DE2164170C3

DE2164170C3 - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Arginin

Info

Publication number: DE2164170C3
Application number: DE2164170A
Authority: DE
Inventors: Ichiro Suita Chibata; Jyoji Sakai Kato; Masahiko Higashi Kisumi; Masaki Kobe Sugiura
Original assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Current assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Priority date: 1970-12-25
Filing date: 1971-12-23
Publication date: 1974-07-25
Also published as: CH560759A5; DE2164170A1; JPS516754B1; FR2119755A5; DE2164170B2; US3734829A; GB1380936A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Arginin durch aerobes Züchten eines Bacillus in einem Nährmedium bei hierfür üblichen Temperaturen und pH-Werten und durch Isolierung des L-Arginins in an sich bekannter Weise.

In den letzten Jahren wurde gefunden, daß L-Arginin eine wichtige Aminosäure als aktiver Bestandteil in medizinischen Präparationen ist. Die bekannten Methoden zu ihrer Herstellung können in drei Gruppen eingeteilt werden. Bei der ersten Methode wird die Extraktion aus Proteinhydrolysat angewandt. Bei der zweiten Methode erfolgt die Herstellung durch Synthese aus L-Ornithin. Ferner ist aus der französischen 5 Offenlegungsschrift 2 024 447 ein Fermentierungsverfahren zur Herstellung von L-Arginin bekannt, bei welchem L-Arginin durch bestimmte Bazillen in einem Nährmedium, welches als Aminosäure Ornithin oder Citrullin enthalten muß, gebildet wird.

ίο Demgegenüber ist es bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht zwingend erforderlich, dem Nährmedium eine solche Aminosäure als zusätzlichen Bestandteil zuzusetzen.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Arginin durch aerobes Züchten eines Bacillus in einem Nährmedium bei hierfür üblichen Temperaturen und pH-Werten und durch Isolierung des L-Arginins in an sich bekannter Weise ist dadurch gekennzeichnet, daß man als Bacillus den

ao Bacillus subtilis ATCC 21 742 in einem üblichen Nährmedium einsetzt.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß bei diesem Verfahren L-Arginin bereits in einem üblichen Nährmedium in guter Ausbeute erhalten wird. Ferner

»5 wurde noch gefunden, daß die L-Argininergiebigkeit bei diesem Verfahren zusätzlich gesteigert werden kann, wenn man die Kultivierung in Anwesenheit von bis 5 GewichtS'/Volumprozent l- oder DL-Glutaminsäure als zusätzlichen Bestandteilen des Nährmediums durchführt.

Tabelle L-Argininmenge im fermentierten Medium (g/dl)

Stamm

Erfindungsgemäß:

Bacillus subtilis ATCC 21 742 (Beispiel 2)

Bacillus subtilis ATCC 21 742 (Beispiel 3)

Französische Offenlegungsschrift 2 024 447: Brevibacterium lactofermentum ATCC 13 869 . Brevibacterium lactofermentum ATCC 13 869 . Brevibacterium lactofermentum ATCC 13 869..

Alcaligenes faecalis ATCC 8750

Achromobacter viscosus ATCC 12 448

Pseudomonas saccharophila ATCC 9114

Aerobacter aerogenes ATCC 15 247

Escherichia coli ATCC 9637

Xanthomonas malvacearum IAM 1652

Flavobacterium proteus ATCC 12 841

Serratia marcescens IAM 1105

Erwinia hcrbicola IAM 1562

Erwinia herbicola IAM 1562

Micrococcus luteus ATCC 398

Bacillus brevis ATCC 8185

Brevibacterium flavum ATCC 14 067

Corynebacterium acetoacidopilum ATCC 13 870 Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15 354 . Arthrobacter citreus ATCC 11 624

Zugesetzte Aminosäure Ausbeute

keine
L-Glutaminsäure

L-Ornithin
L-Ornithin
L-Citrullin
L-Ornithin
L-Citrullin
L-Ornithin
L-Citrullin
L-Ornithin
L-Citrullin
L-Ornithin
L-Citrullin
L-Ornithin
L-Citrullin
L-Ornithin
L-Citrullin
L-Ornithin
L-Citrullin
L-Ornithin
L-Citrullin
L-Ornithin
L-Citrullin
L-Ornithin
L-Ornithin
L-Citrullin
L-Citrullin
L-Citrullin
i.-Ornithin

0,35 1,23

0,58 0,28 0,32 0,14 0,18 0,08 0,12 0,38 0,40 0,25 0,28 0,20 0,28 0,16 0,16 0,14 0,15 0,08 0,10 0,42 0,38 0,11 0,28 0,24 0,22 0,14 0,08

In der vorstehenden Tabelle sind die erzielten L-Argininkonzentrationen in den fermentierten Medien in g/dl sowohl für das erfindungsgemäße Verfahren als auch für die Verfahren mit den verschiedenen Stämmen gemäß der französischen Offeiilegungsschrift 2 024 447 aufgeführt. Hieraus ergibt sich, daß das erfindungsgemäße Verfahren gegenüber diesem vorbekannten Verfahren bessere Resultate ergibt. Ohne Zusatz einer Aminosäure werden nämlich etwa gleich gro3e L-Argininkonzentnitionen erreicht, während bei Zusatz von L-Glutaminsäure eine wesentlich höhere L-Argininkonzentration im fermentierten Medium erreicht wird.

Der obengenannte Stamm Baciüus subtilis ATCC 21 742 ist eine argininhydroxamatresistente Mutante.

Die Fermentierung des genannten Stammes von Bacillus subtilis kann in an sich bekannter Weise entweder durch Schüttelkultivierung oder durch Tauchfermentierung unter aeroben Bedingungen durchgeführt werden. Bevorzugt wird die Fermentierung bei 25 bis37^cC durchgeführt. Das Fermentierungsmedium enthält in an sich bekannter Weise eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und andere Elemente.

Geeignete Kohlenstoffquellen für die Fermentierung schließen Glucose und Stärkehydrolysate ein. Beispiele von geeigneten Stickstoffquellen sind Harnstoff, Ammoniumsalze von anorganischen Säuren, z. B. Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat. Die bevorzugte Menge der Kohlenstoffquelle und der Stickstoffquelle liegen innerhalb des Bereiches von 5 bis 15 bzw. 0,1 bis 2 Gewichts-ZVoIumprozent. Darüber hinaus können dem Medium 0,2 bis 3 Gewichts-/Volumprozent organischer Nährstoffe, z. B. Maisquellflüssigkeit, Caseinhydrolysat, Pepton, !.-Asparaginsäure und 0,01 bei 2 Gewichts-/Volumprozent an anorganischen Elementen, z. B. Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, zugesetzt werden. Vorzugsweise wird die Fermentierung bei einem pH-Wert von 6 bis 9 durchgeführt. Calciumcarbonat und Ammoniak können zur Einstellung des pH-Wertes des Mediums verwendet werden.

Die Fermentierung gemäß der Erfindung kann in etwa 24 bis 96 Stunden erreicht werden. L-Arginin wird in der Fermentierungsbrühe angesammelt.

Nach dem Abschluß der Fermentierung werden Zellen und andere feste Bestandteile der Kultur von der Fermentierungsbrühe durch konventionelle Arbeitsweisen, wie durch Erhitzen, gefolgt von Filtration oder Zentrifugierung, entfernt. Bekannte Arbeitsweisen können bei der Gewinnung und/oder Reinigung von L-Arginin aus dem Filtrat oder der überstehenden Lösung angewandt werden. Beispielsweise wird die filtrierte Fermentierungsbrühe durch ein Harz eines starken Kationenaustauschers durchgeschickt oder hiermit behandelt. Dann wird das Harz mit verdünnter, alkalischer Lösung, z. B. wäßrigem Ammoniak, eluiert. Die L-Arginin enthaltenden Eluate werden vereinigt. Nach der Konzentrierung wird die Lösung mit Halogenwasserstoffsäure angesäuert, dann wird ein Alkanol, wie Methanol oder Äthanol, zu der Lösung hinzugegeben. Die ausgefällten Kristalle werden aus einem wäßrigen Alkanol, z. B. wäßrigem Methanol oder wäßrigem Äthanol, umkristallisiert, um reine Kristalle von L-Argininhydrohalogenid zu erhalten.

Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1

Ein wäßriges Nährmedium wird hergestellt, welches die folgenden Bestandteile enthält:

Gewichts-/ Volumprozent

L-Glutaminsäure 2

Glucose 8

ίο Harnstoff 0,5

Ammoniumchlorid 0,3

Maisquellflüssigkeit 0,7

Caseinhydrolysat 1,0

dibasisches Kaliumphosphat 0,2

Magnesiumsulfat 0,01

Dieses Medium wird auf den pH = 7,0 eingestellt. 30 ml des Mediums werden in eine 500-ml-Schüttelflasche gegeben und deren Bestandteile durch Autoklavbehandlung sterilisiert. Der Inhalt der Schleife ^ao einer !mpfnadel mit Bacillus subtilis ATCC 21 742 wird aseptisch in das Medium eingeimpft. Dann wird das Medium 72 Stunden bei 30⁰C unier Schütteln kultiviert. Das so erhaltene Fermentierungsmedium enthält 5,4 mg/ml !.-Arginin.

1000 ml des Fermentierungsmediums werden 10 Minuten auf 100°C erhitzt und dann filtriert. Das Filtrat wird in eine Säule (3 · 45 cm) eines Harzes eines starken Kationenaustauschers in der Η-Form eingeführt. Nach dem Waschen mit Wasser wird die Säule mit 5°/oigem wäßrigem Ammoniak eluiert. Die L-Arginin enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und auf etwa 20 ml konzentriert. Die Lösung wird mit Chlorwasserstoffsäure angesäuert. Dann werden 20 ml Methanol zu der Lösung hinzugegeben. Die ausfallenden Kristalle werden durcii Filtration gesammelt und aus wäßrigem Methanol umkristallisiert. Es werden 4,9 g L-Argininhydrochlorid erhalten; [<x]'S ■■= +22,6° (C =8; 6 N-HCl).

B e i s ρ i e 1 2

Es wurde ein wäßriges Nährmedium hergestellt, welches folgende Bestandteile umfaßt:

Gewichts-/
Volumprozent

Glucose 8

Harnstoff 1

Ammoniumsulfat 0,5

Maisquellflüssigkeit 0,7

Pepton 1

dibasisches Kaliumphosphat 0,2

Magnesiumsulfat 0,01

Calciumcarbonat 2

Dieses Medium wird auf pH = 7,0 eingestellt. 30 ml des Mediums werden in eine 500-ml-Schüttelflasche eingefüllt und deren Inhalt durch Autoklavbehandlung sterilisiert. Der Inhalt einer Schleife einer Impfnadel mit Bacillus subtilis ATCC 21742 wird aseptisch in das Medium eingeimpft. Dann wird das Medium 72 Stunden bei 30⁰C unter Schütteln kultiviert. Das so erhaltene Fermentierungsmedium enthält 3,5 mg/ml L-Arginin.

Beispiel 3

Es wird ein wäßriges Nährmedium hergestellt, welches folgende Bestandteile umfaßt:

5 6

Gewichts-/ Dieses Medium wird auf pH = 7,0 eingestellt.

Volumprozent _{30 m}, _{des Mediums wer}den in eine 500-mI-Schütlel-

Glucose 8 flasche eingefüllt und deren Inhalt durch Autoklav-

L-Glutaminsäure 2,5 behandlung sterilisiert. Der Inhalt einer Schleife einer

Ammoniumchlorid 2,5 5 Impfnadel mit Bacillus subtilis ATCC 21 742 wird

dibasisches Kaliumphosphat 0,35 aseptisch in das Medium eingeimpft. Dann wird das

monobasisches Kaliumphosphat 0,15 Medium 48 Stunden bei 30⁰C unter Schütteln kulti-

Magnesiumsulfat 0,05 viert. Das so erhaltene Fermentierungsmedium ent-

Eisen(!I)-sulfat 0,001 hält 12,3 mg/ml L-Arginin.

Mangansulfai 0,001 io

Calciumcarbonat 2

Biotin 20 μg/l

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Arginin durch aerobes Züchten eines Bacillus in einem Nährmedium bei hierfür üblichen Temperaturen und pH-Werten und durch Isolierung des L-Arginins in an sich bekannter Weise, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bacillus den Bacillus subtilis ATCC 21742 in einem üblichen Nähnnedium einsetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung in Anwesenheit von 1 bis 5 Gewichte/Volumprozent l- oder DL-Glutaminsäure als zusätzlichen Bestandteilen des Nährmediums durchführt.