KR100346293B1 - 부티로베타인/크로토노베타인-l-카르니틴대사유전자와l-카르니틴의미생물학적제조에사용되는그것의용도 - Google Patents

부티로베타인/크로토노베타인-l-카르니틴대사유전자와l-카르니틴의미생물학적제조에사용되는그것의용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 L-카르니틴의 생합성 관여 효소를 암호화하는 유전자들이 포함된 DNA 단편과 벡터들, 상기 DNA 단편과 벡터를 함유하는 미생물들 그리고 상기 미생물을 사용하는 L-카르니틴의 미생물학적 제조방법을 기술한 것이다.

Description

부티로베타인/크로토노베타인-L-카르니틴 대사 유전자와 L-카르니틴의 미생물학적 제조에 사용되는 그것의 용도{GENES FOR BUTYROBETAINE/CROTONOBETAINE-L-CARNITINE METABOLISM AND THEIR USE FOR THE MICROBIOLOGICAL PRODUCTION OF L-CARNITINE}
본 발명은 부티로베타인/크로토노베타인-L-카르니틴의 유전자 발현을 위한 재조합 유전 물질, 상기 재조합 유전자 물질을 함유하는 미생물 그리고 상기 미생물을 L-카르니틴의 생물공학적 제조에 사용하는 용도에 관한 것이다.
L-카르니틴은 인체 대사에서 매우 중요한, 천연의 비타민-유사 물질이다. 지방산의 활용에 있어, L-카르니틴은 미토콘드리아 막의 신경 전달 물질로서 따라서 대사 에너지의 전달물질로서 필수적이다. 만일 체내에서 L-카르니틴이 적절한 양으로 합성되지 못할 경우, 결핍 증세를 피하기 위해 이를 식사에서 보충하여야 한다. 특히 L-카르니틴을 자체적으로 생합성하지 못하는 유아의 경우, L-카르니틴은 필수 영양성분이다.
L-카르니틴 제제는 약제 제품의 활성 성분으로서 사용된다. 카르니틴 결핍 및 기타 치료학적 요법, 특히 심장 질환 등의 경우에 L-카르니틴의 보충이 필요하다.
고등 동물에서 L-카르니틴의 생합성은 잘 알려져 있으나 또 다른 작용 및 대사에 있어서의 중요성은 집중적으로 연구되어야 할 과제이다. 미생물, 특히 슈도모나스 종의 미생물에 대해 기술된 대사 경로 [γ-부티로베타 인히드록실라아제의 촉매작용, Lindstedt 등, 생화학(Biochemistry) 제 16 호, 제2181-2188페이지, 1977년] 외에도, L-카르니틴은 어떤 미생물들, 예를 들면 아그로박테리룸/리조비움 종의 대사 중간물질로서도 생성된다.
EP-A- 0 l58 194 호는, 예를 들어 γ-부티로베타인으로부터 출발하여, L-카르니틴을 미생물학적으로 생산하는 방법을 명시한 것으로, 여기서는 L-카르니틴 탈수소효소 결함 생산 돌연변이체가 종래의 미생물학적인 선택 방법에 의해 얻어지며, 이 방법의 사용으로 20 - 30 시간의 반응 시간 내에 L-카르니틴이 비교적 좋은 수율로 이미 얻어지고 있다.
그러나, 상기 방법을 용량/시간의 수율 면에서 더욱 최적화시키는 것은 상기의 전통적인 미생물학적 방법을 사용해서는 가능하지 않다.
그러므로, 본 발명의 목적은 보다 짧은 반응 시간 내에 훨씬 더 나은 수율로 L-카르니틴을 생산하는 더욱 경제적인 생물공학적 방법을 제공하는 것이다.
γ-부티로베타인/크로토노베타인 대사에 관한 연구의 결과로 다섯 종류의 유전자들 bcoA/B, bcoC, bcoD, bcoE 및 bcoT 가 밝혀졌으며, 이들은 γ-부티로베타인/크로토노베타인 대사 경로의 효소들을 암호화하며, 특히, 소위 부티로베타인-L-카르니틴 오페론 (bco) 이라는 오페론에 포함되어 있다. 이러한 맥락에서 약어들은 다음과 같은 의미들을 갖는다.
bcoA/B : γ-부티로베타인-CoA 합성효소 (bcoA) / 크로토노베타인-CoA 합성효소 (bcoB) 유전자, 즉, γ-부티로베타인-CoA 합성효소 활성 및 크로토노베타인-CoA 합성효소 활성을 모두 갖는 효소 생성물을 암호화하는 유일한 유전자.
bcoC : γ-부티로베타인-CoA 탈수소효소 유전자
bcoD : 크로토노베타인-CoA 가수분해효소 유전자
bcoE : L-카르니틸 탈수소효소 유전자; 및
bcoT : 잠재성의 운반 시스템 유전자.
bcoA/B, bcoC 및 bcoD 유전자의 유전자 산물은 L-카르니틴의 생합성의 원인이 되는 한편, bcoE는 대사 중간물질 L-카르니틸-CoA 를 베타인으로 분해시키는 카르니틴 탈수소효소를 암호화한다. bcoT는 추측컨대 부티로베타인 대사에 할당된 운반 시스템의 운반 단백질을 암호화하는 유전자이다. 상기 유전자는 L-카르니틴 생합성에 필수적이지는 않다.
따라서 본 발명은 γ-부티로베타인/크로토노베타인 대사에서 L-카르니틴의 생합성을 위한 효소를 암호화하는 유전자 bocC, bcoA/B 및 bcoD의 하나 또는 그 이상 그리고 경우에 따라서는 잠재성의 운반 유전자 bcoT 를 포함하는 DNA 단편 및 벡터들에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기 DNA 단편 및/또는 벡터를 함유하는 미생물에 관한 것이다. 또, 본 발명은 본 발명에 따른 미생물을 이용하여 L-카르니틴을 생산하기 위한 생물공학적 방법에 관한 것이다.
본 명세서와 청구범위에서 사용되는 bcoA/B, bocC, bcoD 및 bcoT의 기호는 정의된 바와 같이 상기 언급된 효소 활성을 갖는 γ-부티로베타인/크로토노베타인-L-카르니틴 대사의 효소를 암호화하는 야생형 미생물의 유전자, 특히 부티로베타인-L-카르니틴 (bco) 오페론의 유전자, 및 그들의 기능적으로 동등한 유전적 변종 및 돌연변이체, 즉 그 생물학적 작용에 있어서 근본적으로 변화되지 않고 야생형 미생물의 유전자로부터 유도된 유전자를 모두 포함한다. 즉, 기능적으로 동등한 유전적 변종 및 돌연변이체는 예를 들면 발현이 일어날 특정 미생물의 바람직한 코돈 사용에 유전자 서열을 맞추기 위해 인위적으로 생성될 수 있는 유전자 코드의 공지된 변성의 상황에서 염기의 변화를 포함한다. 변종 및 돌연변이체는 또한 이렇게 변성된 유전자의 유전자 산물의 생물학적 기능이 근본적으로 유지되는 한도 내에서 염기 또는 코돈의 결실, 삽입 및 치환을 포함한다. 여기에는 예를 들면 야생형 서열에 대해 높은 상동성 (예, 70% 이상) 을 가지며, 엄격한 하이브리드화 조건 (예, 50 - 70 ℃ 의 온도 및 0.5 - 1.5 M 염농도) 하에 야생형 서열의 상보체와 하이브리다이즈할 수 있는 유전자 서열이 포함된다.
여기에서 사용되는 전사 단위라는 용어는 유전자가 하나의 전사 방향으로 배열되어 있고 개재되지 않은 전사물질에서 통상의 전사 조절 하에 전사되는 DNA 서열을 의미하는 것으로 이해되는데, 유전자 뿐만 아니라 DNA 서열도 유전자 발현에 필요한 유전자 제어 요소 (프로모터 및 리보솜 결합부위 등) 를 갖는다.
본 발명은 첨부된 도면에 의해 보다 상세히 설명된다.
제 1 도는 γ-부티로베타인- 또는 크로토노베타인-L-카르니틴 대사 경로의 효소를 나타낸다.
제 2 도는 bco 오페론을 갖는 리조비움/아그로박테리움으로부터의 10.6 kbDNA 단편의 제한 지도(restriction map)를 나타낸다.
제 3 도 및 제 4 도는 플라스미드 pVK 1011 및 pAZ101을 나타낸다. 화살표는 bco 유전자와 beu 유전자 (베타인-활용 유전자: EP-A-0 543 344호) 의 위치와 방향을 가리킨다. 플라스미드 삽입 부위는 굵은 선으로 나타낸다.
제 5 도는 recA 호스트 균주의 생산을 위한 가능한 출발물질로서 플라스미드 PCC49 를 나타낸다.
제 6 도는 플라스미드 pVK1011, pAZ101, pVK 100q 및 pAZ7 의 구성도를 나타낸다.
제 7 도는 recA 호스트 균주의 구성도를 나타낸다.
γ-부티로베타인-/크로토노베타인-L-카르니틴 대사 경로의 유전자 bcoA/B, bcoC, bcoD 및 bcoT 를 분리해내기 위해 사용되는 출발물질은 제 1 도에 의거하여 부티로베타인 및/또는 크로토노베타인을 대사하는 모든 미생물일 수 있다. 적절한 균주의 예로서는 에스케리키아, 슈도모나스, 아그로박테리움, 리조비움 및 아그로박테리움/리조비움 속의 미생물이 있으며, 후자가 바람직하다. 아르고박테리움/리조비움 속의 바람직한 미생물의 예로서, EP-A-0 158 194 호에서 이미 공지된 아그로박테리움/리조비움 종 HK4 (DSM 2938) 의 미생물이 있다. 이미 카르니틴 탈수소효소-결함인, 즉 예를 들면 bcoE 유전자가 없거나 결함이 있는 (이후, bcoE'로 표시함), 미생물이 특히 바람직하게 사용된다. 카르니틴 탈수소효소-결함 미생물의 바람직한 예로서, EP-A- 0 158 194에서 이미 공지된 아그로박테리움/리조비움 종 HK13 (DSM 2903) 및 HK 1331b (DSM 3225), 또는 EP-A- 543 344에 기재된 아그로박테리움/리조비움 종 HK 1349 (DSM 3944) 의 미생물을 들 수 있다.
γ-부티로베타인/크로토노베타인-L-카르니틴 대사의 유전자 bcoA/B, bcoC, bcoD 및 bcoT 는 미생물을, 예를 들면 트랜스포존(transposon) 삽입 돌연변이시켜, γ-부티로베타인/크로토노베타인-L-카르니틴 대사의 유전자를 예를 들면 카나마이신(Km) 내성의 적절한 표지로 표지함으로써, 미생물의 염색체 내에 위치시킬 수 있다. 다음, 부티로베타인 대사의 중간물질을 더 이상 활용할 수 없는, 이와 같이 표지된 돌연변이체를 분리한다. 이러한 방식으로 γ-부티로베타인/크로토노베타인-L-카르니틴 대사의 유전자는 동정되고 그 기능에 관여하게 된다. 다음, 표지된 유전자를 클로닝하고 적절한 제한효소를 이용하여 더 상세히 특징짓는다. 본 발명에 따른 본래대로의 유전자 또는 DNA 단편의 분리는 상응하는 변이되지 않은 미생물의 유전자 은행으로부터 출발하여 수행되며, 그로 부터 bco 유전자 또는 그의 단편이 상기 수득된 돌연변이 균주의 클론된 유전자와의 하이브리드화에 의해 공지 방법으로 분리 및 동정될 수 있다. 수득된 유전자는 원하는 벡터로 클로닝되고, 제한효소에 의해 지도로 나타내진다.
유전자 bcoA/B, bcoC 및 bcoD 만이 L-카르니틴의 생합성에 관여한다. 따라서, 이들 유전자의 존재만이 L-카르니틴의 생산을 위해 필수적이다.
선택된 출발 조건, 예를 들면 선택된 출발 물질 또는 선택된 생산 균주에 따라, L-카르니틴의 생산에 사용되는 DNA 단편 및 벡터가 하나 이상의 L-카르니틴 생합성 유전자를 함유할 수 있다.
bcoA/B, bocC 및 bcoD 유전자 외에도, 본 발명에 따르는 DNA 단편 및 벡터는필요에 따라 잠재적 운반 유전자 bcoT 를 포함할 수 있다.
L-카르니틴 탈수소효소 유전자, 즉, bcoE 유전자가 존재하면 상기 유전자의 존재로 인해 L-카르니틴의 분해가 일어나므로 바람직하지 않다. 그러나 결함있는 bcoE 유전자 (bcoE') 의 존재는 무해하다.
편의상, L-카르니틴 생합성을 위한 유전자들, 즉 bocC, bcoA/B 및 bcoD 와 경우에 따라서는 잠재적 운반 유전자 bcoT 는 하나의 DNA 단편 또는 벡터 분자 상에 함께, 바람직하게는 예를 들면 유전자 조절 요소로부터 통상적인 5'-3'- 방향 하류에, bcoC, bcoA/B 및 bcoD, 또는 bcoC, bcoA/B, bcoD 및 bcoT의 서열로, 상기 정의된 단일 전사 단위 중에, 천연의 부티로베타인-L-카르니틴 오페론의 배열에 상응하도록 존재한다.
상기와 같은 전사 단위의 유전자 bcoC, bcoA/B, bcoD 및 bcoT 는 예를 들면 제 2 도의 제한 지도의 상응하는 부위에 의해 특징지어진다.
bco 유전자들의 전사 또는 발현은 편의상 적절한, 바람직하게는 강력한 프로모터의 제어 하에 일어난다. 프로모터의 선택은 원하는 발현 상태, 예를 들면 구성적 발현이냐 유도된 발현이냐에, 또는 발현이 일어나는 미생물의 종류에 의존한다. 적절한 프로모터의 예를 들면, 천연 부티로베타인-L-카르니틴 오페론의 프로모터 Pbco를 들 수 있다.
L-카르니틴 생합성에 관여하는 bco 유전자의 분리가 예를 들면 결함있는 bcoE 유전자 (bcoE')를 가진 미생물로부터 일어난다면, 전체 bco 오페론은 예를 들면 상기 미생물로부터의 bcoE' 유전자 및 관련 유전자-조절 요소들과 함께 분리 및 클론된 후, 적절한 L-카르니틴 생산용 미생물에서 사용되는 것이 유리하다. 이와 같이 예를 들면 리조비움/아그로박테리움 HK1349 로부터 분리가능한 상기 유형의 변이된 bcoE 유전자를 갖는 전사 단위는, bcoE 의 결함이 예를 들어 점 돌연변이 (point mutation) 만으로 기인되고 제한 절단부위와는 관련이 없는 경우, 제 2도의 제한 지도에 의해 선택적으로 특징되어질 수 있다. 발현에 적절한 다른 프로모터로는 프로모터 PNM, PSJ(M.Labes et.al, Gene, 89, 37-46, 1990), trp 프로모터 (Amann et,al., Gene, 25, 167-178, 1983), lac 프로모터 (Amann et.al, Gene, 25, 167-178, 1983), 및 tac 프로모터, 구성 또는 유도된 프로모터로 이용되는 상기 trp 와 lac 프로모터의 하이브리드 (Russel and Bennett, Gene, 20, 231-243, 1982) 를 예로 들 수 있다.
적절한 생산 균주에서 L-카르니틴을 생산하기 위하여 상기 bco 유전자를 포함하는 본 발명에 따르는 DNA 단편들은, 예를 들어 파아지 또는 플라스미드 같은 특정 발현 벡터 등의 기존의 적절한 벡터에 편의상 공지의 기술에 의해 바람직하게는 단일 전사 단위로 함께 편입된다.
사용된 벡터는 자율적이고 자가-복제적인 벡터 또는 소위 통합 벡터 (integration vector) 이다. 본 명세서에서의 통합 벡터는, 예를 들어 수령체 균주의 게놈과 상동인 적어도 하나의 서열을 갖으며 이 서열과의 상동 재조합에 의해 수령체 균주의 게놈으로의 이종 유전자의 삽입을 허용하는 플라스미드 같은 벡터를의미한다. 바람직하게는 자율적이고 자가-복제적인 벡터를 사용한다.
선택된 벡터의 본질에 따라 L-카르니틴 생합성 효소의 유전자가 다양한 유기체에서 발현될 수 있다. 적절한 벡터는 특정 호스트 스펙트럼을 갖는 벡터와 광범위한 호스트 스펙트럼 (광범위한 호스트 범위) 을 갖는 벡터 둘 다 및 전술한 통합 벡터이다.
이용되는 광범위한 호스트 범위 벡터는 그램-음성 박테리아에 적합한 모든 벡터일 수 있다. 상기 광범위한 호스트 범위 벡터로는 pVK100 (Knauf and Nestor, Plasmid, 8, 45-54, 1982), pME285 (Haas and Itoh, Gene, 36, 27-36, 1985) 및 pKT240 (Bagdasarian et at., Gene, 26, 273-282, 1983) 또는 이의 유도체들을 예로 들 수 있다. pVK100 의 유도체로는 예를 들어 pVK1001 을 사용할 수 있으며, pME285의 유도체로는 예를 들어 pAZ10 을 사용할 수 있으며, pKT240 의 유도체로는 예를 들어 pL032 (EP-A-0 54 344에 이미 공지된) 을 사용할 수 있다.
리조비움/아그로박테리움의 경우에 사용되는 통합 벡터는 PACYC184 또는 pBR322 (Comai et al., Plasmid, 10, 21-30, 1983) 에 기초한 벡터일 수 있다.
상기의 방식으로 예를 들어 플라스미드 pVK100q, pVK1011 (제 3 도), pAZ7, pAZA7::beu, pAZ101 (제 4 도) 및 pLO41 을 획득하였다. 플라스미드 pVK100q 는 기탁 번호 DSM 8726 로 리조비움/아그로박테리움 HK1349 으로 1993년 11월 16일에 기탁되었다 (German Collection for Microorganisms and Cell Cultures GmbH, D-38124 Braunschweig, Mascheroderweg 1b).
발효용 생산 균주, 즉 L-카르니틴 생산용 균주를 생산하기 위해 본 발명에따르는 DNA 단편 또는 벡터를 발현에 바람직하고 적합한 호스트 균주에 편입시켜야한다, 편의상 본 발명에 따르는 DNA 단편들을 포함하는 벡터를 사용하여 기존의 공지된 방법으로 상기 목적을 위해 미생물을 형질전환한다. 미생물은 본발명에 따르는 DNA 단편을 벡터 분자상에 또는 이의 염색체에 통합하여 포함한다.
적절한 생산 균주는 크로토노베타인 및/또는 γ-부티로베타인으로부터 L-카르니틴을 생산할 수 있으며, L-카르니틴의 분해 능력 (이화 작용) 이 완전히 또는 부분적으로 억제된 모든 미생물이다. L-카르니틴의 이화 작용이 억제된 미생물로는 카르니틴 탈수소효소-결함 균주, 즉 카르니틴 탈수소효소 유전자 bcoE 가 예를 들어 돌연 변이 또는 결실에 의해 정지 (switch-off) 된 균주 및/또는 L,D-카르니틴 라세미화 효소-결함 및 L-카르니틴 탈수화효소 (dehydratase)-결함인 균주를 예로 들 수 있다.
적절한 호스트 균주로는 높은 기질과 출발 물질 허용량을 갖는 균주가 바람직하고, 예로는 에스케리키아, 슈도모나스, 아그로박테리움, 리조비움, 코마모나스 및 리조비움/아그로박테리움 속의 미생물이 있으며, 후자가 바람직하다. 리조비움/아그로박테리움 종의 미생물로는 전술한 HK13, HK 1331b 및 HK-1349이 있으며, 또한 HK 1349.4 (EP-A- 543 344 에 기재된)종이 특히 바람직하다.
L-카르니틴의 수율은 호스트 균주의 재조합 능력, 즉 이의 재조합 경향과 재조합 빈도가 감소되면 더욱 증진될 수 있다는 사실이 추가로 발견되었다. 따라서 염색체 상동성에 기초한 벡터와의 재조합은 제한된다. 호스트 군주의 재조합 능력은 예를 들어 기존의 방법으로 이의 recA 유전자의 특정 돌연변이 (recA 돌연변이)에 의해 감소될 수 있다. 재조합 능력이 손상된 미생물로 특히 바람직한 것은 리조비움/아그로박테리움 종의 미생물이며, 후술하는 바에 따라 획득된 본 발명에 따르는 리조비움/아그로박테리움 HK1349.49 종의 균주를 예로 들 수 있다.
그러므로, 적절한 생산 균주로는 각각의 경우에 있어서 pVK100q, pVK1011, pAZ7, pAZ7::beu, pAZ101 또는 pLO41 플라스미드를 포함하는 리조비움/아그로박테리움 HK1349, HK1349.4 및 HK1349.49 종의 미생물을 예로 들 수 있다.
형질 전환된 호스트 균주 (생산 균주) 는 벡터 또는 DNA 단편상에 위치한 표식 유전자로 인하여 균주가 내성을 갖는 항생제가 첨가된 선택적 영양 배지로부터 분리될 수 있다. EP-A-0 543 344 에 따르는 미생물이 생산 균주, 즉 베타인 활용을 암호화하는 염색체 유전자가 돌연 변이되고 베타인 활용을 암호화하는 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질 전환된 미생물로 사용되면 베타인 활용에 관하여 선택될 수 도 있다. 베타인 활용에 관련하여 선택할 수 있는 미생물로는 예를 들어, 플라스미드 pLO41, pAZ101, pAZ7::beu 또는 pVK1011 를 포함하는 전술한 HK1349.4 및 HK1349.49 이 있다.
L-카르니틴의 생명공학적 생산은 본 발명에 따르는 DNA 단편 또는 벡터를 포함하는 미생물을 사용하여 수행된다. L-카르니틴의 생산 공정은, 예를 들어 적당한 탄소 및 질소 공급원 존재하에 γ -부티로베타인으로부터 시작되는 EP-A-0 158 194 에 개시된 공지의 방법으로 수행된다. 사용되는 탄소 및 질소 공급원으로는 글루타메이트, 아세테이트 및 베타인, 또는 글리세를 및 베타인을 예로 들 수 있다.
베타인 활용에 관련되어 선택된 미생물을 사용하여 생명공학적 생산이 수행된다면, 베타인이 유일한 질소 공급원으로 사용된다.
L-카르니틴의 발효와 이후의 분리는 EP-A-0 158 194 에 개시된 공정과 유사한 방법으로 수행될 수 있다 .
배지의 영양분의 변화와 기존의 방법에서의 특정 미생물의 발효 조건을 적응시킴으로써 L-카르니틴의 수율은 더욱 증진될 수 있다.
실시예 1
트랜스포존 삽입 돌연변이체(Tn5)의 생산과 이의 표현형 동정
야생형 균주 리조비움/아그로박테리움 HK4 (DSM 2938, EP-B 0 158 194)을 선택 압력에 의해 스트렙토마이신 (Sm, 1000 ㎍/ml)에 대해 자발적으로 내성을 갖도록 한다. 상기 내성은 선별되지 않고서 50 세대 이상 실험적으로 안정하며 선별 표식으로 사용된다.
E. coli S17-1/pSUP2021(R. Simon et al., Biotechnology, 1983, 1, 784-790)의 Tn5 공여체 배양물 0.2 ml를 수령체 배양물 HK4 2 ml와 혼합하여 원심분리한다. 세포를 0.9 % 식염수(NaCl 용액)으로 세척하고 100 μ의 0,9 % 식염수에 재현탁시킨다. 수령체 균주와 공여체 균주의 접합이 건조 영양 한천상에서 하룻밤동안 30 ℃에서 수행된다. 수확된 세포를 수령체 (SmR) 및 트랜스포존 (네오마이신 내성(NmR))용 선택 배지상에 희석하여 플레이트(plate)한다.
Sm (1000 ㎍/ml) 및 Nm (100 ㎍/ml)을 사용하여 Tn5 돌연변이체를 영양 한천상에서 얻는다. 돌연변이체의 표현형 동정은 제 1 도에 따라서 최소 배지에서 탄소(C) 공급원으로 부티로베타인 대사 중간 물질의 비-활용을 감지하여 수행한다.
실시예 2
HK4 게놈으로부터 Tn5-표지된 DNA 단편의 클로닝
Tn5-돌연변이된 HK4 (5㎍)로부터 분리된 게놈 DNA를 EcoRI(4 U(단위)/㎍)으로 완전히 소화(digest)시킨다. pBR325(2.5 ㎍)(Gene, 1977, 2, 95-113)를 EcoRI으로 완전히 소화시킨 다음 알칼리 포스파타아제로 처리한다. 게놈 DNA와 pBR325를 T4-DNA 리가아제(0.2 U/ DA ㎍) 와 400 ㎕의 연결(ligation) 완충액(20 mM 트리스-HCl, pH7.2, 10 mM DTT(디티오쓰레이톨), 10 mM MgCl2, 0.6 mM ATP)에서 혼합시킨후 12 ℃에서 하룻밤동안 배양하여 재조합 하이브리드 플라스미드를 얻는다.
연결 혼합물의 분액(aliquots)을 E.coli ED 8654(Barek et al., Mol. Gen. Genet., 146, 199-207, 1976)의 형질 전환용으로 사용한다(Cohen et al., 1972, PNAS 69, 2110-2114). 형질 전환체를 이의 암피실린(AP, 100 ㎍/ml)과 카나마이신(Km, 25㎍/ml) 내성용의 영양 배지에서 선별한다. 선택된 모든 하이브리드 플라스미드는 Tn5로 표지된 HK4 삽입체를 운반한다. 삽입체는 제 2 도의 제한 지도에 상응하는 다양한 제한 효소에 의해 지도로 나타내진다. 제한 지도의 비교는 다른 표현형을 갖는 일련의 TnS 돌연변이체에서 동일한 게놈 단편에의 트랜스포존 삽입을 확인하여준다.
상기의 관찰 사실은 동일하게 절단된 플라스미드 DNA 와의 써던 블럿 하이브리드화 (Southern blot hybridization) ("Gentechnische Methoden" [GeneticEngineering Methods), edited by S, Bertram and H,G, Gassen, G, Fischer Verlag 19991, 219 f.) 와 연속한 전기영동 분리에 의해 확인이 가능하다. 사용된 탐식자 (probe) 는 트랜스포존 돌연변이체의 상기 클론된 DNA 의 서브단편 (subfragment) 이다.
실시예 3
λ 파아지에서 게놈 HK4 유전자 은행의 설립(setting up)
λ 파아지에서 DNA 가 패킹되기 위해서는 40-52 Kb 의 크기와 "코스(cos) 부위" 가 필요하다. λ파아지에서 게놈 HK4 유전자 은행을 만들기 위하여 크기가 23 Kb 이어서 17-29 Kb 사이의 DNA 단편들의 클로닝을 허용하는 코스미드 벡터 pVK100 (Knauf and Naster, 1982, Plasmid, 8, 45-54)를 사용한다.
pVK100을 EcoRI으로 소화시키고 탈인산화하여 EcoRI으로 부분적으로 소화시킨 HK4 DNA와 연결시킨다. HK4 DNA의 부분 소화용으로 이상적인 EcoRI의 농도는 0,58 U/㎍의 DNA 또는 0.02 U/㎕의 반응 혼합물, 상기 반응 혼합물에 사용된 HK4 DNA 8.5 ㎍으로 소화 테스트하여 결정한다. 크기가 17Kb 이상인 범위의 DNA 단편들을 아가로스 전기 영동 겔로부터 분리한다. 100 ng의 코스미드 벡터와 400 ng 패신저 (passenger) DNA를 포함하는 10 ㎕ 부피에서 연결을 수행한다. "시험관내 (in vitro) 패킹"을 25 ℃에서 2 시간에 걸쳐 프로메가 바이오텍(Promega Biotech.)의 흔합물에서의 제조자의 지시사항에 따라 수행한다. E.coli S17-1의 감염후 코스미드 벡터의 Km 내성에 대해 선별을 수행한다. 배치를 이용하여 약 5500 콜로니(각각의 클론)들을 얻었다. 유전자 은행 클로니들을 각각 냉동 배지(영양 효모 발효액,NYB, Oxoid 및 50 % 글리세롤)에 약 1000 클론의 배치 5 개로 - 70 ℃ 에 보관한다. 유전자 은행의 증폭은 10 ml의 NYB에서 50㎕ 의 각각의 상기 배치들을 사용하여 하룻밤동안 배양하고 분배하여 수행된다.
실시예 4
HK4 코스미드 유전자 은행의 스크리닝(screening), 콜로니 하이브리드화에 의한 bco 유전자-운반 코스미드 클론의 동정, HK 돌연변이체의 도트 볼럿팅(dot blotting) 하이브리드화 또는 직접적인 상보화
클론된 TnS-표지된 DNA 단편들을 하이브리드화 프로우브로 직접 사용하는 것이 가능하다.
적합한 DNA 서열들을 갖는 클론들은 하이브리드화 부호(signal)을 나타내며 HK4 돌연변이체에서 각각의 경우에 결함 유전자의 상보성으로 이끈다. 다양한 돌연변이체로부터 DNA 의 교차-하이브리드화로 10.6 Kb의 DNA 단편상에 부티로베타인 대사의 몇몇 유전자들이 "응집(clustering)" (제 2 도) 되어있음을 확인한다.
콜로니 하이브리드화를 공지의 방법 (S. Bertram and H.G. Gassen, 1991, ibid, 221f) 으로 수행한다. 도트 블럿팅을 공지의 방법(S, Bertram and H.G. Gassen, 1991, ibid, 221f)으로 수행한다.
실시예 5
HK 돌연변이체의 상보성
부티로베타인 대사의 개별적인 유전자의 정밀한 국소화(localization)로 동정된 펩타이드 사슬에 근거한 분자 크기를 고려한 후, 특정 유전자 부위에 의한 개별적인 돌연변이체의 상보성을 성취하는 것이 가능하여졌다.
특정 발현 플라스미드 pVK100::HK-DNA는 실시예 1에 따르는 다른 대사 단계(제 1 도 참조)에서의 변이를 포함하는 E.coli S17-1의 리조비움/아그로박테리움종 HK4 균주로의 접합를 통하여 편입된다. 공여체의 프롤린(pro) 영양 요구 돌연변이체에 대해서 그리고 벡터의 항생제 내성(KmRTc(테트라사이클린R))으로 선별을 수행한다.
실시예 6
6.1 균주 HK1349(DSM3944) 및 유도체로부터의 bco단편의 클로닝
생산 균주에서의 유전자 선량 효과와 생산성 증가를 성취하기 위하여 HK1349(DSM 3944, EP-A-0 543 344)로부터 boo 오페론을 클론한다. 상기 균주에서 전체 bco 오페론은 완전한 형태로 포함되나 카르니틴-CoA 탈수소효소용의 제 1의 유전자 bcoE는 돌연변이되었다. 그러므로 bco오페론을 갖으며 상기 균주로부터 수득된 DNA 단편은 발현 벡터의 높은 복제수를 고려할 때 생산성 증진용으로 이상적이다.
E.coli S17-1 에서 EP-A-O 543 344 의 실시예 3 에 상응하는 공지의 방법으로 클로닝을 수행한다. 이러한 목적을 위해서, HK1349 유전자 은행으로부터 10.6 Kb의 bco오페론을 분리하여 pVK100 에서 연결한다. 상기로부터 플라스미드 pVK100q 가 얻어진다 (제 6 도에 따르는 구조 체계를 참조).
NYB Km (25㎍/ml) 상에서 E.coli 517-1 에서 선별을 수행한다. 보정된 삽입체를 실시예 5 에 기재된 방법에 따라서 HK 돌연변이체로 동정한다. HK1349 로부터 EcoRI-절단된 DNA를 전기영동적으로 분리하고 10.6 kb 범위 크기의 단편을 겔로부터 분리한다. 분리된 단편을 EcoRI-절단된 pVK100 에 연결시킨다. 상기 하이브리드 플라스미드 혼합물을 사용하여 E.coli S17-1 (프롤린 영양 요구 돌연변이체) 를 형질 전환하여 영양 한천 Km(25㎍/ml) 상에서 선별시킨다. 벡터 및 boo 오페론을 담지하는 10.6 Kb 크기의 DNA 단편으로부터 보정된 하이브리드 플라스미드 클론을 C 및 N 공급원으로 0.2 % (w/v) 부티로베타인이 포함된 최소 배지상에서 부티로베타인-CoA 합성 효소-결함 돌연변이체 (HK4V4) 의 로온 (lawn) 에서 "패치-짝짓기(patch-mating)" 에 의해 동정한다. 보정된 클론은 상기 형태의 돌연변이체로의 접합 전송 후에 상기 C 공급원의 활용에서 세포에 상보적일 수 있다. 상기 방식으로 동정된 클론 pVK100q 은 이후의 서브-클로닝(sub-cloning) 을 위한 bco 오페론을 갖는 DNA 단편의 생산 플라스미드 또는 저장고로 사용된다.
6.2 pAZ101, pAZ7, pVK1011, pVK100q, pLO41 및 pAZ7::beu 의 구축
pAZ101, pAZ7, pVK1011 및 pVK100q를 제 6 도의 구성도에 따라서 구축한다. pLO41은 pLO32(EP-A-0 543 344)로부터 출발하여 bco 유전자 (10.6 kb EcoRI/EcoRI단편)을 삽입하여 구성하고, 플라스미드 pAZ7::beu은 pAZ7(제 6 도)로부터 출발하여 beu 유전자 (3 Kb PstI/PstI 단편, Ep-A-0 543 344)의 삽입에 의해 구성된다. 상응하는 제한 효소는 제조업체의 상세한 지시에 따라 3-S U/㎍ DNA로 사용된다. 플라스미드 pVK100q는 pVK100 (Knauf and nester; ibid)로 bco 유전자를 삽입하여 얻을 수 있다. 출발 플라스미드 pVK100s1(제 6 도 의 구성도)은 플라스미드pVK100s (EP-A-0 543 344)의 EcoRI 결실 클로닝에 의해 수득된다.
실시예 7
HK1349.4 으로의 recA 변이의 도입
7.1 recA를 암호화하는 유전자 은행 클론의 동정
게놈 HK4 코스미드 유전자 은행을 콜로니 하이브리드화 방법 (S. Betram and H.G. Gassen, 1991, ibid, 221f)의 도움으로 recA-암호화하는 클론을 검색하였다. 하이브리드에 사용되는 프로우브는 리조비움 레구미노사룸(W. Selbitschka er al., Mol. Gen. Genet., 299, 1991, 86-95)으로부터 클론된 recA 유전자이다. 표지된 코스미드 클론을 분리하고, EcoRI 소화 후에 수득된 EcoRI DNA 삽입 단편을 recA 프로우브에 대한 써던 블럿 하이브리드화(S. Bertram and H.G. Gassen, 1991,ibid,221f)에 의해 recA-동종성 서열을 검색한다. 상기 방식으로 표지된 EcoRI 단편을 동일한 정도로 절단된 벡터 pVK100에 연결시킨다. 수득된 하이브리드 플라스미드 pVK100r1을 사용하여 E.coli S17-1 세포를 DNA 복제용으로 형질 전환시킨다.
7.2 염색체 recA 유전자의 불활성화를 위한 HK1349.4 로의 카나마이신 내성유전자의 도입
크기가 11.0 Kb인 EcoRI단편을 pVK100r1로부터 EcoRI으로 절단된 pACYC184 (A.C.Y. Chang and S.N. Cohen, J Bacteriol., 134, 1978, 1141-1156) 로 재클론한다.
결정된 제한 지도에 상응하여 써던 블럿 하이브리드화에서 recA 프로우브에대해 표지된 3.1 Kb 크기의 BglII-/NruI-절단된 서브단편을 BamHI-HindIII-절단된 벡터 pWS233으로 클론한다. pWS233는 "유전자 대체" 벡터이다(W. Selbitschka et al., Appl. Microbiol, Biotechnol., 38, 1993,615-618).
Km 내성을 암호화하는 Tn5로부터의 XhoI DNA 단편 (pSUP2021, R. Simon et.al., Biotechnology, 1. 1983, ibid)을 수득된 플라스미드 pCC45의 XhoI 절단 부위로 클론한다. pCC49이 상기에서 수득된다. 전술한 공정( W. Selbitschka et al., 1993, ibid)과 유사하게 "유전자 대체"를 후술하는 방식으로 수행한다:
지수기 생장의 HK1349.4 배양액 3 ml를 지수기 생장의 공여체 배양액 (S17-1/pCC49) 1 ml와 배합하여 원심분리하고, 0.9 %의 NaCl 용액으로 세척한다. 세포를 50 ㎕의 NYB에서 영양 한천상에서 하룻밤동안 30 ℃에서 배양한다. 세포를 0.9 %의 NaCl 용액에 재현탁시킨 다음 선택 배지에 적당한 희석액으로 도포한다. Sm 내성 수령체 HK1349.4의 트랜스접합체(transconjugant)를 Sm (1000 ㎍/ml)및 Nm (150 ㎍/ml)을 사용하여 영양 한천상에서 얻었으며, "대체" 벡터상에서 유전자 sacRB에 상응하는 복합 배지에서 5 % 수크로오스에 대해 감수성을 나타내었다.
영양 한천상에서 선택 압력없이 선택된 트랜스접합체의 배양후 이중 재조합이 낮은 빈도(10-8)로 얻어졌다: 약 1 주일후 배지에서 5 % 수크로오스를 견디어내고 Nm-내성을 보유하나 다시 겐타마이신(Gm)-민감성이 된 (벡터 표식)세포를 분리하는 것이 가능하였다.
상기 표현형은 HK1349.4의 recA 변이에서의 대립 표식 교환과 위치를 확인한다. recA 돌연변이체의 전형적인 표현형 (예를 들어 UV 민감성 등)이 관찰된다.
상기 방식으로 수득된 HK1349.49 균주에서 플라스미드의 동종성 서열과의 염색체 통합(동종성 재조합)의 경향이 분명하게 감소된다. 그러므로 균주는 실시예 6.2에 예시된 하이브리드 플라스미드의 호스트로서 매우 적절하다
실시예 8
바이오형질전환
교반 플라스크(100 ml)에서 0.2 % (w/v)의 γ-부티로베타인(출발 물질) 및 C 공급원으로 0.4 % (w/v)의 글리세롤을 함유하는 N-결핍 최소 배지 (MM; Kulla et al., Arch. Microbiol., 1983, 135, pp.1-7)를 사용하여 바이오형질전환을 수행한다. N 공급원 및 추가의 C 공급원으로 0.2 % (w/v)의 L-글루타메이트(베타인 활용에 결함이 있는 균주와 함께) 또는 0.2 % (w/v)의 베타인이 첨가된다.
사용된 생산 균주는 된 발명에 따른 균주 HK1349.4/pLO41, HK1349.4/pVK1011, HK1349.4/pAZ7::beu, HK1349.4/PAZ101, HK1349/pVK100q 및 HK1349.4/pAZ7 이다.
결과를 EP-A-0 543 344에 공지된 HK13 유도체 HK1349(DSM 3944)및 HK1349.4와 비교하여 표 1 에 나타낸다.
γ-부티로베타인으로부터의 L-카르니틴의 형성은 베르그마이어(H.K. Bergmeyer, 1974, Methoden der Enzymatischen Analyse [Methods of Enzymatic Analysis], Verlag Chemie, Weinheim, 1810f)에 기술된 DTNB (5,5'-디티오비스(Z-니트로벤조에이트)) 방법에 의해 측정된다.

Claims (20)

  1. γ-부티로베타인-CoA 탈수소효소 (bcoC), γ-부티로베타인/크로토노베타인-CoA 합성효소 (bcoA/B) 또는 크로토노베타인-CoA 가수분해효소 (bcoD) 를 암호화하는 L-카르니틴 생합성의 유전자들 bcoC, bcoA/B 및 bcoD 중 하나 이상을 함유하는 분리된 DNA 단편으로서,
    a) 기탁 번호 DSM 8726 하의 리조비움/아그로박테리움 (Rhizobium/Agrobacterium) HK 1349로 기탁된, 플라스미드 pVK100q 에 삽입된 10.6 kb 의 EcoRI 단편, 또는 유전자들 bcoC, bcoA/B 또는 bcoD 중 하나 이상을 포함하는 그의 서브단편 (subfragment); 또는
    b) 50 - 70 ℃ 의 온도 및 0.5 - 1.5 M 염농도의 엄격한 하이브리드화 조건 하에 상기의 10.6 kb 의 EcoRI 단편, 또는 유전자들 bcoC, bcoA/B 또는 bcoD 중 하나 이상을 포함하는 그의 서브단편과 하이브리다이즈하며, γ-부티로베타인-CoA 탈수소효소 활성, γ-부티로베타인/크로토노베타인-CoA 합성효소 활성, 및/또는 크로토노베타인-CoA 가수분해효소 활성을 갖는 효소를 암호화하는 단편에서 선택되는 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
  2. 제 1 항에 있어서, γ-부티로베타인/크로토노베타인 대사에 관여하며 잠재성의 운반 단백질을 암호화하는 유전자 bcoT를 더 함유하는 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 유전자들 bcoC, bcoA/B, bcoD 와 경우에 따라서는 bcoT 가 에스케리키아 (Eschrichia), 슈도모나스 (Pseudomonas), 아그로박테리움 (Agrobacterium), 리조비움 (Rhizobium) 또는 리조비움/아그로박테리움 (Rhizobium/Agrobacterium) 속의 미생물들에서 유래되는 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 유전자들은 발현에 필요한 유전자 제어 요소들과 작동적으로 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, L-카르니틴 생합성의 유전자들은 bcoC, bcoA/B 그리고 bcoD 의 순서 또는, 적합한 것이라면, bcoC, bcoA/B, bcoD 그리고 bcoT 의 순서로 배열되고 있고 단일 전사 단위로서 존재하는 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
  6. 제 4 항에 있어서, 유전자-조절 요소에는 천연의 bco 오페론의 프로모터, Pbco가 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 유전자들 bcoC, bcoA/B, bcoD 그리고 bcoT는 아래의 제한 지도의 특징을 갖는 것을 특징으로 하는 DNA 단편:
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 DNA 단편을 함유하는 벡터.
  9. 제 8 항에 있어서, 기탁 번호 DSM 8726 하의 리조비움/아그로박테리움 HK 1349 로 기탁된 바의 플라스미드 pVK100q, 제 3 도의 제한 지도로 특징지워지는 바의 플라스미드 pVK1011, 또는 제 4 도의 제한 지도로 특징지워지는 바의 플라스미드 pAZ101 인 것을 특징으로 하는 벡터,
  10. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 DNA 단편을 함유하며 에스케리키아, 슈도모나스, 아그로박테리움, 리조비움 또는 리조비움/아그로박테리움 속의 미생물로부터 선택되는 재조합 미생물.
  11. 제 10 항에 있어서, L-카르니틴 분해대사의 능력이 완전히 혹은 부분적으로억제된 상태인 것을 특징으로 하는 미생물.
  12. 제 10 항에 있어서, 재조합 능력이 손상된 상태인 것을 특징으로 하는 미생물.
  13. 기탁 번호 DSM 8726 하에 기탁된 바의 플라스미드 pVK100q, 제 3 도의 제한 지도로 특징지워지는 바의 플라스미드 pVK1011, 또는 제 4 도의 제한 지도로 특징지워지는 바의 플라스미드 pAZ101 을 함유하는 미생물 리조비움/아그로박테리움 HK 1349, 또는 L-카르니틴 생합성 능력이 있는, 상기 미생물에서 유래된 유전적 변종 및 돌연변이체.
  14. 기탁 번호 DSM 8726 하의 리조비움/아그로박테리움 HK 1349 로 기탁된 바의 플라스미드 pVK100q, 제 3 도의 제한 지도로 특징지워지는 바의 플라스미드 pVK1011, 또는 제 4 도의 제한 지도로 특징지워지는 바의 플라스미드 pAZ101 을 함유하는 미생물 리조비움/아그로박테리움 HK 1349.4, 및 L-카르니틴 생합성 능력이 있는, 상기 미생물에서 유래된 유전적 변종 및 돌연변이체들.
  15. 제 10 항에 따른 미생물을 이용하여 적절한 탄소원 및 질소원의 존재 하에 크로토노베타인 및/또는 γ-부티로베타인을 발효시키고 L-카르니틴을 분리하는 것을 특징으로 하는, L-카르니틴의 생물공학적 제조 방법.
  16. 제 5 항에 있어서, 유전자-조절 요소에는 천연의 bco 오페론의 포로모터, Pbco가 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
  17. 제9항에 따른 벡터를 함유하며 에스케리키아, 슈도모나스, 아그로박테리움, 리조비움 또는 리조비움/아그로박테리움 속의 미생물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  18. 제 17 항에 있어서, L-카르니틴 분해대사의 능력이 완전히 혹은 부분적으로 억제된 상태인 것을 특징으로 하는 미생물.
  19. 제 17 항에 있어서, 재조합 능력이 손상된 상태인 것을 특징으로 하는 미생물.
  20. 제 17 항에 따른 미생물을 이용하여 적절한 탄소원 및 질소원의 존재 하에 크로토노베타인 및/또는 γ-부티로베타인을 발효시키고 L-카르니틴을 분리하는 것을 특징으로 하는, L-카르니틴의 생물공학적 제조 방법.
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