JP6362045B2 - Ｌ−トリプトファンの測定 - Google Patents

Description

本発明は、Ｌ−トリプトファンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、該ポリヌクレオチドが挿入された形質転換細胞、Ｌ−トリプトファンオキシダーゼの製造方法及びＬ−トリプトファンオキシダーゼ、並びに該Ｌ−トリプトファンオキシダーゼを用いたＬ−トリプトファンの測定方法、測定試薬組成物及び測定キットに関する。

Ｌ−トリプトファンは代表的なアミノ酸で、必須アミノ酸の１つである。人体の脳、腸、マスト細胞等にも含まれ、脳内では神経伝達物質としてのセロトニンや神経ホルモンとしてのメラトニンに変換され、また生体内では生体酸化還元酵素の補酵素であるＮＡＤに変換されている。

このように、Ｌ−トリプトファンは重要なアミノ酸であるため、Ｌ−トリプトファンの簡易で正確な定量的測定法が模索されていた。

Ｌ−トリプトファンに作用する酵素としては、担子菌Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｓｐ．由来のＬ−トリプトファン用アミノ酸オキシダーゼが知られている（特許文献１及び非特許文献１）。しかし、該酵素は、Ｌ−フェニルアラニンやＬ−チロシンにも反応性を示すことが記載されている。更に、該酵素を含む培養菌体を得るためには、約１ヶ月程度と長い培養日数が必要であり、加えて該酵素は膜結合型酵素で、精製過程で可溶化が必要であることが記載され、煩雑な製造方法が問題だった。

Ｌ−トリプトファン分析方法として、クロモバクテリウム・ビオラセウム由来の酸化酵素であるＶｉｏＡ及びストレプトマイセス・エスピーＴＡ−Ａ０７２４由来の酸化酵素であるＳｔａＯを使用した分析方法が知られている（特許文献２）。しかし、それらの酵素を使用したＬ−トリプトファン分析方法は、１０分間程度の測定ではＬ−トリプトファン濃度と吸光度との間に直線性が得られず、直線性を得るためには、２０分以上という長い時間が必要だった。更に、安定化剤であるグリセロールを含んだＳｔａＯ酵素液及びＶｉｏＡ酵素液であっても、何れも４０℃、１時間の熱処理で顕著な熱失活が見られ、熱安定性が悪いという問題点があった。

一方、Ｌ−トリプトファンに作用する酸化酵素としては担子菌Ｈｅｂｅｌｏｍａ ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｏｒｕｍ由来や子嚢菌Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ由来等の各種Ｌ−アミノ酸オキシダーゼが知られている（非特許文献２〜４）。しかし、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼは、種々のＬ−アミノ酸に作用するため、種々のアミノ酸が夾雑する試料中のＬ−トリプトファンの特異的測定には使用できなかった。

特開２００１−６９９７４号公報 特開２０１２−１９６２０７号公報

Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４（７），１４８６−１４９３，２０００ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９２（２），７５５−７６７，１９５１ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６５（２８），１７２４６−１７２５１，１９９０ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１５８，２７２−２８３，２０１２

本発明は、効率的な可溶性Ｌ−トリプトファンオキシダーゼの製造方法、並びに熱安定性や基質特異性が高い該酵素を使用して、短時間で正確なＬ−トリプトファン測定が可能な、Ｌ−トリプトファンの測定方法、測定試薬組成物及び測定キットを提供するものである。

そこで、スクリーニングにより単離したポリヌクレオチドを利用することにより、短期間で効率的に製造できる可溶性Ｌ−トリプトファンオキシダーゼの製造方法を見出すと共に、Ｌ−トリプトファンオキシダーゼの熱安定性や基質特異性が高いという知見から、短時間で正確なＬ−トリプトファン測定が可能なことを見出すことで、本発明に至った。

すなわち、本発明は、以下の［１］〜［８］の態様に関する。
［１］以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）からなるポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号２又は６記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号２又は６記載のアミノ酸配列と類似性が少なくとも９０％のアミノ酸配列を有し、Ｌ−トリプトファンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［２］［１］に記載のポリヌクレオチドを保有する組換えベクター。
［３］［１］に記載のポリヌクレオチドを保有する形質転換細胞。
［４］［３］記載の形質転換細胞を培養し、得られた培養物からＬ−トリプトファンオキシダーゼを採取することを特徴とするＬ−トリプトファンオキシダーゼの製造方法。
［５］以下の（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）からなる可溶性Ｌ−トリプトファンオキシダーゼ：
（ｉ）配列番号２又は６記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｉｉ）配列番号２又は６記載のアミノ酸配列と類似性が少なくとも９０％のアミノ酸配列を有し、Ｌ−トリプトファンオキシダーゼ活性を有するタンパク質、
（ｉｉｉ）配列番号２又は６記載のアミノ酸配列において好ましくは多くとも５５個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するＬ−トリプトファンオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
［６］Ｌ−トリプトファンに対する作用性を１００％とした場合に、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンに対する作用性が１％以下である［５］記載のＬ−トリプトファンオキシダーゼ。
［７］［５］又は［６］記載のトリプトファンオキシダーゼを使用するＬ−トリプトファン測定方法。
［８］Ｌ−トリプトファンに対する作用性を１００％とした場合に、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンに対する作用性が１％以下である［７］記載のＬ−トリプトファン測定方法。
［９］［７］又は［８］記載の血中Ｌ−トリプトファン測定方法。
［１０］［５］又は［６］記載のトリプトファンオキシダーゼを含むＬ−トリプトファン測定用試薬組成物。
［１１］Ｌ−トリプトファンに対する作用性を１００％とした場合に、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンに対する作用性が１％以下である［１０］記載のＬ−トリプトファン測定用試薬組成物。
［１２］［１０］又は［１１］記載の血中Ｌ−トリプトファン測定用試薬組成物。
［１３］［５］又は［６］記載のトリプトファンオキシダーゼを含むＬ−トリプトファン測定用キット。
［１４］Ｌ−トリプトファンに対する作用性を１００％とした場合に、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンに対する作用性が１％以下である［１３］記載のＬ−トリプトファン測定用キット。
［１５］［１３］又は［１４］記載の血中Ｌ−トリプトファン測定用キット。

本発明によって、熱安定性や基質特異性の高い可溶性のＬ−トリプトファンオキシダーゼを簡便に製造することができるようになり、酵素、並びに該酵素を含む試薬組成物及び測定キットの製造コストの削減も可能になった。加えて、種々のアミノ酸が夾雑する試料においても、短時間で正確かつ特異的なＬ−トリプトファン測定が可能になった。

各基質への作用性を示す図である。 Ｌ−グルタミン存在／非存在下でのＬ−トリプトファン測定結果を示す図である。 配列番号２〜１１のアミノ酸配列をコードする塩基配列同士のアライメントの前半部分を示す図である。 配列番号２〜１１のアミノ酸配列をコードする塩基配列同士のアライメントの後半部分を示す図である。

本発明のポリヌクレオチドは、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）からなるポリヌクレオチドである。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号２又は６記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号２又は６記載のアミノ酸配列と類似性が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％又は９８％のアミノ酸配列を有し、Ｌ−トリプトファンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号１に示される塩基配列と同一性が少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％の塩基配列を有し、且つＬ−トリプトファンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号１のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＬ−トリプトファンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号２又は６記載のアミノ酸配列において好ましくは多くとも６０個、より好ましくは多くとも５５個、５０個、４０個、３０個、２０個、１０個又は５個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するＬ−トリプトファンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号２又は６記載のアミノ酸配列と同一性が少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％のアミノ酸配列を有し、Ｌ−トリプトファンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
例えば、配列番号３〜５、７〜１１、１６〜１８記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが例示でき、該塩基配列は図３及び図４に示している。配列番号３〜５、７〜１１、１６〜１８記載の配列と類似性が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％又は９８％のアミノ酸配列を有し、Ｌ−トリプトファンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドでも良い。

更に、本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは多くとも６５０アミノ酸、多くとも６３０アミノ酸又は多くとも６００アミノ酸の配列長からなるＬ−トリプトファンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。また、成熟タンパク質である活性酵素のアミノ酸配列において、Ｎ末端から、ＦＡＤ結合モチーフ配列であるＧｌｙ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｇｌｙの最初のＧｌｙまでのアミノ酸数が、好ましくは多くとも１００個、８０個、７０個、６０個又は５０個である、Ｌ−トリプトファンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。

同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸ（ゼネティックス社製）の塩基配列同士又はアミノ酸配列同士のホモロジー解析により算出されたｉｄｅｎｔｉｔｙの値に基づく。

類似性は、ＧＥＮＥＴＹＸ（ゼネティックス社製）のアミノ酸配列同士のホモロジー解析により算出されたＳｉｍｉｌａｒｉｔｙの値に基づく。

本発明において、ハイブリダイズに際しての「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ」の具体的な条件とは、例えば、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム、１０ｍＭ リン酸ナトリウム、１ｍＭ エチレンジアミン四酢酸、ｐＨ７．２）、５×デンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’s）溶液、０．１％ ＳＤＳ、１０％ デキストラン硫酸及び１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡで４２℃インキュベーションした後、フィルターを０．２×ＳＳＣ中４２℃で洗浄することを例示することができる。

本発明において、「ポリヌクレオチド」とは、Ｌ−トリプトファンオキシダーゼをコードする合成ＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、ＲＮＡから合成されたｃＤＮＡ又はそれらを鋳型としてＰＣＲ増幅して得たポリヌクレオチドを含む。

染色体ＤＮＡ又はＲＮＡの由来は特に制限されないが、真菌であるのが好ましく、より好ましくは担子菌又は子嚢菌であり、更に好ましくはハラタケ綱に属する菌由来であり、特に好ましくはＣｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ属、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ属、Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ属、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ属、Ｃｏｒｔｉｎａｒｉｕｓ属又はＰｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ属に属する菌由来であり、Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ ｖｏｌｖａｃｅａ、Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ ｍａｔｓｕｔａｋｅ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ ａｄｕｓｔａ、Ｃｏｒｔｉｎａｒｉｕｓ ｇｌａｕｃｏｐｕｓ又はＰｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃａｒｎｏｓａを例示できる。

前記真菌から染色体ＤＮＡ又はＲＮＡを抽出し、ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを調製することができる。続いて、精製したＬ−トリプトファンオキシダーゼのＮ末端アミノ酸配列及び／又は内部アミノ酸配列の解析データに基づいて該酵素をコードするポリヌクレオチドの取得用プライマーを作成する。又は、図３及び図４に示すアライメントに基づいて複数のオリゴヌクレオチドプローブ又は縮重プライマーを作製する。前記のプローブ又はプライマーを用いてハイブリダイズ、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ等、常法によって前記ライブラリーから、本発明のポリヌクレオチドを取得することができる。

塩基配列の相同性を比較したアライメントに基づく取得方法は、具体的には、前記アライメントの内、同一性の高い部位から内部配列解読用のフォワードプライマー及びリバースプライマーを設計し、前記ライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行う。プライマー設計部位は、好ましくは１５〜４０塩基程度の配列長で同一性の高い部位であって、かつ、フォワードプライマーは、好ましくは増幅側（下流側）が少なくとも２塩基一致する部位で、リバースプライマーは、好ましくは増幅側（上流側）が少なくとも２塩基一致する部位を選択し、適宜混合塩基を使用して設計できる。この部位から設計したプライマーを用いてＰＣＲを行う際、アニーリング温度は低く設定し、４０〜５０℃が好ましく、４０〜４５℃がより好ましい。１段階目で使用したプライマーセットの内側のプライマーセットを用いて２段階目のＰＣＲを行っても良い。プライマーに利用した塩基の位置からＰＣＲ産物のサイズを予想し、該当するＰＣＲ産物を解読する。解読したＰＣＲ産物が配列番号１と少なくとも５０％の同一性、好ましくは少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％の同一性があれば、本発明のポリヌクレオチドの内部配列を取得できている。次に解読した内部配列から、周知の方法で本発明のポリヌクレオチド全長を取得できる。つまり、本発明のＬ−トリプトファンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチドのＯＲＦの開始コドン周辺及び終止コドン周辺を解明するためにプライマーを設計し、該プライマーを用いて、前記ライブラリーを鋳型として５’−ＲＡＣＥ法及び３’−ＲＡＣＥ法を行う。その結果、ＯＲＦの開始コドン周辺及び終止コドン周辺が解明できる。続いて、解明した配列と配列番号２との相同性を比較したアライメントに基づき、配列番号２のＮ末端（１番目のアミノ酸）に相当する、解明した配列のＮ末端を決定して、Ｎ末端をコードする塩基から終止コドンまでのポリヌクレオチドを増幅できるプライマーを設計する。好ましくは該プライマーを用いて、前記ライブラリーを鋳型として本発明のポリヌクレオチドを取得することができる。

本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２記載のアミノ酸配列を用いて、機能未知の公開配列に対して例えばＢＬＡＳＴ（ｂｌａｓｔｐ又はｔｂｌａｓｔｎ）等によるホモロジー検索を行い、類似性が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８２％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％でヒットしたアミノ酸配列をコードする塩基配列から取得することができる。ヒットした公開配列と配列番号２との相同性を比較したアライメントに基づき、配列番号２のＮ末端（１番目のアミノ酸）に相当する、ヒットした配列のＮ末端を決定して、Ｎ末端をコードする塩基から終止コドンまでのポリヌクレオチドを増幅できるプライマーを公開配列から設計する。続いて、該塩基配列の由来株のＤＮＡ又はＲＮＡを鋳型としてＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲにより増幅して得ることができる。更に増幅して得たポリヌクレオチドを用いて、常法により組換えタンパク質を取得し、Ｌ−トリプトファンオキシダーゼ活性を確認することで、Ｌ−トリプトファンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであることが確認できれば良い。ＤＮＡ又はＲＮＡは、公開配列の由来株と同種又は同属の株からも得ることができる。

本発明のポリヌクレオチドは、公知のミューテーション導入法や変異導入ＰＣＲ法等によって改変して作製することができる。また、配列番号２〜１１に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列、例えば図３及び図４に示した塩基配列の情報を基に、周知の化学合成技術により、本発明のポリヌクレオチドを合成することができる。

本発明の組換えベクターは、クローニングベクター又は発現ベクターであり、ベクターは適宜選択し、インサートとして本発明のポリヌクレオチドを含む。インサートとしては、宿主細胞に対応して、コドンの使用頻度を最適化したポリヌクレオチドを導入しても良い。更に、インサートは、宿主が真核細胞の場合、イントロンを含んでいても良い。遺伝子に開始コドンを含まない場合は、開始コドンを付加するか、又はベクター側の開始コドンを利用して、融合タンパク質として発現するベクターを選択しても良い。発現ベクターとしては、原核細胞発現用ベクター又は真核細胞発現用ベクターの何れでも良く、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システム、ｐＣｏｌｄ発現システムなどが例示できる。尚、必要に応じて、シャペロンやリゾチームなどの遺伝子を、本発明のポリヌクレオチドと同一及び／又は別のベクターに導入することも可能である。

本発明の形質転換細胞としては、例えば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、真菌（酵母、アスペルギルス属などの子嚢菌、担子菌等）、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。

本発明の形質転換細胞を培養して得られた培養物からＬ−トリプトファンオキシダーゼを採取することによって、可溶性Ｌ−トリプトファンオキシダーゼを製造することができる。

本発明で使用されるＬ−トリプトファンオキシダーゼ生産菌の培養には、通常の微生物培養用培地が使用でき、炭素源、窒素源、ビタミン類、無機物、その他使用する微生物が必要とする微量栄養素を程よく含有するものであれば、合成培地、天然培地の何れでも使用可能である。炭素源としては、グルコース、スクロース、ラクトース、デキストリン、澱粉、グリセリン、糖蜜などが使用できる。窒素源としては、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機塩類、ＤＬ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸などのアミノ酸類、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカーなどの窒素含有天然物が使用できる。ビタミン類としては、リボフラビン、ピリドキシン、ナイアシン（ニコチン酸）、チアミンなどが使用できる。無機物としては、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第二鉄などが使用できる。更に、タンパク質の発現の調整に必要な化合物を適宜添加しても良い。

本発明のＬ−トリプトファンオキシダーゼを得るための培養は、Ｌ−トリプトファンオキシダーゼの生産に適した培養条件に設定すれば特に限定されないが、培養温度は１０℃から４５℃、且つｐＨ４からｐＨ１０の範囲で行うのが好ましい。培養期間は回分培養であれば、１日から８日以内の範囲が好ましいが、流加培養や連続培養による生産量増大を行うのであれば、生産性が最適と判断される範囲で期間を延ばすことができる。

培養物中からＬ−トリプトファンオキシダーゼを得る方法は、通常のタンパク質の精製方法が使用できる。この方法は、例えば、Ｌ−トリプトファンオキシダーゼ生産菌を培養後、培養液を遠心分離して培養上清液を得る方法、又は培養微生物を得、適当な方法で該培養微生物を破砕及び／又は溶菌処理し、処理液から遠心分離などによって上清液を得る方法である。これらの上清液中に含まれるＬ−トリプトファンオキシダーゼは、限外ろ過、塩析、溶媒沈殿、熱処理、透析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィーなどの適当な精製操作を組み合わせることによって精製できる。

本発明の可溶性Ｌ−トリプトファンオキシダーゼは、好ましくは本発明のポリヌクレオチドにより形質転換した前記形質転換細胞より得られる組換えＬ−トリプトファンオキシダーゼである。

本発明のＬ−トリプトファンオキシダーゼは、下記（１）、（２）、（３）及び（４）であり、好ましくは（５）、（６）又は（７）である。
（１）電子受容体存在下で、Ｌ−トリプトファンを酸化して、インドールピルビン酸、過酸化水素及びアンモニアを生成する反応を触媒する酵素であって、酸素に電子を授受することができる。
（２）補酵素としてフラビンが結合している。フラビンとしては、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）が挙げられる。
（３）下記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）からなるタンパク質である。
（ｉ）配列番号２又は６記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である。
（ｉｉ）配列番号２又は６記載のアミノ酸配列と類似性が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、８８％、９０％、９２％、９５％又は９８％のアミノ酸配列を有し、Ｌ−トリプトファンオキシダーゼ活性を有するタンパク質である。
（ｉｉｉ）配列番号２又は６記載のアミノ酸配列において好ましくは多くとも６０個、より好ましくは多くとも５５個、５０個、４０個、３０個、２０個、１０個又は５個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するＬ−トリプトファンオキシダーゼ活性を有するタンパク質である。
（ｉｖ）配列番号２又は６記載のアミノ酸配列と同一性が少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％のアミノ酸配列を有し、Ｌ−トリプトファンオキシダーゼ活性を有するタンパク質である。
（４）膜非結合型酵素であり、可溶性である。

（５）熱安定性が高く、熱処理前の活性を１００％とした場合、４０℃、１時間処理で好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の活性を保持する。
（６）好ましくは多くとも６５０アミノ酸、多くとも６３０アミノ酸、多くとも６００アミノ酸の配列長からなるＬ−トリプトファンオキシダーゼ活性を有するタンパク質である。より好ましくは、成熟タンパク質のアミノ酸配列の先端にメチオニンから始まる１〜数アミノ酸を付加させた改変酵素である。
（７）成熟タンパク質である活性酵素のアミノ酸配列において、Ｎ末端から、ＦＡＤ結合モチーフ配列であるＧｌｙ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｇｌｙの最初のＧｌｙまでのアミノ酸数が、好ましくは多くとも１００個、８０個、７０個、６０個又は５０個であるタンパク質である。
例えば、配列番号３〜５、７〜１１、１６〜１８記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、並びに該配列と類似性が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％又は９８％のアミノ酸配列を有し、Ｌ−トリプトファンオキシダーゼ活性を有するタンパク質でも良い。

本発明のＬ−トリプトファンオキシダーゼは、Ｌ−トリプトファンに対する作用性を１００％とした場合に、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンに対する作用性が低く、好ましくは３％以下であり、より好ましくは２％以下、更に好ましくは１％以下である。本発明のＬ−トリプトファンオキシダーゼは、Ｌ−トリプトファンに対する基質特異性が高いため、特異的なＬ−トリプトファン測定が可能である。

本発明のＬ−トリプトファンオキシダーゼの酵素活性は、次の方法で測定できる。
（酵素活性測定法）
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）が終濃度３３．３ｍＭ、４−アミノアンチピリンが終濃度０．８３３ｍＭ、フェノール溶液が終濃度１４ｍＭ、西洋わさびペルオキシダーゼが終濃度３．３３ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、Ｌ−トリプトファンが終濃度３３．３ｍＭになるよう石英セルに入れ、恒温セルホルダー付き分光光度計にセットして３７℃で１０分間インキュベートした後、酵素溶液０．１ｍｌを加えて撹拌し（総液量３．０ｍｌ）、５００ｎｍにおける５分間の吸光度（Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）変化（△ＡＢＳ／ｍｉｎ）を測定する。そして、次の式により酵素活性を算出する。尚、式中のｎは酵素の希釈倍率を表す。１分間に１μｍｏｌのＬ−トリプトファンが酸化される酵素活性を１ｕｎｉｔ（Ｕ）と定義する。

本発明のＬ−トリプトファンオキシダーゼを用いて、Ｌ−トリプトファンを効率よく測定することができる。Ｌ−トリプトファンを含む被検試料と本発明のＬ−トリプトファンオキシダーゼとを接触させる工程を含み、過酸化水素を産生させる事などより、被検試料中のＬ−トリプトファンを定量することができる。本発明の測定対象は特に限定されないが、例えば生体試料が例示でき、血液試料の測定に適している。

また、本発明のＬ−トリプトファンオキシダーゼを用いて、Ｌ−トリプトファン測定用試薬組成物を製造することができる。本発明の試薬組成物は、酵素として本発明のＬ−トリプトファンオキシダーゼを含む試薬組成物であれば良い。本組成物中の酵素量は、試料中のＬ−トリプトファン測定ができれば特に限定されないが、１試料当り０．００１から２００Ｕ程度が好ましく、０．０５から５０Ｕ程度がより好ましい。該試薬組成物の製造方法としては、該酵素と他の成分とを混合して製造することができる。例えば、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）若しくは卵白アルブミン、糖類（例えば、トレハロースなど）若しくは糖アルコール類、カルボキシル基含有化合物、アルカリ土類金属化合物、アンモニウム塩、硫酸塩又はタンパク質等から成る群より選ばれる安定化剤、抗酸化剤又は緩衝剤等の当業者に公知の安定化成分を適宜含有させ、該酵素や試薬成分の熱安定性や保存安定性を高めることができる。また、前記安定化剤やその他物質を、反応性向上又は特異性向上の目的で、前記試薬組成物に使用する事もできる。

本発明のＬ−トリプトファンオキシダーゼ又は前記試薬組成物を用いて、Ｌ−トリプトファン測定キットを製造することができる。

本発明の測定方法、測定試薬組成物及び測定キットは、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンへの作用性が低く、試料中の好ましくは２００μＭ以下、より好ましくは１５０μＭ以下、更に好ましくは１００μＭ以下、特に好ましくは８０μＭ以下のＬ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンへの作用性が低い。本発明の測定方法、並びに測定試薬組成物又は測定キットを用いた測定において、Ｌ−トリプトファンに対する作用性を１００％とした場合に、試料中のＬ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンへの作用性は、何れも好ましくは３％以下、より好ましくは２％以下、更に好ましくは１％以下である。加えて、本発明の測定方法、測定試薬組成物及び測定キットは、Ｌ−グルタミンの影響をほとんど受けず、好ましくは１０００μＭ以下、より好ましくは８００μＭ以下、更に好ましくは６００μＭ以下のＬ−グルタミンの影響をほとんど受けない。Ｌ−グルタミン存在下と非存在下とのＬ−トリプトファン測定値の差は、好ましくは１５％以内、より好ましくは１０％以内、更に好ましくは５％以内である。よって、本発明の測定方法、測定試薬組成物及び測定キットを使用すれば、夾雑物を含む試料中のＬ−トリプトファンの特異的測定が可能である。特に、本発明の測定方法、測定試薬組成物及び測定キットは、Ｌ−グルタミン存在下でのＬ−トリプトファンの測定に使用可能で、Ｌ−グルタミンは血中アミノ酸の内、最も高濃度で存在するため、血中のＬ−トリプトファン測定への使用に適している。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。

［実施例１］
（Ｌ−トリプトファンオキシダーゼ（ＴＲＯ）の製造方法）
（１）Ｌ−トリプトファンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチドの取得
土壌から単離したＬ−トリプトファンオキシダーゼを産生する株を培養し、得られた培養物から、Ｌ−トリプトファンオキシダーゼを精製した。
精製酵素のＮ末端及び内部アミノ酸配列を解析した結果、Ｎ末端はＴＤＰＨＱだった。
内部アミノ酸配列から５’−ＲＡＣＥ法及び３’−ＲＡＣＥ法用のプライマーを作成し、該酵素生産株から抽出したＤＮＡを鋳型として、５’−ＲＡＣＥ法及び３’−ＲＡＣＥ法を行い、該酵素をコードするポリヌクレオチドの一部の塩基配列を解明した。
解明した塩基配列より、該酵素をコードするポリヌクレオチドを含むＯＲＦを予測して、開始コドンから終始コドンまでのポリヌクレオチドを取得するプライマーを作成した。該プライマーを用いて、該酵素生産株から抽出したＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行って、ＯＲＦの塩基配列を解明した。
該酵素のＮ末端配列より、成熟タンパク質である酵素をコードする塩基配列を予測し、配列番号１に示した。該酵素のアミノ酸配列を配列番号２に示した。

（２−１）Ｌ−トリプトファンオキシダーゼの組換え微生物による製造
Ｌ−トリプトファンオキシダーゼ産生株から抽出したＲＮＡを鋳型として、下記プライマー１及び２(配列番号１２及び１３)を用いたＲＴ−ＰＣＲにより、インサートを調製した。インサートは、配列番号１記載の塩基配列の上流にａｔｇが付加し、ＮｈｅＩ制限酵素サイトを有し、また下流にＸｈｏＩ制限酵素サイトを有するＤＮＡである。該インサートをｐＥＴ−２１（ａ）＋ベクターに挿入し、Ｌ−トリプトファンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチドが挿入されたベクターｐＥＴ２１-Ｔを得た。該ベクターを、大腸菌ＪＭ１０９に挿入し、増幅、単離した後、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。その結果、配列番号１を含むＤＮＡを保有する形質転換細胞１（組換え大腸菌）を得た。
プライマー１：5’-CTAGCTAGCATG ACCGATCCTCACCAGCCC-3’
プライマー２：5’-CCGCTCGAGTTA TTAAGGGGTTTGCAAGTCCAACTT-3’

該組換え大腸菌を、２日間培養して集菌し、集菌した細胞を５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）中で破砕して遠心することにより、遠心上清（可溶性画分）を回収した。尚、培養は、２０℃で培養開始し、２４時間後に１５℃に変更した後、ＩＰＴＧを添加した。
遠心上清にＬ−トリプトファンオキシダーゼ活性を確認できたことから、可溶性のＬ−トリプトファンオキシダーゼが取得できており、短期間の培養でＬ−トリプトファンオキシダーゼが得られることが分かった。
本製造法により得られたＬ−トリプトファンオキシダーゼは、配列番号１６に記載したアミノ酸配列を有する。
次に、前記上清を４０℃で１時間熱処理した後、遠心して得られた上清を回収し、Ｌ−トリプトファンオキシダーゼサンプルとした。

（２−２）Ｌ−トリプトファンオキシダーゼの組換え微生物による製造
前記２−１で得たベクターｐＥＴ２１-Ｔを鋳型として、下記プライマー３及び４（配列番号１４及び１５）を用いたＰＣＲにより、インサートを調製した。インサートは、配列番号１記載の塩基配列の上流にａｔｇが付加し、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素サイトを有し、また下流にＸｂａＩ制限酵素サイトを有するＤＮＡである。該インサートをｐＣｏｌｄＩＩＩベクターに挿入し、トリプトファンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチドが挿入されたベクターｐＣｏｌｄ−Ｔを得た。該ベクターを、大腸菌ＪＭ１０９に挿入し、増幅、単離した後、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。その結果、配列番号１を含むＤＮＡを保有する形質転換細胞２（組換え大腸菌）を得た。
プライマー３：5’-CCCAAGCTT ATGACCGATCCTCACCAGCCC-3’
プライマー４：5’-CTATCTAGATTA TTAAGGGGTTTGCAAGTCCAACTT-3’

該組換え大腸菌を、１日間培養して集菌し、集菌した細胞を５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）中で破砕して遠心することにより、遠心上清（可溶性画分）を回収した。尚、培養は、３７℃で培養開始し、５．５時間後に１５℃に変更した後、ＩＰＴＧを添加した。
遠心上清にＬ−トリプトファンオキシダーゼ活性を確認できたことから、可溶性のＬ−トリプトファンオキシダーゼが取得できており、短期間の培養でＬ−トリプトファンオキシダーゼが得られることが分かった。
本製造法により得られたＬ−トリプトファンオキシダーゼは、配列番号１７に記載したアミノ酸配列を有する。

［実施例２］
（Ｌ−トリプトファンオキシダーゼの特性）
（１）熱安定性
実施例１（２−１）の熱処理前後の酵素活性を測定したところ、熱処理前のＬ−トリプトファンオキシダーゼ活性を１００％とすると、熱処理後の活性は９０％であり、本発明のＬ−トリプトファンオキシダーゼは高い熱安定性を有することが分かった。

（２）作用性
実施例１（２−１）のＬ−トリプトファンオキシダーゼを用いて、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン又はＬ−チロシンへの作用性を確認した。前記活性測定法において、基質として０、２０、４０、６０及び８０μＭのＬ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン又はＬ−チロシンを使用した。尚、Ｌ−トリプトファンオキシダーゼは何れも０．３７Ｕ使用した。
各基質に対する測定結果（検量線）を図１に示した。８０μＭ Ｌ−トリプトファンに対する活性を１００％として、各基質濃度の相対活性として示した。
各基質に対する検量線の傾きを算出し、Ｌ−トリプトファンに対する値を１００％として、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンの作用性として算出したところ、０〜８０μＭの範囲で各基質への作用性はそれぞれ０．５９％及び０．８６％だった。
以上より、本発明のＬ−トリプトファンオキシダーゼは、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンへの作用性は何れも１％以下と低く、基質特異性の高い酵素であり、Ｌ−トリプトファンの特異的な測定に利用可能であることが分かった。

［実施例３］
（Ｌ−トリプトファンの測定）
実施例１（２−１）のＬ−トリプトファンオキシダーゼを用いて、Ｌ−グルタミン存在下又は非存在下で、Ｌ−トリプトファンを測定した。前記活性測定法において、基質として０、２０、４０、６０及び８０μＭのＬ−トリプトファンを使用し、Ｌ−グルタミン存在下では、更に６００μＭのＬ−グルタミンを添加して測定した。
尚、血中に存在するアミノ酸の内、Ｌ−グルタミンは約６００μＭという最も高濃度で存在することが知られている。

測定結果を図２に示した。Ｌ−グルタミン非存在下の８０μＭ Ｌ−トリプトファンに対する活性を１００％として、各測定値を相対活性として示した。
本発明のＬ−トリプトファンオキシダーゼを用いたＬ−トリプトファンの測定で、Ｌ−グルタミン存在下及び非存在下で、Ｌ−トリプトファンの相対活性にほとんど差は見られなかった。
よって、本発明のＬ−トリプトファンオキシダーゼを用いた測定では、６００μＭ Ｌ−グルタミン存在下であっても、正確なＬ−トリプトファンの測定が可能であることが分かった。更に、５分間という短い測定時間であっても、Ｌ−トリプトファン濃度と相対活性との間に良好な直線性が認められた。
以上より、本発明の測定方法はＬ−グルタミンの影響をほとんど受けず、例えばＬ−グルタミン濃度の高い血液サンプルのように他のアミノ酸が夾雑する試料であっても、迅速に正確なＬ−トリプトファンの測定が可能であると思われる。

［実施例４］
（Ｌ−トリプトファンオキシダーゼの製造方法２）
（１）Ｌ−トリプトファンオキシダーゼの検索
配列番号２記載のアミノ酸配列を用いて、公開配列に対してＢＬＡＳＴ（ｂｌａｓｔｐ）によるホモロジー検索を行い、高い類似性を有する配列を取得した。取得した各配列と配列番号２とを比較することで、成熟タンパク質である活性酵素のアミノ酸配列を決定し、配列番号３〜１１に示した。ＧＥＮＥＴＹＸを用いて、配列番号２記載のアミノ酸配列と各配列のホモロジー解析をした結果、配列番号２記載のアミノ酸配列と配列番号３〜１１との各類似性は、配列番号３及び４が９５％、配列番号５が９３％、配列番号６が９２％、配列番号７〜１０が８８％、配列番号１１が８７％だった。これらの配列を有するタンパク質は、Ｌ−トリプトファンオキシダーゼ活性を有すると推察された。
ＧｅｎｅＤｏｃを用いて、配列番号２〜１１記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列同士のアライメントをとった結果を、図３及び図４に示した。

（２）Ｌ−トリプトファンオキシダーゼの組換え微生物による製造２
（１）の結果を基に、配列番号６記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを用いてＬ−トリプトファンオキシダーゼの組換え製造を行うこととした。
配列番号６記載のアミノ酸配列をコードし、コドンの使用頻度を最適化した塩基配列の上流に開始コドンａｔｇを含むＮｄｅＩを付加させ、下流にＸｈｏＩ制限酵素サイトを付加させたインサートＤＮＡを合成した。該インサートをｐＥＴ−２１（ａ）＋ベクターに挿入し、配列番号６記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが挿入されたベクターを得た。該ベクターを、大腸菌ＪＭ１０９に挿入し、増幅、単離した後、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。その結果、配列番号６記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡを保有する形質転換細胞（組換え大腸菌）を得た。

該組換え大腸菌を、３日間培養して集菌し、集菌した細胞を５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）中で破砕して遠心することにより、遠心上清（可溶性画分）を回収した。尚、培養は、３７℃で培養開始し、３．５時間後に１５℃に変更した後、ＩＰＴＧを添加した。
遠心上清に、Ｌ−トリプトファンオキシダーゼ活性を確認できたことから、可溶性のＬ−トリプトファンオキシダーゼが取得できており、短期間の培養でＬ−トリプトファンオキシダーゼが得られることが分かった。
本製造法により得られたＬ−トリプトファンオキシダーゼは、配列番号１８に記載したアミノ酸配列を有する。

以上より、配列番号６記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドから、Ｌ−トリプトファンオキシダーゼが製造可能なことが分かった。
故に、配列番号３〜５及び７〜１１記載のアミノ酸配列を有するタンパク質も、Ｌ−トリプトファンオキシダーゼ活性を有すると共に、配列番号３〜５及び７〜１１記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドからも、同様にＬ−トリプトファンオキシダーゼが製造可能と推察される。

Claims (15)

1. 以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）からなるポリヌクレオチド：
   （ａ）配列番号１に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド、
   （ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
   （ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列と同一性が少なくとも９０％のアミノ酸配列を有し、Ｌ−トリプトファンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
2. 請求項１に記載のポリヌクレオチドを保有する組換えベクター。
3. 請求項１に記載のポリヌクレオチドを保有する形質転換細胞。
4. 請求項３記載の形質転換細胞を培養し、得られた培養物からＬ−トリプトファンオキシダーゼを採取することを特徴とするＬ−トリプトファンオキシダーゼの製造方法。
5. 以下の（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）からなる可溶性Ｌ−トリプトファンオキシダーゼ：
   （ｉ）配列番号２記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、
   （ｉｉ）配列番号２記載のアミノ酸配列と同一性が少なくとも９０％のアミノ酸配列を有し、Ｌ−トリプトファンオキシダーゼ活性を有するタンパク質、
   （ｉｉｉ）配列番号２記載のアミノ酸配列において好ましくは多くとも５５個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するＬ−トリプトファンオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
6. Ｌ−トリプトファンに対する作用性を１００％とした場合に、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンに対する作用性が１％以下である請求項５記載のＬ−トリプトファンオキシダーゼ。
7. 請求項５又は６記載のトリプトファンオキシダーゼを使用するＬ−トリプトファン測定方法。
8. Ｌ−トリプトファンに対する作用性を１００％とした場合に、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンに対する作用性が１％以下である請求項７記載のＬ−トリプトファン測定方法。
9. 請求項７又は８記載の血中Ｌ−トリプトファン測定方法。
10. 請求項５又は６記載のトリプトファンオキシダーゼを含むＬ−トリプトファン測定用試薬組成物。
11. Ｌ−トリプトファンに対する作用性を１００％とした場合に、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンに対する作用性が１％以下である請求項１０記載のＬ−トリプトファン測定用試薬組成物。
12. 請求項１０又は１１記載の血中Ｌ−トリプトファン測定用試薬組成物。
13. 請求項５又は６記載のトリプトファンオキシダーゼを含むＬ−トリプトファン測定用キット。
14. Ｌ−トリプトファンに対する作用性を１００％とした場合に、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンに対する作用性が１％以下である請求項１３記載のＬ−トリプトファン測定用キット。
15. 請求項１３又は１４記載の血中Ｌ−トリプトファン測定用キット。

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