CH657373A5

CH657373A5 - Enzymatische synthese von l-serin.

Info

Publication number: CH657373A5
Application number: CH6225/83A
Authority: CH
Inventors: David Martin Anderson; Humg-Yu Hsiao; Ronald Lamont Somerville; Klaus Manfred Herrmann
Original assignee: Genex Corp
Priority date: 1982-11-19
Filing date: 1983-11-18
Publication date: 1986-08-29
Also published as: GR79037B; FR2536415A1; FR2536415B1; ZA838642B; IT8368213A0; DK529583A; FI834231A0; DE3341763A1; BE898261A; PL244608A1; AU2149383A; FI834231A; IL70271A0; SE8306351D0; BR8306301A; SE8306351L; GB2130216B; ES527388A0; DK529583D0; JPS59109187A

Description

so Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung der Aminosäure L-Serin. Die Aminosäure L-Serin ist ein wertvolles Handelsprodukt, welches in der Hyperernährung und in Nährmitteln verwendet wird und auch als Zwischenprodukt oder Ausgansprodukt in gewissen 55 synthetischen Verfahren dient. Es besteht somit ein Bedarf an L-Serin, und verschiedene Verfahren wurden entwickelt, um es herzustellen. Eine Anzahl dieser Verfahren umfasst die Erzeugung von L-Serin durch Fermentation. Siehe zum Beispiel Y. Morinaga et al., Agric. Biol. Chem. 45(6) 1419-24 60 (1981); Y. Morinaga et al., Agric. Biol. Chem. 45(6) 1425-1430 (1981). Ferner beschreibt die US-Patentschrift 3 616 224, erteilt an Shiio et al., (1971), ein Verfahren zur Herstellung verschiedener Aminosäuren, einschliesslich Serin, durch Fermentation, bei welchem Stämme gewisser 65 Bakterien auf Medien gezüchtet werden, welche Methanol als Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff enthalten. Siehe auch die US-Patentschrift 3 943 038, erteilt an Morinage et al. (1976), welches ein Verfahren zur Herstellung von Serin und

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anderen Aminosäuren durch Züchten spezifischer Stämme verschiedener Bakterien in einem wässerigen Kulturmedium in Gegenwart von Sauerstoff, Wasserstoff und Kohlenstoffdioxid offenbart.

In gemeinsamer Nachteil der bekannten Fermentationsmethoden besteht darin, dass die Konzentration an L-Serin, welches in der Brühe erzeugt wird und daraus gewonnen wird, verhältnismässig nieder ist, selbst nach verhältnismässig langen Fermentationen.

Serin kann auch durch chemische Syntheseverfahren hergestellt werden. Siehe zum Beispiel Kanedo (ed.), Synthetic Production and Utilization of Amino Acids, Halsted Press Books (1974). Oft erzeugen diese chemischen Verfahren Serin in Form eines racemischen Gemisches der optischen D-und L-Isomeren oder in Form des weniger bevorzugten D-Isomers. DL-Gemische müssen aufgelöst werden mit Methoden, welche D-Serin verdauende Bakterien benötigen, Serin-Racemase, durch L-Aminosäureacylase, fraktionierte Kristallisation von Serin-Derivaten oder ähnlichen Methoden, wodurch die Kosten des Produktes erhöht werden.

Es ist bekannt, dass L-Serin aus Glycin hergestellt werden kann. Die biologische Erzeugung von L-Serin aus Glycin wurde mit verschiedenen Mikroorganismen durchgeführt. Siehe zum Beispiel Y. Tanaka et al., J. Ferment. Technol. 59:447 (1981). Wie bei den oben erwähnten Fermentationsverfahren besteht auch bei dieser Methode der Nachteil, dass die Ausbeute an L-Serin typischerweise nicht sehr hoch ist.

Es besteht daher ein Bedarf für eine Methode zur Herstellung von L-Serin in hohen Ausbeuten. Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist daher die Entwicklung eines Verfahrens zur Herstellung von L-Serin, in welchem Serin in hohen Konzentrationen in einer Lösung gebildet wird, aus welcher es wirksam gewonnen werden kann und welches chargenweise oder in einem immobilisierten System durchgeführt werden kann.

Es wurde gefunden, dass L-Serin aus Glycin und Formaldehyd in Gegenwart von biokatalytischen Mengen des Enzyms Serin-Hydroxymethyltransferase und des Cofaktors Tetrahydrofolat unter Serin erzeugenden Bedingungen wirksam hergestellt werden kann. Das Enzym kann in ganzen Zellen oder als roher Extrakt oder als gereinigtes Enzym vorhanden sein und kann in immobilisierter oder nicht-immobilisierter Form vorliegen.

Es ist bekannt, dass das Enzym Serin-Hydroxymethyltransferase (im folgenden mit SHMT bezeichnet) die Spaltung von Serin zu Glycin in einer Reaktion, welche von den Cofak-toren Pyridoxal-5'-phosphat und Tetrahydrofolat abhängt, katalysiert. Die Reaktion ergibt Glycin und Methylentetra-hydrofolat. Siehe L. Schirck, Advances in Enzymology 53:83 (1982). Es wurde jetzt gefunden, dass das SHMT-Enzym wirksam als Biokatalysator verwendet werden kann, um L-Serin aus Glycin und Formaldehyd herzustellen. Die Reaktion erfolgt in Gegenwart des Cofaktors Tetrahydrofolat (im folgenden THF genannt). Die Quelle für das THF kann die Quelle für das SHMT sein, weil THF in Mikroorganismenzellen, welche SHMT enthalten, gefunden wird, oder das THF kann aus einer äusseren Quelle zugesetzt werden. Ein Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass es nur das optische L-Serin-Isomer ergibt. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass der Ausstoss aus dem Reaktor nach vollendeter Reaktion nur Glycin und L-Serin enthält und kein komplexes Gemisch, wie dies in einer Fermentationsbrühe oder als Resultat einer chemischen Synthese zu erwarten wäre.

Es ist überraschend, dass L-Serin aus Glycin und Formaldehyd synthetisiert werden kann, weil Formaldehyd dafür bekannt ist, chemisch mit Proteinen zu reagieren und die Inaktivierung von Enzymen zu verursachen. D. French et al.,

Advances in Protein Chemistry, 2:277-335 (1945). In der Tat wird SHMT rasch durch Formaldehyd inaktiviert. Es wurde jedoch gefunden, dass das Enzym geschützt werden kann durch Zusatz eines Überschusses an Tetrahydrofolat zum s Reaktionsgemisch. Das THF reagiert mit dem Formaldehyd, wodurch das Enzym geschützt wird.

Eine chemische Modifikation von SHMT verleiht ebenfalls Stabilität und Schutz vor der Inaktivierung durch Formaldehyd. Beispielsweise wurde gefunden, dass die Reaktion io von Imidoestern mit Aminogruppen (siehe G. Means et al., Chemical Modification of Proteins, Holden-Day, Inc., 1971) an der Enzymoberfläche dem Enzym erlaubt, in Gegenwart von höheren Konzentrationen von Formaldehyd zu wirken als das nicht-modifizierte Enzym.

is Der enzymatische Weg, welcher wahrscheinlich für die Synthese von L-Serin aus Glycin zutrifft, ist im folgenden dargestellt:

Formaldehyd + THF ^ ^ Methylen-THF

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SHMT

Methylen - THF + Glycin < y L-Serin + THF

Vorzugsweise wird die Reaktion unter anaeroben Bedin-25 gungen, zum Beispiel in einer Stickstoffatmosphäre, durchgeführt, um die Oxidation des THF zu verhindern.

Die Substrate, das SHMT und der Cofaktor, THF, können in verschiedener Weise miteinander umgesetzt werden. Obwohl die Reihenfolge, in welcher die Reaktionsteil-30 nehmer und Katalysatoren zugesetzt werden, nicht kritisch ist, wird bevorzugt, dass das Glycin und das Formaldehyd langsam zum SHMT in Gegenwart von THF zugesetzt werden. Die Reaktion wird unter L-Serin erzeugenden Bedingungen durchgeführt. Wenn das E. coli-SHMT-Gen 35 (glyA) als Quelle für SHMT verwendet wird, umfassen diese Bedingungen im allgemeinen eine Reaktionstemperatur von etwa 4 bis etwa 60°C und ein pH im Bereich von etwa 4 bis etwa 11. Die bevorzugten Reaktionsbedingungen umfassen die Ausführung der Reaktion bei einer Temperatur von etwa 40 20 bis etwa 45°C und einem pH von etwa 8,5. Wenn die Temperatur unter etwa 4°C liegt, wird die Reaktionszeit merklich verlängert, und wenn die Temperatur über etwa 60°C steigt, kann das Enzym denaturiert werden. Ebenso kann das Enzym bei einem pH unterhalb etwa 4 oder oberhalb etwa 11 45 inaktiviert werden. SHMT ist ein zentrales Enzym im Metabolismus von Mikroorganismen und höheren Organismen; es bestehen daher viele potentielle Quellen für dieses Enzym. Die Bereiche der Bedingungen, unter welchen die Reaktion zur Erzeugung von L-Serin durchgeführt wird, hängen von so der verwendeten Enzymquelle ab. Beispielsweise können Enzyme, welche aus den thermophilen Mikroorganismen erhalten werden, bei einer höheren Temperatur eingesetzt werden, als dies möglich ist, wenn E. coli die Enzymquelle bildet.

55 Die Serin-Hydroxymethyltransferase kann in der Form ganzer Zellen, eines rohen Extraktes oder als gereinigtes Enzym vorliegen. Das Enzym kann in immobilisierter oder nicht-immobilisierter Form verwendet werden. Das Enzym wird in Mengen eingesetzt, welche genügen, um die Reaktion 60 zu katalysieren.

Das Enzym kann aus Mikroorganismen erhalten werden, welche unter Verwendung konventioneller genetischer Verfahren modifiziert wurden, um es in hohen Ausbeuten zu ergeben. Siehe G. Stauffer et al., Gene, 15:63-72 (1981). Das es SHMT -Gen (glyA) kann isoliert und in ein Plasmid geklont werden, welches sodann verwendet wird, um geeignete Wirtszellen umzuwandeln, wobei ein hoher Grad an SHMT-Expression erzielt wird. Mutante Mikroorganismen, welche

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bezüglich ihres Methioninmetabolismus modifiziert wurden, überproduzieren SHMT ebenfalls. Siehe G. V. Stauffer und J. E. Brenchley, Genetics 88,221 (1978) sowie G. V. Stauffer und J. E. Brenchley, J. Bacteriol., 129,740 (1977). Unter Verwendung von Gen-Klonierungstechniken wurde die Enzym-Aktivität bis zum Zwanzigfachen erhöht, und sie kann mehr als 10% des löslichen Proteins der Zelle darstellen. Ein E. coli-Stamm (GX1703), mit einem solchen Plasmid umgewandelt, genauer gesagt einem Derivat von pBR322, in welches das glyA-Gen geklont wurde, nämlich pGx 122, wurde am 22. Okt. 1982 als NRRL No. B-l 5215 im Northern Regional Research Laboratory, Agricultural Research Culture Collection, Peoria, Illinois 61604, USA, hinterlegt. Ein Klebsiella-aerogenes-Stamm (GX1704), welcher mit einem ähnlichen, aber kleineren Plasmid mit einer Änderung, welche eine hohe Kopiezahl bewirkt, nämlich pGX 139, umgewandelt wurde, wurde am 22. Oktober 1982 als ATCC No. 39214 bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, hinterlegt und ein Salmonella-typhimurium -Stamm (GX1682), welcher mit pGx 139 umgewandetl wurde, wurde am 22. Oktober 1982 in derselben Stelle als ATCC NO. 39215 hinterlegt.

Wenn das Gen von einer Quelle, wie E. coli entnommen wird, kann es ferner durch willkürliche Mutagenese oder durch stellengerichtete Mutagenese modifiziert werden, um ein Enzym mit verbesserter Stabilität zu ergeben. Das Gen kann aber auch vollständig chemisch synthetisiert werden mit mehrfachen Änderungen, um die Stabilität des Enzyms während des vorliegenden Verfahrens zu verbessern.

Die Verwendung ganzer Zellen kann eine Quelle für THF ergeben. Falls gewünscht, kann zusätzliches THF zugesetzt werden, um Sättigungsspiegel zu erreichen, welche vom pH und der Temperatur abhängen. Beispielsweise kann bei einem pH von etwa 7,5 und einer Reaktionstemperatur von etwa 37°C in einer wässerigen Lösung THF zugesetzt werden, um eine Konzentration von wesentlich über 50 mM pro Liter zu erreichen. Das pH muss angepasst werden, während sich das THF auflöst. Wenn das SHMT entweder als roher Extrakt oder als gereinigtes Enzym zugesetzt wird, wird eine unabhängige Quelle für THF benötigt. Die Menge an THF, welche zugesetzt werden kann, variiert mit der Temperatur, den Lösungsmittelbedingungen und dem pH, bei welchen die Reaktion durchgeführt wird.

Es wurde festgestellt, dass THF seine Aktivität gegenüber SHMT beibehält, wenn es immobilisiert ist. Die Immobilisierung des THF durch Bindung desselben an einen Träger, welcher innerhalb eines zur Durchführung der Reaktion verwendeten Bioreaktors zurückgehalten werden kann, ist vorteilhaft, weil es den wiederholten Gebrauch des Cofaktors nach Beendigung der Synthese des L-Serins erleichtert. Beispielsweise kann THF mit löslichen Polymeren immobilisiert werden, wie Dextran, Polyäthylenglykol oder Polyäthylen-imin. Die Immobilisierung erfolgt über covalente Bindung in den ersten zwei Fällen und durch ionische Interaktion im dritten Fall. Covalente Bindung erfolgt im allgemeinen über die Carboxygruppen des THF mit einer Aminogruppe des Trägers. Unter Verwendung ähnlicher Bindungsmethoden kann aber das THF auch an einen unlöslichen Träger gebunden werden.

Wenn Serin in einem chargenweisen Verfahren synthetisiert wird, ist es andererseits auch möglich, das THF zu recy-clisieren. Beispielsweise kann die Reaktionslösung, nachdem das L-Serin synthetisiert worden ist, durch eine Aktivkohleoder Ionenaustauschersäule geführt werden, welche das THF von der L-Serin-Produktlösung zurückhält und trennt. Das THF kann sodann freigesetzt und neutralisiert werden. Das THF kann aber auch durch covalente Bindung an ein kleines Molekül, wie ein Glucosamin, modifiziert werden, um die

Rückgewinnung des Cofaktors zu erleichtern. Nachdem das L-Serin synthetisiert worden ist, kann die Reaktionslösung über eine Boratsäule geführt werden. Das Borat bindet nur das THF-Glucosamin, und das modifizierte THF kann freigesetzt und wieder zurückgeführt werden.

Glycin und Formaldehyd werden vorzugsweise zu dem Tetrahydrofolat-SHMT-Gemisch zugesetzt. Die Menge an Glycin, welche zugesetzt werden kann, variiert mit dem pH, der Temperatur und den Lösungsmittelbedingungen der Reaktion, doch kann es im allgemeinen zugesetzt werden, bis das Sättigungsniveau erreicht ist.

Wie oben erwähnt, kann Formaldehyd für SHMT hochtoxisch sein. Das Formaldehyd wird daher im allgemeinen langsam zu den übrigen Komponenten zugesetzt, und sein Zusatz wird reguliert. Das Formaldehyd wird in genügender Menge zugesetzt, um die enzymatische Aktivität beizubehalten, im allgemeinen um eine Konzentration von weniger als etwa 10 mM pro Liter höher als die verwendete THF -Konzentration aufrechtzuerhalten, doch kann der Formaldehyd in einer Menge zugesetzt werden, um eine Konzentration bis zu etwa 50 mM pro Liter über der verwendeten THF -Konzentration aufrechtzuerhalten. Je höher die Konzentration an THF im System ist, um so höher kann die Formaldehydkonzentration gehalten werden, weil das THF günstig mit dem Formaldehyd reagiert, wodurch das Enzym geschützt wird. Der Mechanismus der Reaktion von THF und Formaldehyd ist durch R. G. Kallen et al., J. Biol. Chem. 241 (24), 5851-588863 (1966) beschrieben. Je grösser die Enzymaktivität im Reaktor ist, um so schneller wird das Formaldehyd zugesetzt, um die gewünschte Konzentration beizubehalten.

Es wurde ferner festgestellt, das es vorteilhaft sein kann, einen zweiten SHMT-Cofaktor, nämlich Pyridoxal-5'-phos-phat, zu den Reaktionsteilnehmern zuzusetzen. Pyridoxal-5'-phosphat wird fest an das Enzym gebunden. Wenn L-Serin in einem Reaktor über eine ausgedehnte Zeit synthetisiert wird, kann das Pyridoxalphosphat verlorengehen oder inaktiviert werden, in welchem Fall zusätzliches Pyridoxalphosphat zugesetzt werden kann. Der Verlust des Cofaktors während der Synthese wird angezeigt durch den Verlust an Aktivität durch die Serin-Hydroxymethyltransferase. Die Konzentration an dem der Reaktion zugesetzten Pyridoxalphosphat kann zwischen 0 bis etwa 20 mM pro Liter variieren, je nach Bedarf, und beträgt vorzugsweise etwa 0,1 mM bis etwa 1 mM pro Liter.

Der Zusatz von überschüssigem Pyridoxalphosphat kann einer zusätzlichen Funktion dienen. Es wurde festgestellt, dass in einigen Mikroorganismen, welche durch Plasmide, welche das glyA-Gen enthalten und welche hohe SHMT -Niveaux ausdrücken, der Zusatz von Pyridoxal-5'-phosphat notwendig ist, um das vorhandene SHMT zu sättigen und die beobachtete Enzymaktivität zu erhöhen. Ein solcher Mikroorganismus ist Klebsiella aerogenes, welches das oben identifizierte Plasmid pGx 139 enthält.

Die Synthesereaktion kann in Gegenwart von jedem nichtschädlichen Lösungsmittel durchgeführt werden. Beispiele solcher Lösungsmittel umfassen Äthanol, Methanol, Isopro-panol und Dioxan. Die folgenden Beispiele sind zur weiteren Illustrierung der vorliegenden Erfindung bestimmt.

Beispiel 1

Bakterienstämme mit und ohne Plasmid pGx 139 wurden in LB-Medium (10 g/Liter Bactotrypton, 5 g/Liter Hefeextrakt, 5 g/Liter NaCl) oder Minimalmedium (10,5 g/Liter K2HPO4,4,5 g/Liter KH2PO4,1,0 g/Liter (NH4)2S04 und 0,5 g/Liter Natriumcitrat.2H20), unter Zusatz von 0,4% Glucose oder Lactose gezüchtet. Aminosäuren wurden in einer Menge von 20 ng/ml und Vitamine in einer Menge von 1 ng/ml zugesetzt, wo dies zweckmässig war. Die spezifische

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Aktivität der Serin-Hydroxymethyltransferase wird als nMol KH2PO4

ß-Phenylserin, das in Benzaldehyd und Glycin umgewandelt (NH4)2S04

wurde, pro Minute pro Milligramm extrahierbarem Protein Natriumeitrat ■

nach Beschallung der Zellen ausgedrückt. Phenylalanin

Die Versuche erfolgten in 50 mM pro Liter Phosphatpuffer 5 Vitamin Bi bei pH 7,3 mit 0,1 mM pro Liter Pyridoxalphosphat und bei Ampicillin

35 mM pro Liter ß-Phenylserin bei 20°C. Das Auftreten von MgSCk

Benzaldehyd wurde bei 279 nM in einem aufzeichnenden FeSoi Spektrophotometer überwacht.

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2H2O

4,5 g/Liter 1,0 g/Liter 0,5 g/Liter 20 ng/ml

1 (ig/ml 100 [ig/ml

2 mM/Liter 5 mg/ml

SHMT

Spezifische Aktivität (nMol/Minuten/mg)

Stamm

Plasmid

LB-

Medium

Minimai-Medium

Zusatz

E. coli

GX1698

-

39

N.D.*

GX 1671

pGx 139

221

N.D.

GX1703

pGx 139

141

533

Glukose

Phenylalanin

Thiamin

GX1703

pGx 122

218

682

Glucose

Phenylalanin

Thiamin

Salmonella typhimurium LT2

GX1682

28

10 17

Glucose Tryptophan Lactose Tryptophan

GX1682

pGx 139

152

133 306

Glucose Tryptophan Lactose Tryptophan

Klebsiella aerogenes

GX1704

-

36

N.V.

GX1704

pGx 139

590

114

Glucose

223

108

Lactose

Stamm

Genotyp

Die Zellen wurden durch Zentrifugieren des Zellkulturmediums gesammelt und als Enzymquelle verwendet. Glycin (12 mM, Endkonzentration) wurde mit Tetrahydrofolat (5 mM, Endkonzentration), Pyridoxalphosphat (1 mM) und Formaldehyd ( 10 mM Endkonzentration) unter einer Stick-is stoffdecke vermischt. Das pH wurde mit 0,1M Kaliumphosphatpuffer auf 7,6 gehalten, und das Endvolumen dieses Reaktionsgemisches betrug 100 ml.Die Reaktion wurde in Gang gesetzt durch Vermischen der oben genannten Reaktionslösung und der Zellen bei 37°C unter Schütteln. Nach 20 8 Stunden waren 5 mM Serin erzeugt (die Ausbeute betrug 45%, berechnet auf das Glycin). Die gesamte Enzymaktivität war noch vorhanden. Die Konzentration an Glycin und Serin wurde unter Verwendung der Hochleistungsflüssig-Chromatographie bestimmt.

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Beispiel 3

Eine Kolonie von Klebsiella aerogenes, Stamm GX1704 (enthaltend pGxl39), welcher als ATCC No. 39214 hinterlegt ist, wurde in 100 ml des unten beschriebenen Kulturme-30 diums I eingeimpft und bei 30°C über Nacht geschüttelt.

Kulturmedium II Trypton NaCl 35 Hefeextrakt Glucose lOg/Liter 10g/Liter 5 g/Liter 10g/Liter

E. coli

GX 1698 trpEA, tna2, serB, laclq ts 402 GX 1671 thi, ara, strR, GlyA, [serB trpR], laclql, LacZ : tn5

GX1703 glyA, pheA, thi, lac, ara, strR

Salmonella typhimurium LT2 GX1682 trpBEDC43 F' laclq ts420 pro

Klebsiella aerogenes

GX1704 lsd (L-Serin-Deaminase-Mutant)

* nicht bestimmt

E.-coli-Stamm GX 1671, welcher Plasmid pGx 139 enthält, ist ein repräsentativer zusätzlicher Stamm, welcher verwendet wurde als Quelle für SHMT in dem erfindungsgemässen Verfahren.

Beispiel 2

Eine Kolonie von Escherichia coli, Stamm GX1703 (enthaltend pGx 122), welcher als NRRLNo. B-15215 hinterlegt ist, wurde in 100 ml Kulturmedium I, welches unten beschrieben ist, eingeimpft und bei 37°C über Nacht geschüttelt.

Kulturmedium I K2HPO4

10,5 g/Liter

Die Zellen wurden durch Zentrifugieren des Zellkulturme-40 diums gesammelt und als Enzymquelle verwendet.

Das Verfahren nach Beispiel 2 für die Serin-Erzeugung wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass Klebsiella aeo-genes anstelle von E. coli verwendet wurde. Nach 8 Stunden waren 7 mM Serin erzeugt (die Ausbeute betrug 64% 45 berechnet auf Glycin). Die ganze Enzymaktivität war noch vorhanden.

Beispiel 4

Das Verfahren nach Beispiel 2 wurde wiederholt, mit Aus-50 nähme, dass partiell gereinigte Serin-Hydroxymethyltransferase aus E. coli (Stamm GX1703) verwendet wurde. Die Zellen wurden durch Beschallung bei 4°C gebrochen. Die nach dem Zentrifugieren gesammelte überstehende Flüssigkeit wurde mit Ammoniumsulfat (50%ige Sättigung) bei 4°C 55 und pH 7,5 vermischt. Nach Entfernung der Feststoffe durch Zentrifugieren wurde das Enzym aus der Lösung auszutreten gezwungen durch Erhöhung des Ammoniumsulfatgehaltes auf 100%ige Sättigung. Das Enzym wurde durch Zentrifugieren gesammelt und dialysiert. 10 mM Serin wurden nach «o 4 Stunden Reaktionszeit erzeugt. Die Ausbeute betrug 90%, bezogen auf Glycin. Die ganze enzymatische Aktivität war noch vorhanden.

Beispiel 5

65 Das Verfahren nach Beispiel 3 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass die anfängliche Glycinkonzentration 340 mM betrug und Formaldehyd (ursprüngliche Konzentration 2M) mit einer Geschwindigkeit von 1 ml pro Stunde ein-

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geführt wurde. Nach 12 Stunden waren 119 mM Serin erzeugt worden.

Beispiel 6

Das Verfahren nach Beispiel 3 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass Glycin (ursprüngliche Konzentration von 2M) und Formaldehyd (ursprüngliche Konzentation von 2M) in derselben Geschwindigkeit von 1 ml pro Stunde eingeführt wurden. Nach 5 Stunden waren 57 mM Serin erzeugt worden.

Beispiel 7

Das Verfahren nach Beispiel 3 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass THF modifiziert wurde. Dextran (5 g, Pharmacia T40) wurde in Wasser auf eine Endkonzentration von 5% aufgelöst. Die Dextranlösung wurde mit 0,1 M NaIÛ4 während 1 Stunde bei Zimmertemperatur oxidiert. Das oxidierte Dextran wurde durch Zusatz von Äthanol auf 60% (Volumen/Volumen) ausgefällt. Diese Stufe wurde zweimal wiederholt. Das oxidierte Dextran wurde sodann in 100 ml s 0,2 M 1,6-Hecandiamin (HMD) bei pH 9,0 aufgelöst. Natriumborhydrid (0,2 g) wurde nach 30 Minuten und nach 60 Minuten zugesetzt. Das HMD-Dextran wurde über Nacht gegen Wasser dialysiert und sodann lyophilisiert. THF (5 mM) wurde mit 10 mM l-Äthyl-3-63-dimethylamino-lo propyl)-carbodiimid und 0,5% HMD-Dextran bei pH 7,0 unter Stickstoffatmosphäre vermischt. Der gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gesammelt und zweimal mit 0,5 M NaCl-Lösung gewaschen. Das fest THF wurde mit dem Reaktionsgemisch vermischt, wie in Beispiel 3 ls beschrieben. Nach dreistündiger Reaktion waren 7 mM Serin erzeugt worden.

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Claims

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PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung von L-Serin, dadurch gekennzeichnet, dass man Glycin und Formaldehyd in Gegenwart von biokatalytischen Mengen Serin-Hydroxy-methyltransferase und Tetrahydrofolat unter LrSerin erzeugenden Bedingungen umsetzt.
2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur bei 4° bis 60°C und das pH im Bereich von 4 bis 11 gehalten wird.
3. Verfahren nach Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur im Bereich von 20° bis 45°C und das pH im Bereich von 6 bis 8,5 liegt.
4. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Serin-Hydroxymethyl-transferase in ganzen Zellen enthalten ist.
5. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Serin-Hydroxymethyl-transferase in Form eines rohen Extraktes verwendet wird.
6. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Serin-Hydroxymethyl trans-ferase in Form eines gereinigten Enzyms verwendet wird.
7. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Serin-Hydroxymethyl-transferase immobilisiert ist.
8. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion chargenweise durchgeführt wird.
9. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion kontinuierlich durchgeführt wird.
10. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Quelle für Tetrahydrofolat aus ganzen mikrobiellen Zellen, welche Serin-Hydroxy-methyltransferase enthalten, besteht.
11. Verfahren nach Patentanspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzliches Tetrahydrofolat zum Reaktionssystem zugesetzt wird, um dieTetrahydrofolat-Konzentration auf ein Maximum des Sättigungsspiegels zu erhöhen.
12. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration an Tetrahydrofolat im Bereich von 0,15 bis 50 mM pro Liter liegt.
13. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Tetrahydrofolat immobilisiert ist.
14. Verfahren nach Patentanspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Tetrahydrofolat mit einem löslichen Polymer immobilisiert ist.
15. Verfahren nach Patentanspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Tetrahydrofolat durch Bindung an eine feste Unterlage immobilisiert ist.
16. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Tetrahydrofolat in solcher Weise modifiziert ist, dass es recyclisiert werden kann.
17. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass Glycin zugesetzt wird, bis die Reaktionslösung mit Glycin gesättigt ist.
18. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass Formaldehyd bis zu einer maximalen Konzentration von 30 mM bis 50 mM pro Liter höher als die Tetrahydrofolat-Konzentration zugesetzt wird.
19. Verfahren nach Patentanspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration an Formaldehyd auf einen beständigen Wert von etwa 10 mM pro Liter über derjenigen der Konzentration von Tetrahydrofolat gebracht wird.
20. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass den Reaktionsteilnehmern Pyridoxalphosphat in einer Konzentration bis zu 20 mM pro Liter zugesetzt wird.
21. Verfahren nach Patentanspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Pyridoxalphosphat-Konzentration im Bereich von 0,1 bis 1,0 mM pro Liter liegt.
22. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 21,

s dadurch gekennzeichnet, dass die Quelle für Serin-Hydroxy-methyltransferase Escherichia coli Stamm GX1703 ist, welcher Plasmid pGx 122 enthält, hinterlegt im Northern Regional Research Laboratoryals NRRLNo. B-15215.
23. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 21,

io dadurch gekennzeichnet, dass die Quelle für Serin-Hydroxy-

methyltransferase Salmonella typhimurium Stamm GX1682 ist, welcher Plasmid pGxl39 enthält, hinterlegt im American Type Culture Collection als ATCC No. 39215.
24. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 21,

i5 dadurch gekennzeichnet, dass die Quelle für Serin-Hydroxy-

methyltransferase Klebsiella aerogenes Stamm GX1704 ist, welcher Plasmid pGxl39 enthält, hinterlegt im American Type Cultur Collection als ATCC No. 39214.
25. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 24,

20 dadurch gekennzeichnet, dass eine Serin-Hydroxymethyl-

transferase verwendet wird, deren Aktivität in Zellen durch genetische Manipulation erhöht wurde.
26. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass eine Serin-Hydroxymethyl-

25 transferase verwendet wird, deren Aktivität in Zellen durch Klonen des Serin-Hydroxymethyltransferase-Gens in ein Plasmid und Umwandeln einer Wirtszelle mit diesem Plasmid, um die Serin-Hydroxymethyltransferase zu überproduzieren, erhöht wurde.

30 27. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Serin-Hydroxymethyltransferase aus jeder biologischen Quelle erhalten wurde.
28. Verfahren nach einem der Patentansprüche 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, dass das Serin-Hydroxymethyl-

35 transferase-Gen durch willkürliche Mutagenese oder stellengerichtete Mutagenese geändert wurde, um die Stabilität des Enzyms zu erhöhen.
29. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Serin-Hydroxymethyl-

40 transferase-Enzym chemisch modifiziert ist, um die Enzymstabilität zu erhöhen.
30. Verfahren nach Patentanspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym durch Umsetzung mit Imidoestern modifiziert ist.

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