DE3706724A1 - Verfahren zur zuechtung eines mikroorganismus des genus pseudomonas, welcher aminosaeureracemase bildet - Google Patents

Verfahren zur zuechtung eines mikroorganismus des genus pseudomonas, welcher aminosaeureracemase bildet

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Züchtung eines Mikroorganismus des Genus Pseudomonas, welcher Aminosäureracemase bildet. Sie betrifft insbesondere ein Verfahren zur Erhöhung der Ausbeute bzw. Ernte an Aminosäureracemase durch Züchten eines Mikroorganismus des Genus Pseudomonas, der Aminosäureracemase bildet, in einem Medium, welches eine spezifische Kohlenstoffquelle enthält.
Aminosäuren, welche gemäß organischen Syntheseverfahren erhalten werden, liegen normalerweise in DL-Form vor. Wenn eines dieser optischen Isomeren L oder D hergestellt werden soll, müssen sie beispielsweise durch optische Abspaltung getrennt werden. Bei diesem Verfahren ist es übliche Praxis, die Aminosäuren, die nach der Trennung des gewünschten optischen Isomeren zurückbleiben, zu racemisieren und die entstehende DL-Form zur optischen Aufspaltungsstufe zu recyclisieren.
Bei der Herstellung von L-Aminosäuren, wie L-Cystein, L-Tyrosin und L-Tryptophan, gemäß einem enzymatischen Verfahren unter Verwendung von DL-Serin als Substrat sammelt sich das nichtumgesetzte D-Serin in dem Reakionssystem an. Bei einem industriellen Betrieb wird das nichtumgesetzte D-Serin wiedergewonnen und racemisiert und zu der Reaktionsstufe recyclisiert.
Auf den Gebiet der Aminosäureproduktion kann daher eine wirksame Ausnutzung der DL-Aminosäuren mit relativ niedrigen Kosten nach einem organischen Syntheseverfahren erfolgen, welches häufig eine Racemisierungsstufe erfordert. Als Verfahren zur Racemisierung von Aminosäuren sind die Behandlung in der Wärme und die enzymatische Racemisierung bekannt. Das Wärmebehandlungsverfahren ist jedoch industriell nicht günstig, da die gewünschten Aminosäuren thermisch zersetzt werden und ihre Ausbeuten und Reinheiten vermindert werden. Das enzymatische Verfahren ist ein industriell geeignetes Verfahren, da es bei Raumtemperatur unter normalem Atmosphärendruck durchgeführt werden kann und da keine Zersetzung der gewünschten Aminosäuren auftritt.
Aminosäureracemase, die von Pseudomonas putida (IFO 12996) gebildet wird, ist ein typisches Beispiel für ein Enzym, welches die Racemisierung von Aminosäuren katalysiert (d. h. es ist eine Aminosäureracemase). Die Aminosäureracemase, die durch Pseudomonas putida gebildet wird, ist gegenüber aromatischen Aminosäuren und Aminosäuren, in denen die β-Methylgruppe substituiert ist, wie Isoleucin, Valin und Threonin, inert, jedoch gegenüber vielen anderen Aminosäuren, wie Lysin, Arginin, Methionin, Alanin und Serin, aktiv, und sie besitzt eine ausgezeichnete Fähigkeit, diese Aminosäuren zu racemisieren (vgl. Biochemical and Biophysical Research Communication, Bd. 35, Nr. 3, 363-368 (1969); "Seikagaku (Biochemistry)", Bd. 46, Nr. 5, 203-2232 (1974)).
Die Menge an obiger Aminosäureracemase, die von Pseudomonas putida gebildet wird, ist jedoch sehr gering und ungenügend, um das Enzym in industriellem Maßstab verwenden zu können. Bei einem Versuch, die Ausbeute an Aminosäureracemase von Pseudomonas putida zu erhöhen, wurde kürzlich ein Verfahren vorgeschlagen, welches darin besteht, daß man den obigen Mikroorganismus züchtet, während kontinuierlich oder periodisch Glucose zugegeben wird, so daß die Konzentration an Glucose in dem Kulturmedium bei nicht mehr als 1% gehalten wird (vgl. JP-OS 20 187/1983). Dieses Verfahren beruht auf der Erkenntnis, daß die Bildung des obigen Enzyms inhibiert wird, wenn Glucose als Kohlenstoffquelle verwendet wird. Jedoch solange Glucose als Kohlenstoffquelle verwendet wird, kann das Problem der inhibierten Bildung des Enzyms nicht grundsätzlich beseitigt werden, in welchem Ausmaß auch immer man die Konzentration der Glucose in dem Kulturmedium verringert, und es ist schwierig, die Ausbeute an Enzym nach diesem Verfahren starkt zu erhöhen. Außerdem ist eine Extravorrichtung erforderlich, um die Glucosekonzentration in dem Kulturmedium auf nicht mehr als 1% zu kontrollieren, und der Vorgang wird komplex und ist industriell nachteilig.
Mit diesem Hintergrund hat die Anmelderin verschiedene Untersuchungen hinsichtlich des Verfahrens zur Erhöhung der Produktivität von Aminosäureracemase durch Pseudomonas putida, ohne daß Glucose als Kohlenstoffquelle verwendet werden muß, durchgeführt. Diese Untersuchungen haben zu der Enstdeckung geführt, daß, wenn die Züchtung unter Verwendung von Glycerin, Ethanol, Weinsäure, Fumarsäure oder Bernsteinsäure als Kohlenstoffquelle durchgeführt wird, die Produktivität von Aminosäureracemase wesentlich erhöht wird.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Züchtung eines Mikroorganismus des Genus Pseudomonas, welcher Aminosäureracemase bildet, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man den Mikroorganismus in einem Kulturmedium züchtet, welches mindestens eine Verbindung aus der Gruppe Glycerin, Ethanol, Weinsäure, Funarsäure und Bernsteinsäure als Kohlenstoffquelle enthält, und gemäß dem man die Mikroorganismuszellen, welche Aminosäureracemase enthalten, in erhöhter Menge gewinnen kann.
Der Mikroorganismus, der bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden kann, gehört zum Genus Pseudomonas und besitzt die Fähigkeit, Aminosäureacemase zu bilden. Ein bevorzugtes spezifisches Beispiel ist Pseudomonas putida, welche unter der Nummer 12996 beim Institute for Fermentation, Osaka (IFO), 2-17-85, Jusohonmachi, Yodogawa-ku, Osaka-fu, Japan, hinterlegt worden ist und welcher von dieser Hinterlegungsstelle frei verfügbar ist. Andere Aminosäureracemase erzeugende Mikroorganismen des Genus Pseudomonas können erfindungsgemäß ebenfalls verwendet werden.
Das charakteristische Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß der Mikroorganismus in einem Medium gezüchtet wird, welches mindestens eine Verbindug aus der Gruppe Glycerin, Ethanol, Weinsäure, Fumarsäure und Bernsteinsäure als Kohlenstoffquelle enthält. Glycerin, Ethanol und Weinsäure sind bevorzugt, und Glycerin ist die am meisten bevorzugte Kohlenstoffquelle.
Die Menge an Kohlenstoffquelle kann in Abhängigkeit von ihrer Art variiert werden. Im allgemeinen ist es bevorzugt, die Kohlenstoffquelle in solcher Menge zu verwenden, daß ihre Gesamtkonzentration in dem Medium während des Züchtens mindestens 0,5% (G/V) beträgt. Die obere Grenze der Menge ist nicht eng anzugeben. Gewöhnlich liegt die obere Grenze zwischen 10 und 50% (G/V) und variiert in Abhängigkeit von der Art der Kohlenstoffquelle. Die bevorzugte Konzentration an Kohlenstoffquelle in dem Medium zu Beginn des Züchtens beträgt 0,5 bis 20% (G/V) für Glycerin, 0,5 bis 5% (G/V) für Ethanol, 0,5 bis 20% (G/V) für Weinsäure, 0,5 bis 20% (G/V) für Fumarsäure und 0,5 bis 20% (G/V) für Bernsteinsäure. Werden zwei oder mehr Kohlenstoffquellen gemeinsam verwendet, so kann die Konzentration von jeder innerhalb des obigen Bereichs liegen.
Die Kohlenstoffquelle kann zu einem Zeitpunkt zu Beginn der Züchtung zu dem Medium zugegeben werden, oder sie kann während des Züchtens portionsweise zugegeben werden.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren brauchen andere Kohlenstoffquellen nicht zusammen mit den oben spezifizierten Kohlenstoffquellen verwendet zu werden. Gegebenenfalls kann jedoch eine organische Nährstoffquelle, welche eine Kohlenstoffquellen sein kann, wie Hefeextrakt, Polypepton, Maisquellwasser, Fleischextrakt und Casaminosäure, in einem geringen Anteil, vorzugsweise einer Menge von 1/5 oder weniger, mehr bevorzugt 1/10 oder weniger, bezogen auf die Menge der oben angegebenen Kohlenstoffquellen, verwendet werden.
Der Mikroorganismus des Genus Pseudomonas, der Aminosäureracemase bildet, kann in einem per se bekannten Kulturmedium unter per se bekannten Kulturbedingungen gezüchtet werden, beispielsweise kann man ein Kulturmedium verwenden, welches Stickstoffquellen oder anorganische Substanzen enthält, und man kann die Kulturbedingungen anwenden, welche in den oben angegebenen Literaturstellen erwähnt werden. Beispiele für Stickstoffquellen in dem Kulturmedium, welches bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird, umfassen Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid und Ammoniumphosphat; Ammoniak; Nitrate, wie Kaliumnitrat, Natriumnitrat und Ammoniumnitrat; und organische Stickstoffverbindungen, wie Glutaminsäure, Glutamin, Asparaginsäure und Asparagin. Beispiele für anorganische Substanzen sind Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Sulfate und Hydrochloride von Eisen, Mangan, Zink, Kobalt und Calcium. In das Kulturmedium können Wachstumsaktivatoren eingearbeitet werden. Beispielsweise sind Vitamine, wie Thiamin und Biotin; Aminosäuren, wie Methionin und Cystein; und Hefeextrakt, Polypepton, Fleischextrakt, Maisquellwasser und Casaminosäure, welche die zuvor erwähnten Substanzen teilweise oder insgesamt enthalten. Nährstoffquellen außer den Kohlenstoffquellen können in ausreichenden Mengen zu dem Kulturmedium zugegeben werden, wie es in der Literatur beschrieben wird.
Die Kulturtemperatur beträgt im allgemeinen 10 bis 45°C, bevorzugt 25 bis 40°C. Der pH-Wert des Kulturmediums beträgt im allgemeinen 3 bis 10, vorzugsweise 5 bis 9. Während des Züchtens wird der pH-Wert des Mediums vorzugsweise innerhalb des obigen Bereichs konstant gehalten, indem man Ammoniak, Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid etc. zugibt.
Das Züchten erfolgt unter aeroben Bedingungen, und das Kulturmedium wird vorzugsweise direkt belüftet und bewegt bzw. gerührt, so daß der gelöste Sauerstoff kein die Geschwindigkeit kontrollierender Faktor während des Züchtens wird.
Die Züchtungszeit hängt von der Kohlenstoffquelle und den Züchtungsbedingungen ab, beträgt jedoch im allgemeinen 4 Stunden bis 3 Tage.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die Verwendung einer spezifischen Kohlenstoffquelle die Produktivität und Ausbeute an Aminosäureracemase, wie es in den folgenden Beispielen erläutert wird, beträchtlich erhöhen. Die Zellen, die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren gezüchtet wurden, werden nach einem per se bekannten Verfahren aus dem Kulturmedium gewonnen und können direkt als nasse oder trockene Zellen bei der Racemisierungsreaktion verwendet werden. Alternativ können sie verwendet werden, nachdem sie einer Zerkleinerungsbehandlung unterworfen wurden. Es ist ebenfalls möglich, die Aminosäureracemase von den Zellen abzutrennen und die abgetrennte Racemase zu verwenden.
Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren.
Beispiel 1
In einen 500-ml-Erlenmeyer-Kolben gibt man 100 ml Aliquot eines Kulturmediums (pH 7,2), welches aus 10 g Polypepton, 10 g Fleischextrakt, 5 g NaCl und 1000 ml destilliertem Wasser besteht, und das Medium wird 15 Minuten bei 120°C sterilisiert. Eine Platinschlaufe Pseudomonas putida (IFO 12996), ein Aminoracemase bildender Mikroorganismus, wird in dem Medium inokuliert und 15 Stunden lang bei 30°C vorgezüchtet. 1 ml der Kultur wird zum Inokulieren von 100 ml Kulturmedium mit der in Tabelle I angegebenen Zusammensetzung verwendet, und es wird 20 Stunden bei 30°C gezüchtet.
Die Zellen werden aus 40 ml der Kulturflüssigkeit durch Zentrifugieren (6000 Upm, 15 min, 4°C) gewonnen. Die gesammelten Zellen werden einmal mit 40 ml 0,1M Phosphatpuffer (pH 8,0) gewaschen und in 4 ml Puffer suspendiert. Die Zellsuspension wird mit einem Ultraschallzerkleinerungsgerät (Modell 200 Branson) zerkleinert und dann zentrifugiert (12 000 Upm, 40 min, 4°C). Der Überstand wird als rohe Enzymlösung abgetrennt und dann in gekühltem Zustand 24 Stunden bei -20°C gelagert, um die Serinzersetzungsaktivität der rohen Enzymlösung zu inhibieren.
K₂HPO₄   7 g KH₂PO₄   2 g (NH₄)₂SO₄   1g MgSO₄ · 7H₂O   0,1 g Trypton (Difco)   1 g Kohlenstoffquelle *)  15 g Destilliertes Wasser1000 ml pH 7,0
*)Die Kohlenstoffquelle ist eine von Glycerin, Ethanol, Fumarsäure, Bernsteinsäure, Weinsäure und Glucose.
Die entstehende rohe Enzymlösung (o,5 ml) wird zu 4,5 ml einer wäßrigen Reaktionslösung (pH 8,0), welche die in Tabelle II angegebenen Verbindungen enthält, gegeben und 30 Minuten bei 37°C umgesetzt. Die Änderung der spezifischen Rotation von Serin in der Reaktionslösung wird unter sauren Bedingungen unter Verwendung eines Polarimeters (Modell D1P360 von Nippon Bunko K. K.) gemessen. Die Gesamtserinkonzentration wird durch HPLC gemessen, und die Menge an L-Serin, die aus D-Serin gebildet wurde, wird bestimmt. Die Menge an Proteinen in der rohen Enzymlösung wird gemäß dem Verfahren von Lowry u. a. (J. Biol. Chem., 193, 265 (1951)) bestimmt. Unter Verwendung dieser Werte wird die Aktivität des Enzyms pro Mengeneinheit an Proteinen berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle III angegeben, wo die Aktivitäten als relative Werte angegeben sind, wobei man die Aktivität des Enzyms, das man bei Verwendung von Glycerin als Kohlenstoffquelle erhält, als 100 nimmt.
100 mMTris(hydroxymethylaminomethan), pH 8,0 100 mMD-Serin 0,04 mMPyridoxal-5-phosphorsäure KohlenstoffquelleRelative Aktivität
Glycerin100 Ethanol 97 Bernsteinsäure 70 Fumarsäure 71 Weinsäure 90 Glucose (Kontrolle) 35
Beispiel II
Beispiel 1 wird wiederholt mit der Ausnahme, daß L-Methionin anstelle von D-Serin, wie in Tabelle II angegebenen, verwendet wurde. Die Ergebnisse sind wie in Beispiel 1 erhalten und in Tabelle IV angegeben.
KohlenstoffquelleRelative Aktivität
Glycerin100 Ethanol 98 Bernsteinsäure 75 Fumarsäure 73 Weinsäure 89 Glucose (Kontrolle) 36
Beispiel 3
Beispiel 1 wird mit der Ausnahme wiederholt, daß L-Lysinhydrochlorid anstelle von D-Serin, wie in Tabelle II angegeben, verwendet wird. Die Ergebnisse werden wie in Beispiel 1 erhalten und sind in Tabelle V angegeben.
KohlenstoffquelleRelative Aktivität
Glycerin100 Ethanol100 Bernsteinsäure 79 Fumarsäure 75 Weinsäure 98 Glucose (Kontrolle) 33
Beispiel 4
Ein 100-ml-Aliquot eines Kulturmediums (pH 7,2), welches aus 10 g Polypepton, 10 g Extrakt, 5 g NaCl und 1000 ml destilliertem Wasser besteht, wird in einen 500-ml-Erlenmeyer-Kolben gegossen und 15 Minuten bei 120°C sterilisiert. Pseudomonas putida (IFO 12996), ein Aminosäureracemase erzeugender Mikroorganismus, wird zum Inokulieren des Mediums verwendet, und es wird 15 Stunden bei 30°C vorgezüchtet. 2 ml der Kultur werden zum Inokulieren in 100 ml des gleichen Kulturmediums wie oben verwendet, und dann wird 15 Stunden bei 30°C gezüchtet.
Die Kultur wird zum Inokulieren von 1 Liter eines Kulturmediums verwendet, welches die in Tabelle VI angegebene Zusammensetzung hat, wobei man eine 2-Liter-Kolben-Fermentationsvorrichtung (hergestellt von Iwashiya) verwendet, und es wird 24 Stunden bei 30°C unter Belüftung und Rühren bei 600 Upm und 1 v/v/m gezüchtet. Je nach Bedarf wird der pH-Wert des Kulturmediums auf einen konstanten Wert von etwa 7,2 durch Zugabe von 25 bis 28% Ammoniak eingestellt.
K₂HPO₄ 7 g KH₂PO₄ 2 g (NH₄)₂SO₄ 1g MgSO₄ · 7H₂O 0,1 g Trypton 1 g Hefeextrakt 1 g Glycerin20 g pH 7,0
10 ml der Kultur werden zentrifugiert (6000 Upm, 15 min, 4°C), um die Zellen zu isolieren. Die Zellen werden einmal mit 40 ml 0,1M Phosphatpuffer (pH 8,0) gewaschen und in 2 ml des gleichen Puffers suspendiert. Die Zellsuspension wird durch eine Ultraschallzerkleinerungsvorrichtung (Modell 200 Branson) zerkleinert und zentrifugiert (12 000 Upm, 40 min, 4°C). Der Überstand wird als rohe Enzymlösung abgetrennt. Zur Inhibierung der Serinzersetzungsaktivität der rohen Enzymlösung wird sie in gekühltem Zustand 24 Stunden bei -20°C gelagert.
Die Racemaseaktivität auf Serin wird nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 gemessen.
Als Vergleich wird das obige Verfahren mit der Ausnahme wiederholt, daß Glucose als Kohlenstoffquelle verwendet wird. Die Ergebnisse sind in Tabelle VII angegeben.
Tabelle VII

Claims (5)

1. Verfahren zur Züchtung eines Mikroorganismus des Genus Pseudomonas, welcher Aminosäureracemase bildet, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus in einem Kulturmedium züchtet, welches mindestens eine Verbindung aus der Gruppe Glycerin, Ethanol, Weinsäure, Fumarsäure und Bernsteinsäure als Kohlenstoffquelle enthält, und daß man die Mikroorganismuszellen, welche die Aminosäureracemase in erhöhter Menge enthalten, gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kohlenstoffquelle aus Glycerin, Ethanol und Weinsäure ausgewählt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kohlenstoffquelle Glycerin ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Gesamtkonzentration der Kohlenstoffquelle, die während des Züchtens zu dem Medium zugegeben wird, mindestens 0,5 (G/V) beträgt.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Pseudomonas putida IFO12996 ist.
DE19873706724 1986-03-03 1987-03-02 Verfahren zur zuechtung eines mikroorganismus des genus pseudomonas, welcher aminosaeureracemase bildet Withdrawn DE3706724A1 (de)

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