JP6127496B2 - ジアホラーゼ - Google Patents

Description

本発明はジアホラーゼに関する。詳しくは、本発明はジアホラーゼ活性を有する酵素、それをコードするＤＮＡ、及び当該酵素の生産菌、当該酵素の製造方法、当該酵素を使用した、臨床診断薬、酵素電極、酵素センサなどに関する。

ジアホラーゼ［ＥＣ．１．６．９９．−］は、生体内では電子伝達系において重要な役割を果たしている。
ジアホラーゼは、様々な技術分野において、その生体外での利用が検討され、一部が実用化されている。そのような技術分野としては、有用物質の生産、エネルギー関連物質の生産、測定又は分析、環境保全、医療などが挙げられる。例えば、臨床診断の分野では、ジアホラーゼは、それが還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を基質とするという特性を利用して、種々の体外診断用試薬に使用されている。また、ジアホラーゼは、燃料電池の一種である酵素電池にも使用されている（特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、非特許文献１）。

ジアホラーゼは、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属（非特許文献２）、または、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属（特許文献１、特許文献２)に属する微生物から単離・精製されたものが市販されている。特許文献１および特許文献２で記載のジアホラーゼを生産するバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ・ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）は、２００１年にゲオバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）として再分類された（非特許文献３）。ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のもの、あるいは、それらを改変したものなどが知られており、その遺伝子配列、アミノ酸配列および理化学的特性が調べられている（特許文献２、特許文献３、特許文献８、非特許文献１）。

特開昭６０−１５６３８１ 特許３９５３５７８号 特開２００７−１４３４９３ 特開２００８−０４８７０３ 特開２００８−２８９３９８ 特開２００８−２８９４１９ 特許４７６９４１２号 ＷＯ２０１１／１４８９３８ 特開２００９−１４０７６０ 特許第４８３９５６９号 特開２００７−１２２８１

Ｓｕｇｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｓｅｎｓ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ． ２０１０ Ｏｃｔ １５；２６（２）：４５２−７． Ｅｐｕｂ ２０１０ Ａｕｇ ３． Ｋａｐｌａｎ， Ｎ．Ｏ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ， ｖｏｌ１３２， ｐ９１−９８， １９６９ Ｔ．Ｎ．Ｎａｚｉｎａ．， Ｉｎｔ．Ｊｏｕｒ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏ．５１：４３３−４４６． ２００１ Ｔｏｋｉｔａ ｅｔ ａｌ., ＥＣＳ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ. ２００８；１３(２１)：８９−９７.

本発明は、臨床診断・産業利用における使用により適した、新たなジアホラーゼを提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、本発明者らは日夜検討を重ね、これまでにジアホラーゼを生産することが報告されていない多くの微生物や、ジアホラーゼ活性を有する蛋白質をコードすることが報告されていない多くの遺伝子情報に接してスクリーニングした結果、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｙ４．１ＭＣ１に属する微生物に由来する新たな遺伝子配列がジアホラーゼ活性を有する蛋白質をコードすることを見出した。そして、本発明者等は、当該酵素を単離精製し、その特性を調べた結果、優れた耐熱性、高いＮＡＤＨに対する親和性を備えていることを見出し、更に研究を重ねて、該ジアホラーゼおよびそれに関連する発明を完成させ、特願２０１２−０１１７５５として出願した。

本発明者らは、係る知見を基に、該ジアホラーゼにさらに蛋白質工学的な改変を加えることで、臨床診断・産業利用により適した新たなジアホラーゼを提供できないか検討した。
その過程で、本発明者らは、ジアホラーゼの反応を、ＮＡＤＨなどの基質濃度が高い状態で行おうとすると、酵素反応が阻害されることを見出した。酵素の反応速度論によれば、通常、基質濃度がＫｍ値より高いと、酵素は基質との複合体を形成しやすく効率的に触媒反応を進めることができると考えられているが、この知見はそれに反する意外なものであった。
この特性により、例えば燃料電池において、基質であるＮＡＤＨの添加量を上げることが出来ないため、起電力や寿命などの点で満足のいくものが得られないという問題点が発生する。
そこで、本発明者らは、この新たに見出した課題を解決するために、該ジアホラーゼに蛋白質工学的な改変を加え、ある種の変異型ジアホラーゼが、上記の諸特性に加えて、さらに、ＮＡＤＨなどの基質濃度が高いときの反応阻害が低減した特性を有することを見出し、本発明を完成させた。
代表的な本発明は、以下の通りである。

項１
下記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドからなるジアホラーゼ；
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位したアミノ酸配列からなり、ジアホラーゼ活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、ジアホラーゼ活性を有するポリペプチド。
項２
下記の特性（１）〜（５）を有するジアホラーゼ。
（１）サブユニット分子量： ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で測定した酵素のポリペプチド部分の分子量が約２３．７ｋＤａ
（２）複合体分子量： ゲルろ過で測定した酵素のポリペプチド部分の分子量が約５３．３ｋＤａ
（３）Ｋｍ値： ＮＡＤＨに対するＫｍ値が約０．１ｍＭ以下
（４）温度安定性：７０℃以下で安定
（５）ｐＨ安定性： ｐＨ５．０〜９．０の範囲で安定
項３
下記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドからなる変異型ジアホラーゼである、項１または項２に記載のジアホラーゼ。
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列において、１２２位以外の箇所で、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位したアミノ酸配列からなり、ジアホラーゼ活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、配列番号４とのアラインメントにおいて１２２位のグリシンがアスパラギン酸に改変されていて、且つ、ジアホラーゼ活性を有するポリペプチド。
項４
さらに、下記の（ｄ）または（ｅ）のいずれか１つ以上の特性を有する、項３に記載の変異型ジアホラーゼ。
（ｄ）２０ｍＭ ＮＡＤＨ存在下の比活性を１００％としたとき、８０ｍＭ ＮＡＤＨ存在下で比活性が５０％以上保たれる。
（ｅ）（１）ＤＣＰＩＰをメディエータとして用いた場合、３７℃での活性値を１００％とした時、２５℃の相対活性が７０％以上であるか、または、（２）ナフトキノン誘導体をメディエータとして用いた場合、３７℃での活性値を１００％とした時、２５℃の相対活性が５０％以上である。
項５
さらに、下記の（ｆ）の特性を有する、項３または項４の変異型ジアホラーゼ。
（ｆ）ナフトキノン誘導体をメディエータとして用いた場合、比活性が野生型ジアホラーゼと比較して１．５倍以上である。
項６
以下の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかのＤＮＡ：
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列をからなるＤＮＡ、
（Ｃ）配列番号２に示される塩基配列との相同性が８０％以上である塩基配列からなり、且つ、ジアホラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号２に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、且つジアホラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ｅ）配列番号２に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位されている塩基配列であり、ジアホラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ｆ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位したアミノ酸配列からなり、且つ、ジアホラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
項７
以下の（Ａ）〜（Ｆ）のいずれかのＤＮＡである、項６に記載のＤＮＡ。
（Ａ）配列番号４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（Ｂ）配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｃ）配列番号５の塩基配列との同一性が８０％以上である塩基配列からなり、配列番号５とのアラインメントにおいて３６４位〜３６６位のトリプレットがアスパラギン酸をコードし、且つ、ジアホラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（Ｄ）配列番号５の塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、配列番号５とのアラインメントにおいて３６４位〜３６６位のトリプレットがアスパラギン酸をコードし、且つ、ジアホラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ｅ）配列番号５に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位されている塩基配列であり、配列番号５とのアラインメントにおいて３６４位〜３６６位のトリプレットがアスパラギン酸をコードし、且つ、ジアホラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ｆ）配列番号４のアミノ酸配列において、１２２位以外の箇所で、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位したアミノ酸配列からなり、且つ、ジアホラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
項８
項６または項７に記載のＤＮＡを組み込んだベクター。
項９
項８に記載のベクターを含む形質転換体。
項１０
項９に記載の形質転換体を培養することを含む、項１〜項５のいずれかに記載のジアホラーゼの製造方法。
項１１
項１〜項５のいずれかに記載のジアホラーゼを含むプロダクト。

項Ａ．更に下記の特性（６）を備える、項２に記載のジアホラーゼ。
（６）至適活性ｐＨ： ｐＨ６．７〜８．０
項Ｂ．更に下記の特性（７）を備える、項２または項Ａに記載のジアホラーゼ。
（７）由来： ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に分類される微生物に由来する
項Ｃ．ゲオバチルス属に分類される微生物を培養すること、及び、ジアホラーゼを回収すること、を含む、項２、項Ａまたは項Ｂのいずれかに記載のジアホラーゼの製造方法。

項Ｄ．下記の特性（１）〜（４）を備える変異型ジアホラーゼ。
（１）サブユニット分子量： ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で測定した酵素のポリペプチド部分の分子量が約２３．７ｋＤａ
（２）複合体分子量： ゲルろ過で測定した酵素のポリペプチド部分の分子量が約５５．３ｋＤａ
（３）Ｋｍ値： ＮＡＤＨに対するＫｍ値が約０．３７ｍＭ以下
項Ｅ．更に下記の特性（４）および／または（５）を備える、項Ｄに記載の変異型ジアホラーゼ。
（４）温度安定性： ７０℃以下で安定
（５）ｐＨ安定性： ｐＨ５．０〜９．０の範囲で安定
項Ｆ．更に下記の特性（６）を備える、項Ｄまたは項Ｅに記載の変異型ジアホラーゼ。
（６）至適活性ｐＨ： ｐＨ６．５〜８．０
項Ｇ．更に下記の特性（７）を備える、項Ｄ〜項Ｆのいずれかに記載の変異型ジアホラーゼ。
（７）由来： ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に分類される微生物に由来する
項Ｈ．ゲオバチルス属に分類される微生物を培養すること、及び
ジアホラーゼを回収すること
を含む、項Ｄ〜項Ｇのいずれかに記載の変異型ジアホラーゼの製造方法。

本発明のジアホラーゼは、ジアホラーゼ活性を有し、ＮＡＤＨとの親和性が高い（即ち、ＮＡＤＨに対するＫｍ値が有意に低い）ため、より少ない酵素量で試料中のＮＡＤＨと短時間反応することを可能にする。更に、本発明のジアホラーゼは、熱安定性に優れるため、センサストリップへの固定化を比較的高い温度条件下で実施することができる。加えて、本発明のジアホラーゼは、広い範囲のｐＨ領域に対して安定であるため、幅広い条件下での使用に適している。これらの特性を備えるため、本発明のジアホラーゼは、ＮＡＤＨを含むあらゆる試料（例えば、血液や食品（調味料や飲料等））におけるグルコース濃度を正確に測定することを可能にする。更に本発明のＤＮＡは、本発明のジアホラーゼをコードするため、遺伝子工学的手法を用いて、効率的に本発明のジアホラーゼを製造することを可能にする。

さらに本発明のジアホラーゼは、ＮＡＤＨなどの基質濃度が高くても反応が効率的に進行するため、燃料電池に適用する場合などに、寿命と起電力を両立させることを可能にする。

Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのジアホラーゼ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＡＡＤ２４４３６）とＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｙ４．１ＭＣ１のＮＡＤ(Ｐ)Ｈ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ （ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＹＰ_００３９８９１３１）のアライメント Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｙ４．１ＭＣ１由来変異型ジアホラーゼのポリペプチド配列の特定。（Ｄ）Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのジアホラーゼ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＡＡＤ２４４３６）とＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｙ４．１ＭＣ１の変異型ジアホラーゼのアライメント （Ａ）Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｙ４．１ＭＣ１由来野生型ジアホラーゼの精製酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。(Ｂ) Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｙ４．１ＭＣ１由来野生型ジアホラーゼの精製酵素のゲルろ過の結果を示す。 （Ａ）Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｙ４．１ＭＣ１由来変異型ジアホラーゼの精製酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。(Ｂ) Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｙ４．１ＭＣ１由来変異型ジアホラーゼの精製酵素のゲルろ過の結果を示す。 （Ａ）Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｙ４．１ＭＣ１由来野生型ジアホラーゼの活性に対するｐＨの影響を示す。（Ｂ）Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｙ４．１ＭＣ１由来変異型ジアホラーゼの活性に対するｐＨの影響を示す。 （Ａ）Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｙ４．１ＭＣ１由来野生型ジアホラーゼのｐＨ安定性を測定した結果を示す。（Ｂ）Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｙ４．１ＭＣ１由来変異型ジアホラーゼのｐＨ安定性を測定した結果を示す。 （Ａ）Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｙ４．１ＭＣ１由来野生型ジアホラーゼの温度安定性を測定した結果を示す。（Ｂ）Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｙ４．１ＭＣ１由来変異型ジアホラーゼの温度安定性を測定した結果を示す。 Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ジアホラーゼ（ユニチカ製）の温度安定性を測定した結果を示す。 （Ａ）Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｙ４．１ＭＣ１由来野生型ジアホラーゼの反応速度とＮＡＤＨ濃度との関係を示す。（Ｂ）Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｙ４．１ＭＣ１由来変異型ジアホラーゼの反応速度とＮＡＤＨ濃度との関係を示す。 (Ｂ)Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ジアホラーゼ（ユニチカ製）の反応速度とＮＡＤＨ濃度との関係を示す。 （Ａ）ＡＮＱをメディエータとしたときの、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｙ４．１ＭＣ１由来野生型ジアホラーゼ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｙ４．１ＭＣ１由来変異型ジアホラーゼ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ジアホラーゼ（ユニチカ製）のＮＡＤＨ濃度と比活性の関係を示す。（Ｂ）ＡＮＱをメディエータとしたときの、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｙ４．１ＭＣ１由来野生型ジアホラーゼ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｙ４．１ＭＣ１由来変異型ジアホラーゼ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ジアホラーゼ（ユニチカ製）のＮＡＤＨ濃度と比活性低下の関係を示す。 （Ａ）ＤＣＰＩＰをメディエータとしたときの、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｙ４．１ＭＣ１由来野生型ジアホラーゼ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｙ４．１ＭＣ１由来変異型ジアホラーゼ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ジアホラーゼ（ユニチカ製）の反応温度と相対活性の関係を示す。（Ｂ）ＤＣＰＩＰをメディエータとしたときの、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｙ４．１ＭＣ１由来野生型ジアホラーゼ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｙ４．１ＭＣ１由来変異型ジアホラーゼ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ジアホラーゼ（ユニチカ製）の反応温度と比活性の関係を示す。 （Ａ）ＡＮＱをメディエータとしたときの、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｙ４．１ＭＣ１由来野生型ジアホラーゼ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｙ４．１ＭＣ１由来変異型ジアホラーゼ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ジアホラーゼ（ユニチカ製）の反応温度と相対活性の関係を示す。（Ｂ）ＡＮＱをメディエータとしたときの、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｙ４．１ＭＣ１由来野生型ジアホラーゼ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｙ４．１ＭＣ１由来変異型ジアホラーゼ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ジアホラーゼ（ユニチカ製）の反応温度と比活性の関係を示す。

以下、本発明を詳細に説明する。
１．ジアホラーゼ
１−１．ジアホラーゼ活性
「ジアホラーゼ（Ｄｉａｐｈｏｒａｓｅ）」は、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨをフェリシアン化カリウム、メチレンブルー、２,６-ジクロルインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）、テトラゾリウム塩等の色素で酸化する反応を触媒する活性（即ち、ジアホラーゼ活性）を持つ酵素であり、細菌、酵母等の微生物から哺乳類動物まで広く分布する。このジアホラーゼは、生体内の電子伝達系において重要な役割を果たし、このジアホラーゼによって、ＮＡＤ又はＮＡＤＰ依存性の脱水素酵素類による基質からの脱水素反応により生成されるＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨは、電子受容体で酸化され、電子受容体は還元型となる。

ジアホラーゼ活性は、公知の方法で測定することができる。例えば、ＤＣＰＩＰを電子受容体として用い、反応前後における６００ｎｍの波長における試料の吸光度の変化を指標に活性を測定することができる。また、ＡＮＱを電子受容体として用い、反応前後における５２０ｎｍの波長における試料の吸光度の変化を指標に活性を測定することができる。より具体的には、下記の試薬及び測定条件を用いて活性を測定することができ、本願ではこれらの方法で測定した値を用いる。

１−１−１ ＤＣＰＩＰをもちいたジアホラーゼ活性の測定方法
＜試薬＞
蒸留水
２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５
６．０ｍＭ ＮＡＤＨ水溶液
１．２ｍＭ ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）溶液
酵素希釈溶液 ０．１％牛血清アルブミンを含む２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５
＜手順１＞
ジアホラーゼ溶液を、予め氷冷した上記酵素希釈溶液で０．４〜０．８Ｕ／ｍｌに希釈し、氷冷保存したものを酵素溶液とする。
＜手順２＞
上記蒸留水２．４ｍＬ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液０．３ｍＬ、ＮＡＤＨ水溶液０．１ｍＬを混合し、２５℃にて５分間予備加温したものを反応混液とする。

＜測定条件＞
反応混液２．８ｍＬに、酵素溶液０．１ｍＬ、ＤＣＰＩＰ溶液０．１ｍＬの順番で添加しゆるやかに混和後、水を対照に２５℃に制御された分光光度計（光路長１．０ｃｍ）で、６００ｎｍの吸光度変化を２〜３分間記録し、その後直線部分から（即ち、反応速度が一定になってから）１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤ_ＴＥＳＴ）を測定する。盲検は酵素溶液の代わりにジアホラーゼを溶解する酵素希釈溶液とＤＣＰＩＰ溶液を反応混液に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤ_{ＢＬＡＮＫ}）を測定する。これらの値から次の式に従ってジアホラーゼ活性を求める。ここでジアホラーゼ活性における１単位（Ｕ）とは、上記の測定条件で１分間に６００ｎｍの吸光度を１．０減少させる酵素量である。

活性（Ｕ／ｍＬ）＝
｛−（ΔＯＤ_ＴＥＳＴ−ΔＯＤ_{ＢＬＡＮＫ}）×希釈倍率｝／（１．０×０．１）

なお、式中の１．０は活性定義に基いて定められた６００ｎｍにおける単位吸光度、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）を示す。本書においては、メディエータをＤＣＰＩＰにした場合、酵素活性は上記の測定方法に従って、測定される。後述の実施例６〜１４において、ジアホラーゼ活性の測定は本測定方法にて行った。

１−１−２ ＡＮＱをもちいたジアホラーゼ活性の測定方法
＜試薬＞
蒸留水
１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ８．０
１００ｍＭ ２−ａｍｉｎｏ−１,４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ(ＡＮＱ)溶液（ＤＭＳＯに溶解）
４００ｍＭ ＮＡＤＨを含む１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ８．０
酵素希釈溶液 ０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５
＜手順１＞
ジアホラーゼ溶液を、予め氷冷した上記酵素希釈溶液で０．０１〜０．０２ｍｇ／ｍｌに希釈し、氷冷保存したものを酵素溶液とする。
＜手順２＞
上記１００ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液７９．０ｍＬ、１００ｍＭ ２−ａｍｉｎｏ−１,４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ（本明細書ではＡＮＱとも表記する。）溶液１．０ｍＬ、４００ｍＭ ＮＡＤＨを含む１００ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液２０ｍＬを混合し、１００ｍＬ混合液とする。本手順により、終濃度８０ｍＭ ＮＡＤＨの混合液となる。
ＮＡＤＨ濃度の異なる混合液を作成する場合は、１００ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液と４００ｍＭ ＮＡＤＨを含む１００ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液の混合量を変えることにより、混合液を調整する。例えば、１００ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液８９．０ｍＬ、１００ｍＭ ２−ａｍｉｎｏ−１,４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ（ＡＮＱ）溶液１．０ｍＬ、４００ｍＭ ＮＡＤＨを含む１００ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液１０ｍＬを混合し、１００ｍＬ混合液とし、終濃度４０ｍＭ ＮＡＤＨの混合液となる。あるいは、１００ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液９４．０ｍＬ、１００ｍＭ ２−ａｍｉｎｏ−１,４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ（ＡＮＱ）溶液１．０ｍＬ、４００ｍＭ ＮＡＤＨを含む１００ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液５ｍＬを混合し、１００ｍＬ混合液とし、終濃度２０ｍＭ ＮＡＤＨの混合液となる。
＜手順３＞
手順２で作成した混合液から３．０ｍｌを抜き取り、２５℃にて５分間予備加温したものを反応混液とする。

＜測定条件＞
反応混液３．０ｍＬに、酵素溶液０．１ｍＬを添加しゆるやかに混和後、水を対照に２５℃に制御された分光光度計（光路長１．０ｃｍ）で、５２０ｎｍの吸光度変化を２〜３分間記録し、その後直線部分から（即ち、反応速度が一定になってから）１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤ_ＴＥＳＴ）を測定する。盲検は酵素溶液の代わりにジアホラーゼを溶解する酵素希釈溶液を反応混液に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤ_{ＢＬＡＮＫ}）を測定する。これらの値から次の式に従ってジアホラーゼ活性を求める。ここでジアホラーゼ活性における１単位（Ｕ）とは、上記の測定条件で１分間に５２０ｎｍの吸光度を１．０減少させる酵素量である。

活性（Ｕ／ｍＬ）＝
｛−（ΔＯＤ_ＴＥＳＴ−ΔＯＤ_{ＢＬＡＮＫ}）×３．１×希釈倍率｝／｛０．６８×０．１×１．０｝

なお、式中の３．１は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍＬ）、０．６８は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ^２／マイクロモル）、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。本書においては、メディエータをＡＮＱにした場合、酵素活性は上記の測定方法に従って、測定される。後述の実施例１５において、ジアホラーゼ活性の測定は本測定方法にて行った。

本発明のジアホラーゼは、単離されたジアホラーゼ又は精製されたジアホラーゼであることが好ましい。また、本発明のジアホラーゼは、後述の保存方法に適した溶液中に溶解した状態又は凍結乾燥された状態（例えば、粉末状）で存在してもよい。本発明の酵素（ジアホラーゼ）に関して使用する場合の「単離された」とは、当該酵素以外の成分（例えば、宿主細胞に由来する夾雑タンパク質、他の成分、培養液等）を実質的に含まない）状態をいう。具体的には例えば、本発明の単離された酵素は、夾雑タンパク質の含有量が重量換算で全体の約２０％未満、好ましくは約１０％未満、更に好ましくは約５％未満、より一層好ましくは約１％未満である。一方で、本発明のジアホラーゼは、保存又は酵素活性の測定に適した溶液（例えば、バッファー）中に存在してもよい。

１−２．ポリペプチド
本発明のジアホラーゼは、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドで構成されることが好ましい。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加および／または逆位したアミノ酸配列からなり、ジアホラーゼ活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、ジアホラーゼ活性を有するポリペプチド。
配列番号１で示されるアミノ酸配列とは、実施例５に示される通り、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｙ４．１ＭＣ１に由来するジアホラーゼのアミノ酸配列であり、下記１−３、１−４、１−７〜１−１１の特性を全て満たす。

上記（ｂ）のポリペプチドは、ジアホラーゼ活性を保持する限度で、配列番号１に示されるアミノ酸において、１若しくは数個のアミノ酸配残基が置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位（以下、これらを纏めて「変異」とする場合がある。）されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである。ここで「数個」とは、ジアホラーゼ活性及び好ましくは後述する１−３、１−４、１−７〜１−１０（特に１−３、１−４、１−８および１−９）の特性が維持される限り制限されないが、例えば、全アミノ酸の約２０％未満に相当する数であり、好ましくは約１５％未満に相当する数であり、さらに好ましくは約１０％未満に相当する数であり、より一層好ましくは約５％未満に相当する数であり、最も好ましくは約１％未満に相当する数である。より具体的には、変異されるアミノ酸残基の個数は、例えば、２〜１２７個、好ましくは２〜９６個、より好ましくは２〜６４個、更に好ましくは２〜３２個であり、より更に好ましくは２〜２０個、一層好ましくは２〜１５個、より一層好ましくは２〜１０個、特に好ましくは２〜５個である。

上記（ｃ）のポリペプチドは、ジアホラーゼ活性を保持することを限度で、好ましくは下記１−３、１−４、１−７〜１−１０の特性を保持する限度で、配列番号１に示されるアミノ酸配列と比較した同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。好ましくは、本発明のジアホラーゼが有するアミノ酸配列と配列番号１に示されるアミノ酸配列との同一性は、８５％以上であり、より好ましくは８８％以上、更に好ましくは９０％以上、より更に好ましくは９３％以上、一層好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。このような一定以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドは、後述するような公知の遺伝子工学的手法に基づいて作成することができる。

あるいは、本発明のジアホラーゼは、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドで構成されることが好ましい。
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列において、１２２位以外の箇所で、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位したアミノ酸配列からなり、ジアホラーゼ活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、配列番号４とのアラインメントにおいて１２２位のグリシンがアスパラギン酸に改変されていて、且つ、ジアホラーゼ活性を有するポリペプチド。

配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、配列番号１の１２２位のグリシンをアスパラギン酸に改変したアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、下記１−３〜１−１０の特性を全て満たす。
配列番号１で示されるアミノ酸配列とは、実施例６に示される通り、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｙ４．１ＭＣ１に由来するジアホラーゼのアミノ酸配列である。

上記（ｂ）のポリペプチドは、ジアホラーゼ活性を保持する限度で、配列番号４のアミノ酸配列において、１２２位以外の箇所で、１若しくは数個のアミノ酸配残基が置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位（以下、これらを纏めて「変異」とする場合がある。）されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
ここで「数個」とは、ジアホラーゼ活性及び好ましくは後述する１−３〜１−１１の特性のうち１つ以上が維持される限り制限されないが、例えば、全アミノ酸の約２０％未満に相当する数であり、好ましくは約１５％未満に相当する数であり、さらに好ましくは約１０％未満に相当する数であり、さらに好ましくは約６％未満に相当する数であり、より一層好ましくは約５％未満に相当する数であり、最も好ましくは約１％未満に相当する数である。より具体的には、変異されるアミノ酸残基の個数は、例えば、２〜１２７個、好ましくは２〜９６個、より好ましくは２〜６４個、更に好ましくは２〜３２個であり、より更に好ましくは２〜２０個、一層好ましくは２〜１５個、より一層好ましくは２〜１０個、特に好ましくは２〜５個である。

当該変異がアミノ酸の置換である場合、置換の種類は、特に制限されないが、ジアホラーゼの表現型に顕著な影響を与えないという観点から保存的アミノ酸置換が好ましい。「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基はその側鎖によって塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のように、いくつかのファミリーに分類されている。よって、同一のファミリー内のアミノ酸残基間で置換されることが好ましい。

一又は数個の変異は、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやＤＮＡリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｈａｐｔｅｒ １３ ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）やランダム突然変異導入法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｈａｐｔｅｒ １３ ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）など公知の手法を利用して後述する本発明のジアホラーゼをコードするＤＮＡに変異を導入することによって実施することが可能である。また、紫外線照射など他の方法によってもバリアントジアホラーゼを得ることができる。バリアントジアホラーゼには、ジアホラーゼを保持する微生物の個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じるバリアント（例えば、一塩基多型も含まれる。）

本発明の改変型ジアホラーゼにおける「改変前の野生型ジアホラーゼ」は特に限定されない。たとえば後述の１−１１．に記載される微生物等に由来するもの、あるいは、それらを改変したものを挙げることができる。

また、本発明の改変型ジアホラーゼにおける「１２２位以外の変異箇所」は、特に限定されない。例えば、特許文献８に記載のバチルス・ステアロサーモフィラス由来のジアホラーゼの改変部位である、６５位、９６位、１１７位、１２０位、１３０位、１３３位、１５０位、１６７位および１６８位からなる群より選択される少なくとも１以上の箇所に相当する箇所が挙げられる。

また、ジアホラーゼの活性を維持するという観点からは、ジアホラーゼの活性部位又は基質結合部位に影響を与えない部位において上記変異が存在することが好ましい。

上記（ｃ）のポリペプチドは、ジアホラーゼ活性を保持することを限度で、好ましくは１−３〜１−１１の特性のうち少なくとも１つ以上を保持する限度で、配列番号４のアミノ酸配列と比較した同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、配列番号４とのアラインメントにおいて１２２位のグリシンがアスパラギン酸に改変されているポリペプチドである。
好ましくは、本発明のジアホラーゼが有するアミノ酸配列と配列番号４のアミノ酸配列との同一性は、８５％以上であり、より好ましくは８８％以上、更に好ましくは９０％以上、より更に好ましくは９３％以上、より更に好ましくは９４％以上、一層好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。このような一定以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドは、上述するような公知の遺伝子工学的手法に基づいて作成することができる。

アミノ酸配列の同一性は、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができ、例えば、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、算出することができる。本願ではアミノ酸配列の同一性の計算にこの方法を用いる。

１−３．温度安定性
本明細書において、特定の温度条件の下、適当な緩衝液中（例えばリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５））で５０Ｕ／ｍＬの精製酵素を６０分間処理した後の残存酵素活性が、処理前の酵素活性と比較して実質的な低下が認められない（つまり約８０％以上を維持する）とき、当該酵素は当該温度条件において安定であると判断する。本発明のジアホラーゼは、少なくとも０℃〜７０℃の温度範囲において安定であることが好ましい。
上記条件における処理後の酵素活性が約９０％以上を維持するとき、当該酵素が当該温度条件において安定である、と判断する場合では、本発明のジアホラーゼは、少なくとも０℃〜６０℃の温度範囲において安定であることが好ましい。
あるいは、上記条件において処理時間が１５分間であり、処理後の酵素活性が約９０％以上を維持するとき、当該酵素が当該温度条件において安定である、と判断する場合では、本発明のジアホラーゼは、少なくとも０℃〜７０℃の温度範囲において安定であることが好ましい。

１−４．ＮＡＤＨに対する親和性
本発明のジアホラーゼは、ＮＡＤＨに対する親和性が高いことが好ましい。親和性が高いことにより、試料中のＮＡＤＨの濃度が低い場合であっても、上述する触媒反応を進めることができ、より正確なＮＡＤＨ濃度の測定、より短時間での測定、及びより少ない酵素量での測定に資するからである。ジアホラーゼのＮＡＤＨに対する親和性は、Ｋｍ値によって示される。Ｋｍ値は、いわゆるミカエリス・メンテン式から求められる値であり、具体的には、上記１−１．に示す活性測定方法においてＮＡＤＨの濃度を変化させて各濃度における活性を測定し、ラインウィーバー・バーク・プロットを作成することによって求めることができる。

酵素の反応速度論から判断して、Ｋｍ値が低いほど、酵素は基質に対する親和性が高く、基質濃度が低い場合でも基質との複合体を形成することができ、より早い速度で触媒反応を進めることができる。

項１、項２、項Ａまたは項Ｂに記載の、本発明のジアホラーゼのＮＡＤＨに対するＫｍ値は、１ｍＭ以下であることが好ましく、より好ましくは０．５ｍＭ以下、更に好ましくは０．３ｍＭ以下、より更に好ましくは０．１ｍＭ以下であり、特に好ましくは０．０８ｍＭ以下である。

項３、項４、項５、項Ｄ、項Ｅ、項Ｆまたは項Ｇに記載の、本発明のジアホラーゼのＮＡＤＨに対するＫｍ値は、１．５ｍＭ以下であることが好ましく、より好ましくは１．０ｍＭ以下、更に好ましくは０．８ｍＭ以下、より更に好ましくは０．５ｍＭ以下であり、特に好ましくは０．４ｍＭ以下である。

１−５．高濃度ＮＡＤＨ存在下でのジアホラーゼ酵素反応阻害
本発明の変異型ジアホラーゼは、野生型に比べて、高濃度ＮＡＤＨ存在下でのジアホラーゼ酵素反応阻害が低減されている。本発明の変異型ジアホラーゼは、２０ｍＭのＮＡＤＨ存在下の比活性を１００％としたとき、４０ｍＭのＮＡＤＨ存在下で比活性が９０％以上保たれることが好ましく、および／または、８０ｍＭのＮＡＤＨ存在下で比活性が５０％以上保たれることが好ましい。

阻害の程度は、ＮＡＤＨとメディエータの供役下で酵素反応の進行する速度を測定することで示すことができる。具体的には、上記１−１−２．に示す活性測定方法においてＮＡＤＨの濃度を変化させて各濃度における活性を測定することによって求めることができる。

本発明のジアホラーゼの高濃度ＮＡＤＨ存在下での酵素活性は、４０ｍＭＮＡＤＨで４５０Ｕ／ｍｇ以上であることが好ましく、より好ましくは５００Ｕ／ｍｇ以上、更に好ましくは５５０Ｕ／ｍｇ以上以下、より更に好ましくは５８０Ｕ／ｍｇ以上であり、特に好ましくは６００Ｕ／ｍｇ以上である。

上記のように、基質（ＮＡＤＨ）に対する親和性が良く、かつ、温度安定性が良いことによって、本発明のジアホラーゼを種々のプロダクトに適用するときには、その添加量を他のジアホラーゼと比較してごく少量に抑えることができる。
理論上は、基質に対する親和性が低かったり、また、温度安定性が多少良くなかったりしても、酵素添加量を上げれば所望のジアホラーゼの性能を確保できる可能性はある。しかし、例えば酵素センサのようにチップ上に酵素を乾燥状態で塗布する場合には、添加量を上げるにともなって固形分が増え、少量の血液試料のセンサ上への均一な拡散に支障が出て測定の精密性に悪影響を与える等の問題点が考えられる。あるいは、少量の添加では問題にならなかった不純物が、添加量の上昇と共に測定や反応に悪影響を与える可能性もある。しかし、本発明のジアホラーゼを用いることによってそのような問題点を回避することができる。
さらに、本発明のジアホラーゼを用いることによって、例えば燃料電池において、基質であるＮＡＤＨの添加量を上げることが出来ないため、起電力や寿命などの点で満足のいくものが得られないという問題点を回避することができる。

このような変異型ジアホラーゼとしては、特に限定されないが、項３、項４、項５、項Ｄ、項Ｅ、項Ｆまたは項Ｇに記載のジアホラーゼが好ましいものとして例示できる。

１−６．温度依存性
本発明の変異型ジアホラーゼは、野生型に比べて温度依存性が改善（低減）している。本願において、温度依存性とは、温度変化に伴って酵素活性が変化することを意味する。温度依存性の改善とは酵素活性の変化が少なく、広い範囲で一定の酵素活性を示すことを意味する。
本願請求項において「温度依存性が改善されているか」を判断する方法は以下のとおりである。
（１）３７℃、２４時間処理後における活性値（Ｕ／ｍｌ）を測定し、これをＡとする。
（２）２５℃、２４時間処理後における活性値（Ｕ／ｍｌ）を測定し、これをＢとする。
（３）Ａを１００％としたときのＢの相対値（％）を計算し、「温度依存性」とする。
（４）相対値（％）が大きければ、温度依存性は良いと判断する。よって、相対値（％）が野生型酵素（ＷＴ）＜改変型酵素であれば温度依存性は改善されていると判断する。
なお、上記の計算方法は、Ｂの値がＡを超えない場合間での比較を行う方法である。Ｂの値がＡを越える場合間の比較においては、Ａを１００％としたときのＢの相対値（％）は小さいほど温度依存性がよいと判断し、相対値（％）が野生型酵素（ＷＴ）＞改変型酵素であれば温度依存性は改善されていると判断する。また、「Ｂの値がＡを超えない場合」と「Ｂの値がＡを越える場合」との比較であれば、ＡとＢとの差の絶対値が小さい方が温度依存性がよいと判断し、ＡとＢとの差の絶対値が野生型酵素（ＷＴ）＞改変型酵素であれば温度依存性は改善されていると判断する。

本発明の変異型ジアホラーゼは、ＤＣＰＩＰをメディエータとして用いた場合、３７℃での活性値を１００％とした時、２５℃の相対活性が７０％以上であることが好ましい。または、本発明の変異型ジアホラーゼは、ナフトキノン誘導体をメディエータとして用いた場合、３７℃での活性値を１００％とした時、２５℃の相対活性が５０％以上であることが好ましい。
さらに、本発明の変異型ジアホラーゼは、３０℃での活性値を１００％とした時、２５℃の相対活性が９０％以上であることが好ましい。または、本発明の変異型ジアホラーゼは、ナフトキノン誘導体をメディエータとして用いた場合、３０℃での活性値を１００％とした時、２５℃の相対活性が９０％以上であることが好ましい。すなわち本発明のジアホラーゼは、室温に近い温度範囲である２５〜３０℃において、特に温度依存性が低減されている。

本発明の変異型ジアホラーゼは、さらに好ましくは、ナフトキノン誘導体をメディエータとして用いた場合、２５〜３７℃の範囲において、比活性が野生型ジアホラーゼと比較して１．５倍以上である。

このような変異型ジアホラーゼとしては、特に限定されないが、項３、項４、項５、項Ｄ、項Ｅ、項Ｆまたは項Ｇに記載のジアホラーゼが好ましいものとして例示できる。

１−７．至適活性ｐＨ
項１、項２、項Ａまたは項Ｂに記載の、本発明のジアホラーゼは、実施例に示す通り、ｐＨ７．３（リン酸カリウム緩衝液）において最も高い活性を示すことが好ましい。また、ｐＨ６．５〜８．０（リン酸カリウム緩衝液）、ｐＨ７．５〜８．０（Ｔｒｉｓ ＨＣｌ緩衝液）において、本発明のジアホラーゼは、ｐＨ７．３（リン酸カリウム緩衝液）における活性を１００％として、８０％以上の相対活性を示すことが好ましい。即ち、本発明のジアホラーゼの至適活性ｐＨは６．７〜８．０であり、好ましくはｐＨ７．３である。

項３、項４、項５、項Ｄ、項Ｅ、項Ｆまたは項Ｇに記載の、本発明のジアホラーゼは、実施例に示す通り、ｐＨ７．９（リン酸カリウム緩衝液）において最も高い活性を示すことが好ましい。また、ｐＨ７．５〜８．０（ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液）、ｐＨ６．５〜８．０（リン酸カリウム緩衝液）において、本発明のジアホラーゼは、ｐＨ７．９（リン酸カリウム緩衝液）における活性を１００％として、６０％以上の相対活性を示すことが好ましい。即ち、本発明のジアホラーゼの至適活性ｐＨは６．５〜８．０である。より好ましくは８０％以上の相対活性を示す６．８〜８．０である。さらに好ましくはｐＨ７．９である。

１−８．ｐＨ安定性
本明細書において、特定のｐＨ条件の下、２５Ｕ／ｍＬの酵素を２５℃で１６時間処理した後の残存酵素活性が、処理前の酵素活性と比較して９５％以上である場合に、当該酵素は、当該ｐＨ条件において安定であると判断する。本発明のジアホラーゼは、少なくともｐＨ５．０〜９．０の範囲で安定であることが好ましい。

項１、項２、項Ａまたは項Ｂに記載の、本発明のジアホラーゼは、上記１−３、１−４、１−７および１−８で示される特徴のうち少なくとも１つ以上を備えていることが好ましく、より好ましくはその２つ以上を備え、更に好ましくはその３つの特性を備え、特に好ましくはその全てを備える。本発明のジアホラーゼは、上記１−３、１−４、１−７または１−８の特性を如何なる組合せで備えていても良い。

項３、項４、項５、項Ｄ、項Ｅ、項Ｆまたは項Ｇに記載の、本発明のジアホラーゼは、上記１−３〜１−８で示される特徴のうち少なくとも１つ以上を備えていることが好ましく、より好ましくはその２つ以上を備え、更に好ましくはその３つの特性を更に備え、より更に好ましくはその４つ以上を備え、一層好ましくはその５つ以上を備え、より一層好ましくはその６つ以上を備え、特に好ましくはその全てを備える。本発明のジアホラーゼは、上記１−３〜１−８の特性を如何なる組合せで備えていても良い。
なお、本発明のジアホラーゼのｐＨ安定性や至適活性ｐＨ等その他の特性は、許容可能な変動の幅を有する場合がありうる。

１−９．サブユニットの分子量
本発明のジアホラーゼを構成するポリペプチド部分の分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合に約２３．７ｋＤａであることが好ましい。「約２３．７ｋＤａ」とは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量を測定した際に、当業者が、通常２３．７ｋＤａの位置にバンドがあると判断する範囲を含むことを意味する。「ポリペプチド部分」とは、実質的に糖鎖が結合していない状態のジアホラーゼを意味する。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分子量の測定は、一般的な手法及び装置を用い、市販される分子量マーカーを用いて行うことができる。

１−１０．複合体の分子量
項１、項２、項Ａまたは項Ｂに記載の、本発明のジアホラーゼを構成するポリペプチド部分の分子量は、ゲルろ過で測定した場合に約５３．３ｋＤａであることが好ましい。「約５３．３ｋＤａ」とは、ゲルろ過で分子量を測定した際に、当業者が、通常５３．３ｋＤａの位置に保持時間（Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）があると判断する範囲を含むことを意味する。「ポリペプチド部分」とは、実質的に糖鎖が結合していない状態のジアホラーゼを意味する。

項３、項４、項５、項Ｄ、項Ｅ、項Ｆまたは項Ｇに記載の、本発明のジアホラーゼを構成するポリペプチド部分の分子量は、ゲルろ過で測定した場合に約５５．３ｋＤａであることが好ましい。

ゲルろ過での分子量の測定は、一般的な手法及び装置を用い、市販される分子量マーカーを用いて行うことができる。

項３、項４、項５、項Ｄ、項Ｅ、項Ｆまたは項Ｇに記載の、本発明のジアホラーゼは、好ましくは、分子量約２３，７００ダルトンのサブユニットが２量体を形成する、分子量約５５，３００Ｄａのホモ２量体である。

１−１１．由来
本発明のジアホラーゼは、上述する特性を備える限り、その由来は特に制限されない。本発明のジアホラーゼは、例えば、ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に帰属する微生物であるに由来し得る。ゲオバチルス属に属する微生物としては、特に制限されないが、例えば、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、 Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ ＨＴＡ４２６、 Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、 Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ、 Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｘｙｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ、 Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｅｐｉｄａｍａｎｓ、 Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｏｅｂｉｉ ｓｕｂｓｐ. ｄｅｃａｎｉｃｕｓ、 Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｉｕｓ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｙ４１２ＭＣ６１、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｙ４１２ＭＣ５２、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｇ１１ＭＣ１６、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｙ４．１ＭＣ１、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｚａｌｉｈａｅ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓを例示することができる。より具体的には、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｙ４．１ＭＣ１を例示することができる。Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｙ４．１ＭＣ１はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に保管された菌株であり、所定の手続を経ることによってその分譲を受けることができる。

本発明のジアホラーゼが由来する他の生物としては、例えば、土壌や河川・湖沼などの水系又は海洋に存在する微生物や各種動植物の表面または内部に常在する微生物などを挙げることができる。低温環境、火山などの高温環境、深海などの無酸素・高圧・無光環境、油田など特殊な環境に生育する微生物を単離源としてもよい。

本発明のジアホラーゼには、微生物から直接単離されるジアホラーゼだけでなく、単離されたジアホラーゼを蛋白質工学的な方法によりアミノ酸配列等を改変したものや、遺伝子工学的手法により改変したものも含まれる。例えば、バチラス（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）科に分類される微生物、より具体的にはゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に分類される微生物等から取得した酵素に改変を加えることによって上述する上述する特性を備えるように改変したものであってもよい。更に具体的には、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、 Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ ＨＴＡ４２６、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、 Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ、 Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｘｙｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ、 Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｅｐｉｄａｍａｎｓ、 Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｏｅｂｉｉ ｓｕｂｓｐ. ｄｅｃａｎｉｃｕｓ、 Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｉｕｓ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｙ４１２ＭＣ６１、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｙ４１２ＭＣ５２、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｇ１１ＭＣ１６、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ. Ｙ４．１ＭＣ１、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｚａｌｉｈａｅ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓに帰属する微生物に由来するものを改変したものであっても良い。

２．ジアホラーゼをコードするＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、上記１のジアホラーゼをコードするＤＮＡであり、具体的には以下の（Ａ）〜（Ｆ）のいずれかである。
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列をからなるＤＮＡ；
（Ｃ）配列番号２に示される塩基配列との相同性が８０％以上である塩基配列をからなり、且つ、ジアホラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号２に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを含み、且つジアホラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｅ）配列番号２に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位されている塩基配列であり、ジアホラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｆ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位したアミノ酸配列からなり、且つ、ジアホラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。

本発明のＤＮＡは、それがコードするタンパク質がジアホラーゼ活性を有し、好ましくは上記１−２〜１−４および１−７〜１−１１の特性の少なくとも１つを備える限り、配列番号２に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであっても良い。

あるいは、本発明のＤＮＡは、上記１のジアホラーゼをコードするＤＮＡであり、具体的には以下の（Ａ）〜（Ｆ）のいずれかである。
（Ａ）配列番号４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（Ｂ）配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｃ）配列番号５の塩基配列との同一性が８０％以上である塩基配列からなり、配列番号５とのアラインメントにおいて３６４位〜３６６位のトリプレットがアスパラギン酸をコードし、且つ、ジアホラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（Ｄ）配列番号５の塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、配列番号５とのアラインメントにおいて３６４位〜３６６位のトリプレットがアスパラギン酸をコードし、且つ、ジアホラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ｅ）配列番号５に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位されている塩基配列であり、配列番号５とのアラインメントにおいて３６４位〜３６６位のトリプレットがアスパラギン酸をコードし、且つ、ジアホラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ｆ）配列番号４のアミノ酸配列において、１２２位以外の箇所で、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位したアミノ酸配列からなり、且つ、ジアホラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。

本発明のＤＮＡは、配列番号５とのアラインメントにおいて３６４位〜３６６位のトリプレットがアスパラギン酸をコードし、且つ、それがコードするタンパク質がジアホラーゼ活性を有し、好ましくは上記１−２〜１−１１の特性の少なくとも１つを備える限り、配列番号５に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであっても良い。

本書において「タンパク質をコードするＤＮＡ」とは、それを発現させた場合に当該タンパク質が得られるＤＮＡ、即ち、当該タンパク質のアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するＤＮＡのことをいう。従ってコドンの縮重によって相違するＤＮＡも含まれる。

塩基配列の相同性（同一性）は、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができ、例えば、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、ＳＳＥＡＲＣＨ等のソフトウェアを用いて計算される。ＢＬＡＳＴ検索に一般的に用いられる主な初期条件は、以下の通りである。即ち、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＢＬＡＳＴ ２．１において、プログラムにｂｌａｓｔｎを用い、各種パラメータはデフォルト値に設定して検索を行うことにより、ヌクレオチド配列の相同性の値（％）を算出することができる。本願では塩基配列の同一性の計算にこの方法を用いる。

本書において「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であって、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）やＣｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９８７）を参照して設定することができる。

具体的なストリンジェントな条件としては、例えば、ハイブリダイゼーション液（５０％ホルムアミド、１０×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ， １５ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ， ｐＨ ７．０）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１％ ＳＤＳ、１０％ デキストラン硫酸、１０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５））を用いて約４２℃〜約５０℃でインキュベーションし、その後０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを用いて約６５℃〜約７０℃で洗浄する条件を挙げることができる。更に好ましいストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液として５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ， １５ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ， ｐＨ ７．０）、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１％ＳＤＳ、１０％デキストラン硫酸、１０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５））を用いる条件を挙げることができ、本願における「ストリンジェントは条件」はこの条件を指す。

このような条件でハイブリダイズするＤＮＡの中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれ得るが、それらについては、市販の活性発現ベクターに組み込み、適当な宿主で発現させて、酵素活性を公知の手法で測定することによって容易に取り除くことができる。

上記のＤＮＡの変異箇所数に関し、「数個」とは上記１−２に説明したものと同義である。即ち、「数個」とは、ジアホラーゼ活性及び好ましくは上述の１−３〜１−１１の特性のうちいずれか１つ以上が維持される限りにおいて、例えば、全ＤＮＡの約２０％未満に相当する数であり、好ましくは約１５％未満に相当する数であり、さらに好ましくは約１０％未満に相当する数であり、さらに好ましくは約６％未満に相当する数であり、より一層好ましくは約５％未満に相当する数であり、最も好ましくは約１％未満に相当する数である。より具体的には、変異される塩基の個数は、例えば、２〜３８２個、好ましくは２〜２８６個、より好ましくは２〜２９０個、更に好ましくは２〜９５個であり、より更に好ましくは２〜１９個、一層好ましくは２〜１５個、より一層好ましくは２〜１０個、特に好ましくは２〜５個である。

好適な一実施形態において、本発明のジアホラーゼをコードするＤＮＡは、単離された状態で存在するＤＮＡである。ここで「単離されたＤＮＡ」とは、天然状態において共存するその他の核酸やタンパク質等の成分から分離された状態であることをいう。但し、天然状態において隣接する核酸配列（例えばプロモーター領域の配列やターミネーター配列など）など一部の他の核酸成分を含んでいてもよい。例えば染色体ＤＮＡの場合の「単離された」状態とは、好ましくは、天然状態において共存する他のＤＮＡ成分を実質的に含まない。一方、ｃＤＮＡ分子など遺伝子工学的手法によって調製されるＤＮＡの場合の「単離された」状態では、好ましくは、細胞成分や培養液などを実質的に含まない。同様に、化学合成によって調製されるＤＮＡの場合の「単離された」状態では、好ましくは、ｄＮＴＰなどの前駆体（原材料）や合成過程で使用される化学物質等を実質的に含まない。尚、それと異なる意味を表すことが明らかでない限り、本明細書において単に「ＤＮＡ」と記載した場合には単離された状態のＤＮＡを意味する。本発明のＤＮＡには、上記（Ａ）〜（Ｆ）のＤＮＡと相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）も含まれる。本発明のＤＮＡには、組換ＤＮＡも含まれる。

本発明のＤＮＡは、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報（特に、配列番号２または配列番号５）を基に、化学的ＤＮＡ合成法により製造、取得することができるが、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法などを用いることによって容易に調製することができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｄ Ｅｄ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ （１９８９）；続生化学実験講座「遺伝子研究法Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ」、日本生化学会編（１９８６）等参照）。化学的ＤＮＡ合成法としては、フォスフォアミダイト法による固相合成法を例示することができる。この合成法には自動合成機を利用することができる。

標準的な遺伝子工学的手法としては、具体的には、本発明のジアホラーゼが発現される適当な起源微生物より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ライブラリーから、本発明のＤＮＡ配列（例えば、配列番号２または配列番号５の塩基配列）に特有の適当なプローブや抗体を用いて所望クローンを選択することにより実施できる〔Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ．， ７８， ６６１３ （１９８１）；Ｓｃｉｅｎｃｅ１２２， ７７８ （１９８３）等〕。

ｃＤＮＡライブラリーを調整するための起源微生物は、本発明ジアホラーゼを発現する微生物であれば特に制限されないが、好ましくは、ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に分類される微生物である。起源微生物として好適なゲオバチルス属種は、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｙ４．１ＭＣ１が好ましい。

上記の微生物からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニング等は、いずれも常法に従って実施することができる。本発明のＤＮＡをｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法も、特に制限されず、通常の方法に従うことができる。例えば、ｃＤＮＡによって産生されるポリペプチドに対して、該ポリペプチド特異抗体を使用した免疫的スクリーニングにより対応するｃＤＮＡクローンを選択する方法、目的のヌクレオチド配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等やこれらの組合せ等を適宜選択して実施することができる。

ＤＮＡの取得に際しては、ＰＣＲ法〔Ｓｃｉｅｎｃｅ１３０， １３５０ （１９８５）〕またはその変法によるＤＮＡ若しくはＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。殊に、ライブラリーから全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合には、ＲＡＣＥ法〔Ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ；実験医学、１２（６）， ３５ （１９９４）〕、特に５’−ＲＡＣＥ法〔Ｍ．Ａ． Ｆｒｏｈｍａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ．， ８， ８９９８ （１９８８）〕等の採用が好適である。

ＰＣＲ法の採用に際して使用されるプライマーも配列番号２または配列番号５の塩基配列に基づいて適宜設計し合成することができる。尚、増幅させたＤＮＡ若しくはＲＮＡ断片の単離精製は、前記の通り常法に従うことができ、例えばゲル電気泳動法、ハイブリダイゼーション法等によることができる。

本発明のＤＮＡを使用することにより、本発明のジアホラーゼを容易に大量に、安定して製造することができる。

３．ベクター
本発明のベクターは、上記２．で説明する本発明のジアホラーゼをコードするＤＮＡが組み込まれたベクターである。ここで「ベクター」とは、それに挿入された核酸分子を細胞等のターゲット内へと輸送することができる核酸性分子（キャリアー）であり、適当な宿主細胞内で本発明のＤＮＡを複製可能であり、且つ、その発現が可能である限り、その種類や構造は特に限定されない。即ち、本発明のベクターは発現ベクターである。ベクターの種類は、宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターが選択される。ベクターの具体例としては、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等）等を挙げることができる。また、糸状菌を宿主とする場合に適したベクターや、セルフクローニングに適したベクターを使用することも可能である。

大腸菌を宿主とする場合は、例えば、Ｍ１３ファージ又はその改変体、λファージ又はその改変体、ｐＢＲ３２２又はその改変体（ｐＢ３２５、ｐＡＴ１５３、ｐＵＣ８など）など）を使用することができる。酵母を宿主とする場合は、ｐＹｅｐＳｅｃ１、ｐＭＦａ、ｐＹＥＳ２等を使用することができる。昆虫細胞を宿主とする場合は、例えば、ｐＡｃ、ｐＶＬ等が使用でき、哺乳類細胞を宿主とする場合は、例えば、ｐＣＤＭ８、ｐＭＴ２ＰＣ等を使用することができるが、これらに限定される訳ではない。

発現ベクターは通常、挿入された核酸の発現に必要なプロモーター配列や発現を促進させるエンハンサー配列等を含む。選択マーカーを含む発現ベクターを使用することもできる。かかる発現ベクターを用いた場合には選択マーカーを利用して発現ベクターの導入の有無（及びその程度）を確認することができる。本発明のＤＮＡのベクターへの挿入、選択マーカー遺伝子の挿入（必要な場合）、プロモーターの挿入（必要な場合）等は標準的な組換えＤＮＡ技術（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １．８４， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照することができる、制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用いた周知の方法）を用いて行うことができる。

４．形質転換体
本発明は、宿主細胞に本発明のＤＮＡが導入された形質転換体に関する。本発明のＤＮＡの宿主への導入手段は特に制限されないが、例えば、上記３．で説明するベクターに組み込まれた状態で宿主に導入される。宿主細胞は、本発明のＤＮＡを発現してジアホラーゼを生産することが可能である限り、特に制限されない。
具体的には、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、カビ、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。
宿主が大腸菌の特にＫ−１２由来株が好ましく、ＢＬ２１（ＤＥ３），ＢＢ４，ＢＭ２５．５，ＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳ，ＢＷ３１３，Ｃ−ｌａ，Ｃ６００，ＣＪ２３６，ＤＨ１，ＤＨ５，ＤＨ５α，ＤＨ１０Ｂ，ＤＰ５０ｓｕｐＦ，ＥＤ８６５４，ＥＤ８７６７，ＥＲ１６４７，ＨＢ１０１，ＨＭＳ１７４，ＨＳＴ０２，ＨＳＴ０４ｄａｍ−／ｄｃｍ−，ＨＳＴ０８Ｐｒｅｍｉｕｍ，ＪＭ８３，ＪＭ１０１，ＪＭ１０５，ＪＭ１０６，ＪＭ１０７，ＪＭ１０８，ＪＭ１０９，ＪＭ１１０，Ｋ８０２，Ｋ８０３，ＬＥ３９２，ＭＣ１０６１，ＭＶ１１８４，ＭＶ１１９３，ＮｏｖａＢｌｕｅ，ＲＲ１，ＴＡＰ９０，ＴＧ１，ＴＧ２，ＴＨ２，ＸＬ１−Ｂｌｕｅ，Χ−１７７６，γ−１０８８，γ−１０８９，γ−１０９０などが用いられ、ベクターとしてはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ５７、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＥＴ２２ｂ，ｐＵＣ１８，ｐＨＳＧ３９８，ｐＨＳＧ３９９，ｐＲＩＴ２Ｔ，ｐＵＥＸ１〜３，ｐＫＫ２２３−３，ｐＩＮIII １，ｐＴＴＱ１８，ｐＧＥＭＥＸ−１，ｐＧＨ−Ｌ９，ｐＫＫ２３３−２などが例として挙げられる。
宿主が枯草菌の場合は、バチルス・スブチルス、ブレビバチルス・ブレビス、ブレビバチルス・チョウシネンシスなどが例として挙げられ、ベクターとしてはｐＴＢ５３又はその改変体、ｐＨＹ３００ＰＬＫ又はその改変体、ｐＡＬ１０，ｐＡＬ１２、ｐＨＴ０１、ｐＨＴ０８、ｐＨＴ０９、ｐＨＴ１０、ｐＨＴ４３、ｐＮＹ３２６、ｐＮＣＭＯ２などが挙げられる。
宿主が酵母の場合は、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、キャンデイダ・ウチリス、ピキア・パストリスなどが例として挙げられ、ベクターとしてはｐＡＵＲ１０１、ｐＡＵＲ２２４、ｐＹＥ３２などが挙げられる。
宿主が糸状菌細胞である場合は、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ等を例示することができる。
また、本発明のジアホラーゼが単離されたゲオバチルス属に帰属する微生物を宿主とすることも好ましい。即ち、形質転換体では、通常、外来性のＤＮＡが宿主細胞中に存在するが、ＤＮＡが由来する微生物を宿主とするいわゆるセルフクローニングによって得られる形質転換体も好適な実施形態である。

本発明の形質転換体は、好ましくは、上記３．に示される発現ベクターを用いたトランスフェクション乃至はトランスフォーメーションによって調製される。形質転換は、一過性であっても安定的な形質転換であってもよい。
トランスフェクション、トランスフォーメーションはリン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポーレーション（Ｐｏｔｔｅｒ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８１， ７１６１−７１６５（１９８４））、リポフェクション（Ｆｅｌｇｎｅｒ， Ｐ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８４，７４１３−７４１７（１９８４））、マイクロインジェクション（Ｇｒａｅｓｓｍａｎｎ， Ｍ． ＆ Ｇｒａｅｓｓｍａｎｎ，Ａ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７３，３６６−３７０（１９７６））、Ｈａｎａｈａｎの方法（Ｈａｎａｈａｎ， Ｄ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １６６， ５５７−５８０（１９８３））、酢酸リチウム法（Ｓｃｈｉｅｓｔｌ， Ｒ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅｔ． １６， ３３９−３４６（１９８９））、プロトプラスト−ポリエチレングリコール法（Ｙｅｌｔｏｎ， Ｍ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１， １４７０−１４７４（１９８４））等を利用して実施することができる。

本発明の形質転換体は、本発明のジアホラーゼを産生する能力を有するため、それを用いて効率的に本発明のジアホラーゼを製造することが可能となる。

５．ジアホラーゼの製造方法
本発明のジアホラーゼは、本発明のジアホラーゼの生産能を有する微生物を培養することで製造される。培養に供される微生物は、本発明のジアホラーゼを産生する能力を有する限り特に制限されず、例えば、上記１．に示すゲオバチルス属に帰属する野生型の微生物及び上記４．に示す形質転換体を好適に利用することができる。

具体的なゲオバチルス属に分類される微生物としては、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ ＨＴＡ４２６、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、 Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ、 Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｘｙｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ、 Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｅｐｉｄａｍａｎｓ、 Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｏｅｂｉｉ ｓｕｂｓｐ. ｄｅｃａｎｉｃｕｓ、 Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｉｕｓ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｙ４１２ＭＣ６１、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｙ４１２ＭＣ５２、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｇ１１ＭＣ１６、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ. Ｙ４．１ＭＣ１、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｚａｌｉｈａｅ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓが挙げられる。

上記のゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に分類される微生物は、例えば、ＮＢＲＣ（ＮＩＴＥ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ）（独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジー本部 生物遺伝資源部門）とＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に保管された菌株であり、所定の手続を経ることによってその分譲を受けることができる。

培養方法及び培養条件は、本発明のジアホラーゼが生産される限り特に限定されない。即ち、ジアホラーゼが生産されることを条件として、使用する微生物の生育に適合した方法及び条件を適宜設定できる。以下に、培養条件として、培地、培養温度、及び培養時間を例示する。

培地としては、使用する微生物が生育可能な培地であれば、特に制限されない。例えば、グルコース、シュクロース、ゲンチオビオース、可溶性デンプン、グリセリン、デキストリン、糖蜜、有機酸等の炭素源、更に硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、あるいは、ペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、ふすま、肉エキス等の窒素源、更にカリウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、鉄塩、亜鉛塩等の無機塩を添加したものを用いることができる。使用する微生物の生育を促進するためにビタミン、アミノ酸などを培地に添加してもよい。
市販のＬＢ培地（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｉ Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｍ９培地（Ｍ９ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＮＺＣＹＭ培地（ＮＺＣＹＭ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＮＺＹＭ培地（ＮＺＹＭ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＮＺＭ培地（ＮＺＭ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＳＯＢ培地（ＳＯＢ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＴＢ培地（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ）、２ＸＹＴ培地（２ＸＹＴ Ｍｅｄｉｕｍ）を用いてもよい。

ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に分類される微生物を培養して本発明のジアホラーゼを得る場合は、その微生物の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよい。多くの場合は液体培養で行い、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。ただし、生産性を考えた場合に、固体培養で行った方が有利な場合もある。

培地のｐＨは、培養する微生物の生育に適していればよく、例えば約４〜９、好ましくは約６〜８程度に調整し、培養温度は通常約１０〜５０℃、好ましくは約２５〜３５℃程度で、１〜１５日間、好ましくは３〜７日間程度好気的条件下で培養する。培養法としては例えば振盪培養法、ジャー・ファーメンターによる好気的深部培養法が利用できる。

上記のような条件で培養した後、培養液又は菌体よりジアホラーゼを回収することが好ましい。ジアホラーゼを菌体外に分泌する微生物を用いる場合は、例えば培養上清をろ過、遠心処理等することによって不溶物を除去した後、限外ろ過膜による濃縮、硫安沈殿等の塩析、透析、各種クロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて分離、精製を行うことにより本酵素を得ることができる。ゲオバチルス属に属する微生物が産生するジアホラーゼは基本的に分泌型のタンパク質である。

他方、菌体内から回収する場合には、例えば菌体を加圧処理、超音波処理、機械的手法、又はリゾチーム等の酵素を利用した手法等によって破砕した後、必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤及び界面活性剤を添加してジアホラーゼを可溶化し、水溶液として分離採取し、分離、精製を行うことにより本酵素を得ることができる。ろ過、遠心処理などによって予め培養液から菌体を回収した後、上記一連の工程（菌体の破砕、分離、精製）を行ってもよい。

精製は、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿処理、加熱処理や等電点処理、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等を適宜組み合わせて実施することができる。

カラムクロマトグラフィーを用いる場合は、例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ゲル（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）などによるゲルろ過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ （ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）、オクチルセファロースＣＬ−６Ｂ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）等を用いることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。

なお、培養液からのジアホラーゼ活性を有するタンパク質の採取（抽出、精製など）にあたっては、ジアホラーゼ活性、熱安定性などのうちいずれか１つ以上を指標に行ってもよい。

各精製工程では原則としてジアホラーゼ活性を指標として分画を行い、次のステップへと進む。但し、予備試験などによって、適切な条件を予め設定可能な場合にはこの限りでない。

本発明の野生型ジアホラーゼを精製標品とする場合は、例えば比活性の下限が１０００（Ｕ／ｍｇ）の状態に精製することが好ましい。さらに好ましい比活性の下限は２０００（Ｕ／ｍｇ）であり、さらに好ましい比活性の下限は２２００（Ｕ／ｍｇ）であり、さらに好ましい比活性の下限は２４００（Ｕ／ｍｇ）である。また、比活性の上限は３０００（Ｕ／ｍｇ）の状態に精製することが好ましい。さらに好ましい比活性の上限は２８００（Ｕ／ｍｇ）であり、さらに好ましい比活性の上限は２６００（Ｕ／ｍｇ）である。また、最終的な形態は液体状であっても固体状（粉体状を含む）であってもよい。
本発明の変異型ジアホラーゼを精製標品とする場合は、例えば比活性の下限が１０００（Ｕ／ｍｇ）の状態に精製することが好ましい。さらに好ましい比活性の下限は１２００（Ｕ／ｍｇ）である。また、比活性の上限は３０００（Ｕ／ｍｇ）の状態に精製することが好ましい。さらに好ましい比活性の上限は２０００（Ｕ／ｍｇ）であり、さらに好ましい比活性の上限は１４００（Ｕ／ｍｇ）である。また、最終的な形態は液体状であっても固体状（粉体状を含む）であってもよい。
なお、本書において「比活性」という用語を特に断りなく用いる場合は、１−１−１の測定条件にてＤＣＰＩＰをメディエータとした時の比活性を指すものとする。また、「比活性」は、タンパク質当たりの活性を意味するが、溶液においてはＡ２８０の値をタンパク質濃度とみなして相対比較を行ってもよい。

組換えタンパク質として本酵素を得ることにすれば種々の修飾が可能である。例えば、本酵素をコードするＤＮＡと他の適当なＤＮＡとを同じベクターに挿入し、当該ベクターを用いて組換えタンパク質の生産を行えば、任意のペプチドないしタンパク質が連結された組換えタンパク質からなる本酵素を得ることができる。また、糖鎖及び／又は脂質の付加や、あるいはＮ末端若しくはＣ末端のプロセッシングが生ずるような修飾を施してもよい。以上のような修飾により、組換えタンパク質の抽出、精製の簡便化、又は生物学的機能の付加等が可能である。

６．本発明のジアホラーゼの用途
本発明のジアホラーゼは、種々のプロダクトに適用できる。
本明細書において「プロダクト」とは、使用者が或る用途を実行する目的で用いる１セットのうち一部または全部を構成する製品であって、本発明のジアホラーゼを含むものを意味する。

本発明のプロダクトは、種々の用途に適用することができ、その用途は特に限定されるものではないが、典型的には以下の２つの原理のうちいずれかを利用するものが例示できる。
（ａ）ジアホラーゼによりＮＡＤＨなどの基質を測定すること。
（ｂ）ジアホラーゼによる酵素反応により電流を発生させること。

上記の（ａ）の原理を用いるものとしては、体外診断の用途（例えば種々の生体成分の測定）が挙げられる。これらの生体成分測定方法は既に当該技術分野において確立されている。よって、公知の方法に従い、本発明のジアホラーゼを用いて、各種試料中の生体成分の量又は濃度を測定することができる。
本発明のジアホラーゼを用いて生体成分の濃度又は量を測定する限り、その態様は特に制限されないが、例えば、グルコース、ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、中性脂肪（ＴＧ）、胆汁酸および総分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）などの生体成分等を測定するための試薬、キット、センサなど種々の形態が例示できる。

ＬＤＨを測定する場合は、ＬＤＨ反応により生じたＮＡＤＨが、ジアホラーゼを介して、ニトロテトラゾリウムブルーなどを還元させ自身はＮＡＤに戻りホルマザン色素を生成させるので、これを比色定量することによりＬＤＨの活性値を求めることができる。
胆汁酸を測定する場合においても、３−α−ヒドロキシステロイド脱水素酵素が胆汁酸を基質として反応が進みＮＡＤＨが発生するので、これを上記と同様の方法により比色定量することで胆汁酸の濃度を求めることができる。
ＢＣＡＡを測定する場合においても、ロイシンデヒドロゲナーゼがＢＣＡＡを基質として反応が進みＮＡＤＨが発生するので、これを上記と同様の方法により比色定量することでＢＣＡＡの濃度を求めることができる。

ＣＫを測定する場合は、ＣＫ反応においてはＮＡＤＨを直接生じないので、ＣＫ反応で発生したＡＴＰを、予め試薬に添加したグルコースと共にグルコキナーゼと反応させてグルコース６リン酸を生じさせ、さらに、グルコース６リン酸を、予め試薬に添加したＮＡＤと共にグルコース６リン酸デヒドロゲナーゼと反応させてＮＡＤＨを生じさせる、いわゆる共役反応を設計することにより、ジアホラーゼによるＣＫ活性値の定量が可能になる。
ＴＧを測定する場合は、ＴＧを基質とするリポプロテインリパーゼ、および、共役酵素としてグリセロールデヒドロゲナーゼを用いてＮＡＤＨを生じさせることにより、ジアホラーゼによるＴＧ濃度の定量が可能になる。
このような共役反応を適宜設計することにより、上記以外の生体成分の濃度又は量を測定することも可能である。

グルコースを測定する場合は、グルコースデヒドロゲナーゼ反応により生じたＮＡＤＨが、ジアホラーゼを介して、ＤＣＰＩＰなどの電子受容体を還元させて自身はＮＡＤに戻り、ＤＣＰＩＰの構造が変化することによって生じる吸光度の差を比色定量することにより、グルコースの濃度を求めることができる。より具体的には、上記１−１．に示す方法に従って、実施することができる。
グルコースを含有する試料は、特に制限されないが、例えば、血液、飲料、食品等を挙げることができる。

後述するセンサの形態でのグルコース濃度の測定は、例えば、以下のようにして実施することができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエータとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明のジアホラーゼなどを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。

［グルコースアッセイキット］
本発明のプロダクトにおけるキットの形態を、グルコースアッセイキットを事例に説明する。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明のジアホラーゼを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明のジアホラーゼに加えて、ＮＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ、アッセイに必要な緩衝液、メディエータ、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明のジアホラーゼは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。

［グルコースセンサ］
本発明のプロダクトにおけるセンサの形態を、グルコースセンサを事例に説明する。本発明のグルコースセンサにおいて、電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエータとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。本発明のジアホラーゼは、熱安定性に優れるため、比較的高温度条件下で固定化を実施することができる。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のジアホラーゼをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。

グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエータとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明のジアホラーゼを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。

上記の（ｂ）の原理を用いるものとしては、酵素電極（固定化電極であっても良い）、酵素センサ、燃料電池、さらには一つまたは複数の燃料電池を有する電子機器など種々の形態が例示できる。

［燃料電池］
グルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼを用いた、グルコースの酸化反応により電子を取り出す燃料電池は既に当該技術分野において確立されている。よって、公知の方法に従い、本発明のジアホラーゼを用いて、燃料電池を作製し稼動させることができる。
本発明のジアホラーゼを用いて燃料電池を作製し稼動させる限り、その態様は特に制限されないが、例えば、以下のような手段により電池として稼動させることができる。まず、本発明のジアホラーゼをバイオ燃料電池の負極において、グルコースデヒドロゲナーゼ、オスミウム錯体などの電子メディエータなどとともに固定化し、一方、正極において、ビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）、ラッカーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼなどから選択される酸化還元酵素と、ヘキサシアノ鉄酸イオンなどのメディエータを固定化する。さらに、負極と正極とを電子伝導性を持たずプロトンのみ伝導する電解質層を介して対向した構造を構築し、負極では、燃料として供給されたグルコースを酵素により分解し電子を取り出すとともにプロトン（Ｈ＋）を発生させ、正極では、負極から電解質層を通って輸送されたプロトンと負極から外部回路を通って送られた電子と例えば空気中の酸素とにより水を生成させる。
グルコースを含有する試料は、特に制限されないが、例えば、血液、飲料、食品等を挙げることができる。

［燃料電池を有する電子機器など］
本発明のジアホラーゼを用いた燃料電池は電力が必要なものであれば何にでも用いることができ、また、大きさも問わない。具体的には、この燃料電池は、例えば、電子機器、移動体（自動車、二輪車、航空機、ロケット、宇宙船など）、動力装置、建設機械、工作機械、発電システム、コージェネレーションシステムなどに用いることができる。
電子機器は、どのようなものであってもよく、例えば、携帯型のものであっても、据え置き型のものであっても良い。例えば、携帯電話、モバイル機器、ロボット、パーソナルコンピュータ（デスクトップ型、ノート型の双方を含む）、ゲーム機器、カメラ一体型ＶＴＲ（ビデオテープレコーダ）、車載機器、家庭電気製品、工業製品などが挙げられる。モバイル機器は、携帯情報端末機（ＰＤＡ）などが例示できる。
燃料電池の出力、大きさ、形状、燃料の種類などは、共役反応を含めた電池の設計性能や、用途などによって適宜決めることができる。

［酵素電極（酵素固定化電極）］
上記の燃料電池の例において、例えば、ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）とグルタルアルデヒド（ＧＡ）とからなる組成からなる固定化剤を用いて、本発明のジアホラーゼ等を正極および負極に固定化することができる。このようにして得られる酵素電極（酵素固定化電極）もまた、既に当該技術分野において確立されている。よって、公知の方法に従い、本発明のジアホラーゼを用いて、酵素電極（酵素固定化電極）を作製し稼動させることができる。

［酵素センサ］
上記で得られた酵素電極（酵素固定化電極）を用いて、グルコースを測定するための酵素センサ（グルコースセンサ）を作製することもまた、既に当該技術分野において確立されている。よって、公知の方法に従い、本発明のジアホラーゼを用いて、酵素センサ（グルコースセンサ）を作製し稼動させることができる。

本発明のジアホラーゼを、センサ、電極、燃料電池などに用いる場合、メディエータとの相性が重要となる。本発明のジアホラーゼに適用できるメディエータは特に限定されるものではないが、ジアホラーゼとメディエータの関係が調べられている。例えば、２−アミノ−１，４−ナフトキノン（ＡＮＱ）、２−アミノ−３−メチル−１，４−ナフトキノン（ＡＭＮＱ）、２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノン（ＡＣＮＱ）、２，３−ジアミノ−１，４−ナフトキノン、４−アミノ−１，２−ナフトキノン、２−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン、２−メチル−３−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン、ビタミンＫ１（２−ｍｅｔｈｙｌ−３−ｐｈｙｔｙ１，４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ）、ビタミンＫ２（２−ｆａｒｎｅｓｙｌ−３−ｍｅｔｈｙｌ−１，４−ｎａｐｈｔｏｑｕｉｎｏｎｅ）、ビタミンＫ３（２−ｍｅｔｈｙ １，４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ）、などをメディエータとして用いることができる。また、キノン骨格を有する化合物としては、例えば、ａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅ−１−ｓｕｌｆｏｎａｔｅ、ａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅ−２−ｓｕｌｆｏｎａｔｅなどのようなアントラキノン骨格を有する化合物やその誘導体を用いることもできる。特に、ナフトキノン骨格を有する分子の誘導体はメディエータとして安価で安全性がある（特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、非特許文献１、非特許文献４）。よって、ナフトキノン骨格を有するメディエータに反応性が高いことが好ましい。

以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。

実施例１ 相同性タンパク質の検索
Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのジアホラーゼのアミノ酸配列（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＡＡＤ２４４３６）（配列番号３）を全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のデータベースより取得した。取得した２１１アミノ酸残基を全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のｐｒｏｔｅｉｎ ｂｌａｓｔのアルゴリズムｂｌａｓｔｐにより検索した。その結果、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのジアホラーゼのアミノ酸配列（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＡＡＤ２４４３６）とアミノ酸配列相同性をもつタンパク質を同定した。
次に、ｂｌａｓｔｐ の検索結果においてＩｄｅｎｔｉｔｉｅｓ ＝ １２８／２１１ （６１％）以上の相同性を持つアミノ酸配列は除外した。次に、Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ ＝ １２６／２１１ （６０％）以下の相同性であり、好熱菌由来のアミノ酸配列を同定した。その結果、Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ ＝ １２６／２１１ （６０％）であるＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｙ４．１ＭＣ１のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ （ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＹＰ＿００３９８９１３１）（配列番号１）を見出した。アライメント比較をＥｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのホームページにて利用できるＣｌｕｓｔａｌＷ２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２／）にて行い、アミノ酸配列の相違点を明らかにした（図１）。

実施例２ 全長タンパク質をコードする遺伝子の取得
実施例１において同定したＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｙ４．１ＭＣ１のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ （ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＹＰ＿００３９８９１３１）がジアホラーゼ活性を持つポリペプチドであることを確認する必要がある。よって、２１１アミノ残基を元に、２１１アミノ酸残基をコードする６３６塩基の合成遺伝子を設計した（配列番号２）。また、大腸菌にて酵素タンパク質を生産させやすくするため、あらかじめリボゾーム結合配列であるシャイン−ダルガルノ配列（Ｓｈｉｎｅ‐Ｄａｌｇａｒｎｏ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を開始メチオニンの上流に付加した合成遺伝子を設計した。合成遺伝子は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社により合成した。ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社により受領した合成遺伝子はクローニングベクター用プラスミドであるｐＵＣ５７に挿入されていた。

実施例３ 形質転換体の取得
実施例２において取得した合成遺伝子はプラスミドであるｐＵＣ５７のＬａｃＺプロモーター下流に挿入されていた。そこで、合成遺伝子が挿入されていたプラスミドをそのまま発現ベクターとして用いることとし、これを組換え発現プラスミドｐＵＣ−ＤＩ−１と命名した。ｐＵＣ−ＤＩ−１を用いて、エシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡製）を形質転換し、ＳＯＣ培地中で１ｈｒ、３７℃で前培養後、ＬＢ−ａｍｐ寒天培地に展開し、コロニーである該形質転換体を取得した。得られた形質転換体を、エシェリヒア・コリーＤＨ５α（ｐＵＣ−ＤＩ−１）と命名した。

実施例４ 変異の導入および形質転換体の取得
（１）変異の導入
実施例１と実施例２において同定したＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｙ４．１ＭＣ１の２１１アミノ酸残基のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅに変異を導入した。変異部位は公知情報（非特許文献１）をもとに決定した。具体的には、１２２番目のアミノ酸であるグリシンをアスパラギン酸に置換した（配列番号４）（図２）。このようにして設計した変異型ポリペプチドである、２１１アミノ酸残基のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅがジアホラーゼ活性を持つポリペプチドであることを確認するために、１２２番目のアミノ酸であるグリシンをアスパラギン酸に置換した２１１アミノ酸残基をコードする６３６塩基の合成遺伝子を設計した（配列番号５）。合成遺伝子の開始メチオニンの上流には、大腸菌にて酵素タンパク質を生産させやすくするため、あらかじめリボゾーム結合配列であるシャイン−ダルガルノ配列（Ｓｈｉｎｅ‐Ｄａｌｇａｒｎｏ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を付加した。合成遺伝子の作製は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に委託した。ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社より受領した合成遺伝子はクローニングベクター用プラスミドであるｐＵＣ５７に挿入されていた。

（２）形質転換体の取得
取得した変異型ポリペプチドの合成遺伝子はプラスミドであるｐＵＣ５７のＬａｃＺプロモーター下流に挿入されていた。そこで、合成遺伝子が挿入されていたプラスミドをそのまま発現ベクターとして用いることとし、これを組換え発現プラスミドｐＵＣ−ＤＩ−１Ｇ１２２Ｄと命名した。ｐＵＣ−ＤＩ−１Ｇ１２２Ｄを用いて、エシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡製）を形質転換し、ＳＯＣ培地中で１ｈｒ、３７℃で前培養後、ＬＢ−ａｍｐ寒天培地に展開し、コロニーである該形質転換体を取得した。得られた形質転換体を、エシェリヒア・コリーＤＨ５α（ｐＵＣ−ＤＩ−１Ｇ１２２Ｄ）と命名した。

実施例５ 培養上清の準備
実施例３にて取得した形質転換体エシェリヒア・コリーＤＨ５α（ｐＵＣ−ＤＩ−１）のコロニーを一白金耳試験管５ｍｌのＬＢ−ａｍｐ液体培地に植菌し、３０℃で１６時間培養した。培養終了より菌体を遠心分離により集菌し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した後、ソニケーターにて超音波破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。
実施例４にて取得した形質転換体エシェリヒア・コリーＤＨ５α（ｐＵＣ−ＤＩ−１Ｇ１２２Ｄ）についても同様の操作を行い、粗酵素液を得た。

実施例６ ジアホラーゼ活性の確認
実施例５で得た粗酵素液中のジアホラーゼ活性を、上記１−１．に示したジアホラーゼ活性測定方法を用いて測定した。
その結果、形質転換体エシェリヒア・コリーＤＨ５α(ｐＵＣ−ＤＩ−１)由来の粗酵素液にジアホラーゼ活性が存在することが確認された。よって、本合成遺伝子はＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｙ４．１ＭＣ１のＮＡＤ(Ｐ)Ｈ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅをコードしている遺伝子であることがわかった。
また、形質転換体エシェリヒア・コリーＤＨ５α（ｐＵＣ−ＤＩ−１Ｇ１２２Ｄ）由来の粗酵素液についても同様の操作を行い、もジアホラーゼ活性が存在することを確認した。よって、変異型ポリペプチドをコートするｐＵＣ−ＤＩ−１Ｇ１２２Ｄ合成遺伝子はジアホラーゼ活性を持っていることがわかった。

実施例７ Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｙ４．１ＭＣ１由来野生型ジアホラーゼと変異型ジアホラーゼの調製（培養および精製）
５ｍＬのＬＢ液体培地（トリプトン１．０％、イーストイクストラクト０．５％、ＮａＣｌ１．０％、ｐＨ７．０）を試験管に入れ、オートクレーブで滅菌し、前培養用の培地とした。予めＬＢプレート培地で培養した形質転換体であるエシェリヒア・コリーＤＨ５α(ｐＵＣ−ＤＩ−１)を前培養培地に一白金耳植菌し、３０℃、１８０ｒｐｍで１６時間振とう培養し、種培養液を得た。
形質転換体エシェリヒア・コリーＤＨ５α（ｐＵＣ−ＤＩ−１Ｇ１２２Ｄ）についても同様の操作を行い、種培養液を得た。

次に、上記で得た２種類の種培養液を用いて、それぞれ下記の操作を行った。
５００ｍＬのＴＢ液体培地（トリプトン１．２％、イーストイクストラクト２．４％、グリセロール０．４％、ＫＨ_２ＰＯ_４ ０．２３％、Ｋ_２ＨＰＯ_４ １．２５％、ｐＨ７．０）を２Ｌ坂口フラスコに入れ、オートクレーブで滅菌し、本培養培地の培地とした。５ｍＬの種培養液を本培養培地に植菌し、培養温度３０℃、１８０ｒｐｍで２４時間振とう培養した。その後、培養液を遠心分離して集菌し、菌体を回収した。得られた菌体を２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した。

次に、上記で得た２種類の懸濁液を用いて、それぞれ下記の操作を行った。
懸濁液をフレンチプレス（Ｎｉｒｏ Ｓｏａｖｉ製）に流速１６０ｍＬ／分で送液し、７００〜１０００ｂａｒで破砕した。続いて、エチレンイミン（ポリマー）（ナカライテスク株式会社）をポリエチレンイミン含有量５％になるように調整した５％ポリエチレンイミン溶液（ｐＨ７．５）を準備し、破砕液へ破砕液量に対し５％になるように徐々に添加して、室温で３０分間攪拌した後、ろ過助剤を用いて余分な沈殿を除去した。次に０．５飽和になるように硫酸アンモニウム（住友化学（株）製）を徐々に添加し、硫安分画を行い、ジアホラーゼ活性を持つタンパク質を沈殿させ回収し、回収したタンパク質の沈殿を２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した。次に、懸濁液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５のゲルを用いて脱塩した。その後、予め２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した４００ｍＬのＤＥＡＥセファロースＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥヘルスケア製）カラムにかけ、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）のリニアグラジエントで溶出させた。そして、溶出されたジアホラーゼ画分を分画分子量１０，０００の中空糸膜（スペクトラムラボラトリーズ製）で濃縮した。濃縮液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５のゲルを用いて脱塩し、精製酵素を得た。
本実施例では、形質転換体エシェリヒア・コリーＤＨ５α(ｐＵＣ−ＤＩ−１)から得られたジアホラーゼを「野生型ジアホラーゼ」と表記する。また、形質転換体エシェリヒア・コリーＤＨ５α(ｐＵＣ−ＤＩ−１Ｇ１２２Ｄ)から得られたジアホラーゼ「変異型ジアホラーゼ」と表記する。

次に、上記で得た２種類の精製酵素を用いて、それぞれ下記の操作を行った。
得られた精製酵素をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍおよびＰｈａｓｔＧｅｌ^ＴＭ Ｇｒａｄｉｅｎｔ １０−１５ 、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）に供した。この際、タンパク質分子量マーカーとしてフォスフォリラーゼｂ（９７，０００ダルトン）、アルブミン（６６，０００ダルトン）、オバルブミン（４５，０００ダルトン）、カルボニックアンヒドラーゼ（３０，０００ダルトン）、トリプシンインヒビター（２０，１００ダルトン）、α・ラクトアルブミン（１４，４００ダルトン）を用いた。

その結果、それぞれの酵素において単一のバンドが得られたことから、野生型ジアホラーゼと変異型ジアホラーゼが十分に精製されていることが分かった。

実施例９ サブユニットの分子量
サブユニット分子量の測定は、定法のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍおよびＰｈａｓｔＧｅｌ^ＴＭ Ｇｒａｄｉｅｎｔ １０−１５ 、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）で測定を行った。タンパク質分子量マーカー（Ｌｏｗ Ｍｏｌｉｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）フォスフォリラーゼｂ（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｂ）：９７，０００ダルトン、アルブミン（Ａｌｂｕｍｉｎ）：６６，０００ダルトン、オバルブミン（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）：４５，０００ダルトン、カルボニックアンヒドラーゼ（Ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ）：３０，０００ダルトン、トリプシンインヒビター（Ｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）：２０，１００ダルトン、α・ラクトアルブミン（α−Ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ）：１４，４００ダルトンの移動度より求めた分子量は少なくとも野生型ジアホラーゼが分子量約２３，７００ダルトンのサブユニット、変異型ジアホラーゼが分子量約２３，７００ダルトンのサブユニットであった。野生型ジアホラーゼの結果を図３（Ａ）、変異型ジアホラーゼの結果を図４（Ａ）に示す。

実施例１０ 複合体の分子量
本酵素の分子量測定はＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ (７．５ｍｍ Ｉ.Ｄ. Ｘ６０センチ, ＴＯＳＯＨ)を使用した。緩衝液は０．１５ Ｍ ＮａＣｌを含む２０ ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ７）を使用し、流速０．５ｍｌ/ｍｉｎで測定した。分子量を測定するタンパク質マーカーとして、ＭＷ−Ｍａｒｋｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ (ＨＰＬＣ) (オリエンタル酵母)を使用し、本精製酵素の分子量を決定した。タンパク質マーカーの分子量は以下のとおりである。グルタミン酸脱水素酵素（Ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）：２９０ｋＤａ、乳酸脱水素酵素（Ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）：１４２ｋＤａ、エノラーゼ（Ｅｎｏｌａｓｅ）：６７ｋＤａ、ミオキナーゼ（Ｍｙｏｋｉｎａｓｅ）：３２ｋＤａ、シトクローム Ｃ（Ｃｔｙｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ）：１２．４ｋＤａ。本測定条件において、タンパク質マーカーと本酵素の保持時間は、グルタミン酸脱水素酵素（Ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）：２６．４７ ｍｉｎ、乳酸脱水素酵素（Ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）：３０．４４ ｍｉｎ、エノラーゼ（Ｅｎｏｌａｓｅ）：３５．６３ ｍｉｎ、ミオキナーゼ（Ｍｙｏｋｉｎａｓｅ）：３８．７９ ｍｉｎ、シトクローム Ｃ（Ｃｔｙｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ）：４４．８４ ｍｉｎ、野生型ジアホラーゼ：３６．３１ｍｉｎ、変異型ジアホラーゼ：３６．０６ｍｉｎであった。以上の結果から、野生型ジアホラーゼの分子量は約５３，３００Ｄａ、変異型ジアホラーゼの分子量は約５５，３００Ｄａであることが確認された。野生型ジアホラーゼの結果を図３（Ｂ）、変異型ジアホラーゼの結果を図４（Ｂ）に示す。

ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷによるゲルろ過の分子量測定とＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量測定から、野生型ジアホラーゼは分子量約２３，７００ダルトンのサブユニットが２量体を形成する、分子量約５３，３００Ｄａのホモ２量体である。

ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷによるゲルろ過による分子量測定とＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量測定から、変異型ジアホラーゼは分子量約２３，７００ダルトンのサブユニットが２量体を形成する、分子量約５５，３００Ｄａのホモ２量体である。

実施例１１ 至適活性ｐＨ
実施例５で得られたジアホラーゼ酵素液（２Ｕ／ｍＬ）を用いて、至適ｐＨを調べた。１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０−８．０、図中◆印でプロット）、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５−９．０、図中■印でプロット）、１００ｍＭ グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０−１０．０、図中▲でプロット）、を用い、それぞれのｐＨにおいて、温度２５℃にて酵素反応を行い、相対活性を比較した。結果を図５に示す。図５（Ａ）はＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｙ４．１ＭＣ１由来野生型ジアホラーゼ、図５（Ｂ）は本発明のＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｙ４．１ＭＣ１由来変異型ジアホラーゼをそれぞれ用いて至適活性ｐＨを検討した結果である。

その結果、野生型ジアホラーゼの至適活性ｐＨは、ｐＨ７．３において最も高い活性値を示した。また、凡そｐＨ６．７〜ｐＨ８．０の間においては、最大活性値の８０％以上の相対活性を示したことから、このｐＨ域では好適に使用できると考えられる。

また、変異型ジアホラーゼの至適活性ｐＨは、ｐＨ７．９において最も高い活性値を示した。また、凡そｐＨ６．５〜ｐＨ８．０の間においては、最大活性値の６０％以上の相対活性を示したことから、このｐＨ域では好適に使用できると考えられる。

実施例１２ ｐＨ安定性
実施例５で得られたジアホラーゼ酵素液（２５Ｕ／ｍＬ）を用いて、ｐＨ安定性を調べた。１００ｍＭ 酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．０−ｐＨ６．０：図中◆印でプロット）、１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０−ｐＨ８．０：図中■印でプロット）、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５−ｐＨ９．０：図中▲印でプロット）、を用い、２５℃、１６時間処理した後の活性の残存率を測定した。結果を図６に示す。図６（Ａ）はＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｙ４．１ＭＣ１由来野生型ジアホラーゼ、図６（Ｂ）は本発明のＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｙ４．１ＭＣ１由来変異型ジアホラーゼをそれぞれ用いてｐＨ安定性を検討した結果である。

その結果、野生型ジアホラーゼおよび変異型ジアホラーゼは、いずれもｐＨ５．０〜ｐＨ９．０の間において安定であることが示された。

実施例１３ 温度安定性
実施例５で得られたジアホラーゼ酵素液（５０Ｕ／ｍＬ）を用いて、温度安定性を調べた。１００ｍＭ酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて、ジアホラーゼ酵素液を各温度（５０℃、６０℃、７０℃）で１５〜６０分間処理した後、見かけの活性の残存率を測定した。結果を図７に示す。図７（Ａ）はＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｙ４．１ＭＣ１由来野生型ジアホラーゼの温度安定性、図７（Ｂ）は本発明のＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｙ４．１ＭＣ１由来変異型ジアホラーゼの温度安定性をそれぞれ示す。さらに、同様の方法にてＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ジアホラーゼ（ユニチカ製）の温度安定性を調べた（図８）。

その結果、野生型ジアホラーゼは７０℃・６０分間での処理後８３％の残存率を有しており、７０℃以下ではより高い残存活性（５０℃および６０℃で残存９０％以上）を有していた。それに対し、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ジアホラーゼ（ユニチカ製）は７０℃・６０分間での処理後４４％の残存率であった。このことから、本発明の野生型ジアホラーゼは、７０℃以下で安定であることが示された。
なお、本発明の野生型ジアホラーゼは４℃、３０℃、４０℃においても６０分間での処理後９０％以上の残存率を有しており、広い温度範囲において安定であることが示された。
また、５０℃、６０℃、７０℃のそれぞれにおいて１５分間処理後の酵素活性はいずれも９０％以上であった。

また、本発明の変異型ジアホラーゼは、７０℃・６０分間での処理後８８．５％の残存率を有しており、７０℃以下ではより高い残存活性（５０℃および６０℃で残存９０％以上）を有していた。このことから、変異型ジアホラーゼは、７０℃以下で安定であることが示された。

実施例１４ ＮＡＤＨに対するＫｍ値の測定
実施例５で得られたジアホラーゼ酵素液を用いて、上述したジアホラーゼの活性測定法において、基質であるＮＡＤＨの濃度を変化させて活性測定を行い、基質濃度と反応速度のグラフ（図９（Ａ）（Ｂ））からＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−ｂｕｒｋ ｐｌｏｔを作成し、Ｋｍ値を算出した。その結果、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｙ４．１ＭＣ１由来野生型ジアホラーゼのＮＡＤＨに対するＫｍ値は、０．０７３ｍＭであることが判明した（図９（Ａ））。同様の方法にて、本発明のＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｙ４．１ＭＣ１由来変異型ジアホラーゼの活性測定を行った。その結果、本発明の変異型ジアホラーゼのＮＡＤＨに対するＫｍ値は、０．３６３ｍＭであることが判明した（図９（Ｂ））。さらに、同様の方法にてＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ジアホラーゼ（ユニチカ製）の活性測定を行った（図１０）。その結果、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ジアホラーゼ（ユニチカ製）のＮＡＤＨに対するＫｍ値は、０．１１５ｍＭであることが判明した。

実施例１５ ＡＮＱをメディエータとした時の比活性
実施例５で得られたジアホラーゼ酵素液（０．０１〜０．０２ｍｇ／ｍＬ）を用いて、ＡＮＱへの反応性を調べた（図１１（Ａ）（Ｂ））。ＡＮＱは非特許文献５に記載の方法によって合成し、利用することができる。Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｙ４．１ＭＣ１由来野生型ジアホラーゼ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｙ４．１ＭＣ１由来変異型ジアホラーゼ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ジアホラーゼ（ユニチカ製）の酵素活性を測定し、ＮＡＤＨ濃度と比活性（Ｕ／ｍｇ）の関係を一覧表にした（表１）。

その結果、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｙ４．１ＭＣ１由来変異型ジアホラーゼはＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｙ４．１ＭＣ１由来野生型ジアホラーゼに比べ、１．７〜２．６倍の高い比活性を示した（図１１（Ａ））。
ＮＡＤＨ濃度が２０ｍＭ以上では、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｙ４．１ＭＣ１由来変異型ジアホラーゼはＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ジアホラーゼ（ユニチカ製）に比べ、比活性が高いことが判明した。

また、高濃度ＮＡＤＨによるジアホラーゼ活性阻害効果を図１１（Ｂ）にて示す。図１１（Ｂ）はＮＡＤＨが２０ｍＭのときの酵素活性を１００％とした時の相対活性をグラフにしたものである。その結果、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｙ４．１ＭＣ１由来変異型ジアホラーゼは８０ｍＭ ＮＡＤＨ時の相対活性が７９％であった。Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｙ４．１ＭＣ１由来野生型ジアホラーゼは８０ｍＭ ＮＡＤＨ時の相対活性が５０％であった。Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ジアホラーゼ（ユニチカ製）は８０ｍＭ ＮＡＤＨ時の相対活性が３９％であった。
この結果から、本発明の変異型ジアホラーゼは、野生型に比べて、ＮＡＤＨの濃度が高いときの活性阻害が抑制されていることがわかる。

実施例１６ ＤＣＰＩＰをメディエータとした時の温度依存性
実施例５で得られたジアホラーゼ酵素液を用いて、１−１−１記載のジアホラーゼの活性測定法において、２５℃、３０℃、３７℃で測定し温度依存性を調べた。１−６で定義された温度依存性を図１２（Ａ）に示す。反応温度と比活性との関係を図１２（Ｂ）に示す。
図１２（Ａ）が示すとおり、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｙ４．１ＭＣ１由来変異型ジアホラーゼは２５℃の相対値が３７℃に対して７９．６％であったのに対し、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｙ４．１ＭＣ１由来野生型ジアホラーゼは２５℃の相対値が３７℃に対して６１．３％であった。Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ジアホラーゼ（ユニチカ製）は２５℃の相対値が３７℃に対して６９．６％であった。この結果から、本発明の変異型ジアホラーゼは、野生型に比べて、温度依存性が改良されていることがわかる。
また、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｙ４．１ＭＣ１由来変異型ジアホラーゼは２５℃の相対値が３０℃に対して９３．０％であったのに対し、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｙ４．１ＭＣ１由来野生型ジアホラーゼは２５℃の相対値が３０℃に対して８４．１％であった。Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ジアホラーゼ（ユニチカ製）は２５℃の相対値が３０℃に対して８３．７％であった。この結果から、本発明の変異型ジアホラーゼは、野生型に比べて、室温に近い温度範囲である２５〜３０℃において、特に温度依存性が改善されていることがわかる。

実施例１７ ＡＮＱをメディエータとした時の温度依存性
実施例４および実施例５で得られたジアホラーゼ酵素液を用いて、１−１−２記載のジアホラーゼの活性測定法において、２０ｍＭ ＮＡＤＨ時の２５℃、３０℃、３７℃で測定し温度依存性を調べた。１−６で定義された温度依存性を図１３（Ａ）に示す。反応温度と比活性との関係を図１３（Ｂ）に示す。
図１３（Ａ）が示すとおり、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｙ４．１ＭＣ１由来変異型ジアホラーゼは２５℃の相対値が３７℃に対して５２．９％であった。Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｙ４．１ＭＣ１由来野生型ジアホラーゼは２５℃の相対値が３７℃に対して３６．０％であった。Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ジアホラーゼ（ユニチカ製）は２５℃の相対値が３７℃に対して４６．３％であった。この結果から、本発明の変異型ジアホラーゼは、野生型に比べて、温度依存性が改良されていることがわかる。
また、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｙ４．１ＭＣ１由来変異型ジアホラーゼは２５℃の相対値が３０℃に対して９８．０％であったのに対し、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｙ４．１ＭＣ１由来野生型ジアホラーゼは２５℃の相対値が３０℃に対して５９．０％であった。Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ジアホラーゼ（ユニチカ製）は２５℃の相対値が３０℃に対して８３．０％であった。この結果から、本発明の変異型ジアホラーゼは、野生型に比べて、室温に近い温度範囲である２５〜３０℃において、特に温度依存性が改善されていることがわかる。
これらの結果から、本発明の変異型ジアホラーゼは、野生型に比べて、温度依存性が改良されていることがわかる。特に、室温に近い温度範囲である２５〜３０℃で温度依存性が改良されていることがわかる。

図１３（Ｂ）が示すとおり、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｙ４．１ＭＣ１由来変異型ジアホラーゼは、２５〜３７℃の範囲において、何れの温度においても、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｙ４．１ＭＣ１由来野生型ジアホラーゼとＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ジアホラーゼ（ユニチカ製）より、比活性が高い。３７℃での比活性は、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｙ４．１ＭＣ１由来野生型ジアホラーゼが６７８．８Ｕ／ｍｇに対し、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｙ４．１ＭＣ１由来変異型ジアホラーゼは９４２．８Ｕ／ｍｇで、１．３９倍であった。また、３０℃での比活性は、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｙ４．１ＭＣ１由来野生型ジアホラーゼが４１３．３Ｕ／ｍｇに対し、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｙ４．１ＭＣ１由来変異型ジアホラーゼは５０９．６Ｕ／ｍｇで、１．２３倍であった。特に、２５℃での比活性は、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｙ４．１ＭＣ１由来野生型ジアホラーゼが２４４．２Ｕ／ｍｇに対し、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｙ４．１ＭＣ１由来変異型ジアホラーゼは４９８．８Ｕ／ｍｇと、２倍以上高くなっていた。
これらの結果から、本発明の変異型ジアホラーゼは、ナフトキノン誘導体をメディエータとして用いた場合、野生型に比べて温度依存性が改良されており、かつ、さらに比活性が野生型に比べて向上していることがわかる。特に２５〜３７℃の範囲において、その効果が顕著である。

この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。

本発明のジアホラーゼはＮＡＤＨとの親和性に優れＮＡＤＨ量をより正確に測定することを可能にする。従って本発明のジアホラーゼはＮＡＤＨの測定などに好適といえる。

Claims (8)

1. 下記の（ａ）または（ｃ）のポリペプチドからなる変異型ジアホラーゼ。
   （ａ）配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
   （ｃ）配列番号４のアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、配列番号４とのアラインメントにおいて１２２位のグリシンがアスパラギン酸に改変されていて、且つ、ジアホラーゼ活性を有するポリペプチド。
2. さらに、下記の（ｄ）または（ｅ）のいずれか１つ以上の特性を有する、請求項１に記載の変異型ジアホラーゼ。
   （ｄ）２０ｍＭ ＮＡＤＨ存在下の比活性を１００％としたとき、８０ｍＭ ＮＡＤＨ存在下で比活性が５０％以上保たれる。
   （ｅ）（１）ＤＣＰＩＰをメディエータとして用いた場合、３７℃での活性値を１００％とした時、２５℃の相対活性が７０％以上であるか、または、（２）ナフトキノン誘導体をメディエータとして用いた場合、３７℃での活性値を１００％とした時、２５℃の相対活性が５０％以上である。
3. さらに、下記の（ｆ）の特性を有する、請求項１または２の変異型ジアホラーゼ。
   （ｆ）ナフトキノン誘導体をメディエータとして用いた場合、比活性が野生型ジアホラーゼと比較して１．５倍以上である。
4. 以下の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかのＤＮＡ。
   （Ａ）配列番号４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
   （Ｂ）配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡ。
   （Ｃ）配列番号５の塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列からなり、配列番号５とのアラインメントにおいて３６４位〜３６６位のトリプレットがアスパラギン酸をコードし、且つ、ジアホラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
   （Ｄ）配列番号５の塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、配列番号５とのアラインメントにおいて３６４位〜３６６位のトリプレットがアスパラギン酸をコードし、且つ、ジアホラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
5. 請求項４に記載のＤＮＡを組み込んだベクター。
6. 請求項５に記載のベクターを含む形質転換体。
7. 請求項６に記載の形質転換体を培養することを含む、請求項１〜３のいずれかに記載のジアホラーゼの製造方法。
8. 請求項１〜３のいずれかに記載のジアホラーゼを含む体外診断用試薬、体外診断用キット、酵素電極、酵素センサまたは燃料電池。