DE19850433A1 - Crotonobetainyl-Coenzym A, Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents

Crotonobetainyl-Coenzym A, Verfahren zu seiner Herstellung

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    • C12P41/001—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by metabolizing one of the enantiomers

Abstract

Die Erfindung betrifft das Crotonobetainyl-Coenzym A, ein Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung bei der Herstellung von L(-)-Carnitin. DOLLAR A An L(-)-Carnitin besteht ein wachsender Bedarf. Es ist die Aufgabe gestellt, diese Substanz in größeren Mengen zur Verfügung zu stellen. DOLLAR A Die Aufgabe wird gelöst, indem Crotonobetainyl-Coenzym A zur Aktivierung von Carnitinhydratase eingesetzt wird und diese aus Crotonobetain das L(-)-Carnitin produziert. Ähnlich kann verfahren werden, indem Crotonobetainyl-Coenzym A und Carnitinracemisierendes System in Puffer gelöst werden und dieses aus D(+)-Carnitin das gewünschte L(-)-Carnitin herstellt. DOLLAR A Die Erfindung wird angewendet in der L(-)-Carnitinsynthese.

Description

Die Erfindung betrifft Crotonobetainyl-Coenzym A und ein Verfahren zu seiner Herstellung. Sie betrifft ferner die Verwendung von Crotonobetainyl-Coenzym A zur Herstellung von L(-)-Carnitin aus Crotonobetain und D(+)-Carnitin.
Crotonobetainyl-Coenzym A ist als Substanz bisher nicht bekannt. Betrachtet man die Eignung dieser Verbindung, im Prozeß der Herstellung von L(-)-Carnitin verwendet zu werden, muß der Stand von Wissenschaft und Technik bezüglich der Herstellungsverfahren von L(-)-Carnitin berücksichtigt werden. Für die Gewinnung von L(-)-Carnitin sind zahlreiche chemische und biochemische bzw. biotechnologische Verfahren bekannt. Die meisten chemischen Synthesen führen zum D,L-Carnitin. Durch Umsetzung des Racemats mit optisch aktiven Trennsäuren, z. B. mit optischen Isomeren der Weinsäure, der Camphersäure oder der Camphersulfonsäure und einer anschließenden fraktionierten Kristallisation ist es möglich, das L-Enantiomer zu gewinnen (z. B. DD-PS 23 217; DD-PS 93 347; DE-OS 29 27 672). Alle bisher bekannten Verfahren zur Synthese haben den Nachteil, daß D(+)-Carnitin als Abfallprodukt anfällt, entsorgt werden muß und nur maximal 50% des synthetisierten Produktes als L(-)-Carnitin erhalten werden. Der therapeutische Einsatz von D,L-Carnitin ist nicht vertretbar, da D(+)-Carnitin nicht nur wirkungslos bezüglich der Fettsäureoxidation ist sondern auch kompetitiver Hemmstoff verschiedener L(-)-Carnitin-spezifischer Transportsysteme und Enzyme (Life Sciences 28 [1981] 2931-2938). Aus diesem Grund sind in den letzten Jahren Verfahren zur stereospezifischen Synthese aus achiralen Vorstufen entwickelt worden (z. B. Tetrahedron, [1992], Vol. 48, 319-324).
Alternativen zur chemischen Synthese von L(-)-Carnitin stellen mikrobiologische bzw. enzymatische Prozesse dar. So ist es möglich, die Rückreaktion der L(-)- Carnitindehydrogenase (EC 1.1.1.108) zu nutzen, um L(-)-Carnitin aus 3- Dehydrocarnitin herzustellen (US-PS 4221 869). Da es sich dabei um ein NADH- abhängiges Enzym handelt, muß die Bereitstellung von Reduktionsäquivalenten garantiert werden. Außerdem ist 3-Dehydrocarnitin sehr instabil. Verschiedene Stämme von Enterobacteriaceen sind in der Lage, unter anaeroben Bedingungen L(-)- Carnitin über Crotonobetain in gamma-Butyrobetain umzuwandeln (DD-PS 221 905, JP-PS 6167 494, JP-PS 61 234 794, JP-PS 61 234 788). Die Metabolisierung von L(-)- Carnitin in Crotonobetain ist reversibel und wird von einem stereospezifischen Enzym, der L(-)-Carnitindehydratase, katalysiert (DD-PS 281 735, DD-PS 281 919). Damit kann Crotonobetain als achirale Ausgangsverbindung zur Synthese von L(-)- Carnitin verwendet werden. Einige Proteus-Stämme können auch unter aeroben Bedingungen L(-)-Carnitin aus Crotonobetain bilden (US-PS 5300 430). Für die enzymatische Synthese von L(-)-Carnitin aus dem Abfallprodukt D(+)-Carnitin wurde eine Racemase beschrieben (DD-PS 300 181). Eine dritte Möglichkeit stellt die Gewinnung von L(-)-Carnitin aus gamma-Butyrobetain mittels der gamma- Butyrobetainhydroxylase (EC 1.14.11.1) dar (DE-OS 31 23 975). In den EP 158 194, EP 195 944 und JP 61 199 793 sind Verfahren beschrieben, die auf der Produktion von L(-)-Carnitin aus Crotonobetain oder gamma-Butyrobetain mittels Kultivierung selektionierter Mikroorganismen auf einer zusätzlichen C-Quelle, z. B. Glycinbetain, in Anwesenheit von Crotonobetain oder gamma-Butyrobetain beruhen.
Die L(-)-Carnitindehydratase (EC 4.2.1.89) katalysiert die reversible Umwandlung von Crotonobetain zu L(-)-Carnitin nur in Anwesenheit eines aus Escherichia coli isolierten und bisher noch nicht identifizierten niedermolekularen Faktors F (DD-PS 281 735). Durch Immobilisierung einer aus der Familie der Enterobacteriaceae isolierten L(-)-Carnitindehydratase wurde ein Verfahren zur L(-)-Carnitinsynthese ohne Nebenproduktbildung entwickelt (DD-PS 281 919). Für die Racemisierung von D(+)- in L(-)-Carnitin ist dieser niedermolekulare Faktor F ebenfalls essentiell. Auch die Reduktion von Crotonobetain zu gamma-Butyrobetain erfolgt nur in Anwesenheit des gleichen Faktors.
L(-)-Carnitin (3-Hydroxy-4-trimethylaminobutyrat) ist eine ubiquitär in der Natur vorkommende Verbindung. Für den Transport langkettiger Fettsäuren duch die innere Mitochondrienmembran ist es als Acylgruppencarrier von essentieller Bedeutung. Aufgrund seiner zentralen Bedeutung im Stoffwechsel höherer Organismen findet L(-)-Carnitin Anwendung in der Therapie und Prophylaxe von Patienten mit verschiedenen Herzkrankheiten aber auch zur Behandlung von Dialysepatienten (Übersicht: Pathology 17, [1985] 116-169). Bei parenteraler Ernährung in der Postnatalperiode bei Neugeborenen sowie bei Erwachsenen über einen längeren Zeitraum enrveist sich die Supplementation von L(-)-Carnitin als unerläßlich (Gürtler und Löster, Carnitin [1996] 21-30). Von zunehmender Bedeutung ist L(-)-Carnitin als Ergänzungsnährstoff.
Mikrobiologische Verfahren zur Synthese von L(-)-Carnitin haben den Nachteil, daß die Mikroorganismen aufgrund ihrer geringen Größe nur schwierig vom Kulturmedium abgetrennt werden können und daß für die Kultivierung ständig Nährmedien neu zur Verfügung gestellt werden müssen. Dazu kommt, daß zur Aufarbeitung der verdünnten L(-)-Carnitin-haltigen Kulturflüssigkeit ein erheblicher Aufwand betrieben werden muß. Bei der Synthese von L(-)-Carnitin aus Crotonobetain in mikrobiologischen Systemen besteht die Möglichkeit der Umsetzung von Crotonobetain zu gamma-Butyrobetain durch Crotonobetainreduktase als Konkurrenzreaktion zur Synthesereaktion.
Das Verfahren zur enzymatischen Synthese von L(-)-Carnitin aus Crotonobetain hat den Nachteil, daß über die immobilisierte L(-)-Carnitindehydratase neben Crotonobetain eine aus E. coli gewonnene und von Protein befreite Lösung mit einem nicht identifiziertem Faktor F gegeben werden muß, die essentiell für die Aktivierung des Enzyms ist. Störende Einflüsse von Komponenten in der proteinfreien Lösung auf den Faktor F können nicht ausgeschlossen werden. Eine Optimierung der enzymatischen Synthese von L(-)-Carnitin ist nur bedingt möglich, da insbesondere auch die Menge an zugesetztem Faktor F nicht exakt quantifizierbar ist. Für die in E. coli beschriebene Racemisierung von D(+)- zu L(-)-Carnitin ist derselbe Faktor F von essentieller Bedeutung. Der Faktor F kann durch bekannte Coenzyme und Cofaktoren von Enzymen nicht ersetzt werden (Jung et al., Biochim. Biophys. Acta 1003 [1989] 270-276).
Ursachen für die aufgeführten Nachteile sind fehlende Kenntnisse über die Struktur des Faktors F sowie über seine Rolle bei der Aktivierung des Apoenzyms der L(-)- Carnitindehydratase. Andere Verbindungen, die ebenfalls die Aktivierung des Apoenzyms der L(-)-Carnitindehydratse bewirken könnten, sind nicht bekannt.
Das Ziel der Erfindung ist, die stereospezifische Synthese von L(-)-Carnitin aus Crotonobetain im zelifreien Medium bzw. die Racemisierung des Abfallproduktes D(+)-Carnitin zu L(-)-Carnitin enzymatisch zu ermöglichen. Diese Enzym- katalysierten Reaktionen stellen eine Alternative zur rein chemischen Synthese von L(-)-Carnitin bzw. zu mikrobiologischen Verfahren der L(-)-Carnitingewinnung dar.
Die Aufgabe der Erfindung wird darin gesehen, mit Crotonobetainyl-Coenzym A und L(-)-Carnitindehydratase die enzymatische Synthese von L(-)-Carnitin aus Crotonobetain ohne Nebenproduktbildung zu ermöglichen. Weiterhin ist durch die Anwendung des Carnitin-racemisierenden Systems zusammen mit Crotonobetainyl- Coenzym A die Umwandlung des physiologisch unwirksamen Abfallprodukts D(+)- Carnitin in L(-)-Carnitin anzustreben.
Gegenstand der Erfindung ist eine Coenzym A-Verbindung, im folgenden als Crotonobetainyl-Coenzym A bezeichnet, die in der Lage ist, als Cofaktor die L(-)- Carnitindehydratase zu aktivieren, so daß eine reversible Umwandlung von Crotonobetain zu L(-)-Carnitin erfolgen kann. Der Cofaktor ist auch für die Racemisierung von D(+)- zu L(-)-Carnitin sowie für die Umwandlung von Crotonobetain in gamma-Butyrobetain essentiell erforderlich. Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Synthese und Anwendung von Crotonobetainyl- Coenzym A.
Der Einsatz der L(-)-Carnitindehydratase kombiniert mit Crotonobetainyl-Coenzym A eröffnet eine völlig neue Möglichkeit der Synthese von L(-)-Carnitin aus Crotonobetain. Durch Coimmobilisierung von L(-)-Carnitindehydratase und Crotonobetainyl-Coenzym A kann eine Alternative zu bisherigen industriellen Verfahren der L(-)-Carnitin-Produktion entwickelt werden. In analoger Weise kann das racemisierende System zusammen mit Crotonobetainyl-Coenzym A als Verfahren zur Synthese von L(-)- aus D(+)-Carnitin zur Anwendung kommen.
Mit Hilfe der Erfindung ist es möglich, L(-)-Carnitin aus Crotonobetain mittels L(-)- Carnitindehydratase (EC 4.2.1.89) zu synthetisieren. Für die Aktivierung des Apoenzyms der L(-)-Carnitindehydratase sind nur katalytische Mengen an Crotonobetainyl-Coenzym A notwendig.
Voraussetzung für die Synthese von Crotonobetainyl-Coenzym A ist die Aktivierung des Crotonobetains. Als Ausgangsstoff wird vorzugsweise getrocknetes Crotonobetain-Hydrochlorid verwendet. Das Crotonobetain-Hydrochlorid wird mit Phosphortrichlorid bei 15-70°C (vorzugsweise bei 25°C) unter Sauerstoffabschluß umgesetzt. Gebildetes Crotonobetainylchlorid wird von weiteren Produkten und Aus­ gangsstoffen durch Begasen mit Stickstoff abgetrennt.
Das so erhaltene Crotonobetainylchlorid ist für die Synthese von Crotonobetainyl- Coenzym A geeignet. Coenzym A wird zuerst in eiskalter 1 M Natriumhydrogencarbonatlösung, pH 7,5-9,5 (vorzugsweise pH 8,5), suspendiert. Dazu wird eine definierte Menge an Crotonobetainylchlorid (vorzugsweise im Überschuß) unter Kontrolle des pH-Wertes gegeben. Nach 15-30 min ist die Reaktion beendet. Die Bildung von Crotonobetainyl-Coenzym A wird durch HPLC (Spherisorb, C18-Säule) kontrolliert und anschließend einem weiteren Reinigungsschritt (Ionenaustauschchromatographie an DOWEX 50) unterzogen. Die Reinheitskontrolle erfolgt erneut über HPLC (Spherisorb, C18-Säule). Von dem sauberen Präparat wurden physikalisch-chemische Eigenschaften bestimmt (vgl. nachfolgende Tabelle).
Eigenschaften Crotonobetainyl-Coenzym A
Molare Masse 893,6
Absorptionsmaximum 208 nm, 260 nm
Molarer Extinktionskoeffizient (ε260) 20,2 l.mmol-1.cm-1
pH-Stabiltät für 1 h 2-10
Temperaturstabilität für 1 h 100%: -20°C bis 0°C
75%: 20°C bis 60°C
Löslichkeit Wasser
Für den erfindungsgemäßen Nachweis der Aktivierung der L(-)- Carnitindehydratase wird gereinigtes Crotonobetainyl-Coenzym A (vorzugsweise 1-10 nmol∧∧) in Kaliumphosphatpuffer (10 mM, pH 7,5) gegeben, partiell angereicherte L(-)-Carnitindehydratase (ohne Faktor F keine Aktivität zeigend) und die zu metabolisierende Crotonobetainlösung (1 M) hinzugefügt sowie bei 37°C inkubiert.
Gebildetes L(-)-Carnitin wird anschließend im optischen Test mit Hilfe der Carnitin- Acetyltransferase (nach BERGMEYER (1970)) nachgewiesen. Analog wird beim Nachweis der Racemisierungsreaktion verfahren, wobei statt Crotonobetain eine D(+)-Carnitinlösung (1 M) hinzugefügt wird. Die exakte Bestimmung des gebildeten L(-)-Carnitin ist nach vorheriger Eichung des Systems mit bekannten L(-)- Carnitinlösungen möglich.
Für den erfindungsgemäßen Nachweis der Aktivierung des Enzymsystems, welches Crotonobetain in gamma-Butyrobetain umwandelt, wird gereinigtes Crotonobetainyl-Coenzym A (vorzugsweise 1-10 nmol) in temperierten (vorzugsweise 37°C) und mit Stickstoff begasten Kaliumphosphatpuffer (50 mM, pH 7,8) gegeben, Crotonobetain-reduzierendes Enzymsystem (ohne Faktor F keine Aktivität zeigend) sowie Dithionit (vorzugsweise 50 mM) und Benzylviologen (vorzugsweise 1 mM) hinzugefügt. Nach Zugabe der zu metabolisierenden Crotonobetainlösung (3,75 M) kann gebildetes gamma-Butyrobetain im optischem Test anhand des oxidierten Benzylviologen nachgewiesen werden.
Beispiel 1
Bildung von L(-)-Carnitin aus Crotonobetain durch angereicherte L(-)- Carnitindehydratase und Crotonobetainyl-Coenzym A (CB-CoA) nach 10 min Inkubation bei 37°C in Kaliumphosphatpuffer (10 mM, pH 7,5).
Beispiel 2
Bildung von L(-)-Camitin aus D(+)-Camitin durch ein Camitin-racemisierendes System und Crotonobetainyl-Coenzym A (CB-CoA) nach 10 min Inkubation bei 37°C in Kaliumphosphatpuffer (10 mM, pH 7,5).

Claims (6)

1. Crotonobetainyl-Coenzym A, gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften:
  • a) Molare Masse: 893,6
  • b) Absorptionsmaxima: 208 nm und 260 nm
  • c) Molarer Extinktionskoeffizient (ε260): 20,2 l.mmol-1.cm-1
  • d) Km-Wert der L(-)-Carnitindehydratase für Crotonobetainyl-Coenzym A: 8.10-6 M
  • e) Temperaturstabilität: bei -20°C mehrere Wochen bei 0°C einige Stunden
  • f) pH-Stabilität: zwischen pH 2 und pH 10 über 1 Stun­ de gut
    stabil bei pH 5 über mehrere Wochen
  • g) Löslichkeit: in Wasser gut
    in organischen Lösungsmittel sehr we­ nig
  • h) Sonstiges: hygroskopisch.
2. Verfahren zur Herstellung von Crotonobetainyl-Coenzym A nach Anspruch 1 aus Crotonobetain-Hydrochlorid und Coenzym A, dadurch gekennzeichnet, daß zu­ nächst in einem erstenSchritt Crotonobetainylchlorid aus Crotonobetain-Hydro­ chlorid und Phosphortrichlorid bei 25°C hergestellt und anschließend in einem zweiten Schritt mit Coenzym A in eiskalter Natriumhydrogencarbonatlösung zu Crotonobetainyl-Coenzym A umgesetzt wird.
3. Verwendung von Crotonobetainyl-Coenzym A nach Anspruch 1 zur Aktivierung von L(-)-Carnitindehydratase, dadurch gekennzeichnet, daß beide Verbindungen in eine Pufferlösung von pH 7,8 gegeben werden.
4. Verwendung von Crotonobetainyl-Coenzym A nach Anspruch 1 und 2 zur Herstellung von L(-)-Carnitin, dadurch gekennzeichnet, daß beide Verbindungen in einen Puffer bei pH 7,8 gegeben werden und dieser Lösung Crotonobetain zu gefügt wird.
5. Verwendung von Crotonobetainyl-Coenzym A nach Anspruch 1 zur Herstellung von L(-)-Carnitin, dadurch gekennzeichnet, daß Crotonobetainyl-Coenzym A und Carnitin-racemisierendes System zusammen in Puffer bei pH 7,8 gegeben werden und der Lösung D(+)-Carnitin zugesetzt wird.
6. Verwendung von Crotonobetainyl-Coenzym A nach Anspruch 1 zur Herstellung von gamma-Butyrobetain, dadurch gekennzeichnet, daß Crotonobetainyl- Coenzym A und Crotonobetain-reduzierendes Enzymsystem zu Benzylviologen und Dithionit in Puffer pH 7,5 gegeben werden und Crotonobetain zugefügt wird.
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