JPS62289194A - フエニルアラニン又はその誘導体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 〔産業上の利用分野〕 Ｌ−フェニルアラニン（以下フェニルアラニンと略す）
は必須アミノ酸の１つであり、医薬等に用いられる重装
な物質である。又近年注目されているジぜプチド甘味料
であるアス・ぐルチルフェニルアラニンメチルエステル
の重要な原料でもある。

Ｌ　−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（以下Ｌ
　−ＤＯＰＡ　’と略す）及びその誘導体はパーキンソ
ン氏病めるいはうつ病の治療剤として有用なアミノ酸で
ある。

本発明はフェニルアラニン、Ｌ　−ＤＯＰＡ及びその誘
導体の製造法に関し、さらにくわしくは微生物ヲ用い、
フェニルピルビン酸、あるいは３，４−グヒドロキシフ
ェニルピルビン酸、あるいは３，４−ジメトキシフェニ
ルビルビン酸、アルいｆｄ３，４−メチレンジオキシフ
ェニルピルビン酸、あるいは３−ヒドロキシ−４−メト
キシフェニルピルビン酸、あるいは３−メトキシ−４−
ヒドロキシフェニルピルビン酸とフマール酸及ヒアンモ
ー’Ｆムイオンとから７エニルアラニン、Ｌ　−ＤＯＰ
Ａ及びその誘導体を製造する方法に関するものである。

〔従来の技術〕

従来、フェニルピルビン酸を基質とする酵素法によるフ
ェニルアラニンの製造とし壬は、各種微生物菌体Ｋ、フ
ェニルピルビン酸とアミン基供与体としての各種アミノ
酸類を作用せしめる方法（Ａｍ１ｎｏ　Ａｃ１ｄａ　、
第２巻、１８頁、　１９６０年；特公昭３７−１０６７
２号公報、　Ａｍ１ｎｏ　Ａｃ１ｄｓ第１ｄｓ６１頁、
１９６２年；特公昭４５−２０５５６号公報）、フリネ
パクテリウム属細菌の菌体にフェニルピルビン酸とナイ
ロン環状オリゴマー（特公昭４４−１７９９１号公報）
、ナイロン６加水分解物（特公昭４４−１７９９２号公
報）あるいはラクタム（特公昭４４−１７９９０号公報
）を作用せしめる方法が知られており、又本法において
アミノ基共与体とし℃アミノ酸の代わりにフマール酸と
アンモニウムイオンを用いる方法が特開昭６１−１５６
９７で知られている。Ｌ　−ＤＯＰＡの製造法としては
化学的には合成法にＬリラセミ体を製造し、これを光学
分割し″ＣＬ一体を分離する方法が知られ℃いる。微生
物信 を用いる方法とし又は、（特廣昭４７−２６３１７゜４
９−３８８３９．４９−３８８４０、特開昭４８−１８
４７５゜４８−７５７９１．６０−１８４３９４　）が
知られている。しかしこれらの方法は、十分満足な方法
とは言えない。

〔本発明が解決しようとする問題点〕

本発明の目的は、フェニルアラニン、Ｌ　−ＤＯＰＡ及
びその誘導体に対応するα−ケト酸からより効率工く、
フェニルアラニン、Ｌ　−ＤＯＰＡ及びその誘導体を製
造する方法を提供することにある。

〔問題点を解決する之めの手段〕

本発明者らは上記の問題点を解決する為に棟に検討を行
なった結果、Ｌ−フェニルアラニン生産においては、従
来知られ壬いる菌株を用い念α−ケト酸とフマール酸と
アンモニウムイオンからの方法に比べ、より効率よくＬ
−７エニルアラニンを生産する新しい微生物を見い出し
た。Ｌ　−ＤＯＰＡ及びその誘導体の生産に関し又は、
従来、α−ケト酸とアミノ酸を用いる方法のみしか知ら
れていなかったが、今回新たにα−ケト酸とフマール酸
とアンモニウムイオンを用いる新しい方法を見い出した
。

本発明はこれらの知見に基づいてなされ念ものでらる。

本発明において、使用される微生物は、具体的には、以
下に示すようなものがある。

アシネトバクタ−ルオフ４　　ＡＴＣＣ−９０３６（Ａ
ｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　１ｗｏｆｆｉｉ　）（Ｃ１
ｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｉｎｔｅｒｍｅｄＬｕａ　）エン
テロバクタ−エアロデネス　ＡＪ−２６４３ＦＥＢＭ　
Ｐ−０２７６４（ｇｎｔ＠ｒｏｂａｃ　ｔａｒ　ａｅｒ
ｏｇｅｎｅｓ　）エルビニア　力ロトビーラ　ＡＴＣＣ
−７４０３（Ｅｒｗｌｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ　
）（５ｅｒｒａｔｔａ　　ｍａｒｃｓｓｃｅｎｓ　　）
（Ｍｙｅｏｐｌａｎａ　ｂｕｌｌａｔａ　　）フェニル
ピルビン酸、或は３，４−ジヒドロキシフェニルピルビ
ン酸及びその誘導体とフマール酸及びアンモニウムイオ
ンとに、これらの微生物を作用せしめる方法は、本微生
物を栄養培地で培養する際にフェニルピルビン酸、３，
４−ジヒドロキシフェニルピルピン酸およびその誘導体
とフマール酸とアンモニウムイオンを添加し、培養しな
がら反応させてもよいし、本微生物を、培養した後微生
物の培養物、菌体又は菌体処理物をこれらのα−ケト酸
とフマール酸及びアンモニウムイオンとに接触反応せし
めても良い。

上記微生物を培養するための培地とし又は通常の炭素源
、窒素源、無機イオンを含有する通常の培地である。更
にビタミン、アミｙ酸等の有機微量栄養素を添加すると
望ましい結果が得られる場合が多い。

炭素源としては、グルコース、シュクロース等の炭水化
物、酢酸等の有機酸、アルコール類、その他が適宜使用
される。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア
水、アンモニウム塩、ソノ他が用いられる。無機イオン
としては、マグネシウムイオン、燐酸イオン、カリイオ
ン、鉄イオンその他が必要に応じ適宜使用される。培養
は好気条件下に…５．０から８．５に、温度を１５℃か
ら３５℃の適当な範囲に制御しつつ１ないし３日間培養
を行なう。本微生物を用いて、培養中にこれらのα−ケ
ト酸とフマール酸及びアンモニウムイオンを添加し工反
応を行なわしめるには、上記の一１温度にて培養すれば
よい。これらのα−ケト酸とフマール酸及びアンモニウ
ムイオンは培養の開始時に添加し又もよいし、培養途中
に添加してもよい。

これらのα−ケト酸およびフマール酸は、アンモニウム
塩、ナトリワム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の各種
の塩とし又使用することができる。

アンモニウムイオンは、硫酸アンモニウム、リン酸アン
モニウム、？ｉｌ［アンモニウム、塩化アンモニウム、
酢酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、フマール酸アン
モニウム、リンゴ酸アンモニウム、尿素等の塩類として
、あるいはアンモニア水あるいはアンモニアガスとして
供給される。本微生物の培養物、菌体又は菌体処理物、
を水性媒体中に℃これらのα−ケト酸をフマール酸とア
ンモニウムイオンに作用せしめるには、該培養物、菌体
又は菌体処理物、及びこれらの固定化物をこれらのα−
ケト酸とフマール酸及びアンモニウムイオンを含む水性
媒体に俗解、又は懸濁せしめ各水性媒体をｐＨ７，０か
ら９．０．温度を２０℃から５０℃の適当な条件に調節
しつつ漸時静置又は攪拌すればよい。尚、本反応におい
て使用されるこれらのα−ケト酸の使用量は特に制限さ
れないが、通常バッチ法で行なう場合には０．０１から
ＩＭ好ましくは０．０５から０．５Ｍ程度である。他方
の反応基質であるフマール酸及びアンモニウムイオンは
通常上記α−ケトａの１〜３倍モル程度が用いられる。

また菌体とし℃は、菌体を含む培養液をそのまま用い℃
もよい。ま念、これを一旦培養液エリ分離して洗滌ま念
は洗滌せずに使用し℃もよい。菌体処理物とじ１は、機
械的摩砕菌体、超音波にて処理し念菌体、凍結乾燥菌体
、アセトン乾燥菌体、リゾチウム等の酵素で処理した菌
体、界面活性剤、トルエン等で処理した菌体、菌体の蛋
白画分、これらの固定化物又はその他が適宜用いられる
。

このようｉ菌体を得る方法は前記の培地および培養方法
がそのまま採用できる。生成フェニルアラニン、Ｌ　−
ＤＯＰＡ及びその誘導体の定量は高速液（ｆ 体クロマトグラムを用いる方法によりｈ（洗。

〔実施例１〕 フマール酸２．０≠ｇ、ｉｓアンモニウム０．５Ｈｇ酵
母エキス１．０９／ａｔ　、−？プトン１．０ｐ、泡、
甜、ＰＯ４０、Ｉ　Ｖｄｔ　ＳＫ、、ＨＰＯ４０，３９
Ａｔ　、　ＭｇＳＯ４・６　Ｈ２Ｏ０，０５！Ｊ／ｄｉ
　−Ｆｅ５Ｏａ　・７　Ｈ２Ｏ０，ＯＯ１’Ｊ／ａ、Ｍ
ｎ　５ｏ４−４　Ｈ２Ｏ０、００１Ｖｔｔｔ　　を含む
培地（ｐＨ６，５）を５００ゴ容フラスコに５０ｄ入れ
１１５℃で１５分間殺菌し友。

これにブイヨン寒天培地で３０℃、２４時間培養し念第
１表に示す菌株をそれぞれ１白金耳接種し、それぞれ３
０℃、１６時間振盪培養した。これらの培養液より、菌
体をそれぞれ遠心分離にエリ採取し、培養液と同量の生
理食塩水で１回洗浄し、菌体を集めた。これらの菌体を
７エニルビルビントリスー塩酸バツフアー（ｐＨ８，５
）　１００＋＋ｔ／にそれぞれ５チになる様に添加し、
３０℃、２４時間反応し念、その結果を第１衣に示した
。

〔実施例２〕 実施例１と同様に培養し、実施例１と同様に調整した、
第２表に示す菌体を、３，４−ジヒドロキサルリン酸５
．３１ｎ９を含む１００ｍＭ）リスー塩酸バッファー（
ＰＨ８，５）　１００ｍＪにそれぞれ５％になる様に添
加し、３０℃、２４時間反応した。その結果を第２表に
示した。

〔実施例３〕 実施例２と同様に調整したアクロモパクターキャンディ
カンスＡＪ　−２４４４、ＦＥＲＭ　Ｐ　−８７７８を
ン酸５．３　Ｉｎ９を含む１０１００ｆｆ１リス−塩酸
バッファー　（ｐＨ８，５）　１００ｍ１Ｋそれぞれ５
９７ｄｔ　Ｋなる様に添加し、３０℃、２４時間反応し
ｔｏその結果を第３衣に示し念。

第　　３　　戎 〔実施例４〕 実施例１と同様の培地に、ブイヨン培地に３０℃、２４
時間生育させ九アクロモバクタ−キャンディカンスＡＪ
−２４４４、ＦＥＲＭ　Ｐ　−８７７８を１白金耳接種
し、３０℃、１６時間培養した。この培養液にフェニル
ピルビン酸と７マール酸？それぞれ１　’ｊ／ｄｌ、硫
酸アンモニウム１．０　ｇＡＩｔになる様に無菌的に添
加し、さらに３０℃にて２４時間培養し念。この結果培
養液中には０．７９Ａのし一フェニルアラニンが生成し
℃いた。

〔実施例５〕 実施例１と同様の培地に、ブイヨン培地に３０℃、２４
時間生育させたアクロモバクタ−キャンディカンスＡＪ
−２４４４、ＦｇＲＭ　Ｐ　−８７７８を１白金耳接種
し、３０℃、１６時間培養した。この培養液に３，４−
ジメトキシフェニルピルビン酸トフマール酸をそれぞれ
１　ｇＡｌｔ、硫酸アンモニウムを１　ｇ／ｄｌになる
様に無菌体に添加し、さらに３０℃に℃、２４時間培養
し念。この結果培養液中にはｏ、　ｓ　ｇＡｌｔの３，
４−ジメトキシ−し−７エニルアラ二ンが生成していた
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）フェニルピルビン酸、３，４−ジヒドロキシフェニ
   ルピルビン酸、３，４−メチレンジオキシフェニルピル
   ビン酸、３−ヒドロキシ−４−メトキシフェニルピルビ
   ン酸及び３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニルピルビ
   ン酸から成る群より選ばれる基質とフマール酸及びアン
   モニウムイオンからフェニルアラニン、３，４−ジヒド
   ロキシフェニルアラニン、３，４−メチレンジオキシフ
   ェニルアラニン、３−ヒドロキシ−４−メトキシフェニ
   ルアラニン又は３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル
   アラニンを生産する能力を有するエンテロバクター属、
   エルビニア属、エシェリヒア属、シュウドモナス属、セ
   ラチア属、シトロバクター属、アクロモバクター属、ア
   シネトバクター属、プレビバクテリウム属、ビブリオ属
   、アルカリゲネス属、アルスロバクター属、クレビシエ
   ラ属、クルイヘラ属、ミコプラナ属、キサントモナス属
   、ハンゼヌラ属、キャンディダ属、ジェオトリクム属、
   クルイヘロミセス属、ピシア属、又はディポダスカス属
   に属する微生物を水性媒体中で、フェニルピルビン酸、
   ３，４−ジヒドロキシフェニルピルビン酸、３，４−メ
   チレンジオキシフェニルピルビン酸、３−ヒドロキシ−
   ４−メトキシフェニルピルビン酸及び３−メトキシ−４
   −ヒドロキシフェニルピルビン酸から成る群より選ばれ
   る基質とフマール酸及びアンモニウムイオンに作用させ
   フェニルアラニン、３，４−ジヒドロキシフェニルアラ
   ニン、３，４−メチレンジオキシフェニルアラニン、３
   −ヒドロキシ−４−メトキシフェニルアラニン又は３−
   メトキシ−４−ヒドロキシフェニルアラニンを生成・蓄
   積せしめ、該物質を採取することを特徴とするフェニル
   アラニン又はその誘導体の製造法。 ２）基質がフェニルピルビン酸であり、微生物がアクロ
   モバクター属、アシネトバクター属、プレビバクテリウ
   ム属、ビブリオ属、アルカリゲネス属、アルスロバクタ
   ー属、クレブシエラ属、クルイヘラ属、ミコプラナ属、
   キサントモナス属、ハンゼヌラ属、キャンディダ属、ジ
   ェオトリクム属、クルイヘロミセス属、ピシア属、ディ
   ポダスカス属、に属する微生物である特許請求の範囲第
   １項記載のフェニルアラニン又はその誘導体の製造法。