JPS62289A - α−ケト酸からのＬ−α−アミノ酸の酵素学的製造方法 - Google Patents
α−ケト酸からのＬ−α−アミノ酸の酵素学的製造方法Info
- Publication number
- JPS62289A JPS62289A JP61139107A JP13910786A JPS62289A JP S62289 A JPS62289 A JP S62289A JP 61139107 A JP61139107 A JP 61139107A JP 13910786 A JP13910786 A JP 13910786A JP S62289 A JPS62289 A JP S62289A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- acid
- strain
- bacillus
- extract
- enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
- C12N9/0016—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Mycology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、し−α−アミノ酸の製造方法、より詳しくは
、対応る、α−ケト酸の非対称的酵素還元によって、Ｌ
−α−アミノ酸を酵素を用いた方法によって製造る、方
法に関る、。この発明はまた、その方法によって得られ
た生成物にも関る、。
、対応る、α−ケト酸の非対称的酵素還元によって、Ｌ
−α−アミノ酸を酵素を用いた方法によって製造る、方
法に関る、。この発明はまた、その方法によって得られ
た生成物にも関る、。
従来技術およびその問題点
り一α−アミノ酸の酵素による製造反応が下記式によっ
て示されることは知られている。
て示されることは知られている。
（以下余白）
酵素Ａ１
酵素Ｂ
し−アミノ酸デヒドロゲナーゼである酵素へが、有利に
はニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（ＮＡＤ
Ｈ）である補酵素の不可欠な存在下に、α−ケト酸の対
応る、Ｌ−α−アミノ酸への特別な還元を触Ｗ−る、。
はニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（ＮＡＤ
Ｈ）である補酵素の不可欠な存在下に、α−ケト酸の対
応る、Ｌ−α−アミノ酸への特別な還元を触Ｗ−る、。
還元されたニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド
（ＮＡＤＨ＞は、この反応においてニコチンアミド・ア
デニン・ジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）に酸化される。二
次反応において、これをＮＡＤＨの形態にし、従ってこ
れを還元剤Ｒによって再生る、のは非常に有利である。
（ＮＡＤＨ＞は、この反応においてニコチンアミド・ア
デニン・ジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）に酸化される。二
次反応において、これをＮＡＤＨの形態にし、従ってこ
れを還元剤Ｒによって再生る、のは非常に有利である。
この還元剤Ｒは、酸化されて生成物Ｐになる。前記二次
反応は、酵素Ｂによって触媒される。還元剤は、例えば
グルコースであってもよく、これはグルコース・デヒド
ロゲナーゼによって酸化されてグルコノラフ１〜ンにな
り、これは自然に加水分解されてグルコン酸になる。
反応は、酵素Ｂによって触媒される。還元剤は、例えば
グルコースであってもよく、これはグルコース・デヒド
ロゲナーゼによって酸化されてグルコノラフ１〜ンにな
り、これは自然に加水分解されてグルコン酸になる。
酵素ΔおよびＢならびに補酵素は、好ましくは非常に少
量用いられる。還元剤Ｒは反応体であり、α−ケトン酸
に対して相当昂好ましくは少なくとも理論量存在しても
よい。
量用いられる。還元剤Ｒは反応体であり、α−ケトン酸
に対して相当昂好ましくは少なくとも理論量存在しても
よい。
このようなシステムの利点は、明らかである。
これは、高価な物質であるニコチンアミド・アデニン・
ジヌクレオチドが、酸化または還元型で、これが再生さ
れるが故に、非常にわずかな触媒間でしか使用されなく
てもよいからである。
ジヌクレオチドが、酸化または還元型で、これが再生さ
れるが故に、非常にわずかな触媒間でしか使用されなく
てもよいからである。
米国特許第３，０３６，９５８号において、３−インド
ールピルビン酸から、水素供与反応体特にグルコースの
存在下、し−トリブ！・ファンを合成る、ために、特に
バヂルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）とりわけバチルス・メガ
テリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓａ＋ｃｇａｔｅｒｒｕＩｌ
＋ ）の使用が記載されている。しかしこの文献は、二
次反応中に特殊な酵素の作用で、グルコースの存在下に
再生される補酵素ＮＡＤＨ／ＮＡＤ十の使用について示
唆も記載もしていない。
ールピルビン酸から、水素供与反応体特にグルコースの
存在下、し−トリブ！・ファンを合成る、ために、特に
バヂルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）とりわけバチルス・メガ
テリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓａ＋ｃｇａｔｅｒｒｕＩｌ
＋ ）の使用が記載されている。しかしこの文献は、二
次反応中に特殊な酵素の作用で、グルコースの存在下に
再生される補酵素ＮＡＤＨ／ＮＡＤ十の使用について示
唆も記載もしていない。
さらには、Ｈｏｎｇ Ｈ，Ｈ，らの“旧５ｔｒｉｂｕ
ｔｉＯｎ 。
ｔｉＯｎ 。
「しａｌａｎｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ａ
ｎｄ Ｌ−ｇｌｕｔａａ＋ａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎ
ａｓｅ ｉｎ ｂａｃＮＩｉ″Ｂｉｏｃｈｉａ＋、 ｅ
ｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ、八ｃｔａ 第３６巻、第２８８
〜９頁（１９５９年）には、ある種のバチルス（Ｂａｃ
ｉ Ｉ Ｉｕｓ）菌株が、し−アラニン・デヒドロゲナ
ーゼ活性Ｊ３よびＬ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活
性を有る、ことがあって、これらの２つの酵素活性が依
存ＮＡＤ＋であると記載されているが、バチルス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ）菌株が、補酵素の再生に必要なグルコー
ス・デヒドロゲーゼ活性を有していることは、いかなる
場合にも明確にされていない。
ｎｄ Ｌ−ｇｌｕｔａａ＋ａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎ
ａｓｅ ｉｎ ｂａｃＮＩｉ″Ｂｉｏｃｈｉａ＋、 ｅ
ｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ、八ｃｔａ 第３６巻、第２８８
〜９頁（１９５９年）には、ある種のバチルス（Ｂａｃ
ｉ Ｉ Ｉｕｓ）菌株が、し−アラニン・デヒドロゲナ
ーゼ活性Ｊ３よびＬ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活
性を有る、ことがあって、これらの２つの酵素活性が依
存ＮＡＤ＋であると記載されているが、バチルス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ）菌株が、補酵素の再生に必要なグルコー
ス・デヒドロゲーゼ活性を有していることは、いかなる
場合にも明確にされていない。
フランス特許公開箱２．５２６．４４２号には、バチル
ス・メガテリＣシム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔ
ｃｒｉｕｎ＋ ）ΔＴＣＣ３９１１８（Ｉ ＦＰ １８
８）菌株が、高いグルコース・デヒドロゲナーゼ（酵素
番号ＥＣ１，１，１，４７）活性を有る、という特性が
あり、このために、還元剤Ｒがグルコースであり、かつ
生成物Ｐが加水分解後にグルコン酸であるようなシステ
ムで、非常に有利にＮＡＤ＋からＮ Ａ Ｄ Ｈの再生
が行なわれることがすでに記載されている。
ス・メガテリＣシム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔ
ｃｒｉｕｎ＋ ）ΔＴＣＣ３９１１８（Ｉ ＦＰ １８
８）菌株が、高いグルコース・デヒドロゲナーゼ（酵素
番号ＥＣ１，１，１，４７）活性を有る、という特性が
あり、このために、還元剤Ｒがグルコースであり、かつ
生成物Ｐが加水分解後にグルコン酸であるようなシステ
ムで、非常に有利にＮＡＤ＋からＮ Ａ Ｄ Ｈの再生
が行なわれることがすでに記載されている。
その伯に米国特許第４．３０４．８５８号は、上記の型
の連続酵素方法を記載している。これによれば、α−ケ
ト酸から膜を用いた反応器において、水性媒質に可溶な
高分子量の誘導体形態のニコチンアミド・アデニン・ジ
ヌクレオチド補酵素を用いて、および２つの精製された
酵素、すなわち基質の特殊なデヒドロゲナーゼ（Ｌ−ア
ミノ酸デヒドロゲナーゼ）および補酵素の再生に用いら
れる蟻酸デヒドロゲナーゼを用いて、Ｌ−α−アミノ酸
を合成る、。
の連続酵素方法を記載している。これによれば、α−ケ
ト酸から膜を用いた反応器において、水性媒質に可溶な
高分子量の誘導体形態のニコチンアミド・アデニン・ジ
ヌクレオチド補酵素を用いて、および２つの精製された
酵素、すなわち基質の特殊なデヒドロゲナーゼ（Ｌ−ア
ミノ酸デヒドロゲナーゼ）および補酵素の再生に用いら
れる蟻酸デヒドロゲナーゼを用いて、Ｌ−α−アミノ酸
を合成る、。
この方法は、いくつかの不都合を右る、。１“なわち、
・２つのｍ脳内酵素を使用る、こと。これらは、蟻酸デ
ヒドロゲナーゼの場合はカンデイダ・ボイディニイ（Ｃ
ａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ）またはシュードモ
ナス・オキサラティクス（Ｐｓｅｕｄｏｍ。
ヒドロゲナーゼの場合はカンデイダ・ボイディニイ（Ｃ
ａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ）またはシュードモ
ナス・オキサラティクス（Ｐｓｅｕｄｏｍ。
ｎａｓ ｏｘａｌａｔｉｃｕｓ）およびＬ−アミノ酸デ
ヒドロゲナーゼの場合はバチルス・スブテイリス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ）という２つの異な
る微生物に由来る、。このことは異なる２つの培養おＪ
：び細胞内酵素の２つの異なる抽出手順を意味る、。
ヒドロゲナーゼの場合はバチルス・スブテイリス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ）という２つの異な
る微生物に由来る、。このことは異なる２つの培養おＪ
：び細胞内酵素の２つの異なる抽出手順を意味る、。
・２つの精￥ＪｗＩ素による製造法を用いること。
これは高価な精製操作を意味る、。
問題点の解決手段
本発明の目的の１つは、これらの不都合を解消る、こと
である。もう１つの目的は、ニコチンアミド・アデニン
・ジヌクレオチドを再生る、と同時にＬ−α−アミノ酸
を製造る、ことである。
である。もう１つの目的は、ニコチンアミド・アデニン
・ジヌクレオチドを再生る、と同時にＬ−α−アミノ酸
を製造る、ことである。
本発明によるＬ−α−アミノ酸の新規製造方法は、少な
くとも１つのα−ケト酸またはその少なくとも１つの塩
と、アンモニウムイオン源と、還元型または酸化型のニ
コチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドと還元剤との
混合物を、微生物の菌株の培養により生じた酵素粗成物
の作用に付すＬ−α−アミノ酸の製造方法において、唯
一の微生物菌株としてバチルス（ＢａｃｉｌｌｕＳ）菌
株を使用る、こと特徴とる、。
くとも１つのα−ケト酸またはその少なくとも１つの塩
と、アンモニウムイオン源と、還元型または酸化型のニ
コチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドと還元剤との
混合物を、微生物の菌株の培養により生じた酵素粗成物
の作用に付すＬ−α−アミノ酸の製造方法において、唯
一の微生物菌株としてバチルス（ＢａｃｉｌｌｕＳ）菌
株を使用る、こと特徴とる、。
好ましくは、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｆｌｕ
ｓ ｎ＋ｅｇａｔｅｒ；ｕＩｌｌ）菌株の培養生成物
を使用る、。さらに好ましくは、特別高いＬ−α−アミ
ノ酸収率を得るために、バチルス・メガテリウム（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔａｒｉｕｍ ） Ａ Ｔ
Ｃ，Ｃ３９１１８菌株の培養生成物を用いる。
ｓ ｎ＋ｅｇａｔｅｒ；ｕＩｌｌ）菌株の培養生成物
を使用る、。さらに好ましくは、特別高いＬ−α−アミ
ノ酸収率を得るために、バチルス・メガテリウム（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔａｒｉｕｍ ） Ａ Ｔ
Ｃ，Ｃ３９１１８菌株の培養生成物を用いる。
この菌株は、フランス特許公開箱２．５２６゜４４２＠
に記載された、当研究所の保存菌株バチルス・メガテリ
ウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒ＋ｕｍ）Ｉ
ＦＰ１８０の胞子形成の突然変異体である。
に記載された、当研究所の保存菌株バチルス・メガテリ
ウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒ＋ｕｍ）Ｉ
ＦＰ１８０の胞子形成の突然変異体である。
その他に、ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド
の再生レベルは、これが一般に１／あたり０．１ミリモ
ル〜１１あたり１０ミリモルの触媒量で使用されつるの
で高い。
の再生レベルは、これが一般に１／あたり０．１ミリモ
ル〜１１あたり１０ミリモルの触媒量で使用されつるの
で高い。
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株の培養、好ましくは
バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇ
ａｔｅｒｉｕｍ ）菌株、より詳しくはＡＴＣＣ３９１
１８菌株の培養は、高いＬ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ
活性およびグルコース・デヒドロゲナーゼ活性を同時に
有る、酵素粗成物を生じることが発見された。このこと
は［−α−アミノ酸の製造および精製手順を用意にる、
。
バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇ
ａｔｅｒｉｕｍ ）菌株、より詳しくはＡＴＣＣ３９１
１８菌株の培養は、高いＬ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ
活性およびグルコース・デヒドロゲナーゼ活性を同時に
有る、酵素粗成物を生じることが発見された。このこと
は［−α−アミノ酸の製造および精製手順を用意にる、
。
本発明の方法において、一般に好ましくは前記２つの活
性を０．１：１〜１０：１の割合で有る、バチルス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ）の酵素粗成物を使用る、。より好まし
くは、この酵素粗成物は実質的に等しいＬ−アミノ酸デ
ヒドロゲナーゼ活性およびグルコース・デヒドロゲナー
ゼ活性を有してもよい。特に、これらの好ましい条件下
において、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｎｅｇａｔｅｒｉｕｍ ） Ａ Ｔ ＣＣ３９１１８菌
株の存在下に、優れたＬ−α−アミノ酸収率が得られた
。
性を０．１：１〜１０：１の割合で有る、バチルス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ）の酵素粗成物を使用る、。より好まし
くは、この酵素粗成物は実質的に等しいＬ−アミノ酸デ
ヒドロゲナーゼ活性およびグルコース・デヒドロゲナー
ゼ活性を有してもよい。特に、これらの好ましい条件下
において、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｎｅｇａｔｅｒｉｕｍ ） Ａ Ｔ ＣＣ３９１１８菌
株の存在下に、優れたＬ−α−アミノ酸収率が得られた
。
本発明の特徴によれば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）
、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｌ
ｌｅ（ｌａｔｅｒｉｕｍ ）またはＡＴＣＣ３９１１８
菌株の、はとｌυど精製されていないまたは精製されて
いる、粗酵素抽出物を用いて操作を行なうことができる
。
、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｌ
ｌｅ（ｌａｔｅｒｉｕｍ ）またはＡＴＣＣ３９１１８
菌株の、はとｌυど精製されていないまたは精製されて
いる、粗酵素抽出物を用いて操作を行なうことができる
。
粗酵素抽出物は、例えば適当な培地中でその成長が行な
われる培養の遠心分離または濾過によって採集された微
生物の破砕によって調製される。微生物の破砕のために
は、ガラス球を用いた破砕、超音波処理等のような技術
を用いる。
われる培養の遠心分離または濾過によって採集された微
生物の破砕によって調製される。微生物の破砕のために
は、ガラス球を用いた破砕、超音波処理等のような技術
を用いる。
細胞壁のデトリタスを除去る、ために、微生物の破砕物
の遠心分離後に粗酵素抽出物を得る。
の遠心分離後に粗酵素抽出物を得る。
このようにしてｍ製された粗酵素抽出物は、例えばポリ
アクリルアミド、アルギンｗｉ塩またはカラギーナンの
組合体のゲル中において、そのままの状態でまたは固定
化形態で、Ｌ−アミノ酸の合成に使用されつる。
アクリルアミド、アルギンｗｉ塩またはカラギーナンの
組合体のゲル中において、そのままの状態でまたは固定
化形態で、Ｌ−アミノ酸の合成に使用されつる。
さらには、例えば硫酸アンモニウム沈澱、穏和な加熱の
ような種々の処理の優、粗抽出物から精製抽出物を調製
る、ことができる。精製された酵素抽出物は、ついでそ
のままの状態であるいは固定化形態で、Ｌ−アミノ酸合
成に使υ１される。
ような種々の処理の優、粗抽出物から精製抽出物を調製
る、ことができる。精製された酵素抽出物は、ついでそ
のままの状態であるいは固定化形態で、Ｌ−アミノ酸合
成に使υ１される。
本発明のｂう１つの特徴によれば、バチルス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ） 、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｆｌ
ｕｓ ｌｅｇａｔ（３ｒｊｕｌ ）またはバチルス・
メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｃｒｉ
ｕｍ）ＡＴＣＣ３９１１８の完全な細胞を使用る、こと
−ｂできる。
ｌｌｕｓ） 、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｆｌ
ｕｓ ｌｅｇａｔ（３ｒｊｕｌ ）またはバチルス・
メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｃｒｉ
ｕｍ）ＡＴＣＣ３９１１８の完全な細胞を使用る、こと
−ｂできる。
これらは、例えば以下に記載る、適当な培地中において
生長が行なわれた培養の遠心分離または濾過によって採
集される。
生長が行なわれた培養の遠心分離または濾過によって採
集される。
本発明によれば、粗または精製酵素抽出物の使用に比し
て、完全な細胞の使用は、数多くの利点を伴う。そのう
ちで次のことが注目される。
て、完全な細胞の使用は、数多くの利点を伴う。そのう
ちで次のことが注目される。
・微生物の破砕、粗酵素抽出物を回収る、だめの破砕物
の遠心分離および場合によっては粗抽出物の精製の工程
を省くこと。これらの操作はすべて、求められる酵素活
性のレベルで無視しえない損失を伴う。
の遠心分離および場合によっては粗抽出物の精製の工程
を省くこと。これらの操作はすべて、求められる酵素活
性のレベルで無視しえない損失を伴う。
・α−ケト酸のＬ−α−アミノ酸への転換反応中に、核
酸によって、および酵素抽出物中に常に存在る、、バイ
オ変換に必要な酵素とは別のたん白質によって、全く汚
染されていないかまたはほとんど汚染されていない細胞
外反応培地を得ること。これは反応の終りに求められる
物質の精製手順のより大きな簡素化となって表われる。
酸によって、および酵素抽出物中に常に存在る、、バイ
オ変換に必要な酵素とは別のたん白質によって、全く汚
染されていないかまたはほとんど汚染されていない細胞
外反応培地を得ること。これは反応の終りに求められる
物質の精製手順のより大きな簡素化となって表われる。
・酵素システム期間中のより良好な安定性。
本発明のもう１つの特徴によれば、予め化学的または物
理化学的な透過処理を受１プた完全な細胞を用いること
もできる。透過処理は、一般にバイオ変換に含まれる酵
素活性が、実質的に悪化しないＪ：うな条件下において
行なわれる。
理化学的な透過処理を受１プた完全な細胞を用いること
もできる。透過処理は、一般にバイオ変換に含まれる酵
素活性が、実質的に悪化しないＪ：うな条件下において
行なわれる。
これらの処理は、一方で細胞内への反応基質の移動なら
びに細胞外培地の補酵素の移動、他方でａ Ｉｌｌ外へ
の細胞内培地の反応生成物の移動を促進る、ことを目的
と１°る。
びに細胞外培地の補酵素の移動、他方でａ Ｉｌｌ外へ
の細胞内培地の反応生成物の移動を促進る、ことを目的
と１°る。
当業者に良く知られた微生物の透過技術の中で、バクテ
リアを下記のものの存在下に置くことから成る化学的方
法を用いることができる：・いくつかの溶媒例えばトル
エン、アセトン、メタノール、ジメチルスルホキシド、
エチル・エーテル、フェネチル・アルコール等 ・いくつかの洗浄剤例えばＢｒ〜５８、Ｎ−セチル−Ｎ
、Ｎ、Ｎ−１−ジメチルアンモニウム・ブロマイド、ナ
トリウム・ドデシルスルフェート、ナトリウム・ラウリ
ルスルフェート、トリ１〜ンＸ１００、ツイーン８０等 ・いくつかのキレート剤例えばエチレン・ジアミン・テ
トラアセテート（ＥＤｆ八）・いくつかの抗生物質例え
ばナイスクチン、アムボテリシンＢ等。
リアを下記のものの存在下に置くことから成る化学的方
法を用いることができる：・いくつかの溶媒例えばトル
エン、アセトン、メタノール、ジメチルスルホキシド、
エチル・エーテル、フェネチル・アルコール等 ・いくつかの洗浄剤例えばＢｒ〜５８、Ｎ−セチル−Ｎ
、Ｎ、Ｎ−１−ジメチルアンモニウム・ブロマイド、ナ
トリウム・ドデシルスルフェート、ナトリウム・ラウリ
ルスルフェート、トリ１〜ンＸ１００、ツイーン８０等 ・いくつかのキレート剤例えばエチレン・ジアミン・テ
トラアセテート（ＥＤｆ八）・いくつかの抗生物質例え
ばナイスクチン、アムボテリシンＢ等。
さらに例えば破砕（例えば超音波によるもの）、凝固、
乾燥、凍結乾燥、加熱等のような物理的方法を用いるこ
ともできる。
乾燥、凍結乾燥、加熱等のような物理的方法を用いるこ
ともできる。
本発明の方法によれば、固定化形態の完全なＩ胞または
透過されついで固定化された完全な細胞を用いることが
できる。
透過されついで固定化された完全な細胞を用いることが
できる。
当業者に良く知られた微生物の固定化技術のうちで、下
記のものを用いることができるニー例えば多孔質珪藻土
、粉砕レンガ、イオン交換樹脂、ガラス球、木くず、セ
ラミック等のような担体への微生物の吸着技術 ・例えば寒天、アルギン酸カルシウム、カラギーナン、
ポリアクリルアミド等のような重合体のゲル中への微生
物の包括技術 ・例えばグルタルアルデヒド、インシアネート等のよう
な薬剤との共有結合による、種々の担体、シリカ球、溶
融ガラスへの微生物のカップリング技術 バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ） 、バチルス・メガテリ
ウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｃｒｉｕｍ ）
およびＡＴＣＣ３９１１８菌株の培養を行なうのに好ま
しい条件は、下記のとおりである。
記のものを用いることができるニー例えば多孔質珪藻土
、粉砕レンガ、イオン交換樹脂、ガラス球、木くず、セ
ラミック等のような担体への微生物の吸着技術 ・例えば寒天、アルギン酸カルシウム、カラギーナン、
ポリアクリルアミド等のような重合体のゲル中への微生
物の包括技術 ・例えばグルタルアルデヒド、インシアネート等のよう
な薬剤との共有結合による、種々の担体、シリカ球、溶
融ガラスへの微生物のカップリング技術 バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ） 、バチルス・メガテリ
ウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｃｒｉｕｍ ）
およびＡＴＣＣ３９１１８菌株の培養を行なうのに好ま
しい条件は、下記のとおりである。
単糖または少糖例えばグルコース、ラクト−ス、フルク
トースまたはスクロースが、少なくとも１ｇ／ｌ、好ま
しくは１〜４０ａ／ｌの濃度で培地中に存在る、ことは
、一般には、高いグルコース・デヒドロゲナーゼおよび
Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ活性を得るのに有効であ
ることが証明されている。無機窒素（アンモニウムイオ
ン形態）および／または有機窒素＃Ｑ好ましくは例えば
ウレア形態またはアミノ酸形態の有機窒素（例えば特に
酵母菌の抽出物、大豆のペプトン、力ぜインの氷解物、
とうもろこしの解離液、肉の抽出物等）の０．１〜３％
の量の添加によって、好気培地中において良好な生長お
よび高い酵素活性を得ることができる。無機成分例えば
カリウム、ナトリウム、マグネシウムおよび痕跡要素、
例えば鉄、マンガン、モリブデンの塩形前（硫酸塩、燐
酸塩、塩化物）の添加によっても同様に生長をさらに改
善る、ことができる。培養培地の条件は、通常下記のと
おりである。温度２０〜４０℃、Ｉ）Ｈ＝５．５〜８．
０゜温度２７〜３２℃、ｐｔｔ６．５〜７゜５の範囲内
で優れた活性水準が得られた。
トースまたはスクロースが、少なくとも１ｇ／ｌ、好ま
しくは１〜４０ａ／ｌの濃度で培地中に存在る、ことは
、一般には、高いグルコース・デヒドロゲナーゼおよび
Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ活性を得るのに有効であ
ることが証明されている。無機窒素（アンモニウムイオ
ン形態）および／または有機窒素＃Ｑ好ましくは例えば
ウレア形態またはアミノ酸形態の有機窒素（例えば特に
酵母菌の抽出物、大豆のペプトン、力ぜインの氷解物、
とうもろこしの解離液、肉の抽出物等）の０．１〜３％
の量の添加によって、好気培地中において良好な生長お
よび高い酵素活性を得ることができる。無機成分例えば
カリウム、ナトリウム、マグネシウムおよび痕跡要素、
例えば鉄、マンガン、モリブデンの塩形前（硫酸塩、燐
酸塩、塩化物）の添加によっても同様に生長をさらに改
善る、ことができる。培養培地の条件は、通常下記のと
おりである。温度２０〜４０℃、Ｉ）Ｈ＝５．５〜８．
０゜温度２７〜３２℃、ｐｔｔ６．５〜７゜５の範囲内
で優れた活性水準が得られた。
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）またはバチルス・メガテ
リウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ
）特に、ＡＴＣｏ ３９１１８ 菌株から、例えば遠
心分離によってバクテリアを採集る、ことができる。こ
れらのバクテリアのアリコート部分の抽出物から、下記
条件下において、常法により、酵素活性を測定る、こと
ができる：温度３０℃、各酵素について最大活性のｐｔ
ｔ、飽和基質のｍ度。
リウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ
）特に、ＡＴＣｏ ３９１１８ 菌株から、例えば遠
心分離によってバクテリアを採集る、ことができる。こ
れらのバクテリアのアリコート部分の抽出物から、下記
条件下において、常法により、酵素活性を測定る、こと
ができる：温度３０℃、各酵素について最大活性のｐｔ
ｔ、飽和基質のｍ度。
実質的に化学量論割合において使用される代りに再生さ
れるので、還元型（Ｎ Ａ Ｄ Ｈ）または酸化型（Ｎ
ＡＤ＋ ）の補酵素は、１１あたり０．１〜１０ミリモ
ル、好ましくは１１あたり０．３〜３ミリモルの濃度で
使用されることができる。これは特に高分子ｍ （５０
０〜５００００）の重合形態で使用されることができる
。
れるので、還元型（Ｎ Ａ Ｄ Ｈ）または酸化型（Ｎ
ＡＤ＋ ）の補酵素は、１１あたり０．１〜１０ミリモ
ル、好ましくは１１あたり０．３〜３ミリモルの濃度で
使用されることができる。これは特に高分子ｍ （５０
０〜５００００）の重合形態で使用されることができる
。
補酵素の還元剤がグルコースである時、Ｌ−α−アミノ
酸の非常に良好な製造結果が得られた。
酸の非常に良好な製造結果が得られた。
所３ＷＬ−α−アミノ酸の合成は、温度１０〜６０℃、
好ましくは２０〜４５℃に維持された反応器内において
行なわれる。培地のｐＨを６〜１０の選ばれた値に維持
る、。塩基好ましくはアンモニアの添加によって、これ
を好ましくは実質的に一定に維持る、。アンモニアの反
応器への添加は、２重の意味で必要である。ずなわち、
調整剤としてと同時に、これが第１酵素反応すなわちα
−ケト酸の還元アミン化に参加る、ので、反応体として
も必要である。α−ケト酸１モルあたり、アンモニウム
イオン源を、アンモニア表示で１〜３モル注入して、良
好な結果が得られた。
好ましくは２０〜４５℃に維持された反応器内において
行なわれる。培地のｐＨを６〜１０の選ばれた値に維持
る、。塩基好ましくはアンモニアの添加によって、これ
を好ましくは実質的に一定に維持る、。アンモニアの反
応器への添加は、２重の意味で必要である。ずなわち、
調整剤としてと同時に、これが第１酵素反応すなわちα
−ケト酸の還元アミン化に参加る、ので、反応体として
も必要である。α−ケト酸１モルあたり、アンモニウム
イオン源を、アンモニア表示で１〜３モル注入して、良
好な結果が得られた。
ｐＨ６，５〜８．５が、使用される酵素およびニコチン
アミド・アデニン・ジヌクレオチドの安定性のために特
に有利である。実際、ｐＨの選択はこの後者の化合物に
とって重要である。この化合物の還元型が酸性培地では
不安定であり、その酸化型がアルカリ培地中で不安定で
あるからである。Ｗ函数、例えば燐酸の可溶塩例えば燐
酸アンモニウムの培地中の存在は、培地の０１１４３よ
び酵素の安定性を維持る、のに有効であろう。さらには
酵素の安定化剤を添加してもよい。
アミド・アデニン・ジヌクレオチドの安定性のために特
に有利である。実際、ｐＨの選択はこの後者の化合物に
とって重要である。この化合物の還元型が酸性培地では
不安定であり、その酸化型がアルカリ培地中で不安定で
あるからである。Ｗ函数、例えば燐酸の可溶塩例えば燐
酸アンモニウムの培地中の存在は、培地の０１１４３よ
び酵素の安定性を維持る、のに有効であろう。さらには
酵素の安定化剤を添加してもよい。
この中では、チオール基を有る、化合物、例えば２−メ
ルカプトエタノール ール等が特に効果的である。
ルカプトエタノール ール等が特に効果的である。
好ましい操作方法を以下に記載る、。反応器内に、選定
した成分、特に緩衝液、ＮＡＤ＋（またはＮ Ａ Ｄ
ｌ−１ ’）あるいは、バチルス（Ｂａｃｉｆｌｕｓ）
、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇ
ａｔｅｒｉｕａ ）またはＡＴＣｏ ３９１１Ｂ 菌
株、あるいは培養の遠心分離後に採集された完全なバク
テリアであって、透過されおよび／または固定化される
かまたは予め処理されていないものを導入る、。反応に
必要な還元剤の一部例えばグルコースを、反応のはじめ
に導入る、。実際、反応器内には、グルコースの高すぎ
る濃度の存在は避ける方がよい。これは、し−アミノ酸
デヒドロゲナーゼ酵素活性に対る、阻害作用を有る、こ
ともあるからである。同様に、反応器中にα−ケト酸の
高濃度の存在をも避けるのが好ましい。これはＬ−アミ
ノ酸デヒドロゲナーゼ酵素活性に対る、阻害作用を有し
ていることもあるからである。従って、反応器内に、水
溶液形態のこれら２つの化合物を連続して注入る、のが
しばしば有利である。これらの還元剤（例えばグルコー
ス）の量は、α−ケト酸１モルあたり１〜２モルである
。α−ケト酸は、酸形態またはそれらの塩の１つ特にＮ
ａ＋、Ｋ÷、ＮＨ４＋、Ｌｉ＋の塩の形態で導入されて
もよい。注入流量は、好ましくは、反応の制限パラメー
ターが、α−ケト酸の補給であるようにして調節される
。この後者の化合物は、その際、実質的にその導入に応
じてＬ−アミノ酸に転換される。
した成分、特に緩衝液、ＮＡＤ＋（またはＮ Ａ Ｄ
ｌ−１ ’）あるいは、バチルス（Ｂａｃｉｆｌｕｓ）
、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇ
ａｔｅｒｉｕａ ）またはＡＴＣｏ ３９１１Ｂ 菌
株、あるいは培養の遠心分離後に採集された完全なバク
テリアであって、透過されおよび／または固定化される
かまたは予め処理されていないものを導入る、。反応に
必要な還元剤の一部例えばグルコースを、反応のはじめ
に導入る、。実際、反応器内には、グルコースの高すぎ
る濃度の存在は避ける方がよい。これは、し−アミノ酸
デヒドロゲナーゼ酵素活性に対る、阻害作用を有る、こ
ともあるからである。同様に、反応器中にα−ケト酸の
高濃度の存在をも避けるのが好ましい。これはＬ−アミ
ノ酸デヒドロゲナーゼ酵素活性に対る、阻害作用を有し
ていることもあるからである。従って、反応器内に、水
溶液形態のこれら２つの化合物を連続して注入る、のが
しばしば有利である。これらの還元剤（例えばグルコー
ス）の量は、α−ケト酸１モルあたり１〜２モルである
。α−ケト酸は、酸形態またはそれらの塩の１つ特にＮ
ａ＋、Ｋ÷、ＮＨ４＋、Ｌｉ＋の塩の形態で導入されて
もよい。注入流量は、好ましくは、反応の制限パラメー
ターが、α−ケト酸の補給であるようにして調節される
。この後者の化合物は、その際、実質的にその導入に応
じてＬ−アミノ酸に転換される。
反応の間に形成されるＬ−α−アミノ酸は、当業者に知
られた技術、例えばＬ−アミノ酸オキシダーゼを用いて
酵素によって、またはアミノ酸の自動分析器を用いて定
量されつる。
られた技術、例えばＬ−アミノ酸オキシダーゼを用いて
酵素によって、またはアミノ酸の自動分析器を用いて定
量されつる。
反応終了時に、例えば陽イオン交換樹脂上の通過によっ
て形成されたＬ−α−アミノ酸を抽出し、ついで減圧不
溶出液を蒸発させてもよい。
て形成されたＬ−α−アミノ酸を抽出し、ついで減圧不
溶出液を蒸発させてもよい。
例として、本発明による方法によって、次のα−ケト酸
またはそれらの塩の１つから、下記合成を実施る、こと
ができる。
またはそれらの塩の１つから、下記合成を実施る、こと
ができる。
・ピルビン酸からＬ−アラニン
・ヒドロキシピルビン酸からＬ−セリン・α−ケトイソ
カブ０ン酸からＬ−ロイシン・３−メチル−２−オキソ
酪酸からＬ−バリン ・３−メチル−２−オキソ古草酸からＬ−イソロイシン ・フェニルピルビン酸からしーフェニルアラニン 発明の効果 本発明の方法によれば、唯一の微生物菌株としてバチル
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株を使用る、ので、本書冒頭
で説明した従来技術の問題点をことごとく解消る、こと
ができるうえに、ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレ
オチドを再生る、と同時にＬ−α−アミノ酸を製造る、
ことができる。
カブ０ン酸からＬ−ロイシン・３−メチル−２−オキソ
酪酸からＬ−バリン ・３−メチル−２−オキソ古草酸からＬ−イソロイシン ・フェニルピルビン酸からしーフェニルアラニン 発明の効果 本発明の方法によれば、唯一の微生物菌株としてバチル
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株を使用る、ので、本書冒頭
で説明した従来技術の問題点をことごとく解消る、こと
ができるうえに、ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレ
オチドを再生る、と同時にＬ−α−アミノ酸を製造る、
ことができる。
実 施 例
本発明を例証る、下記実施例を、非限定的な例として挙
げる。
げる。
実施例１：Ｌ−ロイシンの製造
バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＋ｍｅ
ｇａｔ５ｒｉｕｉ ） Ａ Ｔ ＣＣ３９１１８菌株を
、下記Ｉｔ Ｊｉｌｃ （７）培地中においてフエルン
バツハフラスコで培養る、。
ｇａｔ５ｒｉｕｉ ） Ａ Ｔ ＣＣ３９１１８菌株を
、下記Ｉｔ Ｊｉｌｃ （７）培地中においてフエルン
バツハフラスコで培養る、。
・カゼインのトリプシン氷解物 １７Ｇ・大豆のパパ
イン・ペプトン ３０・塩化ナトリウム
５ｑ・リン酸水素二カリウム ２．５
ｇ・グルコース ２．５０・蒸留水
１１この培地を植菌前に１１
５℃で３０分間殺菌る、。培養を温度３０℃、ａｌｌ＝
７．０で２４時間実施る、。ついで細胞を遠心分離によ
って採集し、１００ｍＭ、 ｐＨニア ７ 、５の燐酸
カリウム緩衝液中に懸濁させ、細胞懸濁液の温度が決し
て１０℃を超えないようにこれを絶えず冷却しながら、
２分間超音波処理の間破砕した。遠心分離によって細胞
デトリタスを除去し、酵素抽出物を回収る、。これにつ
いて、グルコース・デヒドロゲナーゼおよびロイシン・
デヒドロゲナーゼの酵素活性を測定る、。グルコース・
デヒドロゲナーゼの酵素活性は、抽出物のたん白質１１
１１（Ｉあたり０．２３単位であることがわかる。
イン・ペプトン ３０・塩化ナトリウム
５ｑ・リン酸水素二カリウム ２．５
ｇ・グルコース ２．５０・蒸留水
１１この培地を植菌前に１１
５℃で３０分間殺菌る、。培養を温度３０℃、ａｌｌ＝
７．０で２４時間実施る、。ついで細胞を遠心分離によ
って採集し、１００ｍＭ、 ｐＨニア ７ 、５の燐酸
カリウム緩衝液中に懸濁させ、細胞懸濁液の温度が決し
て１０℃を超えないようにこれを絶えず冷却しながら、
２分間超音波処理の間破砕した。遠心分離によって細胞
デトリタスを除去し、酵素抽出物を回収る、。これにつ
いて、グルコース・デヒドロゲナーゼおよびロイシン・
デヒドロゲナーゼの酵素活性を測定る、。グルコース・
デヒドロゲナーゼの酵素活性は、抽出物のたん白質１１
１１（Ｉあたり０．２３単位であることがわかる。
ロイシン・デヒドロゲナーゼの酵素活性は、抽出物のた
ん白質ｌｌｌ１ｇあたり０．１３単位である。
ん白質ｌｌｌ１ｇあたり０．１３単位である。
酵素の単位は、実験条件下、１分あたり基質（グルコー
ス・デヒドロゲナーゼの場合グルコース、ロイシン・デ
ヒドロゲナーゼの場合α−ケトイソカブＯン酸またはそ
の塩の１つ）１ミクロモルの転換を可能にる、酵素の量
として定義される。
ス・デヒドロゲナーゼの場合グルコース、ロイシン・デ
ヒドロゲナーゼの場合α−ケトイソカブＯン酸またはそ
の塩の１つ）１ミクロモルの転換を可能にる、酵素の量
として定義される。
この酵素抽出物のアリコート部分を４℃以上で限外濾過
により約５回濃縮し、得られた濃縮酵素抽出物を次に１
−ロイシンの合成に用いた。
により約５回濃縮し、得られた濃縮酵素抽出物を次に１
−ロイシンの合成に用いた。
Ｌ−ロイシンの合成を、当初液体容積５０ｍ１を用いて
、棒磁石によって撹１マされかつ３０℃に恒温化されて
いる１５０ｍ／反応器で行なった。当初液体培地は、下
記成分を含む：・燐酸アンモニウム緩衝液ｐＨ＝ ８．
２１モル／ｌ ・ＮＡＤ＋ １ミリモル／Ｉ・グルコ
ース ５０ミリモル／ｌ・上記のようにして得
られた濃縮酵素抽出物＝１２．５＋ａ／ずなわちグルコ
ース・デヒドロゲナーゼ２９０単位およびロイシン・デ
ヒドロゲナーゼ１２２単位 １１あたり２００ミリモルのケトイソカプロン酸ナトリ
ウムと１／あたり２２０ミリ七ルのグルコースを含むｐ
Ｈ＝７．０の溶液を、１．５Ｉｌｌ／ｈの流量で、連続
して注入る、。２Ｎアンモニアを添加して、ｐＨを８．
２に維持る、。
、棒磁石によって撹１マされかつ３０℃に恒温化されて
いる１５０ｍ／反応器で行なった。当初液体培地は、下
記成分を含む：・燐酸アンモニウム緩衝液ｐＨ＝ ８．
２１モル／ｌ ・ＮＡＤ＋ １ミリモル／Ｉ・グルコ
ース ５０ミリモル／ｌ・上記のようにして得
られた濃縮酵素抽出物＝１２．５＋ａ／ずなわちグルコ
ース・デヒドロゲナーゼ２９０単位およびロイシン・デ
ヒドロゲナーゼ１２２単位 １１あたり２００ミリモルのケトイソカプロン酸ナトリ
ウムと１／あたり２２０ミリ七ルのグルコースを含むｐ
Ｈ＝７．０の溶液を、１．５Ｉｌｌ／ｈの流量で、連続
して注入る、。２Ｎアンモニアを添加して、ｐＨを８．
２に維持る、。
２４時間後、反応器中の液体容積は、８６ｍ１であり、
Ｌ−アミノ酸オキシイーゼ酵素定聞法によって測定され
た、形成されたＬ−ロイシン濃度は、１１あたり６５ミ
リモルである。Ｌ−ロイシンの製造は５．６ミリモルで
あり、注入されたα−ケトイソカブロン酸ナトリウムに
対してモル収率７８％である。２Ｎアンモニア涜費聞は
５．７ミリリツ１〜ルである。
Ｌ−アミノ酸オキシイーゼ酵素定聞法によって測定され
た、形成されたＬ−ロイシン濃度は、１１あたり６５ミ
リモルである。Ｌ−ロイシンの製造は５．６ミリモルで
あり、注入されたα−ケトイソカブロン酸ナトリウムに
対してモル収率７８％である。２Ｎアンモニア涜費聞は
５．７ミリリツ１〜ルである。
実施例に記載されたＬ−α−アミノ酸の精製は、下記の
ように行なわれる： １Ｎ塩酸を用いた洗浄ついで水洗浄により、予め）」十
形態にされた陽イオン交換樹脂Ａｌｌ１ｂＱｒｌｉｔｅ
ＥＲ１５１の塔頂に、反応培地を入れる。
ように行なわれる： １Ｎ塩酸を用いた洗浄ついで水洗浄により、予め）」十
形態にされた陽イオン交換樹脂Ａｌｌ１ｂＱｒｌｉｔｅ
ＥＲ１５１の塔頂に、反応培地を入れる。
試料の導入後、塔を再び水で洗浄し、ついで２Ｎアンモ
ニアを用いて溶離る、。塔の「死」容積に対応る、溶離
液の容積の通過後、溶離されたフラクションの回収を開
始し、これらの総容積が、塔の死容積の１．５侶になる
まで回収る、。ついで溶出液を減圧不蒸発させ、水中に
再溶解し、再び蒸発させる。精製収率は９８％である。
ニアを用いて溶離る、。塔の「死」容積に対応る、溶離
液の容積の通過後、溶離されたフラクションの回収を開
始し、これらの総容積が、塔の死容積の１．５侶になる
まで回収る、。ついで溶出液を減圧不蒸発させ、水中に
再溶解し、再び蒸発させる。精製収率は９８％である。
実施例２：Ｌ−バリンの製造
酵素抽出物の調製を、実施例１に記載されたのと同じ条
件下において実施る、。ただし、バチルス・メガテリウ
ム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｃｇａｔｅｒｉｕｌ ）
ＡＴＣＣ３９１１８の培養は３０時間続き、酵素抽出物
を粗の状態で用いた。グルコース・デヒドロゲナーゼお
よびＬ−バリン・デヒドロゲナーゼの酵素活性は、各々
、抽出物のたん白質１ｍｇあたり０．３甲位である。
件下において実施る、。ただし、バチルス・メガテリウ
ム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｃｇａｔｅｒｉｕｌ ）
ＡＴＣＣ３９１１８の培養は３０時間続き、酵素抽出物
を粗の状態で用いた。グルコース・デヒドロゲナーゼお
よびＬ−バリン・デヒドロゲナーゼの酵素活性は、各々
、抽出物のたん白質１ｍｇあたり０．３甲位である。
Ｌ−バリンの合成を、撹拌されかつ３０℃に恒温化され
た１５０１１１／反応器において実施る、。当初容積が
５Ｑｍ／の培地の成分は、グルコース・デヒドロゲナー
ゼ５０単位とＬ−バリン・デヒドロゲナーゼ５０単位と
を含む酵素抽出物８．５ａ＋ ／の存在下、実施例１と
同じである。
た１５０１１１／反応器において実施る、。当初容積が
５Ｑｍ／の培地の成分は、グルコース・デヒドロゲナー
ゼ５０単位とＬ−バリン・デヒドロゲナーゼ５０単位と
を含む酵素抽出物８．５ａ＋ ／の存在下、実施例１と
同じである。
１１あたり２００ミリモルの３−メチル−２−オキソ酪
酸ナトリウムと１１あたり２２０ミリモルのグルコース
とを含むｐｔｌ＝７．０の溶液を、１．５＋＋ ／／ｈ
の流量で連続して注入る、。
酸ナトリウムと１１あたり２２０ミリモルのグルコース
とを含むｐｔｌ＝７．０の溶液を、１．５＋＋ ／／ｈ
の流量で連続して注入る、。
２Ｎアンモニアの添加によってｐＨを８．２に維持る、
。
。
合成反応を２４時間後に停止る、。反応器の液体容積は
この時９０ｍ／であり、形成されたＬ−バリン濃度は１
１あたり８０ミリモルである。Ｌ−バリン合成のモル収
率は、反応黒白に導入された３−メチル−２−オキソ酪
酸す１−リウムに対して１００％であり、Ｌ−バリン製
造は７．２ミリモルである。２Ｎアンモニア消費は７．
４ミリリツトルである。
この時９０ｍ／であり、形成されたＬ−バリン濃度は１
１あたり８０ミリモルである。Ｌ−バリン合成のモル収
率は、反応黒白に導入された３−メチル−２−オキソ酪
酸す１−リウムに対して１００％であり、Ｌ−バリン製
造は７．２ミリモルである。２Ｎアンモニア消費は７．
４ミリリツトルである。
実施例３：バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ） Ａ Ｔ ＣＣ３９１１８細
胞による補酵素の添加を行なわない Ｌ−バリンの製造 ［−バリンの合成を実施例２に記載されたのと同じ条件
下で実施る、。ただし当初培地にＮＡＤ＋を再添加しな
い。
ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ） Ａ Ｔ ＣＣ３９１１８細
胞による補酵素の添加を行なわない Ｌ−バリンの製造 ［−バリンの合成を実施例２に記載されたのと同じ条件
下で実施る、。ただし当初培地にＮＡＤ＋を再添加しな
い。
２４時間の反応後、Ｌ−バリンの濃度は相変らずＯであ
り、３−メチル−２−オキソＮＩＰｌｉすｈリウムは消
費されなかった。
り、３−メチル−２−オキソＮＩＰｌｉすｈリウムは消
費されなかった。
実施例４：バチルス・スブテイリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ） １６８ Ｍの粗抽出物によるＬ−
バリンの製造 バチルス・スブテイリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂ
ｔｉ１ｉｓ ） １６８Ｍ菌株を、実施例１と同じ条件
下で３０時間培養る、。この培養を終えた粗抽出物のグ
ルコース・デヒドロゲナーゼ活性は、たん白質１１１ｇ
あたり０．０７単位であり、３−メチル−２−オキソブ
チレートの存在下において測定したＬ−バリンーデヒド
ロゲナーぜ活性は、たん白質ｌｌｌ１ｇあたり０．０８
単位である。
ｓｕｂｔｉｌｉｓ） １６８ Ｍの粗抽出物によるＬ−
バリンの製造 バチルス・スブテイリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂ
ｔｉ１ｉｓ ） １６８Ｍ菌株を、実施例１と同じ条件
下で３０時間培養る、。この培養を終えた粗抽出物のグ
ルコース・デヒドロゲナーゼ活性は、たん白質１１１ｇ
あたり０．０７単位であり、３−メチル−２−オキソブ
チレートの存在下において測定したＬ−バリンーデヒド
ロゲナーぜ活性は、たん白質ｌｌｌ１ｇあたり０．０８
単位である。
例えば限外濾過による酵素抽出物の濃縮後、３−メチル
−２−オキソ酪酸す１〜リウムから、実施例２によるＬ
−バリンの合成を行ない、１８％の収率を得る。
−２−オキソ酪酸す１〜リウムから、実施例２によるＬ
−バリンの合成を行ない、１８％の収率を得る。
実施例５：Ｌ−イソロイシンの製造
実施例２に記載されているのと同じ酵素抽出物を用いる
。グルコース・デヒドロゲナーゼの酵素活性は、抽出物
のたん白質１１１１！＋あたり０゜３０単位であり、Ｌ
−イソロイシン・デヒドロゲナーゼの酵素活性は、抽出
物のだｌυ白質ｌｆｆ１ｇあたり０．２５単位である。
。グルコース・デヒドロゲナーゼの酵素活性は、抽出物
のたん白質１１１１！＋あたり０゜３０単位であり、Ｌ
−イソロイシン・デヒドロゲナーゼの酵素活性は、抽出
物のだｌυ白質ｌｆｆ１ｇあたり０．２５単位である。
前記実施例にすでに記載された装置において、し−イソ
ロイシンの合成を実施る、。当初容積が５０ｍ／の培地
の成分は、グルコース・デヒドロゲナーゼ４４単位と、
し−イソロイシン・デヒドロゲナーゼ４４単位を含む酵
素抽出物９１／の存在下において、実施例１と同じであ
る。
ロイシンの合成を実施る、。当初容積が５０ｍ／の培地
の成分は、グルコース・デヒドロゲナーゼ４４単位と、
し−イソロイシン・デヒドロゲナーゼ４４単位を含む酵
素抽出物９１／の存在下において、実施例１と同じであ
る。
１／あたり２００ミリモルの３−メチル−２−オキソ吉
草酸ナトリウムと、１／あたり２２０ミリモルのグルコ
ースを含むｐｔ＋＝７．ｏの溶液を、流量１．５＋１１
／／ｈで連続して注入る、。
草酸ナトリウムと、１／あたり２２０ミリモルのグルコ
ースを含むｐｔ＋＝７．ｏの溶液を、流量１．５＋１１
／／ｈで連続して注入る、。
２Ｎアンモニアの添加によってｐＨを８．２に維持る、
。
。
２４時間の反応後、反応器における液体容積は８９Ｉｌ
ｌ／であり、形成したＬ−イソロイシン濃度は、１１あ
たり７８ミリモルである。注入された３−メチル−２−
オキソ吉草酸ナトリウムに対る、Ｌ−イソロイシンの合
成モル収率は９７％である。
ｌ／であり、形成したＬ−イソロイシン濃度は、１１あ
たり７８ミリモルである。注入された３−メチル−２−
オキソ吉草酸ナトリウムに対る、Ｌ−イソロイシンの合
成モル収率は９７％である。
実施例６：Ｌ−フェニルアラニンの製造酵素抽出物を実
施例２のように調製し、たん白質１１１１（ｌあたり０
．０３単位のＬ−フェニルアラニン・デヒドロゲナーゼ
酵素活性と、たん白Ｗ １１１１３あたりの０．３０単
位のグルコース・デヒドロゲナーゼ活性を測定る、。
施例２のように調製し、たん白質１１１１（ｌあたり０
．０３単位のＬ−フェニルアラニン・デヒドロゲナーゼ
酵素活性と、たん白Ｗ １１１１３あたりの０．３０単
位のグルコース・デヒドロゲナーゼ活性を測定る、。
抽出物の濃縮後、実施例１に従ってフェニルピルビン酸
ナトリウムからし−フェニルアラニンの製造を実施し、
精１！Ｊ後３８％の収率を１！る、。
ナトリウムからし−フェニルアラニンの製造を実施し、
精１！Ｊ後３８％の収率を１！る、。
実施例７：固定化されたバチルス・メガテリウム（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｃｒｉｕｎ＋ ） ＡＴＣＣ
３９１１８の粗抽出によるＬ−バリンの製造 ＰＩ＃Ｊ素抽出物のＩ製を、実施例１において用いたの
と同様の条件下において行なう。ただしバチルス・メガ
テリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｒｕ＋ｇ
）ＡＴＣＣ３９１１８の培養時間を３０〜４０時間に
延長した。
ｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｃｒｉｕｎ＋ ） ＡＴＣＣ
３９１１８の粗抽出によるＬ−バリンの製造 ＰＩ＃Ｊ素抽出物のＩ製を、実施例１において用いたの
と同様の条件下において行なう。ただしバチルス・メガ
テリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｒｕ＋ｇ
）ＡＴＣＣ３９１１８の培養時間を３０〜４０時間に
延長した。
グルコース・デヒドロゲナーゼの酵素活性は、たｌυ白
質１ｍｇあたり０．９３単位であり、Ｌ−バリン・デヒ
ドロゲナーゼの酵素活性は、た／ｖ白質１ｍ（ｌあたり
０，２８単位であることがわかる。
質１ｍｇあたり０．９３単位であり、Ｌ−バリン・デヒ
ドロゲナーゼの酵素活性は、た／ｖ白質１ｍ（ｌあたり
０，２８単位であることがわかる。
細胞抽出物の１部分を、アルギン酸カルシウム球中にお
ける固定化処理に付す。このために、アルギン酸ナトリ
ウムを塩化ナトリウム０．９％溶液に添加し、この溶液
１６ｍ／を抽出物８１１Ｉに混合る、。細胞抽出物との
混合物中に２％のアルギン酸塩の最終濃度を得るように
してアルギン酸塩の溶液を調製］る。
ける固定化処理に付す。このために、アルギン酸ナトリ
ウムを塩化ナトリウム０．９％溶液に添加し、この溶液
１６ｍ／を抽出物８１１Ｉに混合る、。細胞抽出物との
混合物中に２％のアルギン酸塩の最終濃度を得るように
してアルギン酸塩の溶液を調製］る。
抽出されたアルギン酸塩混合物を、撹拌された０、１Ｍ
のＣａＣｌ２溶液中に、１Ｗ４ずつ規則的に入れる。す
べての球が形成されると、これらを２時間、撹拌下にＣ
ａＣ／２溶液と接触させておく。次に抽出物を含むアル
ギン酸カルシウム・ゲル球を、濾過によって回収し、つ
いで０．９％のＮａＣ／溶液で洗浄る、。ゲル球は、Ｃ
ａＣ／２を１０ミリモル含む、Ｏ，ＩＭ。
のＣａＣｌ２溶液中に、１Ｗ４ずつ規則的に入れる。す
べての球が形成されると、これらを２時間、撹拌下にＣ
ａＣ／２溶液と接触させておく。次に抽出物を含むアル
ギン酸カルシウム・ゲル球を、濾過によって回収し、つ
いで０．９％のＮａＣ／溶液で洗浄る、。ゲル球は、Ｃ
ａＣ／２を１０ミリモル含む、Ｏ，ＩＭ。
ｐＨ５０コハク酸塩緩衝液中に４℃で保存できる。
Ｌ−バリンの合成は、実施例２と同一の当初条件下に実
施される。ただし、反応器は、アルギン酸塩中で固定化
された抽出物８１／、すなわちグルコース・デヒドロゲ
ナーゼ２７６Ｉｌ′！位とＬ−バリン・デヒドロゲナー
ゼ８４単位を含む。
施される。ただし、反応器は、アルギン酸塩中で固定化
された抽出物８１／、すなわちグルコース・デヒドロゲ
ナーゼ２７６Ｉｌ′！位とＬ−バリン・デヒドロゲナー
ゼ８４単位を含む。
１１あたり３００ミリモルの３−メチル−２−オキソ酪
酸ナトリウムと、１１あたり３３０ミリモルのグルコー
スとを含むａｌ１７．０溶液を、流量０，５ｍ／／ｈで
連続して注入る、。２Ｎアンモニアの添加によって、ｐ
Ｈを８．２に維持る、。
酸ナトリウムと、１１あたり３３０ミリモルのグルコー
スとを含むａｌ１７．０溶液を、流量０，５ｍ／／ｈで
連続して注入る、。２Ｎアンモニアの添加によって、ｐ
Ｈを８．２に維持る、。
合成反応を２５時間後に止める。最終反応容積は６４ｍ
／であり、形成されたバリン濃度は１１あたり４０ミリ
モルである。注入された３−メチル−２−オキソ酪酸ナ
トリウムに対る、Ｌ−バリン合成のモル収率は６９％で
あり、Ｌ−バリンの製造は２．６ミリモルである。２Ｎ
アンモニア消費は６．３ｍ ／である。
／であり、形成されたバリン濃度は１１あたり４０ミリ
モルである。注入された３−メチル−２−オキソ酪酸ナ
トリウムに対る、Ｌ−バリン合成のモル収率は６９％で
あり、Ｌ−バリンの製造は２．６ミリモルである。２Ｎ
アンモニア消費は６．３ｍ ／である。
実施例８：酵母菌の抽出物をベースとる、培地において
培養されたバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｍＨａｔｅｒｉｕｍ ） Ａ Ｔ ＣＣ３９１１８の
粗抽出物によるＬ−アラニンの製造 バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅＱａ
ｔｏｒｉｕｍ ） ＡＴＣＣ３９１１８Ｗａｆ、下記１
成（７） 培地中で培養る、。
培養されたバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｍＨａｔｅｒｉｕｍ ） Ａ Ｔ ＣＣ３９１１８の
粗抽出物によるＬ−アラニンの製造 バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅＱａ
ｔｏｒｉｕｍ ） ＡＴＣＣ３９１１８Ｗａｆ、下記１
成（７） 培地中で培養る、。
・酵母菌の抽出物 ：２０ｇ
・ラクトース ：３０
・硫酸マグネシウム ：０．５＜】・リン酸水素
−カリウム ：２０ ・塩化マンガン ：４０ｍ。
−カリウム ：２０ ・塩化マンガン ：４０ｍ。
・硫化鉄 ：２．５ｒａＱ・モリブデ
ン酸アンモニウム：２ｍＱ ・都市水道水 ：１１ 培地のｐＨを殺菌前に７．３に調整る、。２４時回置養
された培地の３００ＩｌｌＩの容積は、この同じ培地３
．７／の入った醗酵器に植菌る、のに役立つ。醗酵は３
０℃で行なわれ、撹拌速度は２５０回転／分であり、換
気はＱ、５ＶＶｍであり、ｐＨは調整されない。溶解し
た酸素含量は、２時間の培養後Ｏ％に下がる。醗酵を１
８時間後に止め、粗抽出物を得るための超音波破砕前に
連続遠心分離によって細胞を採集る、。
ン酸アンモニウム：２ｍＱ ・都市水道水 ：１１ 培地のｐＨを殺菌前に７．３に調整る、。２４時回置養
された培地の３００ＩｌｌＩの容積は、この同じ培地３
．７／の入った醗酵器に植菌る、のに役立つ。醗酵は３
０℃で行なわれ、撹拌速度は２５０回転／分であり、換
気はＱ、５ＶＶｍであり、ｐＨは調整されない。溶解し
た酸素含量は、２時間の培養後Ｏ％に下がる。醗酵を１
８時間後に止め、粗抽出物を得るための超音波破砕前に
連続遠心分離によって細胞を採集る、。
ピルビン酸の存在下に測定したアラニン・デヒドロゲナ
ーぜ活性は、た／υ白質１ｍ（］あたり１゜４−８ＩＮ
位であり、グルコース・デヒドロゲナーゼ活性は、たん
白質１１１１（ｌあたり０．４２単位である。
ーぜ活性は、た／υ白質１ｍ（］あたり１゜４−８ＩＮ
位であり、グルコース・デヒドロゲナーゼ活性は、たん
白質１１１１（ｌあたり０．４２単位である。
Ｌ−アラニンの合成は実施例１の条件下において実施さ
れるのが、ただし培地の当初容積が５７ＩＩｌ／、添加
された酵素抽出物の１（２４゜７０１／）が、グルコー
ス・デヒドロゲナーゼ１３２単位およびアラニン・デヒ
ドロゲナーゼ４６４単位に相当し、注入された先駆物質
はピルビン酸すトリウムである。
れるのが、ただし培地の当初容積が５７ＩＩｌ／、添加
された酵素抽出物の１（２４゜７０１／）が、グルコー
ス・デヒドロゲナーゼ１３２単位およびアラニン・デヒ
ドロゲナーゼ４６４単位に相当し、注入された先駆物質
はピルビン酸すトリウムである。
４３時間の反応後、Ｌ−アラニン濃度は１１あたり６３
ミリモルである。注入されたピルビン酸ナトリウムに対
る、Ｌ−アラニン製造のモル収率は７９％である。実施
例１のような培地の存在下において、粗抽出物のＬ−ア
ラニン・デヒドロゲナーゼ活性は、グルコース・デヒド
ロゲナーゼ活性の場合たん白質１ｍｏあたり０゜３単位
であるのに対して、たん白質１ｍＯあたり０．０４単位
である。実施例１のように操作を行なって酵素抽出物を
濃縮した後、ピルビン酸ナトリウムからＬ−アラニンの
収率５２％を得る。
ミリモルである。注入されたピルビン酸ナトリウムに対
る、Ｌ−アラニン製造のモル収率は７９％である。実施
例１のような培地の存在下において、粗抽出物のＬ−ア
ラニン・デヒドロゲナーゼ活性は、グルコース・デヒド
ロゲナーゼ活性の場合たん白質１ｍｏあたり０゜３単位
であるのに対して、たん白質１ｍＯあたり０．０４単位
である。実施例１のように操作を行なって酵素抽出物を
濃縮した後、ピルビン酸ナトリウムからＬ−アラニンの
収率５２％を得る。
実施例９；酵母菌の抽出物をベースとる、培地において
培養されたバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｍｅａａｔｅｒｉｕｍ ） Ａ Ｔ ＣＣ３９１１８
の粗抽出物によるＬ−セリンの製造 実施例８において得られたものと同じ酵素抽出物を使用
る、。従って抽出物のグルコース・デヒドロゲナーゼ活
性は変らず、先駆物質としてヒドロキシピルビン酸リチ
ウムの存在下において測定されたセリン・デヒドロゲナ
ーゼ活性は、たん白質１ ｍａあたり０．６３単位であ
る。
培養されたバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｍｅａａｔｅｒｉｕｍ ） Ａ Ｔ ＣＣ３９１１８
の粗抽出物によるＬ−セリンの製造 実施例８において得られたものと同じ酵素抽出物を使用
る、。従って抽出物のグルコース・デヒドロゲナーゼ活
性は変らず、先駆物質としてヒドロキシピルビン酸リチ
ウムの存在下において測定されたセリン・デヒドロゲナ
ーゼ活性は、たん白質１ ｍａあたり０．６３単位であ
る。
し−セリン合成を、実施例８に記載されたのと同じ条件
下において行なう。ただし当初反応器中に存在る、セリ
ン・デヒドロゲナーゼの単位数は１９７単位であり、注
入る、先駆物質をヒドロキシピルビン酸リチウムに代え
る。
下において行なう。ただし当初反応器中に存在る、セリ
ン・デヒドロゲナーゼの単位数は１９７単位であり、注
入る、先駆物質をヒドロキシピルビン酸リチウムに代え
る。
４４時間の反応後、反応器内のＬ−セリン濃度は１１あ
たり４５ミリ［ルであり、注入されたヒドロキシピルビ
ン酸ナトリウムに対して形成されたＬ−セリンの製造の
モル収率５６％であ◆・ 実施例１０：バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｍｅｏａｔｅｒｉｕｍ ＞ Ａ Ｔ Ｇ ０３９１
１８ の細胞によるＬ−バリンの製造 バヂ、ルス・メガテリウム（Ｂａｃ ｉ ｌ Ｉｕｓ
ｎ＋ｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＞ Ａ Ｔ ＣＣ３９１１８
菌株を、実施例１に記載されたのと同じ条件下にａ３い
て２４時間培養る、。ついで細胞を遠心分離によって採
集る、。
たり４５ミリ［ルであり、注入されたヒドロキシピルビ
ン酸ナトリウムに対して形成されたＬ−セリンの製造の
モル収率５６％であ◆・ 実施例１０：バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｍｅｏａｔｅｒｉｕｍ ＞ Ａ Ｔ Ｇ ０３９１
１８ の細胞によるＬ−バリンの製造 バヂ、ルス・メガテリウム（Ｂａｃ ｉ ｌ Ｉｕｓ
ｎ＋ｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＞ Ａ Ｔ ＣＣ３９１１８
菌株を、実施例１に記載されたのと同じ条件下にａ３い
て２４時間培養る、。ついで細胞を遠心分離によって採
集る、。
細菌のかすは４つのフラクションに分けられ、これらは
下記を除いて実施例２０条件下において実施されたＬ−
バリン合成の４つの異なる試験において使用される。
下記を除いて実施例２０条件下において実施されたＬ−
バリン合成の４つの異なる試験において使用される。
・第１試験において、遠心分離後に採集される細胞は、
反応器に導入される前は、処理を全く受（プない。使用
されるｍ胞の吊は、乾燥重量０．１４５０に相当る、。
反応器に導入される前は、処理を全く受（プない。使用
されるｍ胞の吊は、乾燥重量０．１４５０に相当る、。
・第２試験において、遠心分子ｆｉ後採集される細胞（
細菌かす５．５ｑずなわち細胞の乾燥型ｆｆ１１．１６
ＣＪ）が、反応器に導入される前に、実施例７に記載さ
れているのと同様に操作を行なって、アルギン酸塩のゲ
ル球中において固定される。
細菌かす５．５ｑずなわち細胞の乾燥型ｆｆ１１．１６
ＣＪ）が、反応器に導入される前に、実施例７に記載さ
れているのと同様に操作を行なって、アルギン酸塩のゲ
ル球中において固定される。
・第３試験において、遠心分離によって採集されたＩＩ
ｌ胞を、反応器への導入前にアセトン透過処理に付す。
ｌ胞を、反応器への導入前にアセトン透過処理に付す。
乾燥型１０．１６０に相当る、細菌かすを、アセトン２
０％、グルコース５％およびすトリウム・アジド０．０
４％を含む１００ｍＨ，ｐＨ＝ ７ 、５のｖＡ酸塩緩
衝液５ａ＋／中に懸濁させる。これにアセトンの入って
いない同じ緩衝液５ｍｌを添加る、前、全体を２０分間
撹拌させる。透過細胞を遠心分離によって採集し、反応
器への導入前にアセトンの入っていない緩衝液５ｎ＋／
中に再び懸濁させる。
０％、グルコース５％およびすトリウム・アジド０．０
４％を含む１００ｍＨ，ｐＨ＝ ７ 、５のｖＡ酸塩緩
衝液５ａ＋／中に懸濁させる。これにアセトンの入って
いない同じ緩衝液５ｍｌを添加る、前、全体を２０分間
撹拌させる。透過細胞を遠心分離によって採集し、反応
器への導入前にアセトンの入っていない緩衝液５ｎ＋／
中に再び懸濁させる。
・第４試験において、遠心分離にＪ：って採集された細
胞を０．１Ｍ、（１１１７，５の燐酸塩緩衝液中に懸濁
させ、懸濁液を冷却しつつ、２分間ｉＩ！４音波処理に
付す。ついで回収されｌこ破砕物を、実施例７に記載さ
れているのと同様に操作を行なって、アルギン酸塩のゲ
ル中において固定化さぼる。ただし、反応器への導入前
に、酵素抽出物８１１１１を破砕物３ｍ／に代える。
胞を０．１Ｍ、（１１１７，５の燐酸塩緩衝液中に懸濁
させ、懸濁液を冷却しつつ、２分間ｉＩ！４音波処理に
付す。ついで回収されｌこ破砕物を、実施例７に記載さ
れているのと同様に操作を行なって、アルギン酸塩のゲ
ル中において固定化さぼる。ただし、反応器への導入前
に、酵素抽出物８１１１１を破砕物３ｍ／に代える。
これら４つの試験について、３−メチル−２−オキソブ
チレートからのＬ−バリン合成の結果を、下記表にまと
める。
チレートからのＬ−バリン合成の結果を、下記表にまと
める。
（以下余白）
Claims (15)
- （１）少なくども１つのα−ケト酸またはその少なくと
も１つの塩と、アンモニウムイオン源と、還元型または
酸化型のニコチンアミド・アデニン・ジメクレオチドと
還元剤との混合物を、微生物の菌株の培養により生じた
酵素組成物の作用に付すＬ−α−アミノ酸の製造方法に
おいて、唯一の微生物菌株としてバチルス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ）菌株を使用することを特徴とする方法。 - （２）菌株がバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）菌株である、特許請求の範
囲の範囲第１項記載の方法。 - （３）菌株がバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ３９１１８菌株で
ある、特許請求の範囲第１または２項記載の方法。 - （４）前記微生物菌株の粗抽出物または精製抽出物を使
用する、特許請求の範囲第１〜３項のうらいずれか１項
記載の方法。 - （５）前記微生物菌株の完全な細胞を使用する、特許請
求の範囲第１〜３項のうちいずれか１項記載の方法。 - （６）前記抽出物が固定化される、特許請求の範囲第４
項記載の方法。 - （７）透過された完全な細胞、固定化された完全な細胞
または透過されついで固定化された完全な細胞を使用す
る、特許請求の範囲第５項記載の方法。 - （８）前記培養生成物が、１〜４０ｇ／ｌの濃度の単糖
または少糖の存在下に得られたものである、特許請求の
範囲第１〜７項のうちいずれか１項記載の方法。 - （９）培養生成物が、少なくとも１つの無機窒素および
／または有機窒素源を含む培地において、湿度２０〜４
０℃、ｐＨ５．５〜８におけるバチルス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ）の培養により得られたものである、特許請求の範
囲第１〜８項のうちいずれか１項記載の方法。 - （１０）Ｌ−α−アミノ酸の前記製造が、温度１０〜６
０℃、ｐＨ６〜１０で実施される、特許請求の範囲１〜
９項のうちいずれか１項記載の方法。 - （１１）還元剤がグルコースである、特許請求の範囲第
１〜１０項のうちいずれか１項記載の方法。 - （１２）連続操作において、α−ケト酸１モルあたり、
還元剤を１〜２モル、アンモニウムイオン源を、アンモ
ニアで表示して、１〜３モル使用する、特許請求の範囲
第１〜１１項のうちいずれか１項記載の方法。 - （１３）Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ活性とグルコー
ス・デヒドロゲナーゼ活性を０．１：１〜１０：１の割
合で有する酵素粗成物を用いてこの方法を実施する、特
許請求の範囲１〜１２項のうちいずれか１項記載の方法
。 - （１４）α−ケト酸が、ピルビン酸、ヒドロキシピルビ
ン酸、α−ケトイソカブロン酸、３−メチル−２−オキ
ソ酪酸、３−メチル−２−オキソ吉草酸、フェニルピル
ビン酸またはそれらの塩の１つである、特許請求の範囲
１〜１３項のうちいずれか１項記載の方法。 - （１５）特許請求の範囲第１〜１４項のうちいずれか１
項記載の方法により得られたＬ−α−アミノ酸。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8509121 | 1985-06-13 | ||
| FR8509121A FR2583432B1 (fr) | 1985-06-13 | 1985-06-13 | Procede de production enzymatique de l-a-aminoacides a partir d'a-cetoacides |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62289A true JPS62289A (ja) | 1987-01-06 |
Family
ID=9320292
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61139107A Pending JPS62289A (ja) | 1985-06-13 | 1986-06-13 | α−ケト酸からのＬ−α−アミノ酸の酵素学的製造方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0206904B1 (ja) |
| JP (1) | JPS62289A (ja) |
| AT (1) | ATE73851T1 (ja) |
| DE (1) | DE3684366D1 (ja) |
| FR (1) | FR2583432B1 (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005095167A (ja) * | 2003-08-26 | 2005-04-14 | Mitsubishi Chemicals Corp | 光学活性環状アミノ酸の製造方法 |
| JP2007529234A (ja) * | 2004-03-22 | 2007-10-25 | デグサ ゲーエムベーハー | 光学活性アミノ酸をホールセル触媒を用いて製造する方法 |
| WO2020189540A1 (ja) | 2019-03-15 | 2020-09-24 | 中外製薬株式会社 | 芳香族アミノ酸誘導体の製造方法 |
| US11492369B2 (en) | 2017-12-15 | 2022-11-08 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for producing peptide, and method for processing bases |
| US11542299B2 (en) | 2017-06-09 | 2023-01-03 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for synthesizing peptide containing N-substituted amino acid |
| US11732002B2 (en) | 2018-11-30 | 2023-08-22 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Deprotection method and resin removal method in solid-phase reaction for peptide compound or amide compound, and method for producing peptide compound |
| US11891457B2 (en) | 2011-12-28 | 2024-02-06 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Peptide-compound cyclization method |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4970157A (en) * | 1986-08-12 | 1990-11-13 | Sagami Chemical Research Center | Isolated phenylalanine dehydrogenase gene and process for production of phenylalanine dehydrogenase |
| FR2628751B1 (fr) * | 1988-03-15 | 1990-09-14 | Inst Francais Du Petrole | Procede de production continue de l-(alpha)-amino acides a partir d'(alpha)-cetoacides a l'aide de cellules de bacillus |
| CA2008702A1 (en) * | 1989-02-27 | 1990-08-27 | Ronald L. Hanson | Process for transformation of hydroxyketo acids to hydroxyamino acids |
| EP0692539B1 (en) * | 1994-07-11 | 1999-09-22 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for producing an optically active gamma-hydroxy-L-glutamic acid |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3036958A (en) * | 1959-03-17 | 1962-05-29 | Ajinomoto Kk | Process for producing l-tryptophan from 3-indolepyruvic acid |
| FR2217296A1 (en) * | 1972-10-10 | 1974-09-06 | Inst Francais Du Petrole | Organic cpds. prepn. by co-enzymatic reduction - with continuous regeneration of the oxidised coenzyme with a reducing agent |
| DE2930070A1 (de) * | 1979-07-25 | 1981-02-19 | Biotechnolog Forschung Gmbh | Verfahren zur kontinuierlichen enzymatischen umwandlung von wasserloeslichen alpha -ketocarbonsaeuren in die entsprechenden aminosaeuren |
| FR2526442B1 (fr) * | 1982-05-06 | 1985-09-27 | Inst Francais Du Petrole | Production de glucose deshydrogenase et utilisation de l'enzyme obtenu dans la synthese enzymatique de la l-carnitine |
| US4600692A (en) * | 1983-02-10 | 1986-07-15 | Purification Engineering, Inc. | Immobilized cells for preparing phenylalanine |
| DE3423936A1 (de) * | 1984-06-29 | 1986-01-02 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur herstellung von l-phenylalanin |
| US4849345A (en) * | 1985-04-17 | 1989-07-18 | Sagami Chemical Research Center | L-phenylalanine dehydrogenase and use thereof |
-
1985
- 1985-06-13 FR FR8509121A patent/FR2583432B1/fr not_active Expired
-
1986
- 1986-06-11 DE DE8686401267T patent/DE3684366D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-06-11 EP EP86401267A patent/EP0206904B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1986-06-11 AT AT86401267T patent/ATE73851T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-06-13 JP JP61139107A patent/JPS62289A/ja active Pending
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005095167A (ja) * | 2003-08-26 | 2005-04-14 | Mitsubishi Chemicals Corp | 光学活性環状アミノ酸の製造方法 |
| JP4590981B2 (ja) * | 2003-08-26 | 2010-12-01 | 三菱化学株式会社 | 光学活性環状アミノ酸の製造方法 |
| JP2007529234A (ja) * | 2004-03-22 | 2007-10-25 | デグサ ゲーエムベーハー | 光学活性アミノ酸をホールセル触媒を用いて製造する方法 |
| US8105806B2 (en) | 2004-03-22 | 2012-01-31 | Evonik Degussa Gmbh | Process for preparing optically active amino acids using a whole-cell catalyst |
| US11891457B2 (en) | 2011-12-28 | 2024-02-06 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Peptide-compound cyclization method |
| US11542299B2 (en) | 2017-06-09 | 2023-01-03 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for synthesizing peptide containing N-substituted amino acid |
| US11787836B2 (en) | 2017-06-09 | 2023-10-17 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for synthesizing peptide containing N-substituted amino acid |
| US11492369B2 (en) | 2017-12-15 | 2022-11-08 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for producing peptide, and method for processing bases |
| US11732002B2 (en) | 2018-11-30 | 2023-08-22 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Deprotection method and resin removal method in solid-phase reaction for peptide compound or amide compound, and method for producing peptide compound |
| WO2020189540A1 (ja) | 2019-03-15 | 2020-09-24 | 中外製薬株式会社 | 芳香族アミノ酸誘導体の製造方法 |
| KR20210139366A (ko) | 2019-03-15 | 2021-11-22 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 방향족 아미노산 유도체의 제조 방법 |
| US12071396B2 (en) | 2019-03-15 | 2024-08-27 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for preparing aromatic amino acid derivative |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0206904A2 (fr) | 1986-12-30 |
| ATE73851T1 (de) | 1992-04-15 |
| FR2583432A1 (fr) | 1986-12-19 |
| EP0206904A3 (en) | 1989-03-08 |
| FR2583432B1 (fr) | 1988-11-04 |
| DE3684366D1 (de) | 1992-04-23 |
| EP0206904B1 (fr) | 1992-03-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH0559709B2 (ja) | ||
| US4331762A (en) | Bacillus stearothermophilus strain UK 788 and process for producing a useful enzyme | |
| Tsugawa et al. | Production of l-Glutamic Acid from dl-Hydantoin-5-propionic Acid by Microoganisms: Part I. Screening of l-Glutamic Acid-Producing Microorganisms and Some Optimal Conditions for Production of l-Glutamic Acid | |
| JPS62289A (ja) | α−ケト酸からのＬ−α−アミノ酸の酵素学的製造方法 | |
| US4542098A (en) | Production of glucose dehydrogenase and use of the resultant enzyme in the enzymatic synthesis of L-carnitine | |
| US5416019A (en) | Rhodococcus microorganisms that produce phenylalanine dehydroganase | |
| JPS58201985A (ja) | グルコ−ス脱水素酵素の生産方法 | |
| JPH01320991A (ja) | Ｄ−ホモフエニルアラニン類の製造方法 | |
| JP3122990B2 (ja) | Ｏ−メチル−ｌ−チロシン及びｌ−３−（１−ナフチル）アラニンの製造方法 | |
| EP0215414B1 (en) | Process for producing l-phenylalanine | |
| EP0295622B1 (en) | Process for producing l-tryptophan | |
| JPH01317387A (ja) | 新規Ｄ―アミダーゼ及びＤ―α―アラニン及び／又はＬ―α―アラニンアミドの製造法 | |
| JP2899071B2 (ja) | Ｌ―α―アラニンの製造法 | |
| JPH0630572B2 (ja) | Ｌ−フエニルアラニン脱水素酵素 | |
| JP2588707B2 (ja) | サルコシン・オキシダーゼの製造法 | |
| JPH01228489A (ja) | Ｄ−Ｎ−カルバミル−α−アミノ酸の製造法 | |
| CA2339910A1 (en) | Method for producing halo-l-tryptophan | |
| JPS6318471B2 (ja) | ||
| JPS6219093A (ja) | Ｌ−フエニルアラニンの製造方法 | |
| Monot et al. | Simultaneous production of amino acid dehydrogenases and glucose dehydrogenase by Bacillus megaterium and their utilization for L-valine synthesis with NADH regeneration | |
| JPH0516831B2 (ja) | ||
| JPS60172293A (ja) | Ｌ−セリンの製造法 | |
| JPH0630573B2 (ja) | Ｌ−フエニルアラニン脱水素酵素及びその製造方法 | |
| JPS62289194A (ja) | フエニルアラニン又はその誘導体の製造法 | |
| JPH01265896A (ja) | Ｄ−α−アミノ酸の製造法 |