DE2531999C3

DE2531999C3 - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin

Info

Publication number: DE2531999C3
Application number: DE2531999A
Authority: DE
Inventors: Shinichiro Hamada; Keiichi Inuzuka
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1974-07-17
Filing date: 1975-07-17
Publication date: 1979-09-27
Also published as: CA1054544A; NL7508597A; DE2531999B2; NL161502B; GB1501183A; IT1039864B; FR2278764B1; US3959075A; JPS579797B2; JPS5112991A; DE2531999A1; NL161502C; FR2278764A1; AU8314675A

Description

L-Lysin ist eine essentielle Aminosäure, für die in der Nahrungsmittelindustrie und Futtermittelindustrie ein großer Bedarf besteht. Die Herstellung von L-Lysin auf biotechnischem Wege ist bekannt. Im allgemeinen werden dabei Mutanten von coryneformen Glutaminsäure bildenden Bakterien, beispielsweise Corynebacterium glutamicum, eingesetzt

Die coryneformen Glutaminsäure bildenden Bakterien sind bekannt Es handelt sich um elliptische kugelförmige bis runde Stäbchen, die gram-positiv, nicht spurulierend und unbeweglich sind, Biotin benötigen und große Mengen an L-GIutaminsäure bilden.

Eine Anzahl von coryneformen Glutaminsäure bildenden Bakterien ist aus der Literatur bekannt Sie werden je nach der Ansicht der Taxonomen, die die Untersuchungen an den Bakterien durchführten, folgendermaßen klassifiziert:

Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium aminogenes, Brevibacterium divaricatum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium roseum, Brevibacterium saccharolyticum, Brevibacterium immariphilium, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium herculis, Corynebacterium Iiiium, Corynebacterium callunae, Microbacterium ammoniaphilum und Arthrobacter sp.

Nach A b e et al, J. General and Applied Microbiology, Bd. 13 (1967), S. 279-301, sind diese Mikroorganismen taxonomisch sehr nahe miteinander verwandt Die coryneformen Glutaminsäure bildenden Bakterien werden durch Corynebacterium glutamicum dargestellt

Die L-Lysin bildenden Mutanten der coryneformen Glutaminsäure bildenden Bakterien sind im allgemeinen dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens eine der nachstehend aufgeführten beiden Eigenschaften haben, die von einer Genmutation herrühren.

Eine dieser Eigenschaften ist die vollständige oder unvollständige Blockade des biosynthetischen Weges zur Bildung verwandter Aminosäuren. Diese Eigenschaft wird erkannt als Bedarf für verwandte Aminosäuren, wie L-Homoserin, L-Threonin, L-Methionin, L-Leucin oder L-Isoleucin, oder als Empfindlichkeit gegenüber L-Threonin oder L-Methionin. Die andere Eigenschaft ist die vollständige oder unvollständige Abweichung der Rückkopplungssteuerungen durch verwandte Aminosäuren. Diese Eigenschaft wird erkannt als Beständigkeit gegenüber verwandten Aminosäuren, wie L-Lysin oder L-Threonin, oder ihren Analogen, wie S-(2-Aminoäthyl)-L-cystein.

Die Produktivität der L-Lysin bildenden Mutanten mit den vorgenannten Eigenschaften wird durch Vereinigung weiterer genetischer Mutationen verbessert, beispielsweise hinsichtlich des Bedarfs an Aminosäuren, wie L-Valin, L-Tyrosin, oder Vitaminen, wie Thiamin oder Vitamin B12, und Purinbasen, wie Adenin oder Guanin.

Die Produktivität dieser Mutanten zur Bildung von L-Lysin wird ebenfalls verbessert durch Vereinigung anderer als der vorgenannten genetischen Mutationen, beispielsweise hinsichtlich der Resistenz gegenüber Aminosäuren, wie L-Isoleucin, oder ihrer Analogen, wie 2-Amino-3-methyIthiobuttersäure, und Antibiotica, wie Penicillin G oder Polymixin B.

Spezielle Beispiele für bevorzugte L-Lysin bildende Mutanten sind folgende bei der ARS Kultursammlung hinterlegte Mikroorganismen:

Micrococcus glutamicus NRRL B-H 124 und NRRL B-II 125, Brevibacterium flavum NRRL B-II 130, NRRLB-H 131, NRRL B-H 132, NRRLB-Il 126,NRRLB-H 127, NRRLB-Il 128 und NRRL B-H 129 sowie Corynebacteriumglutamicum NRRL B-11 135, NRRLB-H 136, NRRL B-H 145, NRRL BlI 146,NRRLB-H 147, NRRLB-H 148,NRRLB-H 149 und NRRLB-Il 150.

10

Die meisten dieser Mutanten sind in den US-PS 29 79 439, 36 16 218, 36 87 810, 37 1)7 441 und 37 08 395 sowie der GB-PS11 86 988 beschrieben.

Zur Herstellung von L-Lysin unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Stämme werden diese Stämme aerob in einem Nährmedium gezüchtet, das assimilierbare Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Verbindungen und andere Nährstoffe enthält

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes biotechnisches Verfahren zur Herstellung von L-Lysin unter Verwendung von L-Lysin bildenden Mutanten von coryneformen, Glutaminsäure bildenden Bakterien zu schaffen. Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem überraschenden Befund, daß durch Zusatz einer Kulturbrühe bestimmter L-Leucin bildender Mu tan te zum Nährmedium die Ausbeute an L-Lysin erheblich gesteigert wird. Dieser Effekt ist größer als bei Zusatz von L-Leucin zu.n Nährmedium in einer Menge, die der in der Kulturbrühe enthaltenen L Leucinmenge entspricht Es wurde ferner festgestellt, daß dieser Effekt nicht nur bei L-Lysin bildenden Stär-men auftritt, die einen L-Leucin-Bedarf haben, sondern auch bei solchen L-Lysin bildenden Stämmen, die die verschiedensten Eigenschaften besitzen.

Die Erfindung betrifft somit den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Die Herstellung von L-Leucin auf biotechnischem Wege ist bekannt Ebenso wie bei den L-Lysin bildenden Mutanten haben die L-Leucin bildenden Mutanten im allgemeinen mindestens eine der folgenden Eigenschaften, nämlich einen Bedarf an verwandten Aminosäuren, wie L-Isoleucin, L-Methionin oder L-Valin, und eine Resistenz gegenüber verwandten Aminosäuren, wie L-Leucin und ihren Analogen, wie «-Aminobuttersäure, herrührend von der vollständigen oder unvollständigen Blockade des biosynthetischen Sytheseweges und der vollständigen oder unvollständigen Abweichung von Rückkopplungssteuerungen. Die Produktivität dieser Stämme zur Bildung von L-Leucin wird verbessert durch Vereinigung anderer als der vorstehend beschriebenen Eigenschaften, beispielsweise einem Bedarf an Aminosäuren, wie L-Phenylalanin. Die Produktivität wird ferner verbessert durch Vereinigung der Resistenz gegenüber Aminosäuren, wie L-Lysin oder L-Histidin, und ihren Analogen, wie S-(2-Aminoäthyl)-L-cystein oder 2-Thiazolalanin.

Bevorzugte L-Leucin bildende Mutanten sind

Brevibacterium flavum NRRL B-12 133, Brevibacterium lactofermentum NRRL B-H 134, Corynebacterium glutamicum NRRL B-II 137

bis 11 144,

NRRL BlI 151 und NRRL B-II 152 sowie Corynebacterim acetoacidophilum NRRL B-II 153.

Einige der vorgenannten Stämme sind in der JA-OS 101 589/74 beschrieben.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren läßt sich die L-Lysinausbeute dadurch erheblich verbessern, daß man bestimmte L-Lysin bildende Mutanten in einem Nährmedium züchtet, das durch die Kulturbrühe von bestimmten L-Leucin bildenden Mutanten ergänzt wird. Der Mechanismus ist unbekannt Es ist bekannt, d^:<: Produktivität der L-Lysin bildenden Stämme durch Zusatz verschiedener Aminosäuren zu verbessern. Wie * vorstehend bereits beschrieben wurde, beruht die Wirkung des Zusatzes der Kulturbrühe der L-Leucin bildenden Mutanten nicht auf dem in der Kulturbrühe vorhandenen L-Leucin. Die Kulturbrühe der L-Leucin bildenGen Mutanten enthält neben L-Leucin noch andere Aminosäuren, doch kann die Wirkung des Zusatzes der Kulturbrühe nicht diesen Aminosäuren zugeschrieben werden. Dies wird nachstehend näher erläutert

Im erfindungsgemäßen Verfahren kann entweder ein synthetisches oder ein natürliches Nährmedium verwendet werden, sofern es die für den jeweils eingesetzten Stamm erforderlichen assimilierbaren Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Verbindungen und andere wachstumsfördernde Substanzen enthält

Je nach der Art des eingesetzten Mikroorganismus kommen als Kohlenstoffquellen Kohlenhydrate, wie Glucose, Fructose, Sorbit, Mannit, Glycerin, Stärke, Stärkehydrolysate, Melasse, Zuckerrübenmelasse, Carbonsäuren, wie Essigsäure, Fumarsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Bernsteinsäure, und Alkohole, wie Methanoi oder Äthanol, in Frage. Bevorzugt sind in der Praxis Melasse, Zuckerrübenmelasse, Essigsäure und Glucose.

Als Stickstoffquellen können Ammoniak, organische und anorganische Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat, Ammoniumacetat oder Ammoniumphosphat, stickstoffhaltige Verbindungen, wie Harnstoff, Pepion, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisqueliwasser, Caseinhydrolysate Fischmehl, abgebautes Fischmehl, entfettetes Sojabohrionmehl, abgebautes entfettetes Sojabohnenmehl oder Produkte der Säurehydrolyse von Sojabohnenprotein, verwendet werden.

Spezielle Beispiele für verwendbare anorganische Verbindungen sind Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisen(II)-sulfat, Mangarsulfat und Calciumcarbonat.

Wenn die verfahrensgemäß eingesetzten L-Lysin bildenden Mutanten einen Nährstoffbedarf an Aminosäuren, Vitamine oder Purinbasen haben, muß dem Nährmedium natürlich dieser Nährstoff in der entsprechenden Menge zugesetzt werden. Beispielsweise benötigen die coryneformen Glutaminsäure bildenden Bakterien und somit auch deren L-Lysin bildende Mutanten zum Wachstum Biotin. Das Nährmedium muß daher auch Biotin in entsprechender Menge enthalten.

Die Erhöhung der L-Lysin-Ausbeute im erfindungsgemäßen Verfahren wird durch Zusatz der Kulturbrühe A erreicht, die bei der Züchtung einer L-Leucin bildenden Mutante erhalten wird. Die Kulturbrühe A kann dem L-Lysinfermentationsmedium entweder unmittelbar oder nach der Abtrennung der Mikroorganismen zugesetzt werden. In beiden Fällen muß natürlich die Kulturbrühe A oder dessen Filtrat sterilisiert werden, bevor es im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird.

Die Zur Ergänzung des Nährmediums für die

L-Lysinbildung erforderliche Menge an Kulturbrühe A hängt von der Art der Mikroorganismen und der Zusammensetzung der Nährmedien bei der L-Lysin- und L-Leucinproduktion ab. Vorzugsweise enthält das L-Lysinfermentationsmedium die Kulturbrühe A in einer Menge von 2 bis 150ml/Uter, bezogen auf das Volumen des Nährmediums der L-Lysinfermentation. Die optimalen Mengen können durch einfache Vorversuche bestimmt werden.

Die Kulturbrühe A kann dem Nährmedium insgesamt zu Beginn oder in Anteilen während der Fermentation zugesetzt werden. Im letztgenannten Fall kann die Kulturbrühe A auf-einmal, absatzweise oder kontinuierlich eingespeist werden. Vorzugsweise ist die Zufuhr der Kulturbrühe A bis zum Ende der log-Phase, d.h. der exponentiellen Wachstumsphase, beendet. Im allgemeinen ist die log-Phase nach 10 bis 24 Stunden nach Beginn der Züchtung beendet

Die Fermentation der L-Lysin bildenden Mutanten wird unter den üblichen Bedingungen durchgeführt, d. h. unter aeroben Bedingungen, beispielsweise unter Belüftung und Rühren oder unter Schütteln bei Temperaturen von 25 bis 40° C und pH-Wei ten von 6 bis 8,5. Im allgemeinen hat sich nach 30 bis 150 Stunden eine beträchtliche Menge an L-Lysin im Nährmedium angesammelt. Nach beendeter Züchtung wird das L-Lysin nach üblichen Methoden isoliert und gereinigt, beispielsweise durch Behandlung mit einem lonenaustauscherharz und durch Umkristallisation.

Die Kulturbrühe für die L-Leucin bildende Mutante jo wird nach üblichen Methoden hergestellt. Es kann jede L-Leucin bildende Mutante von coryneformen Glutaminsäure bildenden Bakterien mit den vorstehend beschriebene Eigenschaften zur Herstellung der Kulturbrühe verwendet werden. Ebenso wie bei der L-Lysinfermentation kann entwder ein synthetisches oder ein natürliches Nährmedium auch bei der L-Leucinfermentation eingesetzt werden, sofern es die zum Wachstum des Mikroorganismus erforderlichen Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische -"> Verbindungen und andere Nährstoffe enthält. Es können die gleichen Verbindungen verwendet werden, wie bei der L-Lysinfermentation. In der Praxis sind als Kohlenstoffquellen Melasse, Zuckerrübenmelasse, Essigsäure und Glucose bevor&igt Sofern die Stämme einen speziellen Nährstoffbedarf haben, müssen diese Nährstoffe natürlich im Nährmedium vorhanden sein. Die Züchtung der L-Leucin bildenden Mutanten wird ebenfalls unter übüchen Bedingungen durchgeführt, im allgemeinen unter aeroben Bedingungen, beispielsweise unter Belüftung und Rühren oder als Schüttelkultur bei Temperaturen von 25 bis 40"C, pH-Werten von 6 bis .9 und während eines Zeitraums von 48 bis 120 Stunden.

Die nachstehenden Versuchsbeispiele erläutern die Bestimmung des bevorzugten Bereiches der Menge an Kulturbrühe A der L-Leucin bildenden Mutante, die dem L-Lysinfermentationsmedium zuzusetzen ist.

Versuchsbeispiel 1

Aus folgenden Bestandteilen wird ein Basalmedium ^Wl hergestellt:

Glucose
(NH₄J₂SO₄
KH₂PO₄
MgSO₄ · 7 H-O
FeSO₄ - 7 H₂O
MnSO₄ · 4 H₂O

150 g/l

40 g/l I g/l 0,4 g/: 0.01 g/l 6 mg/1

Biotin	300 jV\|
Thiamin-HCI	200 γΐ\
Säurehydrolysat von
Sojabohnenprotein	Ig/l
CaCO₃	5 g/l
L-Threonin	600 j>/ml
DL-Methionin	200y/ml

Der pH-Wert des Basalmediums betragt vor dem Sterilisieren 7,4.

Durch Zusatz einer Kulturbrühe eines L-Leucin bildenden Stammes mit einer Leucinkonzentration von 15,6 g/Liter zum Basalmedium in unterschiedlichen Mengen werden 6 Nährmedien hergestellt Brevibacterium flavum NRRL B-Il 127 wird in lOml-Anteile des Basalmediums sowie die erhaltenen 6 Nährmedien in 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben überimpft und 110 Stunden bei 28°C unter Schütteln gezüchtet Nach beendeter Züchtung werden öl:· L-Lysin-Ausbeute und das Wachsum der Zellen bestimmt Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt

Tabelle I	Ausbeute an	Wachstum
Konzentration der ein	L-Lysin	der Zellen
gesetzten Kulturbrühe
des L-Leucin		g/l Trocken
bildenden Stammes	g/l	zellen
ml/1	32	9,8
0	40	10,9
2	48	12,5
5	55	13,8
IO	60	15,3
20	59	14,7
40	56	13,5
60

Die Kulturbrühe des L-Leucin bildenden Stammes, wird folgendermaßen hergestellt:

Corynebacterium giutamicum NRRL B-Il 151 wird in 3 Liter eines Einsaatmediums in einem 5 Liter fassenden Fermenter überimpft. Das Einsaatmedium hat folgende Zusammensetzung:

D-Glucose

Pepton

Hefeextrakt Maisquellwasser

NaCI

Harnstoff

Biotin

50 g/l

10 g/l

5 g/I

23 g/l

3 g/l

50y/l

Der pH-Wert des Einsaatmediums beträgt vor dem Sterilisieren 72.

Die Züchtung wird 18 Stunden bei 30⁰C, einer Belüftungsgeschwindigkeit von 3 Liter/min und einer Rührgeschwindigkeit von 600 U/min durchgeführt

1 Liter de^r erhaltenen Einsaatkultur wird in 10 Liter eines Hauptfermentationsmediums in einem 30 Liter fassenden Fermenter überimpft Das Hauptfermentationsmedium hat folgende Zusammensetzung:

Ammoniumacetat KH₂PO₄ MgSO₄ ■ 7 H₂O FeSO₄ · 7 H₂O MnSO₄ ■ 4 H₂O Biotin

5,0 g/l 2,0 g/l 0,5 g/l 0,1 g/l 0,01 g/I 50y/l

Der pH-Wert des Hauptfermentationsmediums beträgt vor dem Sterilisieren 7,4.

Die Züchtung wird 60 Stunden bei 30⁰C, einer Belüftungsgeschwindigkeit von 10 Liter/min und einer Rührgeschwindigkeit von 400 U/min durchgeführt. >

3 Stunden nach Beginn der Züchtung werden innerhalb 56 Stunden 10 Liter eines Gemisches aus 71 g/Liter Ammoniumacetat und 380 g/Liter Essigsäure kontinuierlich eingespeist. Dabei wird der pH-Wert des Mediums bei 6,8 und die Essigsäurekonzentration bei 1,2 in bis 18 g/Liter gehalten. Nach beendeter Züchtung enthält die Kulturbrühe 15,6 g/Liter L-Leucin.

Versuchsbeispiel 2

Versuchsbeispiel 1 wird wiederholt, jedoch wird r> Corynebacterium glutamicum NRRL B-Il 148 als L-Lysin bildender Stamm verwendet. Die Kulturbrühe des L-Leucin bildenden Stammes wird in den in Tabelle Il angegebenen Mengen eingesetzt. Die Ergebnisse sind ebenfalls in dieser Tabelle zusammengefaßt.

Tabelle Il	Ausbeute an	Wachstum
Konzentration der zu	L-Lysin	der Zellen
gesetzten Kulturbrühe
des L-Lcucin		g/l Trocken
bildenden Stammes	g/l	zellen
ml/Liter	30	9,0
0	37	10.1
2	48	12,6
5	56	13,5
10	62	14,9
20	58	14,4
40	55	14,0
60	53	13,8
80	54	13,3
100	52	13,5
150

Beispiel 1

Corynebacterium glutamicum NRRL B-Il 145 wird als L-Lysin bildender Stamm in 330 ml eines Einsaatmediums in einem 2 Liter fassenden Erlenmeyerkolben überimpft und 24 Stunden bei 28°C unter Schütteln gezüchtet. Das Einsaatmedium hat folgende Zusammensetzung:

D-Glucose

KH2PO4

K₂HPO₄

Harnstoff

MgSO₄ - 7 H₂O

Pepton

Fleischextrakt

Biotin

40 g/l
0,5 g/l
13 g/l
3 g/l
03 g/l

20 g/l
5 g/l

50y/l

Der pH-Wert des Einsaatmediums beträgt vor dem ω Sterilisieren 7,2.

Es werden 5 Medien folgender Zusammensetzung hergestellt:

Medium A-I:

Zuckerrübenmelasse

MgSO₄ - 7 H₂O

150 g/l
(als Glucose)
03 g/l

65

KH2PO4	0.7 g/l
Harnstoff	3 g/l
Säurehydrolysat von
Sojabohnenprotein	20 g/l

Der pH-Wert des Mediums beträgt vor dem Sterilisie ren 7,4.

Medium A-2:

Medium A-I + 13 ml/Liter einer Kulturbrüh« eines L-Leucin bildenden Stammes mit 15.0 g/Liter L-Leucin

Medium A-3:

Medium A-I + 200 mg/Liter L-Leucin

Medium A-4:

eines L-Glutaminsäure bildenden Stammes mii 60 g/Liter L-Glutaminsäure

Medium A-5:

Medium A-I + 13 ml/Liter der Kulturbrühe de L-Glutaminsäure bildenden Stammes von Mediurr A-4 + 200 mg/Liter L-Leucin.

Jeweils 1 L ^;*er der erhaltenen Einsaatkultur wird in K Liter der vorstehend beschriebenen 5 Medien in 30 Liter fassenden Fermentern überimpft. Die Züchtung wird 4f Stunden bei 28⁰C, einer Belüftungsgeschwindigkeit von 10 Liter/min und einer Rührgeschwindigkeit von 400 U/min durchgeführt. Während der Züchtung wire der pH-Wert des Mediums mit 22%iger wäßriger Ammoniaklösung bei 6,8 gehalten. Nach beendeter Züchtung werden die Kulturflüssigkeiten auf ihren L-Lysingehalt analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt.

Tabelle III

Medium Zusatz

Ausbeuten an L-Lysin

g/l

A-I - 40

A-2 Kulturflüssigkeit des L-Leucin 55

produzierenden Stammes

"'" A-3 L-Leucin 44

A-4 Kulturflüssigkeit des L-Glut- 40

aminsäure produzierenden

Stammes

A-5 Kulturflüssigkeit + L-Leucin 46

Die Kulturbrühe des L-Leucin und L-Glutaminsaur« bildenden Stammes wird folgendermaßen hergestellt:

a) Herstellung der Kulturbrühe des L-Leucin
bildenden Stammes

Brevibacterium lactofermentum NRRL B-11 134 (ein L-Leucin bildender Stamm) wird in 3 Liter eines Einsaatmediums in einem 5 Liter fassenden Fermenter überimpft und 18 Stunden bei 30° C, einer Belüftungsgeschwindigkeit von 3 Liter/min und einer Rührgeschwindigkeit von 600 U/min gezüchtet Das Einsaatmedium hat folgende Zusammensetzung:

IO

D-Glucose

Pepton

Hefeexirak·

Maisquellwasser

NaCI

Harnstoff

Biotin

50g/l

10g/l

5g/l

2,5 g/l

3g/l

50y/l

Schütteln gezüchtet. Das Einsaatmedium hat folgende Zusammensetzung:

Natriumacetat
Pepton

Fleischextrakt
NaCI

10 g/l
10 g/l
5 g/l
2,5 g/l

Der pH-Wert des Einsaatmediums beträgt vor dem Sterilisieren 7,2. I Liter der erhaltenen Einsaatkultur wird in 10 Liter eines Hauptfermentationsmediums in einem 30 Liter fassenden Fermenter überimpft. Das Hauptfermentationsmedium hat folgende Zusammensetzung:

Der pH-Wert des Einsaatmediums beträgt vor dem Sterilisieren 7,0. 300 ml der erhaltenen Einsaatkultur werden in 3 Liter eines Hauptfermentationsmediums in einem 5 Liter fassenden Fermenter überimpft. Das Hauptfermentationsmedium hat folgende Zusammensetzung:

Ammoniumacetat	15 g/l	ι >	Ammoniumacetat	20 g/l
KH₂PO₄	2,0 g/l			(als Essigsäure)
MgSO₄ · 7 H₂O	0,5 g/l		KH₂PO₄	I g/l
FeSO₄ · 7 H₂O	0,1 g/l		K₂HPO₄	lg/1
MnSO₄ · 4 H₂O	Λ Λ4 — Ii U₁UI g/1		U-ΡΛ 7 Il Λ IVIgJV/4 * I I VlKJ	η e ~/l v/,j ₆i ι
Biotin	50y/l	H)	MnSO₄ · 4 H₂O	10mg/l
Thiamin · hydrochlorid	100 mg/1		FeSO₄ · 7 H₂O	10mg/l
*Ii iif . l__ ta » ^ _**		Thiamin · Hydrochlorid	5y/l

trägt vor dem Sterilisieren 7,4. Die Züchtung wird 60 Stunden bei 30° C, einer Belüftungsgeschwindigkeit von IO Liter/min und einer Rührgeschwindigkeit von 400 >^r> U/min durchgeführt. Der pH-Wert wird mit 60%iger wäßriger Essigsäure auf 6,8 eingestellt. 7 Stunden nach Beginn der Züchtung werden dem Medium stündlich während 50 Stunden jeweils 70-ml-Anteile einer wäHrigen Lösung zugegeben, die 11 g Ammoniumacetat m enthält. Während der Züchtung wird die Essigsäurekonzentration im Medium auf einen Wert von 1,2 bis 18 g gehalten. Nach beendeter Züchtung beträgt die L-Leucinkonzentration in der Kulturbrühe 15,0 g/Liter.

b) Herstellung der Kulturbrühe des L-Glutaminsäure bildenden Stammes

Arthrobacter paraffineus ATCC 15591 (ein L-Glutaminsäure bildender Stamm) wird in 300 ml eines Einsaatmediums in einem 2 Liter fassenden Erlenmeyer- 4< > kolben überimpft und 24 Stunden bei 30° C unter

Tabelle IV

Der pH-Wert des Hauptfermentationsmediums beträgt vor dem Sterilisieren 7,0. Die Züchtung wird 3 Tage bei 30⁰C, einer Belüftungsgeschwindigkeit von 3 Liter/min und einer Rührgeschwindigkeit von 600 U/min durchgeführt. Während der Züchtung wird das Medium mit 1 Liter einer wäßrigen Lösung versetzt, die durch Zusatz von 3 Gewichtsteilen Wasser zu einem Gemisch von 70 Gewichtsteilen Eisessig und 27 Gewichtsteilen 22%iger wäßriger Ammoniaklösung hergestellt wurde. Der pH-Wert des Mediums wird auf einen Wert von 4 bis 9 eingestellt. Die Zufuhr der wäßrigen Lösung ist 2 Stunden vor Beendigung der Züchtung beendet. Nach Beendigung der Züchtung haben sich in der Kulturbrühe 60 g/Liter L-Glutaminsäure angesammelt

Das vorstehend verwendete Medium A-2 enthält Aminosäuren aus der Kulturbrühe, ein Säurehydrolysat von Sojabohnenprotein und Zuckerrübenmelasse in de.·, in Tabelle IV angegebenen Mengen.

Aminosäure Mengen der Aminosäure, mg/1

Aus der Kulturbrühe Aus Säurehydrolysat von Aus Zucker-

Sojabohnenprotein hergestellt rübenmelasse

hergestellt

99,0
278

7,5 (als
Hydrochlorid)

3,0
7,5
9,0

13,5 (als
Hydrochlorid)

	des L-Leucin produ	Sojat
	zierenden Stammes
	hergestellt
Alanin	6,37	176
Asparaginsäure	-	967
Arginin	—	546
Cystin	—	_
Glycin	4,81	332
Glutaminsäure	12,6	1570
Histidin	—	242
Isoleucin	5,85	284
Leucin	195	586
Lysin	5,2	550
Methionin	—	98

Fortsetzung

Aminosäure Mengen der Aminosäure, mg/1

Aus der Kulturbrühc Aus Säurehydrolysat von Aus Zucker-

des L-Leucin produ- Sojabohnenprolein hergestellt rübenmelasse zierenden Stammes hergestellt

hergestellt

Phenylalanin -

Prolin -

Serin -

Threonin -

Tryptophan -

Tyrosin -

Valin -

Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß die in der Kulturbrühe des L-Leucin bildenden Stammes enthaltenen Aminosäuremengen sehr gering sind im Vergleich zu den Mengen Aminosäuren, die im Säurehydrolysat von Sojabohnenprotein oder Zuckerrübenmelasse enthalten sind. Daraus ist ersichtlich, daß die in der Kulturbrühe der L-Leucin bildenden Mutante enthalte- 2> nen Aminosäuren keine zusätzlichen Wirkungen bei der Bildung von L-Lysin entfalten. Die Versuche lassen den Schluß zu, daß die Wirkung des Zusatzes der Kulturbrühe des L-Leucin bildenden Stammes nicht auf seinem Gehalt an Aminosäuren beruht. jo

Beispiel 2

In diesem Beispiel werden vier verschiedene Nährmedien folgender Zusammensetzung hergestellt:

Medium B-I: ^J>

D-Glucose 150 g/l

(NH₄J₂SO₄ 40 g/l KH₂PO₄ 1 g/l

MgSO₄ ■ 7 H₂O 0,4 g/l

FeSO₄ · 7 H₂O 0,01 g/1

MnSO₄ · 4 H₂O ö mg/i

Biotin 300 y/1

Thiamin · Hydrochlorid 200 yl\ Säurehydrolysat von

Sojabohnenprotein 1 g/l

CaCO₃ 5 g/l

L-Threonin 600 y/ml

DL-Methionin 200 y/ml

12,0

52,5
52,5
7,5
13,5
48

kolben überimpft und 110 Stunden bei 8O⁰C unter 2» Schütteln gezüchtet. Nach beendeter Züchtung wird die L-Lysinkonzentration bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle V angegeben.

Der pH-Wert des Mediums beträgt vor dem Sterilisieren 7,4.

Medium B-2:

Medium B-I +20 ml/Liter der gemäß Versuchsbeispiel 1 hergestellten Kuturbrühe mit 15,6 g/Liter L-Leucin.

Medium B-3:

Medium B-I +320 mg/Liter L-Leucin

Medium B-4:

Medium B-I +1 g/Liter Säurehydrolysat von Sojabohnenprotein.

Brevibacterium NRRL B-Il 127 (ein L-Lysin badender Stamm) wird in 10-ml-Anteilen in die vorstehend beschriebenen Medien in 250 ml fassenden Erlenmeyer-

Tabelle V	Zusatz	Ausbeute
Medium		an L-Lysin,
		mg/1
	-	32
B-I	Kulturbrühe des L-Leucin	60
B-2	produzierenden Stammes
	L-Leucin	35
B-3	Säurehvdrolvsat von Soia-	46
B-4

bohnenprotein

Beispiel 3

In diesem Beispiel werden als L-Lysin bildende Stämme Corynebacterium glutamicum NRRL 3-11 148, orcvioacicriuni navun) Nimm-. d-\ 1 1^0 uiiu vXn'jriicuaC-terium glutamicum NRRL B-Il 150 verwendet. Diese Stämme werden in jeweils 40 ml eines Einsaatmediums in 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben überimpft und 24 Stunden bei 28° C unter Schütteln gezüchtet

Das Einsaatmedium hat folgende Zusammensetzung:

D-Glucose

NaCl

Harnstoff

Pepton

Hefeextrakt

Maisquellwasser

Biotin

50 g/l
2,5 g/I
3 g/l

10 g/l

iög/i
5 g/l

50y/l

Der pH-Wert des Einsaatmediums beträgt vor dem Sterilisieren 7,2.

Es werden 3 Nährmedien folgender Zusammensetzunghergestellt:

Medium C-I:	100 g/l
Zuckerrübenmelasse	(als Glucose)
	0,5 g/l
KH₂PO₄	0,5 g/l
MgSO₄(Anhydrid)	33 g/l
(NH₄J₂SO₄
Säurehydrolysat von	20 g/l
Sojabohnenprotein

25 3\

Der pH-Wert des Mediums beträgt vor dem Sterilisieren 7,4.

Medium C-2:

Medium C-I+ml/Liter der gemäß Beispiel 1 hergestellten Kuturbrühe mit 15,0 g/Liter L-Leucin.

Tabelle Vl

Medium C-3:

Medium C-I +300 mg/Liter L-Leucin.

Die Versuchsbedingungen und die Ergebnisse der Züchtung in diesen Medien sind in Tabelle VI zusammengefaßt.

Stamm

Medium

Zusatz

L-Lysin-Ausbeute

g/Liter

Corynebacterium
eliitamicum
NRRL B-Il 148

Brevibacterium

flavum

NRRL B-Il 128

C-I	—	27,0
C-2	Kulturbnihe des L-Leucin produzie renden Stammes	32.0
C-3	L-Leucin	27,2
C-I	-	26,1
C-2	Kullurbrühe des L-Leucin produzie renden Stammes	28,7
C-3	L-Leucin	26,0

Corynebacterium
glutamicum
NRRL B-Il 150

C-I

C-2

C-3

Medium E-2:

Medium E-I + 12 mi/Liter einer Kuiturbrühe mit 15,8 g/Liter L-Leucin.

Medium E-3:

Medium E-I +200 mg/Liter L-Leucin.

Jeweils 1 Liter der Einsaatkultur wird in 10 Liter der vorgenannten 3 Medien in einem 30 Liter fassenden Fermenter überimpft- Die Züchtung wird 48 Stunden bei 28° C, einer Belüftungsgeschwindigkeit von 10 Liter/min und einer Rührgeschwindigkeit von 400 U/min durchgeführt. Während der Züchtung wird der pH-Wert des Mediums mit 22%iger wäßriger Ammoniaklösung bei 6,8 gehalten. Nach beendeter Züchtung wird die L-Lysinkonzentration bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VII zusammengefaßt.

Kulturbrühe des
L-Leucin produzierenden Stammes

L-Leucin

Beispiel 4

Gemäß Beispiel 1 wird Corynebacterium glutamicum NRRL B-Il 145 (ein L-Lysin bildender Stamm) in einer Einsaatkultur gezüchtet.

Es werden 3 verschiedene Nährmedien folgender Zusammensetzung hergestellt:

Medium E-I:

wie Medium A-I.

Tabelle VII

Medium Zusatz

27,8

30,5

26,8

50 i.Lysinkonzentration

g/Liter

E-I keiner 41

E-2 Kuiturbrühe des L-Leucin 57

bildenden Stammes

L-Leucir. 46

Die Kuturbrühe des L-Leucin bildenden Stammes wird folgendermaßen hergestellt:

Brevibacterium lactofermentum NRRL B-Il 134 (ein L-Leucin bildender Stamm) wird gemäß Beispiel 1 angezüchtet 1 Liter der Anzuchtkultur wird in 10 Liter eines Hauptfermentationsmediums in einem 30 Liter fassenden Fermenter überimpft Das Hauptfermenta-

bo tionsmedium hat folgende Zusammensetzung:

Zuckerrübenmelasse	150 g/l
	(als Glucose)
MgSO₄ - 7 H₂O	03 g/i
KH₂PO₄	0,7 g/l
(NH₄J₂SO₄	20 g/l

Die Züchtung wird 30 Stunden bei 30⁰C, einer Belüftungsgeschwindigkeit von 10 Liter/min und einer

Rührgeschwindigkeit von 400 U/min durchgeführt Der pH-Wert des Mediums wird mit 22%iger wäßriger Ammoniaklösung auf 63 eingestellt Nach beendeter Züchtung beträgt die L-Leucinkonzentration 153 g/Liter.

Beispiel 5

Beispiel 1 wird mit Corynebacterium glutamicum NRRL B-11 145 (ein L-Lysin bildender Stamm) wiederholt

Es werden 3 verschiedene Nährmedien folgender Zusammensetzung hergestellt:

Ammoniumacetat	15 g/l
KH₂PO₄	2,0 g/l
MgSO₄ - 7 H₂O	0,5 g/I
FeSO₄ · 7 H₂O	0,1 g/l
MnSO₄ · 4 H₂O	0,01 g/l
Biotin	50y/l
Thiamin · hydrochlorid	100 mg/I
Säurehydrolysat von
Sojabohnenprotein	20 g/l
Der pH-Wert des Mediums beträgt	vor dem Sterilisie-
ren 7,4.

Medium F-2:

Medium F-I+ 13 ml/Liter der gemäß Beispiel 5 hergestellten Kulturbrühe mit 15,8 g/Liter L-Leucin

Medium F-3:

Medium F-I +200 mg/Liter L-Leucin.

Jeweils 1 Liter der Anzuchtkultur wird in 10 Liter der vorgenannten 3 Nährmedien in einem 30 Liter fassenden Fermenter überimpft. Die Züchtung wird 62 Stunden bei 28° C einer Belüftungsgeschwindigkeit von 10 Liter/min und einer Rührgeschwindigkeit von 400 U/min durchgeführt. Der pH-Wert des Mediums wird mit 60%iger wäßriger Essigsäure bei 63 gehalten. 10 Stunden nach Beginn der Züchtung werden stündlich 50maI jeweils 70-ml-Anteile einer wäßrigen Lösung zugegeben, die 13 g Ammoniumacetat enthält Während der Züchtung wird die Essigsäurekonzentration im Medium auf einem Wert von 0,5 bis 15 g/Liter gehalten. Nach beendeter Züchtung wird die L-Lysinkonzentration bestimmt Die Ergebnisse sind in Tabelle VIII zusammengefaßt.

Tabelle	VIII	L-Lysin-
Medium	Zusatz	konzen-
		tration
		g/Liter
		32
F-I	keiner	48
F-2	Kulturbrühe des L-Leucin
	bildenden Stammes	35
F-3	L-Leucin

Beispiel 6

Beispiel 5 wiederholt, jedoch wird die gemäß Beispiel 1 hergestellte Kulturbrühe des L-Leucin bildenden Stammes eingesetzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IX zusammengefaßt.

Tabelle IX

Zusatz

L-Lysinkonzent ration

g/Liter

Keiner 30

Kulturbrühe des L-Leucin bildenden 49

Stammes

L-Leucin 34

Die in den US-PS 37 08 395, 37 07 441 und 36 16 218

beschriebenen Verfahren zur Herstellung von L-Lysin verwenden Mutanten mit speziellen Eigenschaften. Deshalb wird das erfindungsgemäße Verfahren mit den in den US-PS beschriebenen Verfahren so verglichen, daß die in den US-PS beschriebenen Mutanten in einem

λι Basalmedium gezüchtet und dieses Medium durch die Kulturbrühe einer L-Leucin bildenden Mutante ergänzt wird Sodann wird die Produktivität der Bildung von L-Lysin in beiden Medien verglichen. Zum Vergleich wird auch ein Basalmedium verwendet das durch

L-Leucin ergänzt ist

In dem in der US-PS 36 87 809 beschriebenen Verfahren zur Herstellung von L-Lysin wird ein Nährmedium verwendet, das durch L-Asparaginsäure ergänzt ist Deshalb wird das erfindungsgemäße Verfahren mit dem aus der US-PS 36 87 809 beschriebenen Verfahren so verglichen, daß eine L-Lysin bildende Muiante in einem Basalmedium gezüchtet wird, das durch L-Asparaginsäure ergänzt ist, und das Basalmedium durch die Kulturbrühe einer L-Leucin bildenden Mutante ergänzt ist, und die Produktivität der Bildung von L-Lyin in diesen Medien verglichen wird. Zum Vergleich wird die Fermentation in einem Basalmedium ohne irgendwelche Zusätze durchgeführt

I. US-PS 37 08 395 1.1 Es werden folgende Mutanten verwendet:

Corynebacterium glutamicum ATCC 21526,

ATCC 21543 und NRRL B-Il 149

sowie

Brevibacterium flavum NRRLB-II 129

1.2 Herstellung der Impfkultur

Eine Platinöse jeder Mutante aus einem Schrägagar wird in 10 ml des Impfmediums der nachstehend angegebenen Zusammensetzung in einem 50 ml fassenden Reagenzglas überimpft. Die Impfkultur wird durch 24stündiges Schütteln bei 30⁰C durchgeführt.

Zusammensetzung des Einsaatmediums:

Glucose	4 g/dl
Polypepton	2 g/dl
KH₂PO₄	0,15 g/dl
MgSO₄ ■ 7 H₂O	0,05 g/dl
Biotin	50y/l
Harnstoff	03 g/dl
Hefeextrakt	0.5 g/dl

Der pH-Wert des Impfmediums beträgt vor dem Sterilisieren 7,2.

909 639/321

13 Hauptkultur

13,1 Hauptfermentationsmedium: A-I Basalmedium Zusammensetzung:

Rohrzuckermelasse Sojabohnenproteinhydrolysat

KH^PO₄

MgSO₄ · 7 H₂O

Harnstoff

(NH₄J₂SO₄

CaCO₃

10 g/dl (als Glucose) lOOml/l 0,07 g/dl 0,05 g/dl 03 g/dl 0,5 g/dl 3g/dl Die Züchtung wird 60 Stunden bei 30" C und einer Lufteinleitungsgeschwindigkeit von 10|/min und einer Rührgeschwindigkeit von 400 U/min durchgeführt Der pH-Wert der Kulturbrühe wird mit 60prozentiger Essigsäure auf 6,8 eingestellt Während der 3. bis 56. Stunde nach Beginn der Züchtung werden insgesamt 10 Liter einer wäßrigen Lösung kontinuierlich eingespeist, die 71 g/l Ammoniumacetat und 380 g/I Essigsäure enthält Nach beendeter Züchtung sind in der Kulturbrü he 17,6 g/l L-Leucin enthalten.

20

Der pH-Wert vor dem Sterilisieren beträgt 7,5. A-2 Basalmedium+200 mg/I L-Leucin

A-3 Basalmedium+12 ml/l der Kulturbrühe einer L-Leucin bildenden Mutante.

13.2 Verfahren der Hauptzüchtung

1 ml der Impfkultur werden in 20 ml eines Hauptfermentationsmediums in einem 250 ml fassenden Erlenmeyer-KoIben überimpft und 96 Stunden bei 30⁰C unter Schütteln inkubiert

133 Herstellung der Kuturbrühe einer L-Leucin bildenden Mutante

Es wird die gleiche Kulturbrühe der L-Leucin jo bildenden Mutante als Vergleich mit den in den US-PS beschriebenen Verfahren verwendet

Corynebacterium glutamicum NRRL B-Il 151 (eine L-Leucin bildende Mutante) wird in 40 ml eines Impfmediums in einem 250 ml fassenden Kolben überimpft und 24 Stunden bei 28° C inkubiert

Das Impfmedium hat folgende Zusammensetzung: D-Glucose 5 g/dl

Pepton 1 g/dl

Hefeextrakt 1 g/dl Maisquellwasser 0,5 g/dl

NaCI 0,25 g/dl

Harnstoff 03 g/dl

Biotin 50 γ/\ f,

Der pH-Wert beträgt vor dem Sterilisieren 7,2.

6 ml der Impfkultur werden in 3 Liter eines Impfmediums der vorstehend beschriebenen Zusammensetzung in einem 5 Liter fassenden Fermenter überimpft und 18 Stunden bei 30⁰C bei einer Lufteinleitungsgeschwindigkeit von 3 l/min und einer Rührgeschwindigkeit von 600 U/min inkubiert. 1 Liter der erhaltenen Einsaatkultur wird in 10 Liter eines Hauptfermentationsmediums der nachstehend angegebenen Zusammensetzung in einem 30 Liter fassenden Fermenter überimpft.

Zusammensetzung des Hauptfermentationsmediums: Afnmoniumäcetät 03 g/dl

KH₂PO₄ 0,2 g/dl

2. US-PS 37 07 441 2.1 Es werden folgende Mutanten verwendet:

NRR-B-Il 130 ATCC 21491

MgSO₄	• 7H₂O	0,05 g/dl
FeSO₄ ■	7H₂O	0,01 g/dl
MnSO₄	-4H₂O	0,001 g/dl
Biotin		50y/l
Thiamin	• HCI	100 mg/1

Brevibacterium flavum Corynebacterium aceto-

glutamicum Microbacterium ammonia-

philum Micrococus glutamicus

ATCC 21 490 ATCC 21492

22 Herstellung der Impfkultur

Die Züchtung wird in gleicher Weise wie vorstehend unter 1.2 beschrieben durchgeführt

23 Hauptkultur

23.1 Hauptfermentationsmedium B-I Basalmedium

Zusammensetzung:	13g/dl
Rohrzuckermelasse	5,5 g/dl
(als Glucose)	25 ml/1
(NH₄J₂SO₄	0,1 ml/dl
Sojabohnenproteinhydrolysat	74g/dl
Antischaummittel
CaCO₃

pH-Wert vor dem Sterilisieren 8,0. B-2 Basalmedium + 200 mg/1 L- Leucin

B-3 Basalmeuium + 12 ml/I der Kulturbrühe einer L-Leucin bildenden Mutante

23.2 Verfahren der Hauptzüchtung

Die Züchtung wird in gleicher Weise wie vorstehend bei 13.2 durchgeführt.

3.US-PS36 16 218 3.1 Es werden folgende Mutanten verwendet:

Der pH-Wert beträgt vordem Sterilisieren 7,4.

Brevibacterium flavum Brevibacterium flavum Brevibacterium flavum

NRRLB-II 131 NRRLB-Il 132 ATCC 21 129

25 31	19	1	3708 395	J-	ATCC 21526	5	999	20
3.2 Herstellung der Impfkultur			^r			4. US-PS 36 87 809
Die Züchtung wird auf die gleiche Weise wie	-if					4.1 Als Mutante v/ird Brevibacterium flavum NRRL
vorstehend unter \2 beschrieben durchgeführt.			NRRL B-Il 149	10	B-11 130 als eine der im erfindungsgemäßen Verfahren
	k				eingesetzten L-Lysin bildenden Mutanten ausgewählt
33 Hauptkultur	fr			4.2 Herstellung der Impfkultur
33.1 Hauptfermentationsmedium		15	Die Züchtung wird auf die gleiche Weise wie unter \2
C-I Basalmedium	ATCC 21543		beschrieben durchgeführt.
Zusammensetzung:
			43 Hauptkultur
Glucose 10 g/dl (NH₄J₂SO₄ 4 g/dl	NRRLB-Il 129		43.1 Hauptfermentationsmedium
KH₂PO₄ 0,1 g/dl		20	D-I Basalmedium
MgSO₄ - 7 H₂O 0,04 g/dl
Biotin 300 y/1			Zusammensetzung:
Thiamin-HCl 200 y/I
FeSO₄ · 7 H₁O 10 mg/1			Rohrzuckermelasse
MnSO₄ · 4 H₂O 8 mg/1	25	(als Glucose) lOg/dl
CaCO₃ 5 g/dl		KH₂PO₄ 0,05 g/d!
		MgSO₄ - 7 H₂O 0,05 g/dl
Der pH-Wert beträgt vor dem Sterilisieren 7,5.		(NH₄J₂SO₄ 033 g/dl
		Sojabohnenproteinhydrolysat 100 ml/l
Bei der Züchtung des ATCC-Starnmes 21 128 werden	30	CaCO₃ 3 g/dl
dem Nährmedium ferner 0,6 mg/ml L-Threonin zuge
setzt, während bei der Züchtung des ATCC-Stammes		pH-Wert vor dem Sterilisieren 7,4.
21 129 0,2 mg/ml L-Methionin und 2 ml/1 Sojabohnen-
proteinhydrolysat einverleibt werden.	J5	D-2 Basalmedium + ( g/dl L-Asparaginsäure
C-2 Basalmedium+200 mg/1 L-Leuc-.i		D-3 Basalmedium + 12 ml/l Kulturbrühe einer L-Leucin
		bildenden Mutante.
C-3 Basalmedium+ 12 ml/1 Kulturbrü'-c einer L-Leucin	40
bildenden Mutante.
		43.2 Verfahren der Hauptzüchtung
33.2 Verfahren der Hauptzüchtung		Die Züchtung wird wie vorstehend unter 13.2 beschrieben durchgeführt Nachstehend sind in Tabelle X die Mengen an
Die Züchtung wird auf die gleiche Weise wie unter		L-Lysin-HCI angegeben, die sich nach beendeter
132 beschrieben durchgeführt, jedoch beträgt die		Züchtung in der Kulturbrühe angereichert haben.
Züchtungsdauer 72 Stunden.
Tabelle X		Medium Menge an entstan-
US-PS Mutante		entstandenem
		L-Lysin ■ HCl
		g/l
		A-I 27,3
	A-2 28,0
	A-3 30,9
	A-I 31,8
	A-2 31,2
	A=3 34,6

	A-I 25,1
	A-2 26,2
	A-3 29,4
A-I 28,7
A-2 27,0
A-3 31.7

21

Fortsetzung 22

US-PS

MuUinte	Medium	Menge an entsinn entstandenem L-Lysin · HCI
		g/l
NRRL B 11 130	B-I B-2 B-3	28,8 29,9 33,1
ATCC 21491	B-I B-2 B-3	22,6 22,9 24,1
ATCC 21490	B-I B-2 B-3	15,7 14,9 .18,6
ATCC 21492	B-I B-2 B-3	8,6 8,5 11,2
NRRL B-Il 131	C-I C-2 C-3	16,9 16,4 25,7
NRRLB-Il 132	C-I C-2 C-3	28,6 27,9 33,4
ATCC 21129	C-I C-2 C-3	27,0 28,6 34,1
NRRLB-Il 130	D-I D-2 D-3	20,8 22,1 24,6

3707441 3616218

36 87 809

Anm.: A-3, B-3, C-3 und D-3 sind erflndungsgemäB verwendete Nährmedien.

Aus Tabelle X ist ersichtlich daß im erfindungsgemäßen Verfahren die Menge an erzeugtem L-Lysin größer ist als bei den bekannten Verfahren.

Claims

K) 15 Patentansprüche:

1. Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin durch Züchtung einer L-Lysin bildenden Mutante von coryneformen, Glutaminsäure bildenden Bakterien in einem Nährmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man als L-Lysin bildende Mutante einen Mikroorganismus der Art

Brevibacterium aminogenes, Brevibacterium divaricatum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium roseum, Brevibacterium saccharolyticum, Brevibacterium immariphilium, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterim herculis, Corynebacterium iiiium, Corynebacterium callunae, Microbacterium ammoniaphilum oder Arthrobacter sp.

in einem ersten Nährmedium züchtet, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie 2 bis ml/Liter einer Kulturbrühe A enthält, die bei der Züchtung eines L-Leucin bildenden Mikroorganismus der Art

Brevibacterium aminogenes, Brevibacterium divaricatum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium roseum, Brevibacterium saccharolyticum, Brevibacterium immariophilium, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium herculis, Corynebacterium Iiiium, Corynebacterium callunae, Microbacterium ammoniaphilum oder Arthrobacter sp.

in einem zweiten Nährmedium erhalten worden ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung der L-Lysin bildenden Mutanten bei Temperaturen von 25 bis so 40⁰C und einen pH-Wert von 6 bis 8,5 durchführt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man dem ersten Nährmedium die Kulturbrühe A in Anteilen zusetzt und die gesamte Kulturbrühe A bis zum Ende der log-Phase zufügt. «

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlenstoffquelle Melasse, Zuckerriibenmelasse, Glucose, Essigsäure oder ein Gemisch aus mindestens zwei dieser Stoffe verwendet. M)

30

35

-(O