DE1517834C3 - Verfahren zur biotechnischen Her stellung von L Lysin - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin durch Züchten von Mikroorganismen bei hierfür üblichen Bedingungen in n-Paraffinkqhlenwasserstoffe als Hauptkohlenstoffquelle enthaltenden Nährmedien.

L-Lysin, d. h. 2,6-Diaminohexansäure, ist eine bekannte Aminosäure. Sie wird auf dem Gebiet der Nahrungsmittelanreicherung verwendet, wo' die Ergänzung von Nahrungsmitteln auf der Basis von Weizen mit Lysin deren Proteinqualität verbessert und ein besseres Wachstum und einen besseren Gewebeaufbau zur Folge hat. Diese Verbindung wird auch medizinisch als Nährstoff verwendet. Es besteht daher ein Bedürfnis nach einem wirtschaftlichen Verfahren zur Herstellung dieser Substanz in großtechnischem Maßstab.

Die biotechnische Herstellung von L-Lysin durch aerobes Züchten eines L-Lysin bildenden Mikroorganismus in einem mindestens einen Kohlenwasserstoff als Hauptkohlenstoffquelle enthaltenden Nährmedium ist aus »Agr. Biol. Chem.«, Bd. 27, Nr. 5, 1963, S. 390 bis 395, sowie aus der britischen Patentschrift 996 544 bereits bekannt. Es ist auch bereits bekannt, L-Lysin unter Einsatz von Mutanten, die Homoserin oder Threonin und Methionin benötigen, biotechnisch herzustellen (britische Patentschrift 851 396).

Die bisher bekannten Verfahren zur Herstellung von L-Lysin haben den Nachteil, daß sie entweder das L-Lysin nur in geringer Ausbeute und zudem in durch unerwünschte Nebenprodukte verunreinigter Form ergeben oder daß zu ihrer Durchführung ausschließlich Kohlehydrate als Hauptkohlenstoffquelle verwendet werden müssen, die nicht immer in ausreichender Qualität und Menge zur Verfügung stehen.

Aufgabe der Erfindung ist es nun, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von L-Lysin auf biotechnischem Wege anzugeben, das sich in wirksamer und einfacher Weise in großtechnischem Maßstab ausführen läßt und ein Produkt hoher Reinheit in guter Ausbeute liefert.

Gegenstand der Erfindung ist nun ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin durch Züchten von Mikroorganismen bei hierfür üblichen Bedingungen in n-Paraffinkohlenwasserstoffe als Hauptkohlenstoffquelle enthaltenden Nährmedien, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Mikroorganismus Arthrobacter paraffineus ATCC 21003 oder Brevibacterium ketoglutamicum ATCC 21004 einsetzt.

Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich gegenüber den bisher bekannten Verfahren dadurch aus, daß es damit möglich ist, das gewünschte L-Lysin in wesentlich höherer Ausbeute und in höherer Reinheit als bisher zu gewinnen. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhält man das L-Lysin in Mengen in der Größenordnung von etwa 10 000 mg pro Liter Fermentationsmedium, während gemäß Beispiel 9 der britischen Patentschrift 996 544 nur etwa 2 mg L-Lysin pro Liter Fermentationsmedium gebildet werden. Nach Tabelle V in »Agr. Biol. Chem.«, Bd. 27, Nr.'5, S. 390 bis 395, 1963, werden im besten Falle 23,9 mg L-Lysin pro Liter Fermentationsmedium erhalten.

ίο Hinzu kommt noch, daß bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens die Bildung von anderen Aminosäuren, wie z. B. L-Glutaminsäure, L-Alanin und L-Valin, die bei den bisher bekannten Verfahren stets auftritt, praktisch vermieden wird.

Gegenüber dem aus der britischen Patentschrift 851 396 bekannten Verfahren hat das erfindungsgemäße Verfahren den Vorteil, daß als Hauptkohlenstoffquelle keine Kohlehydrate verwendet werden müssen, die nicht immer in ausreichender Qualität und Menge zur

ao Verfügung stehen, sondern daß zur Herstellung von L-Lysin ausschließlich n-Paraffinkohlenwasserstoffe als Hauptkohlenstoffquelle verwendet werden. Auch ist. die Ausbeute an L-Lysin bei. Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens höher als bei dem

as aus der zuletzt genannten britischen Patentschrift bekannten Verfahren. Während nach den Beispielen 5 und 6 der genannten britischen Patentschrift die Ausbeute an L-Lysin, bezogen auf die eingesetzte Kohlenstoffquelle, bei 29,2 bzw. 28,0 °/„ liegt, beträgt die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erzielbare Ausbeute an L-Lysin, ebenfalls bezogen auf die eingesetzte Kohlenstoff quelle, 33,3 bzw. 30,8 °/₀.

Für das Wachstum und die Fermentierung der erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen kann entweder ein synthetisches oder ein natürliches Kulturmedium Verwendet werden, solange dieses die wesentlichen Nährstoffe für das Wachstum des speziell verwendeten Mikroorganismus enthält. Insbesondere sollte das Kulturmedium mindestens einen Stickstofflieferanten, ein organisches Salz und eine kleine Menge der speziellen Nährsubstanz, die der Mikroorganismus benötigt, sowie mindestens einen n-Kohlenwasserstoff als Hauptkohlenstoffquelle enthalten. Als Kohlenwasserstoffquelle für die Verwendung bei der Kultur der Mikroorganismen werden in dem erfindungsgemäßen Verfahren n-Paraffinkohlenwasserstoffe mit 10 bis 30 Kohlenstoffatomen bevorzugt. Ein einziges η-Paraffin oder eine Mischung von mehr als einem dieser η-Paraffine oder eine Mischung aus einem oder mehreren dieser η-Paraffine mit einem anderen Kohlenstofflieferanten, in der das η-Paraffin den Hauptbestandteil darstellt, kann ebenfalls verwendet werden. Zu den n-Paraffinkohlenwasserstoffen der obengenannten Art gehören n-Dodecan, n-Tridecan, n-Tetradecan, n-Pentadecan, n-Hexadecan, n-Heptadecan, n-Octadecan und Mischungen davon. Die anderen Details für die Züchtung sind üblich und dem Fachmann bekannt. Beispielsweise können in kleineren Mengen andere Kohlenstofflieferanten verwendet werden, z. B. organische Säuren wie Essigsäure oder ihre Salze, Kohlehydrate, z. B. Glukose, Stärkehydrolysat, Melasse usw., oder andere übliche Kohlenstofflieferanten. Zu den beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendbaren anorganischen Salzen gehören Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Mangansulfat, Kaliumchlorid, Eisen(II)-sulfat, Calfliumcarbonat usw. In dem erfindungsgemäßen Verfahren können als Stickstofflieferanten ζ. Β. organische Stickstofflieferanten

wie Maisquellwasser, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Pepton, Fischmehl u. dgl. sowie, anorganische Stickstofflieferanten wie Ammoniumsalze, beispielsweise Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid, Ammoniumcarbonat u. dgl. und/oder Harnstoff verwendet werden.

Der n-Paraffinkohlenwasserstoff kann dem Fermentationsmedium in Mengen zwischen 1 und 30 Gewichtsprozent zugesetzt werden.

Die Fermentation wird unter aeroben Bedingungen, beispielsweise durch aerobes Schütteln der Kultur bei einer Temperatur zwischen etwa 20 und 40⁰C und einem pH-Wert zwischen etwa 4,0 und 9,0, durchgeführt. Nach Beendigung des Fermentationsprozesses wird das L-Lysin aus der Fermentationsbrühe nach üblichen Verfahren, z.B. durch Behandlung mit Ionenaustauscherharz, Extraktion mit Lösungsmitteln, Zentrifugieren, Chromatographie od. dgl., gewonnen.

Das folgende Beispiel soll die Erfindung erläutern. Die darin angegebenen Prozentsätze sind, wenn nichts anderes angegeben ist, Gewichtsprozent/Volumprozent.

Beispiel

Der Homoserin benötigende Mikroorganismus Arthrobacter paraffineus ATCC 21003 und der Methionin und Threonin benötigende Mikroorganismus Brevibacterium ketoglutamicum ATCC 21004 wurden in jeweils 10 ml eines Hefebouillon-Impfkulturmediums inoculiert, das in großen Reagenzgläsern enthalten war. Das Impfkulturmedium enthielt 1 % Hefeextrakt, 1% Fleischextrakt, 1% Pepton und 0,2% NaCl. Die Kultivierung erfolgte durch 24stündiges aerobes Schütteln bei 30⁰C mit 200 UpM.

Die verschiedenen Impfkulturen wurden 50-ml-Portionen des Fermentationsmediums der nachfolgend angegebenen Zusammensetzung, die in 500-ml-Flaschen enthalten waren, in einer Menge von 10 Volumprozent zugesetzt. Das Fermentationsmedium bestand aus 10 Volumen/Volumprozent einer Mischung gleicher Volumenanteile n-Paraffinkohlenwasserstoff mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen (von n-Dodecan bis n-Octadecan) und enthielt außerdem folgende Bestandteile:

0,1% KH₂PO₄,
0,1% K₂HPO₄,
0,1% MgSO₄-7 H₂O,
0,002% MnSO₄ · 4 H₂O,
0,002% FeSO₄ · 7 H₂O,
100 γβ Thiaminhydrochlorid,
2,0% (NH₄)₂SO₄.

Der pH-Wert des Fermentationsmediums betrug 6,5.

Dem Medium, welches den Stamm enthielt, der Homoserin benötigt, wurden lOOy/ml L-Homoserin zugesetzt, während dem Medium, welches den Stamm enthielt, der Methionin und Threonin benötigt, 200y/ml DL-Methionin und lOOy/ml L-Threonin zugegeben wurde. Dann wurde unter aerobem Schütteln bei 30⁰C mit 110 UpM kultiviert.

Die in den verschiedenen Fermentationsmedien angereicherten L-Lysinmengen sind in der folgenden

" Tabelle angegeben. Das L-Lysin wurde nach Beendigung der Fermentation wie nachfolgend beschrieben aus der Fermentationsbrühe gewonnen.
Das durch Entfernen der Zellkörper durch zentrifugale Abtrennung gewonnene Filtrat wurde durch ein schwach basisches Anionenaustauscherharz geführt, wobei der pH-Wert des Filtrats vorher mit einer 0,5molaren Pufferlösung auf 7,0. eingestellt wurde. Die Harzkolonne wurde mit Wasser gewaschen und

ao mit 0,15 n-Ammoniakwasser eluiert. Die eine positive Ninhydrinreaktion ergebenden Fraktionen wurden vereinigt, und die darin enthaltene Ammoniakmenge wurde durch Belüftung entfernt. Der pH-Wert der so erhaltenen Lösung wurde mit 6 n-HCi auf 2,0 eingestellt, und dann wurde die Lösung unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt.

Auf diese Weise wurden durch Auflösen der dabei erhaltenen Substanz in einer kleinen Menge Wasser unter Zusatz von Alkohol Rohkristalle von L-Lysinhydrochlorid erhalten. Die Rohkristalle von L-Lysinhydrochlorid wurden durch Zugabe von Äther zur Kristallisationsmutterlauge erhalten. Die Menge an gewonnenen L-Lysinhydrochloridkristallen ist in der Spalte 4 der folgenden Tabelle angegeben.

	Verwendeter	Benötigter	angereicherte	Aus 500 ml
.7,.	Stamm	Nährstoff	Menge	Kultur
	«		L-Lysin	medium
40			mg pro ml	gewonnene
			Kultur	Menge
	Arthrobacter		medium -	L-Lysin-
	paraffineus			hydrochlorid
	ATCC 21003	Homoserin		(g)
45	Brevibacterium
	keto		10,0
	glutamicum	Methionin		.. 4,1
	ATCC 21004	+Threonin
5°
		4,0
		.1,6

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin durch Züchten von Mikroorganismen bei hierfür üblichen Bedingungen in n-Paraffinkohlenwasserstoffe als Hauptkohlenstoffquelle enthaltenden Nährmedien, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Arthrobacter paraffineus ATCC 21003 oder Brevibacterium ketoglutamicum ATCC 21004 einsetzt.