DE1960524C3

DE1960524C3 - Fermentatives Verfahren zur Herstellung von L-3,4-Dihydroxyphenylalanin

Info

Publication number: DE1960524C3
Application number: DE19691960524
Authority: DE
Inventors: Hitoshi Kawasaki Kanagawa Enei; Koichi Minoo Osaka Ogata; Shinji Jiyugaoka Okumura; Hideaki Kyoto Yamada
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1968-12-02
Filing date: 1969-12-02
Publication date: 1974-07-11
Also published as: CA936115A; DE1960524B2; GB1268721A; DE1960524A1; FR2025054A1

Description

HO

KO

25

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-3,4-Dihydroxyphenylalanin (im folgenden als DOPA abgekürzt) durch enzymatische Umsetzung.

DOPA ist eine sehr wichtige Verbindung zur medizinischen Behandlung des Parkinsonsyndroms.

Bekanntlich ist DOPA in der Rinde oder in den Knospen von Vicia fava l enthalten und kann hieraus durch Extraktion erhalten werden. Es kann auch nach verschiedenen synthetischen Verfahren, z. B. aus L-Tyrosin erhalten werden. Andererseits wurde in jüngster Zeit berichtet, daß DOPA aus Brenzcatechin und L-Tyrosin durch enzymatische Einwirkung der /i-Tyrosinase erhalten wird, welche durch Kultivierung eines zum genus Escherichia gehörenden Mikroorganismus erhalten wurde.

Jedoch hat das Verfahren zur Herstellung von DOPA aus Brenzcatechin und L-Tyrosin den großen Mangel bei der praktischen Anwendung, daß Phenol, welches den Fortschritt der Umsetzung hemmt, ebenfalls zusammen mit DOPA in der Reaktionslösung gebildet wird und daß das gebildete DOPA und das in der Reaktionslösung verbliebene L-Tyrosin nur sehr schwer voneinander zu trennen sind.

Aufgabe der Erfindung ist die Herstellung von DOPA durch ein biochemisches Verfahren aus leicht zugänglichen Rohmaterialien in einfacherer und leichterei Arbeitsweise, als dies bisher möglich war.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man eine wäßrige Lösung mit einem Gehalt an 0,1 bis 20 Gewichtsprozent Brenzcatechin und 0.1 bis 10 Gewichtsprozent einer oder mehrerer der Aminosäuren Cystein, Cystin, Serin, Alanin, ihrer Ammonium-, Natrium-, Kalium- oder Calciumsalze, ihrer Hydrochloride, ihrer Methyl- oder Äthylester oder ihrer S-Methyl- oder S-Äthylester bei einem pH-Wert von 4 bis 11 mit /i-Tyrosinase oder Substanzen, die /f-Tyrosinase enthalten, in Berührung bringt und das gebildete L-3,4-DihydroxyphenylaIanin in an sich bekannter Weise abtrennt.

Bei dem Verfahren der Erfindung kann DOPA beispielsweise durch die folgenden Umsetzungen, die durch das Enzym katalysiert werden, gebildet wer der:

HO

3. HO

HS-CH₂-CH-COOH
NH₂

CH₂-CH-COOH + H₂S

NH,

+ H₃C-S-CH₂-CH — COOH NH,

CH₂-CH - COOH + CH₃ - SH NH,

+ HO-CH₂-CH-COOH
NH₂

HO

HO~<\-CH₂—CH-COOH + H₂O

NH,

HO

4. HO

HO

•HO

+ HCH₂-CH-COOH
NH₂

CH₂-CH-COOH + H₂

NH,

Das gemäß der Erfindung eingesetzte Enzym /i-Tyro sinase kann als kristalline //-Tyrosinase oder in Forn von Substanzen, die /i-Tyrosinase enthalten, zur An Wendung gelangen.

Infolge weiterer Untersuchungen wurde nun ge funden, daß eine bemerkenswerte Menge an DOP/ gebildet wird, wenn /J-Tyrosinase oder Substanzen die /i-Tyrosinase enthalten, zu einer Lösung zugegebei werden, die Brenzcatechin und eine oder mehren der vorstehend aufgeführten Aminosäuren enthäll und daß die /?-Tyrosinase in einer Kulturflüssigkei und in den mikrowellen Zellen gebildet wird, wem bestimmte Mikroorganismen in einem Nährmediuir das Tyrosin enthält, kultiviert werden.

Die /f-Tyrosinase enthaltenden Substanzen werdei üblicherweise als Kulturbrühe, worin bestimmte Mi

I 960 524

icroorganismen kultiviert wurden, oder deren zellfreie Filtrate, als wäßrige Suspensionen von mikrowellen Zellen, als gemahlene Zellsuspensionen oder als Filtrate hiervon erbalten.

Die Mikroorganismen mit der Eigenschaft zur Bildung ties Enzyms, wie sie im Rahmen der Erfindung angewandt werden, sind im Bereich der Mikroben sehr weit verbreitet. Insbesondere handelt es sich um solche Mikroorganismen, die zu den genera Escherichia, Aerobacter, Erwinia, Pseudomonas, Bacillus, Achromobacter, Xanthomonas und Proteus gehören. Insbesondere sind typische Specien der Mikroorganismen mit der Fähigkeit zur Bildung des Enzyms, welches DOPA bildet, Escherichia intermedia, Aerobacter aerogenes, Erwinia herbicola, Achromobacter candicans, Alcaligenes faecalis, Pseudomonas ovalis, Bacillus megatherium, Xanthoraonas campestris und Proteus mirabilis.

Die zur Kultivierung der Mikroorganismen zwecks Erhalt des Enzymausgangsmaterials angewandten Medien können übliche Medien sein, die Ausgangsmateriaüen für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff und die üblichen geringeren Nährstoffe enthalten und die außerdem eine geeignete Menge an Tyrosin enthalten. Sie wuchsen zufriedenstellend auf Medien, die Kohlenhydrate, wie Glucose, Fructose, Saccharose, Mannose, Maltose, Mannit, Xylose, Galactose, Stärkehydrolysate und Melassen enthielten. Organische Säuren, wie Essigsäure, Citronensäure, Milchsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure, α-Ketoglutarsäure, Gluconsäure und Brenztraubensäure, Alkohole, wie Methanol, Äthanol, Propanol und Butanol, Fettsäuren und Kohlenwasserstoffe sind ebenfalls als Hauptkohlenstoffquellen oder ergänzende Kohlenstoffquellen entsprechend der Wahl des eingesetzten Mikroorganismus verwendbar. Die Konzentration des Kohlenstoffausgangsmaterials im Medium liegt normalerweise zwischen 0,1 und 10 Gewichtsprozent, angegeben als Glucoseäquivalente. Stickstoff kann durch Ammoniumsalze von anorganischen oder organischen Säuren, beispielsweise Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure, Essigsäure und Kohlensäure, durch Harnstoff und durch Ammoniak in wäßriger Lösung oder im Gaszustand geliefert werden. Andere organische stickstoffhaltige Substanzen, wie Maisquellflüssigkeit, Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt und aus Hefeextrakt gewonnene Aminosäuren werden als zusätzliche Stickstoffquellen verwendet.'

Das Medium sollte auch anorganische und organische Substanzen enthalten, die das Wachstum der Mikroorganismen fördern. Zu den anorganischen Substanzen gehören die essentiellen anorganischen Ionen, die aus Dikaliumhydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisen(II)-sulfat, Mangansulfat, Zinksulfat, Kupfersulfat und Calciumcarbonat erhältlich sind. Zu den bekannten organischen wachstumsfördernden Substanzen gehören allgemein Aminosäuren. Biotin. Vitamine, organische Säuren, Fettsäuren und proteinhaltige Substanzen. Sie können zu dem Medium in Form von Substanzen zugesetzt werden, die das aktive Mittel unter den Bedingungen der Kultivierung bilden, beispielsweise als Fleischextrakt, Pepton, Hefeextrakt, Maisquellflüssigkeit, Magermilch, Chloreltaextrakt, Sojaproteinhydrolysat und verschiedene andere Extrakte von pflanzlichen und tierischen Geweben, wie sie an sich bekannt sind.

Die Zugabe von Tyrosin zum Kulturmedium ist wichtig, um eine gute Ausbeute das Enzyms zu erhalten, insbesondere sollte es zu dem Medium in einer Menge von mehr als 0,01% und bevozugt in einer Menge von 0,05 bis 0,5%, bezogen auf das Gewicht

des Mediums, zugesetzt werden.

Aminosäuren, wie Methionin, Glycin, Alanin, Vitamine, wie Pyridoxin, Pyridoxal und Pyridoxalphosphat können ebenfalls zu dem Medium zur Verbesserung der Enzyroaktivität zugegeben werden. Die

ίο Konzentration der zugesetzten Aminosäuren liegt normalerweise zwischen 0,01 und 5 Gewichtsprozent, als freie Aminosäuren.

Die Fermentierung wird unter aeroben Bedingungen» beispielsweise durch aerobes Schütteln der Kultur

oder durch Rühren einer Submerskultur unter Einführung von Luft, bei einer Temperatur von 25 bis 40⁰C durchgeführt. Bevorzugt wird der pH-Wert des Kulturmediums auf einem Bereich von 5,5 bis 8,5 mit üblichen Neutralisiermitteln während der Kultivierung eingeregelt, so daß eine gut» Herstellung des Enzyms erhalten wird. Die Kultivierung wird im allgemeinen während 10 bis 72 Stunden durchgeführt.

Die auf diese Weise hergestellte Kulturflüssigkeit kann als Enzymausgangsmaterial, so wie sie ist, ohne Entfernung der Bakterienzellen verwendet werden. Zellfreie Filtrate der Kulturbrühe, lebende aus der Kulturbrühe erhaltene Bakterienzellen und Suspensionen von zerbrochenem Bakt<*rienzellenmaterial, die durch Verreiben, Autolyse oder Ultraschallbehandlung hergestellt wurden, können ebenfalls als Enzymausgangsmaterial im Rahmen der Erfindung verwendet werden. Es ist auch möglich, ein rohes Enzym anzuwenden, welches beispielsweise durch Behandlungen, wie Zentrifugieren, Aussalzen und Lösungsmittelausfällung hergestellt wurde.

Andererseits ist es auch möglich, DOPA durch Zusatz von Brenzcatechin und einer oder mehrerer der Aminosäuren aus der Gruppe von Cystein, Cystin. Serin. Alanin und Salzen oder Derivaten hiervon zu dem Medium während cL-r Kultivierung herzustellen. Brenzcatechin kann als Substrat gemäß der Erfindung nicht nur als reine Verbindung verwendet werden, sondern auch als rohe, die bestimmte Verunreinigungen enthält.

Die als Substrat angewandten Aminosäuren, wie Cystein. Cystin. Serin und Alanin, können in Form der freien Säure oder als Ammonium-, Natrium-, Kaliumoder Calciumsalze oder als Hydrochloride zugegeben werden. Sie können auch in Form von Estern, bei-

so spielsweise des Äthylesters oder Methylesters, oder in Form anderer Derivate zugeführt werden.

Zu geeigneten Ausgangsmaterialien für die Aminosäuren gehören nicht nur die reinen Verbindungen sondern auch Rohsubstanzen, die eine oder mehren dieser Aminosäuren enthalten, und sie können in dei L-Form. η-Form. ni.-Form und als Gemische de D- und 1.-Formen verwendet werden. Weiterhin ge hören zu geeigneten Ausgangsmülerialien für i.-Serii uder i.-Alanin rohe Kulturbrühen, die L-Serin ode

ho L-Alanin enthalten, die durch Fermentierung erhaltei wurden. Die Konzentration der zu dem Reaktionsge misch als Substrat zuzusetzenden Aminosäuren is üblicherweise nicht begrenzt, beträgt jedoch zweck mäßigerweise 0,1 bis 10% als freie Aminosäuren.

<·>5 Die enzymatische Umsetzung wird unter den Be dingungen eines pH-Wertes von 4 bis 11 und eine Temperatur von 10 bis 50 C ausgeführt. Der pH-Wei der das Enzym enthaltenden Reaktionslösung hi

einen wichtigen Einfluß aur die zur Herstellung von DOPA erforderliche Gesamtzeit und auf die schließlich erhaltene Ausbeute an DOPA, Der pH-Wert soll während der Umsetzung durch Zugabe von CaI-ciumcarbonat, Ammoniak, Ätzalkalien oder Phospbatpuflern geregelt werden.

Die Gewinnung des DOPA aus dem Reaktionsgemisch kann durch das im Journal of Biological Chemistry, Bd, 239, S. 2910 (1964), beschriebene Verfahren erreicht werden,

Das nach dem Verfahren der Erfindung erhaltene Produkt läßt sich als DOPA durch deu bei der Papierchromatographie erhaltenen Rf-Wert und durch den auftretenden purpurroten Flecken identifizieren, der auftritt, wenn eine l%ige Lösung von Kaliumferricyanid auf das Papierchromatogramm gesprüht wird. Die Bestimmung des in der Reaktionslösung angesammelten DOPA kann nach dem Verfahren von A r η 0 w und Mitarbeiter (Journal of Biological Chemistry, Bd. 118, S. 531 bis 537, 1937) erfolgen.

Beispiel 1

Es wurde ein wäßriges Kulturmedium hergestellt, welches 1% Fleischextrakt, 1% Polypepton, 0,5% Natriumchlorid, 0,2% L-Tyrosin enthielt und auf pH 7,0 eingestellt war. Anteile von 40 ml der Lösung wurden in Schüttelkolben von 500 ml gegeben.

Die wäßrigen Medien wurden mit den Kulturen ^₀ inokuliert, die durch Kultivierung von Escherichia intermedia (ATCC 6750) auf Bouillon-Agarschlitzen bei 28° C während 24 Stunden hergestellt worden waren, und die Kultivierung wurde in den wäßrigen Medien, deren pH-Wert zu Beginn 7,0 betrug, bei 31° C während 18 Stunden unter Schütteln durchgeführt.

Die mikrobiellen Zellen in 1 1 der Kulturbrühe wurden durch Zentrifugieren abgetrennt, gewaschen und ir. 100 ml eines Verdünnungspuffers suspendiert, welcher 0,05-m-Kaliumphosphat (pH 6) enthielt. Die Zellsuspension wurde einer Ultraschallbehandlung unterworfen (2OkHz während 30 Minuten) und zentrifugiert.

Die überstehende Lösung wurde mit Ammoniumsulfat fraktioniert und anschließend eine Dialyse gegen den Verdünnungspuffer durchgeführt. Ein Zehntel des Volumens an einer 6%igen Protaminsulfatlösung mit einem pH-Wert von 7,0 wurde zu dem Dialysat zugesetzt und der gebildete Niederschlag abzentrifugiert. Die überstehende Lösung wurde auf eine Kolonne auf Dextranbasis (6 χ 53 cm), die mit dem Verdünnungspuffer äquilibriert war, aufgetragen. Nachdem die Kolonne mit einem 0,1-m-Kaliumphosphatpulfer, pH 7,0, der 0,005-m-Mercaptoäthanol enthielt, gewaschen worden war, wurde das Enzym mit einem 0,1-m-KaliumphosphatpufTer. pH 7,0 der 0,005-m-Mercaptoäthanol und 0,1-m-KCl enthielt, eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt und durch Zusatz von Ammoniumsulfat (Sättigung 70%) konzentriert. Der Niederschlag wurde gesammelt und gegen den Verdünnungspuffer dialysiert.

Das Dialysat wurde auf eine Hydroxylapatitkolonne (5 χ 10 cm), die mit dem Verdünnungspuffer äquilibriert war, aufgetragen. Nachdem die Kolonne mit (\s einem 0,03-m-Kaliumphosphatpuffer, pH 6,0, mit einem Gehalt von 0,005-m-Mercaptoäthanol gewaschen worden w»r, wurde das Enzym mit 0.1-m-Kaliumphosphatjjuffer, pH 6,0, mit einem Gehalt von Q,QQ5-m-Mercaptoäthanol eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt und mit Ammoniumsulfat (Sättigung 70%) konzentriert. Der Niederschlag wurde gesammelt und in der kleinsiraöglichen Menge des Verdtinnungspuffers gelöst. Die Enzymlösung wurde durch eine Kolonne auf Dextranbasis (2 χ 100 cm), die mit dem Verdünnungspuffer äquilibriert war, gegeben. Die aktiven Fraktionen, die das Enzym mit einer spezifischen Aktivität größer als 1,0 enthieUen, wurden vereinigt und mit Ainmoniumsulfat (Sättigung 70%) konzentriert. Der Niederschlag wurde in einer minimalen Menge des Verdünnungspuffers gelöst. Feingepulvertes Ammoniumsulfat wurde vorsichtig zu der Enzymlösung zugegeben, bis diese geringfügig trüb wurde, und das Gemisch in ein Eisbad gestellt. Die Kristallisation begann etwa nach 6 Stunden und war innerhalb einer Woche praktisch vollständig.

Dadurch wurden 80 mg des kristallinen Enzyms erhalten.

Das auf die vorstehende Weise hergestellte Enzym wui de zu 200 ml eines 0,05-m-Kaliumphosphatpuffers (pH 8,5) gegeben, der '...5 g Brenzcatechin und 1 g L-Serin enthielt, und die Umsetzung bei 31°C während 3 Stunden ausgeführt. 870 mg DOPA fanden sich in der Reaktionslösung.

Zu der Reaktionslöung wurde Trichloressigsäure zur Entfernung des Proteins zugesetzt und der pH-Wert der Lösung auf 8,5 mit wäßrigem Ammoniak eingestellt. Die das DOPA enthaltende Lösung wurde auf eine Aluminiumoxydkolonne (4 χ 20 cm) aufgetragen. Diese Kolonne wurde zunächst mit destilliertem Wasser und dann mit 0,3-n-Essigsäure eluiert. Die das DOPA enthaltende Fraktion, die aus dem Eluat getrennt wurde, wurde mit Äthylacetat behandelt. Der erhaltene Sirup wurde auf eine Kieselsäurekolonne aufgetragen und die Kolonne eluiert. Das Eluat wurde eingedampft und dabei 560 mg kristallines DOPA erhalten.

Wenn an Stelle von 1 g L-Serin beän vorstehenden Versuch 1 g 1.-Cystein eingesetzt wurde, wurden 1250mg DOPA in der Reaktionslösung gefunden und 830 mg kristallines DOPA erhalten.

Beispiel 2

Aerobacter aerogenes (ATCC 7256) wurde in der gleichen Weise, wie im Beispiel 1, kultiviert. Die mikrobiellen Zellen in 1 1 der Kulturflüssigkeit wurden abgenommen und in 100 ml eines Verdünnungspuffers suspendiert, der 0,05-m-Kaliumphosphat (pH 6) enthielt, suspendiert. Die Zellsuspension wurde einer Ultraschallbehandlung (2OkHz während 30 Minuten) unterworfen und zentrifugiert.

Die überstehende Lösung wurde als Enzymausgangsmaterial verwendet. Die Enzymlösung, die 80 mg Protein enthielt, wuide zu 200 ml eines 0,05-m-Kaliumphosphatpuffers (pH 8,5), der 4 g Brenzcatechin, 2 g i.-Cystein und 4 mg Pyridoxalphosphat enthielt, zugesetzt und bei 31 ° C während 3 Stunden umgesetzt. 1,2 g DOPA wurden in der Reaktionslösung erhalten. 0,9 g kristallines DOPA wurden aus der Lösung in der gleichen Weise, wie im Beispiel 1, erhalten.

Wenn 2 g S-Methylcystein an Stelle des i.-Cystcin im vorstehenden Ansatz eingesetzt wurden, wurden 0.8 g DOPA in der Reaktionslösung festgestellt und 0,4 g kristallines DOPA erhalten.

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Beispiel 3

Ein wäßriges Kulturmedium mit nachfolgender Zusammensetzung wurde hergestellt und auf pH 6,5 ingeregelt:

Zusammensetzung des Mediums

L-Tyrosin 0,2 g/100 ml

K₂HPO₄ 0,1 g/100 ml

MgSO₄ 0,05 g/100 ml

Citronensäure 0,2 g/100 ml

Glycerin 0,2 g/100 ml

Hefeextrakt 1,0 g/100 ml

Pyridoxin 0,01 g/100 ml

Glycin 0,1 g/100 ml

Alanin 0,3 g/100 ml

Methionin 0,15 g/100 ml

Anteile von 60 ml der Lösung wurden in Schüttelkolben von 500 ml gegeben.

Die wäßrigen Medien wurden mit Kulturen inokuliert, die durch Kultivierung von Erwinia herbicola (ATCC 21 434) auf Bouillon-Agarschrägen bei 28° C während 20 Stunden hergestellt worden waren, und die Kultivierung in den wäßrigen Medien bei 31°C während 20 Stunden unter Schütteln durchgeführt.

Die mikrowellen Zellen in 11 der Kühlflüssigkeit wurden durch Zentrifugieren abgetrennt und mit destilliertem Wasser gewaschen. Die auf diese Weise hergestellten mikrowellen Zellen wurden in der Reaktionslösung, deren Menge die Hälfte von derjenigen der Kühlflüssigkeit betrug, mit der nachfolgend aufgeführten Zusammensetzung suspendiert:

Zusammensetzung der Reaktionslösung (pH 8,8)

m.-Serin 1,5 g/100 ml

Brenzcatechin 0,75 g/100 ml

Na₂SO₃ 0,2 g/100 ml

(NH₄)₂NO₃ 0,2 g/100 ml

EDTA*) 0,1 g/100 ml ₄c

*) Äthylendiamintctraessigsäure.

Die Umsetzung wurde bei 30° C während 20 Stunden durchgeführt. 0,92 g/100 ml DOPA fanden sich in der Reaktionslösung.

21 der Reaktionslösung wurden auf pH 3,5 mit Salzsäure eingestellt und zur Entfernungder mikrobiellen Zellen zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde auf 250 ml eingeengt und deren pH-Wert auf etwa 1,0 eingeregelt und die erhaltene Lösung auf eine Kolonne mit Aktivkohle (130g getrockneter Aktivkohle) aufgetragen. Nachdem die Kolonne mit 0,1-n-Salzsäure zur Entfernung des verbliebenen L-Serins gewaschen worden war, wurde das DOPA mit verdünntem wäßrigem Ammoniak eluiert. Aus dem Eluat wurde rohes kristallines DOPA durch Einengen erhalten, und die Umkristallisation wurde dreimal wiederholt. Die Ausbeute an DOPA betrug 13,6 g. Es wurde bestätigt, daß das erhaltene DOPA vollständig in der L-Form vorlag, indem eine Untersuchung mit einem Polarimeter durchgeführt wurde.

Beispiel 4

Erwinia herbicola (ATCC 21 434) wurde in der gleichen Weise, wie im Beispiel 3, kultiviert. Die mikrobiellen Zellen in 11 der Kulturflüssigkeit wurden abzentrifugiert und mit destilliertem Wasser gewaschen. Die auf diese Weise hergestellten mikrobiellen Zellen, deren Trockenmaterial 50 mg betrug, wurden in 100 ml der Reaktionslösung mit der gleichen Zusammensetzung, wie im Beispiel 3, suspendiert, jedoch mit der Ausnahme, daß eine der in der nachfolgenden Tabelle I aufgeführte Aminosäure an Stelle von ni.-Serin eingesetzt wurde; die Umsetzung wurde unter den gleichen Bedingungen, wie im Beispiel 3, durchgeführt. Die Menge an gebildetem DOPA in der Reaktionslösung ist ebenfalls in Tabelle I aufgeführt.

Tabelle I

Nr.	Aminosäure als Substrat	Gebildetes DOPA (g/100 ml)
1	L-Cystein	0,52
2	n-Cystein	0,45
3	!.-Serin	0,88
4	D-Serin	0,74
5	K-Cystin	0,32
6	L-Alanin	0.08
7	D-Alanin	0.04
8	S-Methyl-i.-cystein	0,32
9	S-Methyl-D-cystein	0,32

Beispiel 5

Erwinia herbicola (ATCC 21 434) wurde in der gleichen Weise, wie im Beispiel 3, kultiviert. Die mikrobiellen Zellen in 11 der Kulturflüssigkeit wurden abgenommen. Die Zellen (23 g Trockengewicht) wurden in 100 ml eines 0,5-m-Kaliumphosphatpuffers (pH 6,0) suspendiert und die Suspension mit Ultraschall (2OkHz während 20 Minuten) behandelt und dann zentrifugiert. Die überstehende Lösung wurde als Enzymmaterial verwendet.

Das auf diese Weise hergestellte Enzymausgangsmaterial wurde zu 21 einer Reaktionslösung zugesetzt, deren Zusammensetzung 2,0 g/100 ml D-Serin. 1,0 g/ 100 ml Brenzcatechin, 0,2 g/100 ml Na₂SO₃ und 0,1 g/ 100 ml EDTA betrug und die mit wäßrigem Ammoniak auf pH 8,8 eingestellt war. Nachdem die Umsetzung bei 30⁰C während 20 Stunden durchgeführt worden war, waren 0,84 g/100 ml DOPA in der Reaktionslösung gebildet.

10,6 g kristallines DOPA wurden in der gleichen Weise, wie im Beispiel 3, erhalten.

Beispiel 6

Jeweils 60 ml der wäßrigen Medien A bis D, die die nachfolgend in Tabelle II aufgeführten Zusammensetzungen hatten, wurden mit Kulturen inolculiert, welche durch Kultivierung von Erwinia herbicola (ATCC 21 433) auf Bouillon-Agarschrägen bei 28° C während 20 Stunden erhalten worden waren, und die Kultivierung bei 31° C während 20 Stunden untei Schütteln durchgeführt. Die mikrobiellen Zellen ir 10 ml der Kulturflüssigkeit wurden abzentrifugierl und die erhaltenen Zellen in 5 ml der Reaktionslösunj mit einem pH-Wert von 8,8 und folgender Zusammen setzung suspendiert: 2,0 g/100 ml L-Serin, 1,0 g/100m Brenzcatechin, 0.1 g/100 ml EDTA und 0.2 g/100 m Na₂SO₃.

Nachdem die Umsetzung bei 30° C wahrem 20 Stunden ausgeführt wurde, wurde das in jede Reaktionslösung gebildete DOPA bestimmt. Die Er gebnisse sind in folgender Tabelle II enthalten.

409 628Ί1

Tabelle!!

Zusammensetzung des
Mediums

ι-Tyrosin

KH₂PO₄

MgSO₄

Pyridoxin

Glycerin

Citronensäure

DL-Methionin

Glycin

DL-Alanin

Hefeextrakt

pH (eingestellt mit
KOH)

DOPA gebildet
(g/100 ml)

(g/IOOml)

0,2

0,1

0,05

0,2

0,1

0,2

1,0

6,5

0,22

0,2

0,1

0,05

0,01

0,2

0,1

0,2

1,0

6,5 0,58

0,2

0,1

0,05

0,2

0,1

0,2

1,0

6,5 0,42

0,2

0,1

0,05

0,01

0,2

0,1

0,2

1,0

6,5 0,88 Das in jeder Reaktionslösung gebildete DOPA lag in folgender Menge vor:

Tabelle IH

Angewandte
Mikroorganismen

Escherichia intermedia

(ATCC 6750)

Achromobacter

candicans (OUT 8005)
,₅ Proteus mirabilis

(ATCC 15 290)

Xanthomonas
campestris
(ATCC 7381)

Beispiel 7

Ein wäßriges Kulturmedium mit folgender Zusammensetzung wurde hergestellt und der pH-Wert a ;f 6,5 eingeregelt:

Zusammensetzung des Mediums

Fleischextrakt 0,3%

Polypepton 0,3%

Hefeextrakt 0,2%

Natriumchlorid 0,2%

L-Tyrosin 0,05%

L-Serin 0,05%

L-Cystein 0,02%

L-Alanin 0,02%

Anteile von 40 ml der Lösung wurden in Schüttelkolben von 500 ml gegeben.

Die wäßrigen Medien wurden jeweils mit Kulturen inokuliert, die durch Kultivierung von Escherichia intermedia (ATCC 6750). Achromobacter candicans (OUT 8005), Proteus mirabilis (ATCC 15 290), Xanthomonas campestris (ATCC 7381) auf Bouillon-Agarschrägen bei 28° C während 24 Stunden erhalten worden waren, und die Kultivierung in den wäßriger. Medien bei 3 Γ C während 18 Stunden unter Schütteln durchgeführt.

Die mikrowellen Zellen in jeweils 11 der Kulturflüssigkeit wurden abzentrifugiert. Die dabei erhaltenen mikrowellen Zellen wurden in 100 ml eines 0,05-m-Kaliumphosphatpuffers (pH 6,0) suspendiert und die Suspensionen einer Ultraschallbehandlung (20 kHz während 20 Minuten) unterworfen. Die erhaltenen Lösungen, die die gebrochene Zellsubstanz von jedem Mikroorganismus enthielt, wurden als Enzymausgangsmaterial in der nachfolgend beschriebenen Weise verwendet.

Jedes Enzymausgangsmaterial (100 mg Trockenmaterial) wurde zu jeweils 100 ml der Reaktionslösung (pH 7,8), die 200 mg einer der in Tabelle III aufgeführten Aminosäuren, 400 mg Brenzcatechin und 2,5 mg Pyridoxalphosphat enthielt, zugegeben und die Umsetzung bei 31^CC während 3 Stunden ausgeführt.

Gebildetes DOPA (g/100 ml) Substrat

L-Cy-

0,180
0,130

0,103

0,082

!.-Cystin

0,065 0,043

0,035

0,025

L-Serin

0,140 0,105

0,072

0,045

!.-Alanin

0,015 0,012 0,008

0,005

30

35

40

Beispiel 8

Ein wäßriges Kulturmedium mit folgender Zusammensetzung wurde hergestellt und der pH-Wert auf 7,0 eingeregelt.

Zusammensetzung des Mediums

Glucose 2%

(NHJ₂SO₄ 1%

KH₂PO₄ 0,2%

MgSO₄ 0,1%

Fe^{+ +} 2 ppm

Mn ⁺⁺ 2 ppm

Hefeextrakt 0,1 %

Maisquellflüssigkeit 0,05%

L-Tyrosin 0,05%

L-Serin 0,05%

i.-Cystein 0,05%

CaCO₃ (getrennt sterilisiert) 2,5%

Anteile von 20 ml der Lösung wurden in Schüttelkolben von 500 ml gegeben.

Die wäßrigen Medien wurden jeweils mit Kulturen inokuliert, welche durch Kultivieren von acht Arten der in Tabelle IV aufgeführten Mikroorganismen jeweils auf Bouillon-Agarschlitzen bei 31°C während 24 Stunden hergestellt worden waren. Nachdem die Kulti vierungjedes Mikroorganismus bei 3 Γ C während 24 Stunden unter Schütteln durchgeführt worden war wurden 0,5% (Konzentration in der Flüssigkeit) ar Brenzcatechin und 0,2% (Konzentration in der Flüssigkeit) an L-Serin oder L-Cystein zu der Kulturflüssig keit zugegeben und die Umsetzung während 24 Stun den durchgeführt. Die Menge des gebildeten DOP/ in der Reaktionslösung wurde nach dem Verfahrei von A r η ο w und Mitarbeiter bestimmt. Es wurdei folgende Ergebnisse erhalten:

Tabelle IV Angewandte Mikroorganismen

Aerobacter aerogenes
(ATCC 7256)

Escherichia intermedia
(ATCC 6750)

Gebildetes DOPA (g/100 ml) Substrat

L-Serin

0,085 0,108

L-Cystein

0,105 0,135

Fortsetzung

Angewandte Mikroorganismen

Achromobacter candicans

(OUT 8005)

Proteus mirabilis (ATCC 15 290) Xanthomonas campestris

(ATCC 7381)

Pseudomonas ovalis (IAM 1622) Bacillus cereus (IAN 1229)

Gebildetes DOPA

Ig/100 ml)

Substrat

L-Serin

0,062 0,078

0,069 0,042 0,055

L-Cystein

0,082 0,098

0.085 0,070 0,72

Beispiel 9

Ein wäßriges Kulturmedium mit folgender Zusammensetzung wurde hergestellt und der pH-Wert auf 6,5 eingeregelt.

Zusammensetzung des Mediums

Fleischextrakt 0,3%

Polypepton 0,3%

Hefeextrakt 2,0%

DL-Alanin 0.3%

L-Tyrosin 0,2%

Glycin 0,1%

Citronensäure 0,2%

Caseinhydrolysat 0,3%

Anteile von 60 ml der Lösung wurden in Schüttelkolben von 500 ml gebracht.

Die wäßrigen Medien wurden jeweils mit Kulturen inokuliert, die durch Kultivierung der in Tabelle V aufgefuhrten Mikroorganismen auf Bouillon-Agar-

schragen bei 28° C während 20 Stunden hergestellt worden waren, und die Kultivierung in den wäßrigen Medien bei 31° C während 20 Stunden unter Schütteln durchgeführt.

Die mikrowellen Zellen in jeweils 1 1 der Kulturflüssigkeit wurden abzentrifugiert. Die Enzymausgangsmaterialien wurden hergestellt, indem diese erhaltenen mikrowellen Zellen zu 100 m! eines 0,05-m-Kaliumphosphatpuffers (pH 8,5) zugesetzt wurden.

Jedes Enzymausgangsmaterial (0,5 g Trockenmaterial) wurde zu 100 ml der Reaktionslösungen (pH 8,6) zugesetzt, die aus 0,05-m-KaliumphosphatpufTerlösungen mit einem Gehalt von 1 g D-Serin, 1 g D-Cystein, 1 g D-Cyslin, 1 g D-Tyrosin oder 3 g D-Alanin zusammen mit 0,8 g Brenzcatechin und 0,2 g Na₂SO₃ bestanden. Dann wurde die Umsetzung bei 3 Γ C während 20 Stunden ausgeführt. Es wurden folgende Mengen an DOPA in den jeweiligen Reaktionslösungen gebildet:

Tabelle V

	Gebildetes DOPA (g/(00 ml)	Substrat	ο-Serin	n-Ala-
Angewandte		U-Cy-		nin
25 Mikroorganismen	D-Cy-	slin
	siein		0,52	0,15
Escherichia intermedia		0,25
(ATCC 6750)	0,46		0,44	0,06
³⁰ Escherichia freundii		0,20
(ATCC 8090)	0,32		0,32	0,05
Escherichia coli		0,21
(ATCC 3655)	0,35		0,08	0,02
15 Proteus mirabilis		0,05
(ATCC 15 290)	0,10

Claims

Patentansprüche:

1, Fermentative« Verfahren zur Herstellung von L-3,4-Diby droxyphenylalanin, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung mit einem Gebalt an 0,1 bis 20 Gewichtsprozent Brenzcatechin und 0,1 bis 10 Gewichtsprozent einer oder mehrerer der Aminosäuren Cystein, Cystin, Serin, Alanin, ihrer Ammonium-, Natrium-, Kalium- oder Calciumsalze, ihrer Hydrochloride, ihrer Methyl- oder Äthylester oder ihrer S-Methyl- oder S-Äthylester bei einem pH-Wert von 4 bis 11 mit /J-Tyrosinase oder Substanzen, die 0-Tyrosinase enthalten, in Berührung bringt und das gebildete L-3,4-Dihydroxyphenylalanin in an sich bekannter Weise abtrennt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die enzymatische Umsetzung in einer Kulturflüssigkeit durchfuhrt, in der die /i-Tyrosinase durch Mikroorganismen hergestellt wird.

I, HO