DE10032076A1 - Verfahren zur enzymatischen Synthese von L-Carnitin - Google Patents

Verfahren zur enzymatischen Synthese von L-Carnitin

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Synthese von L-Carnitin aus Crotonobetain.
Für die Gewinnung von L-Carnitin sind zahlreiche chemische und mikrobiologische bzw. enzymatische Verfahren bekannt. Die meisten chemischen Synthesen führen zum D,L-Carnitin. Durch Umsetzung des Racemats mit optisch aktiven Trennsäuren, z. B. mit optischen Isomeren der Weinsäure, der Camphersäure oder der Camphersulfonsäure und einer anschließenden fraktionierten Kristallisation ist es möglich, das L-Enantiomer zu gewinnen (z. B. DD-PS 23 217; DD-PS 93 347; DE-OS 29 27 672). Alle bisher bekannten chemischen Verfahren zur Synthese haben den Nachteil, daß D-Carnitin als Abfallprodukt anfällt, entsorgt werden muß und so nur maximal 50% des synthetisierten Produktes als L-Carnitin erhalten werden. Der therapeutische Einsatz von D,L-Carnitin ist nicht vertretbar, da D-Carnitin nicht nur wirkungslos bezüglich der Fettsäureoxidation sondern auch kompetitiver Hemmstoff verschiedener L-Carnitin-spezifischer Transportsysteme und Enzyme ist (Life Sciences 28 [1981] 2931-2938). Aus diesem Grund sind in den letzten Jahren Verfahren zur stereospezifischen Synthese aus achiralen Vorstufen entwickelt worden (z. B. Tetrahedron, [1992], Vol. 48, 319-324).
Alternativen zur chemischen Synthese von L-Carnitin stellen mikrobiologische bzw. enzymatische Prozesse dar. So ist es möglich, die Rückreaktion der L- Carnitindehydrogenase (EC 1.1.1.108) zu nutzen, um L-Carnitin aus 3- Dehydrocarnitin herzustellen (US-PS 4221 869). Da es sich dabei um ein NADH- abhängiges Enzym handelt, muß die Bereitstellung von Reduktionsäquivalenten garantiert werden. Außerdem ist 3-Dehydrocarnitin sehr instabil. Verschiedene Stämme von Enterobacteriaceen sind in der Lage, unter anaeroben Bedingungen L- Carnitin über Crotonobetain in γ-Butyrobetain umzuwandeln (DD-PS 221 905, JP-PS 6167 494, JP-PS 61 234 794, JP-PS 61 234 788). Die Metabolisierung von L- Carnitin in Crotonobetain ist reversibel und wird von einem stereospezifischen Enzym, der L-Carnitindehydratase, katalysiert (DD-PS 281 735, DD-PS 281 919). Damit kann Crotonobetain als achirale Ausgangsverbindung zur Synthese von L- Carnitin verwendet werden. Einige Proteus-Stämme können auch unter aeroben Bedingungen L-Carnitin aus Crotonobetain bilden (US-PS 5300 430). Für die enzymatische Synthese von L-Carnitin aus dem Abfallprodukt D-Carnitin wurde eine Racemase beschrieben (DD-PS 300 181). Eine dritte Möglichkeit stellt die Gewinnung von L-Carnitin aus γ-Butyrobetain mittels der γ-Butyrobetainhydroxylase (EC 1.14.11.1) dar (DE-OS 31 23 975). In den EP 158 194, EP 195 944 und JP 61 199 793 sind weitere biotechnologische Verfahren beschrieben, die auf der Produktion von L-Carnitin aus Crotonobetain oder γ-Butyrobetain mittels Kultivierung selektionierter Mikroorganismen auf einer zusätzlichen C-Quelle, z. B. Glycinbetain, in Anwesenheit von Crotonobetain oder γ-Butyrobetain beruhen.
Die L-Carnitindehydratase (EC 4.2.1.89) katalysiert die reversible Umwandlung von Crotonobetain zu L-Carnitin nur in Anwesenheit eines aus Escherichia coli isolierten und bisher noch nicht identifizierten niedermolekularen Faktors F (DD-PS 281 735). Durch Immobilisierung einer aus der Familie der Enterobacteriaceae isolierten L- Carnitindehydratase wurde ein Verfahren zur L-Carnitinsynthese ohne Nebenproduktbildung entwickelt (DD-PS 281 919). Für die Racemisierung von D- in L-Carnitin ist dieser niedermolekulare Faktor F ebenfalls essentiell. Auch die Reduktion von Crotonobetain zu γ-Butyrobetain erfolgt nur in Anwesenheit des gleichen Faktors.
Es ist bisher nicht bekannt, dass eine Enoyl-CoA Hydratase, eine CoA-Transferase sowie ein CoA-Derivat einer Trimethylammoniumverbindung in Form von CB-CoA oder BB-CoA an der enzymatischen Synthese von L-Carnitin aus Crotonobetain im zellfreien Extrakt beteiligt sind.
L-Carnitin (3-Hydroxy-4-trimethylaminobutyrat) ist eine ubiquitär in der Natur vorkommende Verbindung. Für den Transport langkettiger Fettsäuren durch die innere Mitochondrienmembran ist es als Acylgruppencarrier von essentieller Bedeutung. Aufgrund seiner zentralen Bedeutung im Stoffwechsel höherer Organismen findet L-Carnitin Anwendung in der Therapie und Prophylaxe von Patienten mit verschiedenen Herzkrankheiten aber auch zur Behandlung von Dialysepatienten (Übersicht: Pathology 17, [1985] 116-169). Bei parenteraler Ernährung in der Postnatalperiode bei Neugeborenen sowie bei Erwachsenen über einen längeren Zeitraum erweist sich die Supplementation von L-Carnitin als unerläßlich (Gürtler und Löster, Carnitin [1996] 21-30). Von zunehmender Bedeutung ist L-Carnitin als Ergänzungsnährstoff.
Mikrobiologische Verfahren zur Synthese von L-Carnitin haben den Nachteil, daß die Mikroorganismen aufgrund ihrer geringen Größe schlecht vom Kulturmedium abgetrennt werden können und daß für die Kultivierung ständig Nährmedien neu zur Verfügung gestellt werden müssen. Dazu kommt, daß zur Aufarbeitung der verdünnten L-Carnitin-haltigen Kulturflüssigkeit ein erheblicher Aufwand betrieben werden muß. Bei der Synthese von L-Carnitin aus Crotonobetain in mikrobiologischen Systemen besteht die Möglichkeit der Umsetzung von Crotonobetain zu γ-Butyrobetain durch Crotonobetainreduktase als Konkurrenzreaktion zur Synthesereaktion.
Das Verfahren zur enzymatischen Synthese von L-Carnitin aus Crotonobetain hat den Nachteil, daß über die immobilisierte L-Garnitindehydratase neben Crotonobetain eine aus E. coli gewonnene und von Protein befreite Lösung mit einem nicht identifiziertem Faktor F gegeben werden muß, die essentiell für die Aktivierung des Enzyms ist. Störende Einflüsse von Komponenten in der proteinfreien Lösung auf den Faktor F können nicht ausgeschlossen werden. Eine Optimierung der enzymatischen Synthese von L-Carnitin ist nur bedingt möglich, da insbesondere auch die Menge an zugesetztem Faktor F nicht exakt quantifizierbar ist. Für die in E. coli beschriebene Racemisierung von D- zu L-Carnitin ist derselbe Faktor F von essentieller Bedeutung. Der Faktor F kann durch bekannte Coenzyme und Cofaktoren von Enzymen nicht ersetzt werden (Jung et al., Biochim. Biophys. Acta 1003 [1989] 270-276).
Ursachen für die aufgeführten Nachteile sind fehlende Kenntnisse über die Struktur des Faktors F sowie über seine Rolle bei der Aktivierung des Apoenzyms der L- Carnitindehydratase. Andere Verbindungen, die ebenfalls die Aktivierung des Apoenzyms der L-Carnitindehydratse bewirken könnten, sind nicht bekannt.
Das Ziel der Erfindung ist es, die stereospezifische Synthese von L-Carnitin aus Crotonobetain im zellfreien Medium zu ermöglichen. Diese Enzym-katalysierte Reaktion stellt eine Alternative zur rein chemischen Synthese von L-Carnitin bzw. zu mikrobiologischen Verfahren der L-Carnitingewinnung dar.
Die Aufgabe der Erfindung wird darin gesehen, mit den CoA-Derivaten BB-CoA und/oder CB-CoA sowie mit Hilfe der beiden Proteine Betainyl-CoA Transferase und Enoyl-CoA Hydratase die enzymatische Synthese von L-Carnitin aus Crotonobetain im zellfreien Extrakt ohne Nebenproduktbildung zu ermöglichen.
Gegenstand der Erfindung ist die Herstellung von L-Carnitin aus Crotonobetain im zellfreien Extrakt. Dazu erforderlich ist ein Enzymsystem bestehend aus einer Betainyl-CoA Transferase und einer Enoyl-CoA Hydratase sowie die Anwesenheit eines CoA-Derivates einer Trimethylammoniumverbindung (z. B. BB-CoA oder CB- CoA). Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren über die Anwendung von CB- CoA und BB-CoA sowie der Betainyl-CoA Transferase und Enoyl-CoA Hydratase zur Herstellung von L-Carnitin aus Crotonobetain.
Der Einsatz dieser beiden Enzyme kombiniert mit BB-CoA oder CB-CoA eröffnet eine völlig neue Möglichkeit der Synthese von L-Carnitin aus Crotonobetain im zellfreien Extrakt.
Mit Hilfe der Erfindung ist es möglich, L-Carnitin aus Crotonobetain mit Hilfe der Proteine Betainyl-CoA Transferase und Enoyl-CoA Hydratase in Anwesenheit von CB-CoA oder BB-CoA zu synthetisieren. Dabei ist der Einsatz katalytischer Mengen an BB-CoA bzw. CB-CoA ausreichend.
Voraussetzung für die Synthese von CB-CoA/BB-CoA ist die Aktivierung von Crotonobetain/γ-Butyrobetain. Als Ausgangsstoff wurde vorzugsweise getrocknetes Crotonobetain-/γ-Butyrobetain-Hydrochlorid verwendet. Das Crotonobetain/γ- Butyrobetain-Hydrochlorid wurde mit Phosphortrichlorid bei 15-70°C (vorzugsweise bei 25°C) unter Sauerstoffabschluß umgesetzt. Gebildetes γ-Crotonobetainyl-/Bu­ tyrobetainylchlorid wurde von weiteren Produkten und Ausgangsstoffen durch Begasen mit Stickstoff abgetrennt.
Das so erhaltene Crotonobetainyl-/γ-Butyrobetainylchlorid ist für die Synthese von CB-CoA/BB-CoA geeignet. Coenzym A wird zuerst in eiskalter 1 M Natriumhydrogencarbonatlösung, pH 6,5-9,5 (vorzugsweise pH 8,5), suspendiert. Dazu wird eine definierte Menge an Crotonobetainyl-/γ-Butyrobetainylchlorid (vorzugsweise im Überschuß) unter Kontrolle des pH-Wertes gegeben. Nach 15-­ 30 min ist die Reaktion beendet. Die Bildung von CB-CoA/BB-CoA wird durch HPLC (Spherisorb, C18-Säule) kontrolliert und anschließend einem weiteren Reinigungsschritt (Ionenaustauschchromatographie an DOWEX 50) unterzogen. Die Reinheitskontrolle erfolgt erneut über HPLC (Spherisorb, C18-Säule).
Die Präparation der Enzyme erfolgte jeweils aus einem Überexpressionsstamm. Der zur erfindungsgemäßen Durchführung geeignete Stamm ist Escherichia coli BL21 (DE3). Für die Präparation der Betainyl-CoA Transferase enthielt E. coli BL21 (DE3) das Plasmid pT7-6 mit dem Gen caiB unter Kontrolle des T7 RNA-Polymerase Promotors. Im Unterschied dazu trägt für die Präparation der Enoyl-CoA Hydratase E. coli BL21 (DE3) das Plasmid pT7-5 mit dem Gen caiD ebenfalls unter Kontrolle des T7 RNA-Polymerase Promotors. Beide Überexpressionsstämme verfügen über eine Ampicillinresistenz.
Die Kultivierung der Bakterien erfolgte in Luria-Broth-(LB-) Medium unter Zusatz von Ampicillin (vorzugsweise 100 mg/l) und Isopropyl-1-thio-β-D-Galactopyranosid (vorzugsweise 0,4 mM). Nach einer Kultivierungszeit von 4-24 h (vorzugsweise 10-12 h) unter anaeroben Bedingungen bei einer Temperatur 25-37°C (vorzugsweise 37°C) werden die Zellen durch Zentrifugation abgetrennt und in Phosphatpuffer pH 6-9 (vorzugsweise pH 7,5) aufgenommen und mit bekannten Verfahren (Alcoa, French Press, Ultraschall) aufgeschlossen. Die Betainyl-CoA Transferase wurde in einem zweistufigen Verfahren (DEAE-Sepharose, Resource™Q) bis zur Homogenität gereinigt und dabei etwa 11-fach angereichert. Die Betainyl-CoA Transferase transferiert den CoA-Rest zwischen den Betainen und ist spezifisch für CoA-Derivate von Trimethylammoniumverbindungen (Abb. 1). Das Enzym akzeptiert ausschließlich CB-CoA, BB-CoA und L-Carnitinyl-CoA als Cosubstrat. Die Enoyl- CoA Hydratase wurde ebenfalls in einem zweistufigen Verfahren (EMD-DEAE, Resource™Q) gereinigt und dabei etwa 3-fach angereichert. Die Enoyl-CoA Hydratase hydratisiert CB-CoA zu L-Carnitinyl-CoA (Abb. 1) und Crotonyl-CoA zu L- Hydroxybutyryl-CoA, jedoch nicht Crotonobetain zu L-Carnitin. Dabei liegt Vmax beim Umsatz von CB-CoA ca. um den Faktor 103 höher als beim Umsatz von Crotonyl- CoA.
Für den erfindungsgemäßen Nachweis der Synthese von L-Carnitin aus Crotonobetain wurde homogene Betainyl-CoA Transferase, homogene Enoyl-CoA Hydratase und gereinigtes CB-CoA/BB-CoA in Kaliumphosphatpuffer (10 mM, pH 7,5) gegeben, die zu metabolisierende Crotonobetainlösung (vorzugsweise 1 M) hinzugefügt und bei 37°C inkubiert. Gebildetes L-Carnitin wurde anschließend im optischen Test mit Hilfe der Carnitin-Acetyltransferase (nach BERGMEYER (1970)) nachgewiesen. Die exakte Bestimmung des gebildeten L-Carnitin ist nach vorheriger Eichung des Systems mit bekannten L-Carnitinlösungen möglich.
Beispiel 1 Reinigung der Betainyl-CoA Transferase aus E. coli BL21 (DE3)
Die Aktivität der Betainyl-CoA Transferase wurde über die Bestimmung des Umsatzes von Crotonobetain zu L(-)-Carnitin ermittelt. Dazu muß in jedem Fall die Betainyl-CoA Transferase im Inkubationsansatz mit der Enoyl-CoA Hydratase und CB-CoA oder BB-CoA gesättigt werden. Die Reaktionsansätze wurden 5 min bei 37°C in Kaliumphosphatpuffer (10 mM, pH 7,5) inkubiert.
Beispiel 2 Reinigung der Enoyl-CoA Hydratase aus E. coli BL21 (DE3)
Die Aktivität der Enoyl-CoA Hydratase wurde über die Bestimmung des Umsatzes von Crotonobetain zu L(-)-Carnitin ermittelt. Dazu muß in jedem Fall die Enoyl-CoA Hydratase im Inkubationsansatz mit der Betainyl-CoA Transferase und CB-CoA oder BB-CoA gesättigt werden. Die Reaktionsansätze wurden 5 min bei 37°C in Kaliumphosphatpuffer (10 mM, pH 7,5) inkubiert.
Beispiel 3
Synthese von L-Carnitin aus Crotonobetain in Anwesenheit von CB-CoA oder BB- CoA durch ein Enzymsystem bestehend aus der Betainyl-CoA Transferase und der Enoyl-CoA Hydratase. Die Reaktionsansätze wurden 5 min bei 37°C in Kaliumphosphatpuffer (10 mM, pH 7,5) inkubiert.

Claims (8)

1. Betainyl-CoA Transferase aus E. coli BL21 (DE3) gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften:
  • a) Relative Molmasse (denaturiert): 45 kDa
  • b) Relative Molmasse (nativ): 86 kDa
  • c) Enzymatische Funktion: CoA-Transferaseaktivität
  • d) Substratspezifität: Crotonobetain, γ-Butyrobetain, L-Carnitin
  • e) Cosubstratspezifität: Crotonobetainyl-CoA, γ-Butyrobetainyl- CoA, L-Carnitinyl-CoA.
2. Enoyl-CoA Hydratase aus E. coli BL21 (DE3) gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften:
  • a) Relative Molmasse (denaturiert): 27 kDa
  • b) Relative Molmasse (nativ): 87 kDa
  • c) Enzymatische Funktion: Enoyl-CoA Hydrataseaktivität
  • d) Substratspezifität: Crotonobetainyl-CoA (Km = 1,2 10-5 M;
    Vmax = 2086 U/mg),
    Crotonyl-COA (Km = 3,8 10-5 M; Vmax = 0,9 U/mg).
3. Verwendung von Betainyl-CoA Transferase aus E. coli BL21 (DE3) nach Anspruch 1 zur Synthese von L-Carnitin.
4. Verwendung von Enoyl-CoA Hydratase aus E. coli BL21 (DE3) nach Anspruch 2 zur Synthese von L-Carnitin.
5. Verwendung von Crotonobetainyl-CoA (CB-CoA) gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften
  • a) Molare Masse: 893,2
  • b) Absorptionsmaxima: 208 nm, 260 nm
  • c) Molarer Extinktionskoeffizient (ε260): 20,2 l.mmol-1.cm-1
    zur Synthese von L-Carnitin.
6. Verwendung von γ-Butyrobetainyl-Coenzym A (BB-CoA) gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften
  • a) Molare Masse: 895,2
  • b) Absorptionsmaximum: 258 nm
  • c) Molarer Extinktionskoeffizient (ε260): 16,1 l.mmol-1.cm-1
    zur Synthese von L-Carnitin.
7. Verwendung von gereinigter Betainyl-CoA Transferase und sowie gereinigter Enoyl-CoA Hydratase nach Anspruch 1 und 2 zur Synthese von L-Carnitin, dadurch gekennzeichnet, daß beide Verbindungen in eine Pufferlösung von pH 7,8 gegeben werden.
8. Verwendung von BB-CoA oder CB-CoA zur Synthese von L-Carnitin nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine der beiden Verbindungen in eine Lösung nach Anspruch 5 bei pH 7,8 gegeben wird und dieser Lösung Crotonobetain zugefügt wird.
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