JPH0559709B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

この発明はＬ−カルニチンの製造法に関する。
Ｌ−カルニチンは通常生体内に存在し、子供の成
長を促進することが知られている。 Ｌ−カルニチンを直接製造する方法としては、
フランス特許出願第7722183号と、日本国特開昭
57−39731号が知られている。 フランス特許出願7722183号の方法は、NADを
使用し、またNADがバクテリアの細胞壁を通過
できるような処理を必要とするためにコスト高に
なる。また日本国特開昭57−39731号の方法は反
応に、基質であるβ−ブチロベタインの他に２−
オキソグルタミン酸、還元剤、第一鉄イオン、カ
タラーゼ等を必要とし、反応系が複雑になり、そ
の結果Ｌ−カルニチンの精製工程も複雑となり、
コスト高となる。 本発明者らは、この様な従来のＬ−カルニチン
の製造法に対し、より効率の良い方法を見い出す
べく研究した結果、従来の技術的および経済的な
問題点を一挙に解決する全く新規な方法を見い出
すに至つた。即ち、この発明は、クロトンベタイ
ンをＬ−カルニチンに変換せしめる能力を有する
微生物の作用により、水性媒体中にてクロトンベ
タインをＬ−カルニチンに変換せしめることを特
徴とするＬ−カルニチンの製造法である。 クロトンベタインをＬ−カルニチンに変換せし
める能力を有する微生物の作用により、水性媒体
中にてクロトンベタインをＬ−カルニチンに変換
せしめる方法は、水溶性媒体中にて、クロトンベ
タインと上記微生物の菌体、培養液あるいは菌体
処理物とを接触せしめれば良い。 本発明において用いるクロトンベタインをＬ−
カルニチンに変換せしめる能力を有する微生物と
しては、例えば アルカリゲネス マーシヤーリ ATCC 21030 イ アシネトバクター ルオーフイ ATCC 9036 アグロバクテリウム ツメフア ATCC 4452 シエンス アースロバクター パラフイネ ATCC 15590 ウス アクロモバクター ビスコサス ATCC 12448 アゾトバクター クロロアコク ATCC 9043 ム エアロモナス パンクタータ ATCC 11163 バチルス ラテロスポラス ATCC 64 ブレビバクテリウム リネンス ATCC 8377 コリネバクテリウム キセロシ ATCC 373 ス シトロバクター インターメデ IFO 13539 ウス セルロモナス フラビゲナ ATCC 15724 エンテロバクター アグロメラ ATCC 12287 ンス エシエリヒア コリ ATCC 10798 フラボバクテリウム フエルギ ATCC 13524 ニウム ハフニア アルベイ ATCC 9760 クルチア ゾフイー ATCC 6900 クレブシエラ ニユーモニアエ ATCC 9621 クルイヘラ シトロフイラ AJ−2628
（FERM−P3149） ミコプラナ ブラータ ATCC 4278 ミクロコツカス バリアンス ATCC 399
ミクロバクテリウム アンモニ ATCC 15354 アフイルム モラキセラ ノンリクエフアシエンス AJ−11221
（FERM−P4348） シユードモナス クロロラフイ ATCC 9446 ス プロテウス ミラビリス ATCC 15290 サルモネラ ガリナルム ATCC 9184 セラチア リクエフアシエンス ATCC 14460 スタフイロコツカス アウレウ IFO 3060 ス ビブリオ メチユニコビ ATCC 7708 キサントモナス コンペストリス ATCC 8721 ズグレア ラミゲナ ATCC 19544 プロタミノバクター アルボフ IFO 3707 ラブム チオバチルス ペロメタボリス ATCC 23370 ノカルデイア コラリーナ IFO 3338 サツカロマイコプシス リポリ IFO 0746 テイカ クリプトコツカス ネオフオル IFO 0608 マンス デバリオミセス ハンセニイ IFO 0080 ジオトリクム キヤンデイダム IFO 4602 ハンセヌラ アノマラ IFO 0122 ハンセニアスポラ バルビエン IFO 0683 シス クルイヘロミセス フラジリス IFO 0541 リポミセス リボフエルス IFO 0673 クロエツケラ ジヤポニカ IFO 0151 ピヒア メンブレンフアシエン IFO 0460 ス パキソレン タンノフイルス IFO 1007 ロドトルラ ピリマネ IFO 0395 ロダロマイセス エロンギスポ IFO 1676 ラス トリグノプシス バリアビリス IFO 0755 トルロプシス キヤンデクダ ATCC 12790 等がある。 これらの微生物の菌体を得るには、通常の培地
が用いられるが、培養の初めから、あるいは培養
の途中でクロトンベタインを添加して培養すると
活性のよい菌体が得られる事がある。 本微生物の培養のために用いられる培地はクロ
トンベタインを含むほかは通常の炭素源、窒素
源、無機イオンを含有する通常の培地である。更
にビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を添加
すると望ましいい結果が得られる場合が多い。 炭素源としては、グルコース、シユクロース等
の炭水化物、酢酸等の有機酸、アルコール類、そ
の他が適宜使用される。窒素源としては、アンモ
ニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩、その
他が用いられる。無機イオンとしては、マグネシ
ウムイオン、燐酸イオン、カリイオン、鉄イオ
ン、その他が必要に応じ適宜使用される。 培養は好気的条件下に、PH４ないし８、温度25
ないし40℃の適当な範囲に制御しつつ１ないし10
日培養を行えば望ましい結果が得られる。 菌体としては、培養終了後の培養液そのまま、
培養液より分離された菌体、洗浄された菌体な
ど、いずれも使用可能である。菌体処理物として
は凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、トルエン、
界面活性剤等と接触せしめた菌体、リゾチームで
処理した菌体、超音波にさらした菌体、機械的に
摩砕した菌体等のほか、これら菌体処理物から得
られた、クロトンベタインをＬ−カルニチンに変
換せしめる酵素活性を有する酵素蛋白区分、更に
は、これらの菌体の固定化物、菌体処理物の不溶
化物、その他いずれも使用できる。 水溶性媒体としては、水、バツフアーおよびエ
タノール等の有機溶媒を含むものが使用できる。
更に必要に応じて、微生物の生育に必要な栄養
素、抗酸化剤、界面活性剤、補酵素、ヒドロキシ
ルアミンおよび金属イオン等を水性媒体に添加す
ることもできる。 上記微生物の菌体を水溶性媒体中で培養しなが
ら、菌体とクロトンベタインを接触せしめて作用
せしめる場合には、クロトンベタインを含み、か
つ微生物の生育に必要な炭素源、窒素源、無機イ
オンなどの栄養素を含む水性媒体が用いられる。
更にビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を添
加すると望ましい結果が得られる場合が多い。 炭素源としては、グルコース、シユクロース等
の炭水化物、酢酸等の有機酸、アルコール類、そ
の他の適宜使用される。窒素源としては、アンモ
ニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩、その
他が用いられる。無機イオンとしては、マグネシ
ウムイオン、燐酸イオン、カリイオン、鉄イオ
ン、その他が必要に応じ適宜使用される。 培養は好気的条件下に、PH４ないし８、温度25
ないし40℃の適当な範囲に制御しつつ行えば望ま
しい結果が得られる。 かくして１ないし10日間も培養を行えば、クロ
トンベタインはＬ−カルニチンのみに効率よく変
換される。 これに対し、上記微生物の培養液をそのまま、
培養菌体あるいは菌体処理物をクロトンベタイン
と接触せしめて作用せしめる場合には、クロトン
ベタインと培養液、培養菌体あるいは菌体処理物
を溶解またはけん濁した水性媒体を10℃ないし70
℃の適当な温度に調節し、PHを４ないし８に保ち
つつ、暫時静置または撹拌すればよい。かくして
５ないし100時間も経過すれば水性媒体中に多量
のＬ−カルニチンが生成蓄積される。 このようにして得られたＬ−カルニチンを培養
液又は水溶液より採取する方法は、本発明の方法
によれば、Ｄ−カルニチンが副生しないので、イ
オン交換樹脂を用いる方法、等電点にて沈澱せし
める方法等、通常の方法が採用される。 生成したＬ−カルニチンの定量は、デビツド・
ジエイ・ピアスン（David J.Poarson）らの方法
で分析した（Mothod of Enzymatic
Analysis″）、第４巻（第２版）、1974年、1758頁、
Academic Press Inc.参照）。 以下実施例にて説明する。 実施例 １ グリセロール２ｇ／dl、硫酸アンモニウム0.3
ｇ／dl、KH₂PO₄0.1ｇ／dl、K₂HPO₄0.3ｇ／dl、
MgSO₄・7H₂O0.05ｇ／dl、FeSO₄・7H₂O1mg／
dl、MnSO₄・4H₂O1mg／dl、酵母エキス１ｇ／
dl、ペプトン１ｇ／dl、マルトキス0.5ｇ／dl、
クロトンベタイン硫酸塩0.3ｇ／dl、炭酸カルシ
ウム4.0ｇ／dl（別殺菌）（PH7.0）を500ml容フラ
スコに50ml入れ120℃で15分間殺菌した。 これにブイヨン寒天培地で30℃にて30時間培養
したアシネトバクタールオーフイATCC 9036あ
るいはプロテウス ミラビリスATCC 15290を一
白金耳接種し、30℃で16時間振盪培養した。この
培養液より菌体を遠心分離により採取し、培養液
と同量の生理食塩水で一回洗浄し、菌体を集め
た。この菌体をクロベタイン塩酸塩1.5ｇ／dlを
含む0.1Mリン酸緩衝液（PH6.0）（終末100ml）に
なる様に添加し、30℃に16時間保持反応した。 反応液中に生成するカルニチンは、前記の酵素
的分析法で測定した。この結果、アシネトバクタ
ールオーフイ ATCC 9036を用いた場合には、
0.58ｇ／dl、プロテウス ミラビリス ATCC
15290の場合には0.53ｇ／dlのＬ−カルニチンが
生成していた。これらの反応液より菌体を遠心分
離により除去した上清を分子量5000の膜を用いた
限外濾過を行い、この濾過液をDowex50×12を
用いたカラムクロマトグラフイーを行つた。この
分画物のカルニチン画分より、カルニチン塩酸塩
として、カルニチンを採取した。これらの比旋光
度を測定した結果、Ｌ体である事が確かめられ
た。 実施例 ２ 表−１に示した微生物を用いる事以外は実施例
１と全く同じ方法でＬ−カルニチンを生成させ
た。この時のＬ−カルニチンの生成量を表−１に
示した。

【表】

【表】

【表】 実施例 ３ 実施例１に示した培地からクロトンベタインを
除いた培地にブイヨン寒天培地で30℃にて30時間
培養したアシネトバクタールオーフイ ATCC
9036を一白金耳接種し、30℃で12時間振盪培養し
たのち、15ｇ／dlのクロトンベタイン硫酸塩
（KOHでPH6.0になる様中和）溶液を５ml加えて
更に10時間培養した。この培養液中のＬ−カルニ
チンを実施例１と同様にして測定したところ0.43
ｇ／dlのＬ−カルニチンが生成してした。 実施例 ４ 実施例１と同様に培養したアシネトバクタール
オーフイ ATCC 9036を実施例１と同様の方法
で洗浄分離し菌体を集めた。この菌体を生理食塩
水に20ｇ／dlになる様に懸濁した菌液５mlに４％
アルギン酸ナトリウム溶液５mlを加え混合した
後、15ｇ／dl塩化カルシウム溶液にこの混合液を
徐々に滴下し、ビーズ状の固定化菌体を作成し
た。 この固定化物全量をクロトンベタイン硫酸塩
1.5ｇ／dlを含む0.1Mリン酸緩衝液（PH6.0）20ml
に投入し、30℃に５時間保持反応させた。この結
果反応液中には0.34ｇ／dlのＬ−カルニチンが生
成していた。 実施例 ５ アシネトバクタールオーフイ ATCC 9036を
用い、反応液に表−２に示した金属イオンを添加
する以外は実施例１と全く同様に反応を行つた。
その結果を表−２に示す。

【表】

【表】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ アルカリゲネス属、アシネトバクター属、ア
   グロバクテリウム属、アースロバクター属、アク
   ロモバクター属、アゾトバクター属、エアロモナ
   ス属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリ
   ネバクテリウム属、シトロバクター属、セルロモ
   ナス属、エンテロバクター属、エシエリヒア属、
   フラボバクテリウム属、ハフニア属、クルチア
   属、クレブシエラ属、クルイヘラ属、ミコプラナ
   属、ミクロコツカス属、ミクロバクテリウム属、
   モラキセラ属、シユードモナス属、プロテウス
   属、サルモネラ属、セラチア属、スタフイロコツ
   カス属、ビブリオ属、キサントモナス属、ズグレ
   ア属、プロタミノバクター属、チオバチルス属、
   ノカルデイア属、クリプトコツカス属、デバリオ
   ミセス属、ジオトリクム属、ハンセヌラ属、ハン
   セニアスポラ属、クルイヘロミセス属、リポミセ
   ス属、クロエツケラ属、ピヒア属、パキソレン
   属、ロドトルラ属、ロダロマイセス属、サツカロ
   マイコプシス属、トリグノプシス属、及びトルロ
   プシス属より成る群から選ばれ、クロトンベタイ
   ンをＬ−カルニチンに変換せしめる能力を有する
   微生物の作用により水性媒体中にてクロトンベタ
   インをＬ−カルニチンに変換せしめることを特徴
   とするＬ−カルニチンの製造法。