JPS60156381A - Ｕｋ５６３菌株 - Google Patents
Ｕｋ５６３菌株Info
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- JPS60156381A JPS60156381A JP1411084A JP1411084A JPS60156381A JP S60156381 A JPS60156381 A JP S60156381A JP 1411084 A JP1411084 A JP 1411084A JP 1411084 A JP1411084 A JP 1411084A JP S60156381 A JPS60156381 A JP S60156381A
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- JP
- Japan
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- strain
- diaphorase
- medium
- culture
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド： （ジクロロフェノールインドフェノール）オキシ
ド レダクターゼを高濃度に含有する新規なバチルス
ステアロサーモフィラス（ｊ’１ａｃｉｌｌｕｓ ５ｔ
ｅａｒｏｔ、ｊｅｒｍｏｐ−ｈｉｌｌｕすＵＫ５６３菌
株に関するものである。
ド： （ジクロロフェノールインドフェノール）オキシ
ド レダクターゼを高濃度に含有する新規なバチルス
ステアロサーモフィラス（ｊ’１ａｃｉｌｌｕｓ ５ｔ
ｅａｒｏｔ、ｊｅｒｍｏｐ−ｈｉｌｌｕすＵＫ５６３菌
株に関するものである。
還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド： （ジ
クロロフェノールインドフェノール）オキシド レダク
ターゼは通称ジアホラーゼと呼ばれ。
クロロフェノールインドフェノール）オキシド レダク
ターゼは通称ジアホラーゼと呼ばれ。
動物組織、酵母、微生物などに見い出され、還元型ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド（以後ＮＡＤＨと称
す）を基質としてメナジオン、フェリシアニド、ニトロ
テトラゾリウムブルー、２．６−ジクロロフェノールイ
ンドフェノールなどを還元発色させる酵素である。その
ため、臨床検査でＮ Ａ Ｄ ］（の関与する各種分析
キットの発色系の酵素として汎用されており１例えばグ
ルコース、クレアチン５乳酸１ ピルビン酸、胆汁酸な
どの測定に使用されている。かかるジアホラーゼの製造
に関しては、成育速度が速いことや大量生産のしやすさ
から、もっばら微生物菌体より分離精製されているが、
ジアホラーゼは菌体内酵素であるため。
チンアミドアデニンジヌクレオチド（以後ＮＡＤＨと称
す）を基質としてメナジオン、フェリシアニド、ニトロ
テトラゾリウムブルー、２．６−ジクロロフェノールイ
ンドフェノールなどを還元発色させる酵素である。その
ため、臨床検査でＮ Ａ Ｄ ］（の関与する各種分析
キットの発色系の酵素として汎用されており１例えばグ
ルコース、クレアチン５乳酸１ ピルビン酸、胆汁酸な
どの測定に使用されている。かかるジアホラーゼの製造
に関しては、成育速度が速いことや大量生産のしやすさ
から、もっばら微生物菌体より分離精製されているが、
ジアホラーゼは菌体内酵素であるため。
菌体を破壊して目的のジアホラーゼのみを精製するため
には夾雑する他の蛋白をすべて除外する複雑な工程が必
要である。そのため、純度の高いジアホラーゼは著しく
高価なものとなり、経済的な点で産業上大きな問題とな
っている。
には夾雑する他の蛋白をすべて除外する複雑な工程が必
要である。そのため、純度の高いジアホラーゼは著しく
高価なものとなり、経済的な点で産業上大きな問題とな
っている。
かかる問題を解決するためにジアホラーゼ含有量の高い
菌株を自然界より分離し、使用に供する努力がなされて
きており２例えばジャーナル オブ アプライド バイ
オケミストリー １巻２４７〜２５８頁１９７９年（Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＡｐｐｌｉｅｄＲ４ｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ）には、約１０万ニー’−ット／ｋｇ乾燥菌体
のジアホラーゼを含有するバチルス ステアロサーモフ
ィラスＮＣＡ１５０’３株が報告されている。また、バ
イオケミカル ジャーナル １９１巻４５７〜４６５頁
１９８０年（Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｊ、 １９８０）には
、約５０万ユニツト／ｋｇ乾燥菌体のジアホラーゼを含
有するバチルス ステアロサーモフィラスＰ Ｈ２４に
ついて報告がなされている。後者の場合、−見金有量が
高いようであるが、酵素含有量の測定温度が５５℃で行
われており、酵素反応速度は１０℃低下すると約％にな
ることから、臨床検査で用いられる測定温度３０℃では
、約６〜８万ユニソ）／ｋｇ乾燥菌体と計算され、工業
生産上両者とも含有量が低く困難が予想される。
菌株を自然界より分離し、使用に供する努力がなされて
きており２例えばジャーナル オブ アプライド バイ
オケミストリー １巻２４７〜２５８頁１９７９年（Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＡｐｐｌｉｅｄＲ４ｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ）には、約１０万ニー’−ット／ｋｇ乾燥菌体
のジアホラーゼを含有するバチルス ステアロサーモフ
ィラスＮＣＡ１５０’３株が報告されている。また、バ
イオケミカル ジャーナル １９１巻４５７〜４６５頁
１９８０年（Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｊ、 １９８０）には
、約５０万ユニツト／ｋｇ乾燥菌体のジアホラーゼを含
有するバチルス ステアロサーモフィラスＰ Ｈ２４に
ついて報告がなされている。後者の場合、−見金有量が
高いようであるが、酵素含有量の測定温度が５５℃で行
われており、酵素反応速度は１０℃低下すると約％にな
ることから、臨床検査で用いられる測定温度３０℃では
、約６〜８万ユニソ）／ｋｇ乾燥菌体と計算され、工業
生産上両者とも含有量が低く困難が予想される。
本発明者等は、ジアホラーゼ含有量の高い好熱性細菌を
めて広く自然界を対象に寒天平板法でスクリーニングを
行った結果２京都府宇治市小桜の土壌より、バチルス
ステアロサーモフィラスに属すると考えられる新菌株を
発見し、その新菌株がジクロロフェノールインドフェノ
ールを水素受容体とした場合に特異的にＮ Ａ Ｄ Ｈ
オキシドレダクターゼ作用を示す酵素を驚くべきことに
従来菌株の５０〜８０倍、すなわち少なくとも５００万
ユニソ）／ｋｇ？ｉＪ、菌体含有する好熱性細菌である
ことを見い出し５本発明を完成するに至った。
めて広く自然界を対象に寒天平板法でスクリーニングを
行った結果２京都府宇治市小桜の土壌より、バチルス
ステアロサーモフィラスに属すると考えられる新菌株を
発見し、その新菌株がジクロロフェノールインドフェノ
ールを水素受容体とした場合に特異的にＮ Ａ Ｄ Ｈ
オキシドレダクターゼ作用を示す酵素を驚くべきことに
従来菌株の５０〜８０倍、すなわち少なくとも５００万
ユニソ）／ｋｇ？ｉＪ、菌体含有する好熱性細菌である
ことを見い出し５本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、バチルス ステアロサーモフィラス
に属し、ＮＡＤＨ： （ジクロロフェノールインドフェ
ノール）オキシド レダクターゼを少なくとも５００万
ユニソ）／ｋｇ湿菌体含有するＩＪＫ５６３株である。
に属し、ＮＡＤＨ： （ジクロロフェノールインドフェ
ノール）オキシド レダクターゼを少なくとも５００万
ユニソ）／ｋｇ湿菌体含有するＩＪＫ５６３株である。
本発明のＵＫ５６３菌株は、ジアホラーゼが０．０６ｍ
Ｍジクロロフェノールインドフェノール及び１ｍＭ還元
型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む５０ｍ
Ｍのリン酸緩衝液（３０”Ｃ。
Ｍジクロロフェノールインドフェノール及び１ｍＭ還元
型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む５０ｍ
Ｍのリン酸緩衝液（３０”Ｃ。
ＰＨ７，５）を加えたときの６００ｎｍの吸光度の単位
時間当りの減少量を測定し、１分間当り吸光度を６減少
せしめる酵素活性を１ユニツトとした時に。
時間当りの減少量を測定し、１分間当り吸光度を６減少
せしめる酵素活性を１ユニツトとした時に。
少なくとも５００万ユニソ）／ｋｇ乾燥菌体を含有して
いる。
いる。
次に本発明の菌株の菌学的性質を示す。この菌学的性質
の検討には、マニュアル・オブ・マイクロバイオロジカ
ル・メソソズ（Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏ−ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ； ５ｏｃｉｅｔ
ｙ ｏｆ ＡｍｅｒｉｃａｎＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉ
ｓｔｓ、 Ｍｃｇｒａｗ−１１ｉ１１ Ｒｏｏｋ Ｃｏ
ｍｐａｒ＋ｙ ） ＋微生物の分類と同定（長谷用武治
編著、東京大学出版会）及び培地学各＃！ ＜坂崎利−
著、納谷書店）に記載されている方法、培地組成を用い
た。また。
の検討には、マニュアル・オブ・マイクロバイオロジカ
ル・メソソズ（Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏ−ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ； ５ｏｃｉｅｔ
ｙ ｏｆ ＡｍｅｒｉｃａｎＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉ
ｓｔｓ、 Ｍｃｇｒａｗ−１１ｉ１１ Ｒｏｏｋ Ｃｏ
ｍｐａｒ＋ｙ ） ＋微生物の分類と同定（長谷用武治
編著、東京大学出版会）及び培地学各＃！ ＜坂崎利−
著、納谷書店）に記載されている方法、培地組成を用い
た。また。
寒天培地の場合には、寒天を３％（重量）を加えた。
〔形態的所見〕６０℃、２４時間培養
１、細胞の形及び大きさ：桿状、（０，５〜０．８）×
（１〜２）ミクロン ２、多形性：なし ３、運動性：あり ４、胞子 ：円筒形の内生胞子を細胞中央ないしは先端
に形成する。胞子のうはふくれない。
（１〜２）ミクロン ２、多形性：なし ３、運動性：あり ４、胞子 ：円筒形の内生胞子を細胞中央ないしは先端
に形成する。胞子のうはふくれない。
５、ダラム染色：陽性
６、抗酸性：なし
〔生育状態〕６０℃、２４時間培養
■、肉汁寒天平板培養
形状：円形
周縁：波状
隆起：扁平
光沢：なし
表面：平滑
色調：透明
２、肉汁寒天斜面培養
生育度：良好
形状 ：糸状
３、肉汁液体培養
表面生育：わずかに歯環を形成する。
濁度：混濁
沈渣：少量
着色、脱色：なし
４、肉汁ゼラチン穿刺培養
ゼラチン３０％添加、６０℃で適時培養した後、冷却し
て固化状態を判定：ゼラチン液化５．肉汁寒天穿刺培養 形状：金球状 表面生育：良好 ６、リドマス、ミルク リドマス退色ｐｌｆ ６．０． ミルクは固化された後
。
て固化状態を判定：ゼラチン液化５．肉汁寒天穿刺培養 形状：金球状 表面生育：良好 ６、リドマス、ミルク リドマス退色ｐｌｆ ６．０． ミルクは固化された後
。
液化される。
〔生理学的性質〕６０℃、１〜２日培養１、硝酸塩の還
元：あり ２、脱窒反応：陰性 ３、ＭＲテスト：陽性 ４、ＶＰテスト：陽性 ５、インドールの生成：なし ６、硫化水素の生成：弱い陽性 ７、デンプンの加水分解：あり ８、クエン酸の利用：なし ９、硝酸塩の利用 ：なし １０、アンモニウム塩の利用：なし １１、色素の生成：なし １２、ウレアーゼ活性：なし １３、オキシダーゼ活性：あり １４、カタラーゼ活性：あり １５、生育ｐＨ： ５．０〜８．５ 至適ｐｔｌ：６．０〜７．５ １６、生育温度：４０〜７０℃ 至適温度：５０〜６３℃ １７、酸素に対する態度 好気的で良く生育するが、嫌気下でも弱い生育が見られ
る。
元：あり ２、脱窒反応：陰性 ３、ＭＲテスト：陽性 ４、ＶＰテスト：陽性 ５、インドールの生成：なし ６、硫化水素の生成：弱い陽性 ７、デンプンの加水分解：あり ８、クエン酸の利用：なし ９、硝酸塩の利用 ：なし １０、アンモニウム塩の利用：なし １１、色素の生成：なし １２、ウレアーゼ活性：なし １３、オキシダーゼ活性：あり １４、カタラーゼ活性：あり １５、生育ｐＨ： ５．０〜８．５ 至適ｐｔｌ：６．０〜７．５ １６、生育温度：４０〜７０℃ 至適温度：５０〜６３℃ １７、酸素に対する態度 好気的で良く生育するが、嫌気下でも弱い生育が見られ
る。
１８．０−Ｆテスト：陰性
１９、フェニルアラニンの脱アミノ反応：陰性２０、塩
化ナトリウムの耐性：５％では生育するが。
化ナトリウムの耐性：５％では生育するが。
７％では生育できない。
２１、ビタミン要求性：あり。ビオチン及びビタミンＢ
群 ２２、チロシンの分解性：なし 〔炭素源からの酸及びガスの生成）６０℃、１〜２日培
養 酸 ガス １、Ｌ−アラビノース − ２、Ｄ−キシロース − ３、Ｄ−グルコース 十 − ４、Ｄ−マンノース ＋ − ５、Ｄ−フラクトース 十 − ６、Ｄ−ガラクトース − ７、麦芽糖 十 − ８、ショ糖 十 − ９、乳糖 − １０、トレハロース ＋ − １１、Ｄ−ソルビット − １２、Ｄ−マンニット − １３、イノジット −− １４、グリセリン 十 − １５、デンプン 十 − 以上の菌学的性質から、ノ＼−シイのマニュアＪレオブ
・デイタミネイティブ・バタテリオロジー第８版（Ｂｅ
ｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎ
ａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉ−ｏｌｏｇｙ ８ｅｄ、）
に基づき検索した結果、ノ＜チルレスステアロサーモフ
ィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ
−直シ）に大略一致した。そこでバチルス ステアロサ
ーモフィラスの標準菌株、Ｉ ＡＭ １．１００１゜１
１００２、 １１００３． １１００４ （以上東京大
学応用微生物研究所保管株） 、Ｉ ＦＯ１２５５０（
財団法人発酵研究所（呆管株）との対比を行ったところ
、２，３゜の生理学的性質において、上記標準菌株と互
いに異なっており１本菌株はバチルス ステアロサーモ
フィラスに属するものであるが、既存菌株とは異なって
おり、待にシアホラ〜ゼ含有量が著しく高いことから新
菌株と判定できるので、バチルスステアロサーモフィラ
スＵＫ５６３と命名し、昭和５８年９月２９日に通産省
工業技術院微生物工業技術研究所へ寄託した。その微生
物受託番号は微工研菌寄第７２７５号（ＦＥＲＭ Ｐ−
７２７５）である。
群 ２２、チロシンの分解性：なし 〔炭素源からの酸及びガスの生成）６０℃、１〜２日培
養 酸 ガス １、Ｌ−アラビノース − ２、Ｄ−キシロース − ３、Ｄ−グルコース 十 − ４、Ｄ−マンノース ＋ − ５、Ｄ−フラクトース 十 − ６、Ｄ−ガラクトース − ７、麦芽糖 十 − ８、ショ糖 十 − ９、乳糖 − １０、トレハロース ＋ − １１、Ｄ−ソルビット − １２、Ｄ−マンニット − １３、イノジット −− １４、グリセリン 十 − １５、デンプン 十 − 以上の菌学的性質から、ノ＼−シイのマニュアＪレオブ
・デイタミネイティブ・バタテリオロジー第８版（Ｂｅ
ｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎ
ａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉ−ｏｌｏｇｙ ８ｅｄ、）
に基づき検索した結果、ノ＜チルレスステアロサーモフ
ィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ
−直シ）に大略一致した。そこでバチルス ステアロサ
ーモフィラスの標準菌株、Ｉ ＡＭ １．１００１゜１
１００２、 １１００３． １１００４ （以上東京大
学応用微生物研究所保管株） 、Ｉ ＦＯ１２５５０（
財団法人発酵研究所（呆管株）との対比を行ったところ
、２，３゜の生理学的性質において、上記標準菌株と互
いに異なっており１本菌株はバチルス ステアロサーモ
フィラスに属するものであるが、既存菌株とは異なって
おり、待にシアホラ〜ゼ含有量が著しく高いことから新
菌株と判定できるので、バチルスステアロサーモフィラ
スＵＫ５６３と命名し、昭和５８年９月２９日に通産省
工業技術院微生物工業技術研究所へ寄託した。その微生
物受託番号は微工研菌寄第７２７５号（ＦＥＲＭ Ｐ−
７２７５）である。
本発明のＩＪＫ５６３菌株を培養するに際して用いられ
る培地としては、細菌の一般的培地であればよく、特に
液体培地を用いることが好ましい。
る培地としては、細菌の一般的培地であればよく、特に
液体培地を用いることが好ましい。
この培地の栄養源において炭素源として１例えばグルコ
ース、シュークロス、フルクトース、 殿粉。
ース、シュークロス、フルクトース、 殿粉。
加水分解物、稠密、亜硫酸パルプ廃液の糖類、酢酸、乳
糖等の有機酸類、さらにＵＫ５６３菌株が資化しうるア
ルコール類、油脂、脂肪類及びグリセリン等が使用でき
、窒素源として１例えばアミノ酸、ペプトン、肉エキス
、酵母エキス等の有機物が使用でき、必要に応じて無機
の窒素源を加えても良い。さらに無機塩類として１例え
ばカリウム、ナトリウム、リン酸、亜鉛、鉄、マグネシ
ウム、マンガン、銅、カルシウム、コバルト等の各塩類
、微量金属塩、コーン・ステープ・リカー。
糖等の有機酸類、さらにＵＫ５６３菌株が資化しうるア
ルコール類、油脂、脂肪類及びグリセリン等が使用でき
、窒素源として１例えばアミノ酸、ペプトン、肉エキス
、酵母エキス等の有機物が使用でき、必要に応じて無機
の窒素源を加えても良い。さらに無機塩類として１例え
ばカリウム、ナトリウム、リン酸、亜鉛、鉄、マグネシ
ウム、マンガン、銅、カルシウム、コバルト等の各塩類
、微量金属塩、コーン・ステープ・リカー。
ビタミン類、核酸等を使用してもよく、細菌の一般的栄
養源が使用できる。これらの培地を用いて。
養源が使用できる。これらの培地を用いて。
［ＪＫ’５６３株を２０’Ｃ〜８０’Ｃ，好ましくは４
０℃〜７０°Ｃ２最適には５０℃〜６３℃で約２〜６時
間、好気的に培養すればよい。この場合２回分培養法及
び連続培養法のどちらでも菌体を得ることができる。
０℃〜７０°Ｃ２最適には５０℃〜６３℃で約２〜６時
間、好気的に培養すればよい。この場合２回分培養法及
び連続培養法のどちらでも菌体を得ることができる。
本発明のＵＫ５６３菌株は、ジアホラーゼ含有量が著し
く高いため、ジアホラーゼを効率良く得ることが可能で
、精製法も簡略化でき、工業生産上メリットが大きい。
く高いため、ジアホラーゼを効率良く得ることが可能で
、精製法も簡略化でき、工業生産上メリットが大きい。
実際にジアホラーゼを単離精製するには、菌体を緩衝液
に懸濁させ１通常の方法で破砕後、塩あるいは界面活性
剤を含む溶液などで抽出し、核酸の除去、硫酸アンモニ
ウムを用いた塩析による分画などを行った後１種々の担
体を用いたカラムクロマトグラフィーを実施すればよい
。カラムクロマ１〜グラフイーとしては、特に高価なア
フィニティークロマトグラフィーを必要と廿ず、一般に
よく用いられているＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）
−セルロースのようなイオン交換クロマトグラフィー、
フェニルアガロースのような疎水性クロマトグラフィー
及びケル濾過クロマトグラフィーを行うことにより、高
純度のジアホラーゼを得ることができる。
に懸濁させ１通常の方法で破砕後、塩あるいは界面活性
剤を含む溶液などで抽出し、核酸の除去、硫酸アンモニ
ウムを用いた塩析による分画などを行った後１種々の担
体を用いたカラムクロマトグラフィーを実施すればよい
。カラムクロマ１〜グラフイーとしては、特に高価なア
フィニティークロマトグラフィーを必要と廿ず、一般に
よく用いられているＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）
−セルロースのようなイオン交換クロマトグラフィー、
フェニルアガロースのような疎水性クロマトグラフィー
及びケル濾過クロマトグラフィーを行うことにより、高
純度のジアホラーゼを得ることができる。
次に本発明の菌株から得られるジアホラーゼの理化学的
性質を示す。
性質を示す。
（１１作用；次の反応を触媒する。
ＮＡＤＩ＋＋ジクロロフェノールインドフェノール→Ｎ
ＡＤ＋還元型ジクロロフェノールインドフェノ ーール （２）基質特異性：２，６−シクロロフエノールインド
フエノールの活性値を１００％とすると，メナジオンで
１８％，フェリシアン化カリでおよそ１．５％，Ｐ−ア
イオドニトロテトラゾリウムでおよそ１％，ニトロテト
ラゾリウムブルーでおよそ０、１％である。
ＡＤ＋還元型ジクロロフェノールインドフェノ ーール （２）基質特異性：２，６−シクロロフエノールインド
フエノールの活性値を１００％とすると，メナジオンで
１８％，フェリシアン化カリでおよそ１．５％，Ｐ−ア
イオドニトロテトラゾリウムでおよそ１％，ニトロテト
ラゾリウムブルーでおよそ０、１％である。
（３）至適ｐ１１：約ｐＨ ７．５ （温度３０℃）（
４）安定ｐＨ範囲： ｐＨ ７．０〜１１．０で４℃，
２４時間の処理でほとんど失活が起こらない。
４）安定ｐＨ範囲： ｐＨ ７．０〜１１．０で４℃，
２４時間の処理でほとんど失活が起こらない。
（５）作用適温の範囲： ｐｌ＋ ７．５で，２５℃よ
り６５℃までの温度の上昇とともに活性は増大する。通
常は３０°Ｃにおいて反応を行わしめる。
り６５℃までの温度の上昇とともに活性は増大する。通
常は３０°Ｃにおいて反応を行わしめる。
（６）耐熱性：６０°Ｃ，１５分間の加熱に対して１０
０％の活性を保持し安定である。
０％の活性を保持し安定である。
（７）分子量：セファデソクスＧ−７５ゲルクロマトグ
ラフイーから約３０， ０００であった。
ラフイーから約３０， ０００であった。
（８）活性の測定法： ０．０６．ｍＭの２，６−シク
ロロフエノールインドフエノール及び１ｍＭのＮＡＤＨ
を含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ ７．５＞にジア
ホラーゼを加えたときの６００ｎｍの吸光度の単位時間
当りの減少量を測定しく３０℃）、１分間当りり吸光度
を６減少せしめる酵素活性を１ユニツトとした。
ロロフエノールインドフエノール及び１ｍＭのＮＡＤＨ
を含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ ７．５＞にジア
ホラーゼを加えたときの６００ｎｍの吸光度の単位時間
当りの減少量を測定しく３０℃）、１分間当りり吸光度
を６減少せしめる酵素活性を１ユニツトとした。
（９）単一性：精製標品にはアクリルアミディスク電気
泳動法により陽極側に移動し，単一なバンドを与えた。
泳動法により陽極側に移動し，単一なバンドを与えた。
本発明の菌株は，ジアホラーゼ含有量が著しく高いため
，カラムクロマトグラフィーなどの精製工程が大幅に小
型化，簡略化でき，操業性，収率が向上し，ジアホラー
ゼを効率良′，かつ工業生産に適した経済性でもって型
造することができる。
，カラムクロマトグラフィーなどの精製工程が大幅に小
型化，簡略化でき，操業性，収率が向上し，ジアホラー
ゼを効率良′，かつ工業生産に適した経済性でもって型
造することができる。
次に本発明を実施例によって具体的に説明する。
実施例１，比較例１
グルコース０．１７５％（ Ｗ／Ｗ， 以下同様）、酵
母エキス０．１５％， ヘア” ） ７０．１０％，
ＫＨ２ ＰＯ４０．１０％， Ｎａ２ＨＰＯ ４ ・１
２８２０ ０．１０％， ＭｇＳＯａ ’ ７８２ ０
０、０５％の組成よりなるｐＨ ７．４の培地１００ｍ
Ｉ！を５００＋ｎβ三角フラスコに入れ，１気圧加圧
下，１２１℃で湿熱滅菌した。これに同組成の寒天培地
で生育させたバチルス ステアロサーモフィラスＵ’Ｋ
５ ６ ３株１工研菌寄第７２７５号）を植菌し、５
８℃で回転振盪培養（高崎製作所、 ＲＧＲＮｏ、 ２
型１８０ ｒｐｍ）を開始した。約３時間で菌の増殖が
対数増殖後期となったので、培養を中止し、 ８０００
Ｇ ５分間遠心分離（トミ〜製作所、 、 Ｒ３７１型
）を行って菌体を簗菌した。
母エキス０．１５％， ヘア” ） ７０．１０％，
ＫＨ２ ＰＯ４０．１０％， Ｎａ２ＨＰＯ ４ ・１
２８２０ ０．１０％， ＭｇＳＯａ ’ ７８２ ０
０、０５％の組成よりなるｐＨ ７．４の培地１００ｍ
Ｉ！を５００＋ｎβ三角フラスコに入れ，１気圧加圧
下，１２１℃で湿熱滅菌した。これに同組成の寒天培地
で生育させたバチルス ステアロサーモフィラスＵ’Ｋ
５ ６ ３株１工研菌寄第７２７５号）を植菌し、５
８℃で回転振盪培養（高崎製作所、 ＲＧＲＮｏ、 ２
型１８０ ｒｐｍ）を開始した。約３時間で菌の増殖が
対数増殖後期となったので、培養を中止し、 ８０００
Ｇ ５分間遠心分離（トミ〜製作所、 、 Ｒ３７１型
）を行って菌体を簗菌した。
こうして得られた湿菌体１ｇ（乾燥菌体２００ｍｇに相
当）を、２０ｍＪのＯ，１Ｍリン酸緩衝液（ｐｌ＋ ７
．５）に懸濁し、超音波破砕機（久保田商事２００Ｍ型
）を用いて破砕し、菌体中のジアホラーゼ含有量を測定
したところ、５３０万ユニット／ｋｇ乾燥菌体の高含有
量値を示した。
当）を、２０ｍＪのＯ，１Ｍリン酸緩衝液（ｐｌ＋ ７
．５）に懸濁し、超音波破砕機（久保田商事２００Ｍ型
）を用いて破砕し、菌体中のジアホラーゼ含有量を測定
したところ、５３０万ユニット／ｋｇ乾燥菌体の高含有
量値を示した。
なお、比較のため、バチルス ステアロサーモフィラス
■＾Ｍ １１００３株（東京大学応用微生物研究所より
入手、バチルス ステアロサーモフィラスＮＣ４１５０
３株と同じ菌株。）を用いる以外は、上記と全く同様に
して湿菌体を得、上記と全く同様にして菌体中のジアホ
ラーゼ含有量を測定したところ、２８万ユニット／ｋｇ
乾燥菌体であった。
■＾Ｍ １１００３株（東京大学応用微生物研究所より
入手、バチルス ステアロサーモフィラスＮＣ４１５０
３株と同じ菌株。）を用いる以外は、上記と全く同様に
して湿菌体を得、上記と全く同様にして菌体中のジアホ
ラーゼ含有量を測定したところ、２８万ユニット／ｋｇ
乾燥菌体であった。
実施例２
実施例１と同様にして５００ｍ ｌ三角フラスコで培養
を行った後、三角フラスコ１０本分の培養液を同組成の
培地２０１！を入れ、あらかじめ湿熱滅菌（１２１℃、
１気圧加圧下１０分）した３ＯＮ容ジャーファーメンタ
−（丸菱理化装置、 ＭＳＪ−Ｕ型。
を行った後、三角フラスコ１０本分の培養液を同組成の
培地２０１！を入れ、あらかじめ湿熱滅菌（１２１℃、
１気圧加圧下１０分）した３ＯＮ容ジャーファーメンタ
−（丸菱理化装置、 ＭＳＪ−Ｕ型。
手羽タービン式）に接種した。通気量２０ｉ／分。
回転数４０Ｏｒｐｍ、温度６０℃で培養を開始したとこ
ろ、直ちに菌の生育がみられ増殖に伴いｐＨの低下が起
こったので、 ４Ｎ ＮａＯＨでｐＨを６．８〜７．２
に調整しつつ培養を続けたところ、約２時間で波長６６
０ｎｍにおける吸光度が１．２に達し、はぼ培地中の主
要炭素源であるグルコースを消費しつくしたので、炭素
源制限型の連続培養を実施した。連続培養はハツチ培養
に用いたものと同組成の培地を２Ｑ １． ／ｆｉｒの
速度下で供給すると同時に、同速度で培養液をジャーフ
ァーメンタ−から抜き出し。
ろ、直ちに菌の生育がみられ増殖に伴いｐＨの低下が起
こったので、 ４Ｎ ＮａＯＨでｐＨを６．８〜７．２
に調整しつつ培養を続けたところ、約２時間で波長６６
０ｎｍにおける吸光度が１．２に達し、はぼ培地中の主
要炭素源であるグルコースを消費しつくしたので、炭素
源制限型の連続培養を実施した。連続培養はハツチ培養
に用いたものと同組成の培地を２Ｑ １． ／ｆｉｒの
速度下で供給すると同時に、同速度で培養液をジャーフ
ァーメンタ−から抜き出し。
希釈率を１．０ｈｒ−１に設定して実施した。
連続培養移行後、３時間目の菌体のジアホラーゼ含有量
を測定したところ、５６０万ユニット／ｋｇ乾燥菌体で
あり、連続培養によってもジアホラーゼ高含有量の菌体
が得られることが確認された。
を測定したところ、５６０万ユニット／ｋｇ乾燥菌体で
あり、連続培養によってもジアホラーゼ高含有量の菌体
が得られることが確認された。
特許出願人 ユニ亭力株式会社
Claims (1)
- （１）バチルス ステアロサーモフィラスに属し、還元
型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド＝（ジクロロ
フェノールインドフェノール）オキシド レダクターゼ
を少なくとも５００万ユニ・ッ）／ｋｇ乾燥菌体含有す
るＵＫ５６３菌株。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1411084A JPS60156381A (ja) | 1984-01-27 | 1984-01-27 | Ｕｋ５６３菌株 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1411084A JPS60156381A (ja) | 1984-01-27 | 1984-01-27 | Ｕｋ５６３菌株 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60156381A true JPS60156381A (ja) | 1985-08-16 |
| JPH043947B2 JPH043947B2 (ja) | 1992-01-24 |
Family
ID=11851974
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1411084A Granted JPS60156381A (ja) | 1984-01-27 | 1984-01-27 | Ｕｋ５６３菌株 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60156381A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013094630A1 (ja) | 2011-12-21 | 2013-06-27 | 東洋紡株式会社 | ジアホラーゼ |
-
1984
- 1984-01-27 JP JP1411084A patent/JPS60156381A/ja active Granted
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013094630A1 (ja) | 2011-12-21 | 2013-06-27 | 東洋紡株式会社 | ジアホラーゼ |
| US9506043B2 (en) | 2011-12-21 | 2016-11-29 | Toyobo Co., Ltd. | Diaphorase |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH043947B2 (ja) | 1992-01-24 |
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| JPS6251590B2 (ja) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |