分
(S)−マンデロニトリル − 14分
(1) 分子質量と4次構造の分析
上記実施例1で精製されたR−ChHNLの単量体サブユニットのサイズを、分子量マーカー(Bio−Rad社製)を用いたSDS−PAGEにより分析した。分子量と4次構造は、GEヘルスケア社製のSuperdex 10/300GLを用いたゲルろ過クロマトグラフィにより求めた。詳細は、Dadashipourら,Journal of Biotechnology,153, pp.100−110(2011)(以下、当該文献を「Dadashipourら(2011)と略記する)を参照した。SDS−PAGEの結果を図2(A)に示す。図2(A)中、1は、上から97.4kDa、66.2kDa、45kDa、31kDa、21.5kDaおよび14.4kDaの分子量マーカーのレーンであり、2は精製R−ChHNLのレーンである。
糖鎖の有無は、Pierce Glycoprotein Staining kit(Thermo Scientific社製)を用いて確認した。詳しくは、SDS−PAGEゲルにおいて、グリコプロテインに含まれるcis−ジオールを過ヨウ素酸によりアルデヒドに酸化し、生成したアルデヒド基をシッフ塩基に変換して赤紫色に発色させ、糖鎖の有無を確認した。かかる反応でR−ChHNLの糖鎖の有無を確認した結果を、代表的なグリコプロテインである西洋ワサビペルオキシダーゼの結果と共に図2(B)に示す。図2(B)中、1はR−ChHNLのレーンであり、2は西洋ワサビペルオキシダーゼのレーンである。
R−ChHNLを20mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)に溶解し、紫外可視近赤外分光光度計(島津製作所社製,「UV2600」)で210〜600nmの範囲で測定することにより、補欠分子族を検出した。また、R−ChHNLを、室温、pH7.0で、分光計(Jasco社製,「720 Circular Dichroism Spectrophotometer)により170〜300nmの範囲で分析した。さらに、赤外分光光度計(Waltham社製,「Perkin−Elmer IR Spectrum 100」)を用い、精製酵素の二次構造を推定した。R−ChHNLの紫外・可視・近赤外スペクトル、赤外スペクトル、および円偏光二色性スペクトルを測定した。それぞれの結果を図3(A)〜(C)に示す。
(1) R−ChHNLをコードするcDNAのクローニング:
ヤンバルトサカヤスデを氷温麻酔し、ピンセットを用いてその体節側方突起を集めた。取得された組織をtotal RNA分離用試薬(インビトロゲン社製,「TRIzol Reagent」)に添加し、ディスポーザブルホモジナイザー(Nippi社製,「BioMasher II」)を使ってホモジェナイズした。指示書に基づいてRNAを抽出した。5’/3’−RACEのためのcDNAを、Clontech Laboratories社製のSMART RACE cDNA Amplification KitとSMARTScribe Reverse Transcriptaseを使って合成し、RNase H(タカラバイオ社製)で処理した。
in−gel digestion法(APROライフサイエンス研究所)を用いて若しくは用いずに、エドマン分解法により精製したR−ChHNLのアミノ酸配列を決定した。決定されたアミノ酸配列に基づいて、以下の縮重プライマーを設計した。
APTALDIKf1: 5'-GC(A/C/G/T)CC(A/C/G/T)AC(A/C/G/T)GC(A/C/G/T)TT(A/G)GA(C/T)AT(A/C/T)AA-3'(配列番号5)
APTALDIKf2: 5'-GC(A/C/G/T)CC(A/C/G/T)AC(A/C/G/T)GC(A/C/G/T)CT(A/C/G/T)GA(C/T)AT(A/C/T)AA-3'(配列番号6)
APTALDIKr1: 5'-TT(A/G/T)AT(A/G)TC(C/T)AA(A/C/G/T)GC(A/C/G/T)GT(A/C/G/T)GG(A/C/G/T)GC-3'(配列番号7)
APTALDIKr2: 5'-TT(A/G/T)AT(A/G)TC(A/C/G/T)AG(A/C/G/T)GC(A/C/G/T)GT(A/C/G/T)GG(A/C/G/T)GC-3'(配列番号8)
AAINPIQEf: 5'-GC(A/C/G/T)GC(A/C/G/T)AT(A/C/T)AA(C/T)CC(A/C/G/T)AT(A/C/T)CA(A/G)GA-3'(配列番号9)
ATINPIQEf: 5'-GC(A/C/G/T)AC(A/C/G/T)AT(A/C/T)AA(C/T)CC(A/C/G/T)AT(A/C/T)CA(A/G)GA-3'(配列番号10)
LAINPIQEf1: 5'-TT(A/G)GC(A/C/G/T)AT(A/C/T)AA(C/T)CC(A/C/G/T)AT(A/C/T)CA(A/G)GA-3'(配列番号11)
LAINPIQEf2: 5'-CT(A/C/G/T)GC(A/C/G/T)AT(A/C/T)AA(C/T)CC(A/C/G/T)AT(A/C/T)CA(A/G)GA-3'(配列番号12)
LTINPIQEf1: 5'-TT(A/G)AC(A/C/G/T)AT(A/C/T)AA(C/T)CC(A/C/G/T)AT(A/C/T)CA(A/G)GA-3'(配列番号13)
LTINPIQEf2: 5'-CT(A/C/G/T)AC(A/C/G/T)AT(A/C/T)AA(C/T)CC(A/C/G/T)AT(A/C/T)CA(A/G)GA-3'(配列番号14)
AAINPIQEr: 5'-TC(C/T)TG(A/G/T)AT(A/C/G/T)GG(A/G)TT(A/G/T)AT(A/C/G/T)GC(A/C/G/T)GC-3'(配列番号15)
ATINPIQEr: 5'-TC(C/T)TG(A/G/T)AT(A/C/G/T)GG(A/G)TT(A/G/T)AT(A/C/G/T)GT(A/C/G/T)GC-3'(配列番号16)
LAINPIQEr1: 5'-TC(C/T)TG(A/G/T)AT(A/C/G/T)GG(A/G)TT(A/G/T)AT(A/C/G/T)GC(C/T)AA-3'(配列番号17)
LAINPIQEr2: 5'-TC(C/T)TG(A/G/T)AT(A/C/G/T)GG(A/G)TT(A/G/T)AT(A/C/G/T)GC(A/C/G/T)AG-3'(配列番号18)
LTINPIQEr1: 5'-TC(C/T)TG(A/G/T)AT(A/C/G/T)GG(A/G)TT(A/G/T)AT(A/C/G/T)GT(C/T)AA-3'(配列番号19)
LTINPIQEr2: 5'-TC(C/T)TG(A/G/T)AT(A/C/G/T)GG(A/G)TT(A/G/T)AT(A/C/G/T)GT(A/C/G/T)AG-3'(配列番号20)
NCPETHGCFAFf: 5'-AA(C/T)TG(C/T)CC(A/C/G/T)GA(A/G)AC(A/C/G/T)CA(C/T)GG(A/C/G/T)TG(C/T)TT(C/T)GC(A/C/G/T)TT-3'(配列番号21)
NCPETHGCFAFr: 5'-AA(A/C/G/T)GC(A/G)AA(A/G)CA(A/C/G/T)CC(A/G)TG(A/C/G/T)GT(C/T)TC(A/C/G/T)GG(A/G)CA(A/G)TT-3'(配列番号22)
上記縮重プライマーとポリメラーゼ(Thermo Fisher Scientific社製,「Dream Taq DNA polymerase」,および,Clontec Laboratories製,「Advantage GC2 Polymerase Mix」)を用い、PCRを行った。反応は、94℃で3分間の後、(i)94℃で1分間、(ii)40℃で1分間、(iii)72℃で1分間の(i)〜(iii)のサイクルを70回繰返して行った。次いで、ゲル(Promega社製,「Wizard SV PCR and Gel Clean−Up System」)を使ってPCR産物を精製し、ベクター(Agilent Technologies社製,「pBluescript II SK (+)」)のEco RV認識部位にライゲーションした。DNA配列を、遺伝子解析器(Applied Biosystems社製,「3500Genetic Analyzer」)を使って決定した。得られた配列をアッセンブルし、シーケンスアセンブリソフトウェア(Genetyx社製,「ATGC and Genetyx」)を使って解析した。
得られたDNA配列に基づいて、以下の遺伝子特異的プライマーを設計した。
R-ChHNL-2:5'-GGCATAATGAATCTTGTCGCCGTTTGGAAC-3'(配列番号24)
R-ChHNL-3:5'-TTTGGTAGTGGACCAGCGAGCAGGTTGCAC-3'(配列番号25)
R-ChHNL-4:5'-ATAATCCCTTTAAAGTTCAGGTGCAATTAG-3'(配列番号26)
R-ChHNL-5:5'-ATACCAACACATCAAACTTACCAAGCTTAG-3'(配列番号27)
R-ChHNL-6:5'-ATTATGGCTTACGATTTCGTCGGTGGTCC-3'(配列番号28)
遺伝子特異的プライマーであるChHNL−4およびChHNL−5と、DNAポリメラーゼ(Agilent Technologies社製,「PfuUltra II fusion HS DNA polymerase」)を用い、cDNA全長を増幅した。PCRは、95℃で2分間の後、(i)95℃で20秒間、(ii)40℃で20秒間、(iii)72℃で1分間のサイクルを30回繰返し、最後に72℃で3分間反応させた。反応液を制限酵素(New England Biolabs社製,「Dpn I」)で、37℃で1時間処理した。DNA断片をゲルで精製し、ベクター(Stratagene社製,「pBluescript II SK (+)」)にライゲーションし、上記と同様に配列を決定した。
ChuaHNLstop-XbaI:5'-CGCTCTAGATTAGTAAAAAGCAAAGCAACCGTGGGTTTC-3'(配列番号30)
作製されたプラスミドベクターを、制限酵素SacIを用いて37℃で3〜4時間消化した。陽性の酵母クローンを得るため、EasySelect Pichia Expression Kit(Life technologies社)と、GS115系統のピキア・パストリス(Pichia pastoris)酵母を使用した。Pichiaコンピテント細胞の調製法は、Joan Lin−Cereghinoら,BioTechniques,38,pp.44−48(2005)の方法に従った。形質転換体をヒスチジン添加最少グリセロール培地で培養した後、タンパク質の発現を誘導するために、さらにヒスチジン添加最少メタノール(0.5%)培地4L中、30℃で4日間培養した。
R−ChNHLの基質を、シアノヒドリン合成反応によりスクリーニングした。R−ChNHLの基質を決定するために、酵素試料として強陰イオン交換カラム画分(25μL,表1)を2.5U用い、ブランクとしては、酵素試料の代わりに再蒸留水を用いた。300μmolのクエン酸ナトリウム緩衝液(pH4.2)、酵素試料、50mMのカルボニル化合物および100mMのKCNを混合し(総量:1mL)、25℃で5分間反応させた。結果は、検出波長を254nmとするOJ−Hキラルカラムを用いたHPLCでモニターし、反応生成物を検出することにより活性の有無を決定した。
基質として様々なアルデヒド化合物またはマンデロニトリルのラセミ体を用い、上記と同様の条件で酵素反応を行った。但し、基質としてベンズアルデヒドを用いた場合には、反応条件をpH5.2で且つ22℃、またはpH5.8で且つ35℃とした。基質として様々な濃度のベンズアルデヒドを使い、酵素活性測定はそれぞれ3回行い、その平均値を算出して基質飽和曲線を作成し、Vmax、Kmおよびkcatの値を求めるためHanes−Woolfプロットした。結果を表3に示す。なお、表3中の「S.A.」は比活性であり、相対比活性は、基質としてベンズアルデヒドを用いてpH5.2,22℃で反応させた場合に対する比活性である。また、基質としてマンデロニトリルラセミ体を用いた場合は分解反応になるので、比活性は算出できない。
上記実施例1で得た天然型R−ChHNLまたは上記実施例3で得た組換え型R−ChHNLについて、最終濃度400mMのクエン酸塩緩衝液と基質としてベンズアルデヒドを用い、上記と同様の酵素反応条件により温度とpHに対する安定性を試験した。温度による安定性は、pH7.0の反応液中、0〜70℃の温度範囲で1時間反応させることにより測定した。また、反応温度を20℃に設定し、pHを3〜11に変更して同様に反応を行った。この際、pH3〜8ではクエン酸−リン酸緩衝液を用い、pH8〜11ではグリシン−NaOH緩衝液を用いた。酵素活性は、Dadashipourら(2011)に記載の方法に従って測定した。天然型R−ChHNLの反応pHと比活性および残存活性との関係をそれぞれ図5(A)と図5(B)に示し、反応温度と比活性および残存活性との関係をそれぞれ図6(A)と図6(B)に示す。また、両R−ChHNLの反応温度および反応pHと残存活性との関係をそれぞれ図7(A)と図7(B)に示す。
R−ChHNLについて、活性阻害剤につき実験した。上記と同様の酵素反応条件において、実施例1で得た天然由来R−ChHNLを用い、1mMまたは0.1mMの濃度の被検化合物を反応液に加え、10mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)中、20℃で60分間反応を行った。残存活性を3回測定した。その平均値を表4に示す。
Claims (9)
- 下記(1)〜(3)の何れかのアミノ酸配列を有する(R)−ヒドロキシニトリルリアーゼ。
(1) 配列番号3に示されるアミノ酸配列;
(2) 上記(1)に規定されるアミノ酸配列において、1個以上、20個以下のアミノ酸が欠損、置換および/または付加されたアミノ酸配列であり、且つ当該アミノ酸配列を有する(R)−ヒドロキシニトリルリアーゼのヒドロキシニトリルリアーゼ活性が、配列番号3に示されるアミノ酸配列を有する天然型(R)−ヒドロキシニトリルリアーゼと比較して維持されているアミノ酸配列;
(3) 上記(1)に規定されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ当該アミノ酸配列を有する(R)−ヒドロキシニトリルリアーゼのヒドロキシニトリルリアーゼ活性が、配列番号3に示されるアミノ酸配列を有する天然型(R)−ヒドロキシニトリルリアーゼと比較して維持されているアミノ酸配列。 - 上記(1)〜(3)の何れかのアミノ酸配列を有するサブユニットの二量体である請求項1に記載の(R)−ヒドロキシニトリルリアーゼ。
- キャンベルリニアス属(Chamberlinius)由来のものである請求項1または2に記載の(R)−ヒドロキシニトリルリアーゼ。
- ヤンバルトサカヤスデ(Chamberlinius hualienensis)由来のものである請求項3に記載の(R)−ヒドロキシニトリルリアーゼ。
- 配列番号2に示される塩基配列、または、請求項1に記載の(2)もしくは(3)のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する(R)−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子。
- 配列番号1に示される塩基配列を有する請求項5に記載の(R)−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子。
- 請求項5または6に記載の(R)−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を含むことを特徴とするベクター。
- 請求項7に記載のベクターにより形質転換されたものであることを特徴とする形質転換体。
- (R)−ヒドロキシニトリルリアーゼを製造するための方法であって、
請求項8に記載の形質転換体を培養して培養物を得る工程、および、
上記培養物から(R)−ヒドロキシニトリルリアーゼを精製する工程
を含むことを特徴とする方法。
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