DE2531999A1

DE2531999A1 - Verfahren zur biotechnischen herstellung von l-lysin

Info

Publication number: DE2531999A1
Application number: DE19752531999
Authority: DE
Inventors: Shinichiro Hamada; Keiichi Inuzuka
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1974-07-17
Filing date: 1975-07-17
Publication date: 1976-02-05
Also published as: AU8314675A; DE2531999B2; DE2531999C3; JPS5112991A; FR2278764A1; FR2278764B1; IT1039864B; JPS579797B2; GB1501183A; CA1054544A; US3959075A; NL161502C; NL7508597A; NL161502B

Description

"Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin"

Priorität: 17. Juli 1974, Japan, Nr. 81 142/74

L-Lysin ist eine essentielle Aminosäure, für die in der Nahrungsmittelindustrie und Futtermittelindustrie ein großer Bedarf besteht. Die Herstellung von L-Lysin auf biotechnischem Wege ist bekannt. Im allgemeinen v/erden dabei Mutanten von coryneformen Glutaminsäure bildenden Bakterien, beispielsweise Corynebacterium glutamicum, eingesetzt.

Die coryneformen Glutaminsäure bildenden Bakterien sind bekannt. Es handelt sich um elliptische kugelförmige bis runde Stäbchen,

509886/10G3

^Γ π

- 2 - ? S 'η ν >η->

die Gram-positiv, nicht spurulierend und unbeweglich sind, Biotin benötigen und große Mengen an L-Glutaminsäure bilden.

Eine Anzahl von coryneformen Glutaminsäure bildenden Bakterien ist aus der Literatur bekannt. Sie werden je nach der Ansicht der Taxonomen, die die Untersuchungen an den Bakterien durchführten, folgendermaßen klassifiziert: Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium aminogenes , Brevibacterium divaricatum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum Brevibacterium roseura, Brevibacterium saccharolyticum, Brevibacterium immariophilium, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium herculis, Corynebacterium lilium, Corynebacterium callunae, Microbacterium ammoniaphilum und Arthrobacter sp. Nach Abe et al., J. General and Applied Microbiology, Bd. 13 (1967), S. 279-301, sind diese Mikroorganismen taxonomisch sehr nahe miteinander verwandt. Die coryneformen Glutaminsäure bildenden Bakterien werden durch corynebacterium glutamicum dargestellt.

Die L-Lysin bildenden Mutanten der coryneformen Glutaminsäure bildenden Bakterien sind im allgemeinen dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens eine der nachstehend aufgeführten beiden Eigenschaften haben, die von einer Genmutation herrühren.

Eine dieser Eigenschaften ist die vollständige oder unvollständige Blockade des biosynthetischen Weges zur Bildung verwandter Aminosäuren. Diese Eigenschaft wird erkannt als Bedarf für verwandte Aminosäuren, wie L-Ilomoserin, L-Threonin, L-Methionin,

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ORIGINAL INSPECTED

Γ

2 Fi ? 1 ''■ H P

L-Leucin odor L-Isoleucin, oder eils Empfindlichkeit cjegenüber L-Threonin oder L-Methionin. Die andere Eigenschaft ist die vollständige oder unvollständige Abweichung der Rückkopplungssteuerungen durch verwandte Aminosäuren. Diese Eigenschaft wird erkannt als Beständigkeit gegenüber verwandten Aminosäuren, wie L-Lysin oder L-Threonin, oder ihren Analogen, wie S-(2-Aminoäthyl)-L-cystein.

Die Produktivität der L-Lysin bildenden Mutanten mit den vorgenannten Eigenschaften wird durch Vereinigung weiterer genetischer Mutationen verbessert, beispielsweise hinsichtlich des Bedarfs an Aminosäuren, wie L-Valin, L-Tyrosin, oder Vitaminen, wie Thiamin oder Vitamin B₁₂, und Purinbasen, wie Adenin oder Guanin.

Die Produktivität dieser Mutanten zur Bildung von L-Lysin wird ebenfalls verbessert durch Vereinigung anderer als der vorge-

hinsichtlich

nannten genetischen Mutationen, beispielsweise/Jer Resistenz gegenüber Aminosäuren, wie L-Isoleucin, oder ihrer Analogen, wie 2-Amino-3-methylthiobuttersäure, und Antibiotica, wie Penicillin G oder Polymixin B.

Spezielle Beispiele für bevorzugte L-Lysin bildende Mutanten sind Micrococcus glutamicus ATCC 13286 und ATCC 13287, Brevibacterium flavum ATCC 21475, ATCC 21127, ATCC 21128, ATCC 21517, ATCC 21518, ATCC 21528, ATCC 21529, und Corynebacterium glutamicum ATCC 21299, ATCC 21300, ATCC 21513, ATCC 21514, ATCC 21515, ATCC 21516, ATCC 21527, ATCC 21544, KY 10403 und KY 10031.

^l\ D 9 P s π /1 η π ι

Die meisten dieser Mutanten sind in den US-PSen 2 979 439, 3 616 218, 3 687 810, 3 707 441 und 3 708 395 sowie der GB-PS 1 186 988 beschrieben.

Zur Herstellung von L-Lysin unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Stämme werden diese Stämme aerob in einem Nährmedium gezüchtet, das assimilierbare Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Verbindungen und andere Nährstoffe enthält.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes biotechnisches Verfahren zur Herstellung von L-Lysin unter Verwendung der vorgenannten L-Lysin bildenden Mutanten von coryneformen Glutaminsäure bildenden Bakterien zu schaffen. Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem überraschenden Befund, daß durch Zusatz einer Kulturbrühe einer L-Leucin bildenden Mutante zum Nährmedium die Ausbeute an L-Lysin erheblich gesteigert wird. Dieser Effekt ist größer als bei Zusatz von L-Leucin zum Nährmedium in einer Menge, die der in der Kulturbrühe enthaltenen L-Leucinmenge entspricht. Es wurde ferner festgestellt, daß dieser Effekt nicht nur bei L-Lysin bildenden Stämmen auftritt, die einen L-Leucin-Bedarf haben, sondern auch bei solchen L-Lysin bildenden Stämmen, die die verschiedensten Eigenschaften besitzen.

Die Herstellung von L-Leucin auf biotechnischem Wege ist bekannt. Ebenso wie bei den L-Lysin bildenden Mutanten haben die L-Leucin bildenden Mutanten im allgemeinen mindestens eine der folgenden

. Eigenschaften, nämlich einen Bedarf an verwandten Aminosäuren,

^L J

5 0 9 8 8 6/1ΠΠ3

Γ Π

7 5 ^ 1 Π 9 9

wie L-Isoleucin, L-Methionin oder L-Valin, und eine Restistenz gegenüber verwandten Aminosäuren, wie L-Leucin und ihren Analogen, wie oC-Aminobuttersäure, herrührend von der vollständigen oder unvollständigen Blockade des biosynthetischen Syntheseweges und der vollständigen oder unvollständigen Abweichung von Rückkopplungssteuerungen. Die Produktivität dieser Stämme zur Bildung von L-Leucin wird verbessert durch Vereinigung anderer als der vorstehend beschriebenen Eigenschaften, beispielsweise einem Bedarf an Aminosäuren,wie L-Phenylalanin. Die Produktivität wird ferner verbessert durch Vereinigung der Resistenz gegenüber Aminosäuren, wie L-Lysin oder L-Histidin, und ihren Analogen, wie S-(2-Aminoäthyl)-L-cystein oder 2-Thiazolalanin.

Bevorzugte L-Leucin bildende Mutanten sind Brevibacterium flavum (FERM-P Nr. 1838) ATCC 21889, Brevibacterium lactofermentum (FERM-P Nr. 1837) ATCC 21888, Corynebacterium glutamicum ATCC 21301 bis 21308, ATCC 21885, ATCC 21886 (FERM-P Nr. 1835), und Corynebacterium acetoacidophilum (FERM-P Nr. 1836) ATCC 21887.

Einige der vorgenannten Stämme sind in der J/v-OS 101 589/74 beschrieben.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren läßt sich die L-Lysinausbeute dadurch erheblich verbessern, daß man L-Lysin bildende Mutanten in einem Nährmedium züchtet, das durch die Kulturbrühe von L-Leucin bildenden Mutanten ergänzt wird. Der Mechanismus ist unbekannt. Es ist bekannt, die Produktivität der L-Lysin bildenden Stäir.nie durch Zusatz verschiedener Aminosäuren zu verbessern. Wie vor-L_ stehend bereits beschrieben wurde, beruht die Wirkung des _j

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75 3 19 9

Zusatzes der Kulturbrühe der L-Leucin bildenden Mutanten nicht auf dem in der Kulturbrühe vorhandenen L-Leucin. Die Kultur brühe der L-Leucin bildenden Mutanten enthält neben L-Leucin noch andere Aminosäuren, doch kann die Wirkung des Zusatzes der Kulturbrühe nicht diesen Aminosäuren zugeschrieben v/erden. Dies wird nachstehend näher erläutert.

Die Erfindung betrifft somit den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Im erfindungsgemäßen Verfahren kann entweder ein synthetisches oder ein natürliches Nährmedium verv/endet werden, sofern es die für den jeweils eingesetzten Stamm erforderlichen assimilierbaren Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Verbindungen und andere wachstumsfördernde Substanzen enthält.

Je nach der Art des eingesetzten Mikroorganismus kommen als Kohlenstoffquellen Kohlenhydrate, wie Glucose, Fructose, Sorbit, Mannit, Glycerin, Stärke, Stärkehydrolysate, Melasse, Zuckerrübenmelasse, Carbonsäuren, wie Essigsäure, Fumarsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Bernsteinsäure, und Alkohole, wie Methanol oder Äthanol, in Frage. Bevorzugt sind in der Praxis Melasse, Zuckerrübenmelasse, Essigsäure und Glucose.

Als Stickstoffquellen können Ammoniak, organische und anorganische Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat, Ammoniumacetat oder Ammoniumphosphat, stickstoffhaltige Verbindungen, wie Harnstoff, Pepton, Fleischextrakt,

L ' -I

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Γ "1

7531999

Hefeextrakt, Maisquellwasser, Caseinhydrolysate, Fischmehl, abgebautes Fischmehl, entfettetes Sojabohnenmehl, abgebautes entfettetes Sojabohnenmehl oder Produkte der Säurehydrolyse von Sojabohnenprotein, verwendet werden.

Spezielle Beispiele für verwendbare anorganische Verbindungen sind Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisen(II)-sulfat, Mangansulfat und Calciumcarbonat.

Wenn die verfahrensgemäß eingesetzten L-Lysin bildenden Mutanten einen Nährstoffbedarf an Aminosäuren, Vitamine oder Purinbasen haben, muß dem Nährmedium natürlich dieser Nährstoff in der entsprechenden Menge zugesetzt werden. Beispielsweise benötigen die coryneformen Glutaminsäure bildenden Bakterien und somit auch deren L-Lysin bildende Mutanten zum Wachstum Biotin. Das Nährmedium muß daher auch Biotin in entsprechender Menge enthalten.

Die Erhöhung der L-Lysin-Ausbeute im erfindungsgemäßen Verfahren wird durch Zusatz der Kulturbrühe A erreicht, die bei der Züchtung einer L-Leucin bildenden Mutante erhalten wird. Die Kulturbrühe A kann dem L-Lysinfermentationsmedium entweder unmittelbar oder nach der Abtrennung der Mikroorganismen zugesetzt werden. In beiden Fällen muß natürlich die Kulturbrühe A oder dessen Filtrat sterilisiert werden, bevor es im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird.

509886/10 f) 3

Γ Π

Die zur Ergänzung des Nährmediuras für die L-Lysinbildung erforderliche Menge an Kulturbrühe Λ hängt von der Art der Mikroorganismen und der Zusammensetzung der Nährmedien bei der L-Lysin- und L-Leucinproduktion ab. Vorzugsweise enthält das L-Lysinfermentationsmedium die Kulturbrühe A in einer Menge von 2 bis 150 ml/Liter, bezogen auf das Volumen des Nährmediums der L-Lysinfermentation. Die optimalen Mengen können durch einfache Vorversuche bestimmt werden.

zu Beginn Die Kulturbrühe A kann dem Nährmedium insgesamt/oder in Anteilen während der Fermentation zugesetzt werden. Im letztgenannten Fall kann die Kulturbrühe A auf einmal, absatzweise oder kontinuierlich eingespeist werden. Vorzugsweise ist die Zufuhr der Kulturbrühe A bis zum Ende der log-Phase, d.h. der exponentiellen Wachstumsphase, beendet. Im allgemeinen ist die log-Phase nach 10 bis 24 Stunden nach Beginn der Züchtung beendet.

Die Fermentation der L-Lysin bildenden Mutanten wird unter den üblichen Bedingungen durchgeführt, d.h. unter aeroben Bedingungen, beispielsweise unter Belüftung und Rühren oder unter Schütteln bei Temperaturen von 25 bis 40°C und pH-Werten von 6 bis 8,5. Im allgemeinen hat sich nach 30bis 150 Stunden eine beträchtliche Menge an L-Lysin im Nährmedium angesammelt. Nach beendeter Züchtung wird das L-Lysin nach üblichen Methoden isoliert und > gereinigt, beispielsweise durch Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz und durch Umkristallisation.

Die Kulturbrühe für die L-Leucin bildende Mutante wird nach üb-■ liehen Methoden hergestellt. Es kann jede L-Leucin bildende _j

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Γ Π

7511999

Mutante von coryneforitien Glutaminsäure bildenden Bakterien mit den vorstehend beschriebenen Eigenschaften zur Herstellung der Kulturbrühe verv/endet werden. Ebenso wie bei der L-Lysinfermentation kann entweder ein synthetisches oder ein natürliches Nährmedium auch bei der L-Leucinfermentation eingesetzt werden, sofern es die zum "Wachstum des Mikroorganismus erforderlichen Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Verbindungen und andere Nährstoffe enthält. Es können die gleichen Verbindungen verwendet werden, wie bei der L-Lysinfermentation. In der Praxis sind als Kohlenstoffquellen Melasse, Zuckerrübenmelasse, Essigsäure und Glucose bevorzugt. Sofern die Stämme einen speziellen Nährstoffbedarf haben, müssen diese Nährstoffe natürlich im Nährmedium vorhanden sein. Die Züchtung der L-Leucin bildenden Mutanten wird ebenfalls unter üblichen Bedingungen durchgeführt, im allgemeinen unter aeroben Bedingungen, beispielsweise unter Belüftung und Rühren oder als Schüttelkultur bei Temperaturen von 25 bis 40 C, pH-Werten von 6 bis 9 und während eines Zeitraums von 48 bis 120 Stunden.

Die nachstehenden Versuchsbeispiele erläutern die Bestimmung des bevorzugten Bereichs der Menge an Kulturbrühe A der L-Leucin bildenden Mutante, die dem L-Lysinfermentationsmedium zuzusetzen ist.

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^Γ - 10 - Π

Versuchsbeispiel 1

Aus folgenden Bestandteilen wird	ein Basalmedium Y
Glucose	150 g/A
(NH.) SO .	4 0 g/A
KH₂PO₄	ι g/A
MgSO₄-7H₂O	0.4 g/A
FeSO₄·7H₂O	0.01 g/A
MnSO₄*4H₂O	6 mg/A
Biotin	300 γ/Α
Thiamin -HC A	200 γ/Α
Säurehydrolysat von Soj abohnenprotein CaCO₃	1 g/A 5 g/A
L-Threonin	600 γ/mA
DL-Methionin	200 γ/mA

Der pH-Wert des Basalmediums beträgt vor dem Sterilisieren 7,4.

Durch Zusatz einer Kulturbrühe eines L-Leucin bildenden Stammes mit einer Leucinkonzentration von 15,6 g/Liter zum Basalmedium in unterschiedlichen Mengen werden 6 Nährmedien hergestellt. Brevibacterium flavum ATCC 21518 wird in 10 ml-Anteile des Basalmediums sowie die erhaltenen 6 Nährmedien in 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben überimpft und 110 Stunden bei 28 C unter Schütteln gezüchtet. Nach beendeter Züchtung werden die L-Lysin-Ausbeute und das Wachstum der Zellen bestimmt. Die Ergebnisse

sind in Tabelle I zusammengefaßt.
^L J

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- Ί1 -

Tabelle I

Konzentration der eingesetzten Kulturbrühe des L-Leucin bildenden Stammes, ml/1

	7 5 319 9 9
Ausbeute an L-Lysin. g/i	Wachstum der Zellen, g/l Trocken zellen
32	9.8
40	10'. 9
48	12.5
55	13.8
60	15.3
59	14.7
56	13.5

0 2 5

10 20 40 60

Die Kulturbrühe des L-Leucin bildenden Stammes wird folgendermaßen hergestellt:

Corynebacterium glutamicum (FERM-P Nr. 1834) ATCC 21885 wird in 3 Liter eines Einsaatmediums in einem 5 Liter fassenden Fermenter überimpft. Das Einsaatmedium hat folgende Zusammensetzung:

D~Glucose

Pepton

Hefeextrakt

Maisquellwasser

NaCl

Harnstoff

Biotin

50 g/l

10 g/A

10 g/A 5. g/A 2.5 g/A 3 g/A

50 γ/Α

bO9886/inr»3

7 5319 9

Der pH-Wert des Einsaatmediums beträgt vor dem Sterilisieren 7,2

Die Züchtung wird 18 Stunden bei 3O°C, einer Belüftungsgeschwindigkeit von 3 Liter/min und einer Rührgeschwindigkeit von 600 ü/min durchgeführt.

1 Liter der erhaltenen Einsaatkultur wird in 10 Liter eines Hauptfermentationsmediums in einem 30 Liter fassenden Fermenter überimpft. Das Hauptfermentationsmedium hat folgende Zusammensetzung:

Ammoniumacetat 5.0 g/5,

KH₃PO₄ 2.0 g/i,

MgSO₄.7H₂O · 0.5 g/5,

FeSO₄.7H₂O 0.1 g/5,

MnSO₄. 4 H₂O 0.01 g/5,

Biotin 50 γ/5.

Thiamin · Hydrochlorid 100 mg/5,

Der pH-Wert des Hauptfermentationsmediums beträgt vor dem Sterilisieren 7,4.

Die Züchtung wird 60 Stunden bei 3O°C, einer Belüftungsgeschwindigkeit von 10 Liter/min und einer Rührgeschwindigkeit von 400 U/min durchgeführt.

3 Stunden nach Beginn der Züchtung werden innerhalb 56 Stunden 10 Liter eines Gemisches aus 71 g/Liter Ammoniumacetat und 380 g/Liter Essigsäure kontinuierlich eingespeist. Dabei wird der pH-Wert des Mediums bei 6,8 und die Essigsäurekonzentration

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Γ Π

_ 13 —

7 5 319 9

bei 1,2 bis 18 g/Liter gehalten. Nach beendeter Züchtung enthält die Kulturbrühe 15,6 g/Liter L-Leucin.

Versuchsbeispiel 2

Versuchsbeispiel 1 wird wiederholt, jedoch wird Corynebacterium glutamicum ATCC 21516 als L-Lysin bildender Stamm verwendet. Die Kulturbrühe des L-Leucin bildenden Stammes wird in den in Tabelle II angegebenen Mengen eingesetzt. Die Ergebnisse sind ebenfalls in dieser Tabelle zusammengefaßt.

Tabelle II

Konzentration der zugesetzten Ausbeute an Wachstum der Kulturbrühe des L-Leucin bildenden L-Lysin, Zellen- g/l Stammes, ml/Liter g/Liter Trockenzellen

10

40

60

80

100 150

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

30	9.0
37	10.1
48	12.6
56	13.5
62	■ 14.9
58	14.4
55	14.0
53	13.8
54	13.3
52	13.5

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Beispiel 1

Corynebacterium glutaniicum ATCC 21513 wird als L-Lysin bildender Stamm in 330 ml eines Einsaatmediums in einem 2 Liter fassenden Erlenmeyerkolben überimpft und 24 Stunden bei 28 C unter Schütteln gezüchtet. Das Einsaatmedium hat folgende Zusammensetzung:

D-Glucose	40 g/A	150 g/A (als Glucose)
KH₂PO₄	0.5 g/A	0.3 g/A
K₂HPO₄	1.5 g/A	0.7 g/A
Harnstoff	3 g/A	3 g/A
MgSO₄·7H₂O	0.5 g/A	20 g/A
Pepton	20 g/A
Fleischextrakt	5 g/A
Biotin	50 γ/Α
Der pH-Wert des Einsaatmediums beträgt vor dem Sterilisieren 7,2
Es werden 5 Medien folgender Zusammensetzung hergestellt:
Medium A-1: Zuckerrübenmelasse
MgSO₄·7H₂O
KH₂PO₄
Harnstoff
Säurehydrolysat von Sfinahnhnonnrnfoi η

Der pH-Wert des Mediums beträgt vor dem Sterilisieren 7,4.

Medium A-2: Medium A-1 +13 ml/Liter einer Kulturbrühe eines

L-Leucin bildenden Stammes mit 15,0 g/Liter L-Leucin Medium A-3: Medium A-1 + 200 mg/Liter L-Leucin Medium A-4: Medium A-1 +13 ml/Liter einer Kulturbrühe eines

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1 - 15 -

7 5 3 19 9

L-Glutaminsäure bildenden Stammes mit 60 g/Liter L-GIutaminsäure
Medium A-5: Medium A-1 +13 ml/Liter der Kulturbrühe des L-Glutaminsäure bildenden Stammes von Medium A-4 + 200 mg/Liter L-Leucin.

Jeweils 1 Liter der erhaltenen Einsaatkultur wird in 10 Liter der vorstehend beschriebenen 5 Medien in 30 Liter fassenden Fermentern überimpft. Die Züchtung wird 48 Stunden bei 28 C, einer Belüf tungsgeschv/indigkeit von 10 Liter/min und einer Rührgeschwindigkeit von 400 U/min durchgeführt. Während der Züchtung wird der pH-Wert des Mediums mit 22 %iger wäßriger Ammoniaklösung bei 6,8 gehalten. Nach beendeter Züchtung werden die Kulturflüssigkeiten auf ihren L-Lysingehalt analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt.

Tabelle III

Medium Zusatz Ausbeuten an L-Lysin

g/l

A-I - 40

A-2 Kulturflüssigkeit des L-Leucin

produzierenden Stammes 55

A-3 L-Leucin 44

A-4 Kulturflüssigkeit des L-Glutaminsäure produzierenden Stammes 40

A-5 Kulturflüssigkeit 4- L-Leucin 46

L _J

5098Β6/1ΠΠ 3

? 5 3 I 9 9

Die Kulturbrühe'des L-Leucin und L-Glutarainsäure bildenden Stammes wird folgendermaßen hergestellt:

a) Herstellung der Kulturbrühe des L-Leucin bildenden Stammes

Brevibacteriura lactofermentum (FERM-P Nr. 1837) ATCC 21888 (ein L-Leucin bildender Stamm) wird in 3 Liter eines Einsaatmediums in einem 5 Liter fassenden Fermenter überimpft und 18 Stunden bei 30⁰C, einer Belüftungsgeschwindigkeit von 3 Liter/min und einer Rührgeschwindigkeit von 600 U/min gezüchtet. Das Einsaatmedium hat folgende Zusammensetzung:

D-Glucose 50 g/l

P ep ton IO g/l

Hefeextrakt 10 g/l

Maisquellwasser 5 g/l

2.5 g/l Harnstoff 3

Biotin 50 γ/£

Der pH-Wert des Einsaatmediums beträgt vor dem Sterilisieren 7,2. 1 Liter der erhaltenen Einsaatkultur wird in 10 Liter eines Hauptfermentationsmediums in einem 30 Liter fassenden Fermenter überimpft. Das Hauptfermentationsriedium hat folgende Zusammensetzung:

L -I

509886/1063

Γ I

7 5 3 19 9 9

Ammoniumacetat 15 g/J!, KII₂PO₄ 2.0 g/Ä,

MgSO₄.7H₂O 0.5 g/£

FeSO₄-7H₂O 0.1 g/Ä,

MnSO. · 411 O 0.01 g/Ä,

Biotin 50 γ/Α.

Thiamin . Hydrochlorid 100 mg/Ä,

Der pH-Wert des Hauptferinentationsmediums beträgt vor dem Sterilisieren 7,4. Die Züchtung wird 60 Stunden bei 30 C, einer Belüftungsgeschwindigkeit von 10 Liter/min und einer Rührgeschwindigkeit von 400 U/min durchgeführt. Der pH-Wert wird mit 60 %iger wäßriger Essigsäure auf 6,8 eingestellt. 7 Stunden nach Beginn der Züchtung werden dem Medium stündlich während 50 Stunden jeweils 70 ml-Anteile einer wäßrigen Lösung zugegeben, die 11 g Ammoniumacetat enthält. Während der Züchtung wird die Essigsäurekonzentration im Medium auf einen Wert von 1,2 bis 18g gehalten. Nach beendeter Züchtung beträgt die L-Leucinkonzentration in der Kulturbrühe 15,0 g/Liter.

b) Herstellung der Kulturbrühe des L-Glutaminsäure bildenden Stammes

Arthrobacter paraffineus ATCC 15591 (ein L-Glutaminsäure bildender Stamm) wird in 300 ml eines Einsaatmediums in einem 2 Liter fassenden Erlenmeyerkolben überimpft und 24 Stunden bei 30 C unter Schütteln gezüchtet. Das Einsaatmedium hat folgende Zusammensetzung:
L -1

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9 R Ί, 1 Q Q Q Natriumacetat 10 g/l ^/ ^

Pepton . 10 g/S,

Fleischextrakt 5 g/S,

NaCJl 2.5 g/l

Der pH-Wert des Einsaatmediums beträgt vor dem Sterilisieren 7,0. 300 ml der erhaltenen Einsaatkultur werden in 3 Liter eines Hauptfermentationsmediums in einem 5 Liter fassenden Fermenter überimpft. Das Hauptfermentationsmedium hat folgende Zusammensetzung:

Ammoniumacetat 20 g/l (als Essigsäure)

KH₂PO₄ ι gA

K₂IIPO₄ 1 g/A

MgSO₄. 7H₂O 0.5 g/S,

MnSO₄. 4H₂O 10 mg/S,

FeSO₄.7H₂O 10 mg/S. Ihiamin . Hydrochlorid 5 γ/Α

Der pH-Wert des Hauptfermentationsmediums beträgt vor dem Sterilisieren 7,0. Die Züchtung wird 3 Tage bei 30⁰C, einer Belüftungsgeschwindigkeit von 3 Liter/min und einer Rührgeschwindigkeit von 600 U/min durchgeführt. Während der Züchtung wird das Medium mit 1 Liter einer wäßrigen Lösung versetzt, die durch Zusatz von 3 Gewichtsteilen Wasser zu einem Gemisch von 70 Gewichtsteilen Eisessig und 27 Gewichtsteilen 22 %iger wäßriger Ammoniaklösung hergestellt wurde. Der pH-Viert des Mediums wird auf einen Wert von 4 bis 9 eingestellt. Die Zufuhr der wäßrigen Lösung ist 2 Stunden vor Beendigung der Züchtung beendet. Nach Beendigung der Züchtung

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? R Ί 1 9 Π 9

haben sich in der Kulturbrühe 60 g/Liter L-Glutaminsäure angesammelt.

Das vorstehend verwendete Medium A-2 enthält Aminosäuren aus der Kulturbrühe, ein Säurehydrolysat von Sojabohnenprotein und Zuckerrübenmelasse in den in Tabelle IV angegebenen Mengen.

Aminosäure Tabelle IV

Mengen der Aminosäure, mg/1

Aus der Kulturbrühe Aus Säurehydrolydes L-Leucin produ- sat von Sojabohzierenden Stammes nenprotein hergehergestellt stellt

Aus Zukkerrüben- melasse hergestellt

Alanin	6,37
Asparaginsäure	-
Arginin	-
Cystin	-
Glycin	4,81
Glutaminsäure	12,6
Histidin	-
Isoleucin	5,85
Leucin	195
Lysin	5,2
Methionin	-
Phenylalanin	-
Prolin	-
Serin	-
Threonin	-
Tryptophan Tyrosin !Valin

176 967 546

332

1570

242

28 4 58 6 550 98 340 460 376 362

208 310

99,0 278

7,5(als Hydrochlorid)

3,0 7,5 9,0

13,5 (als Hydrochlorid)

12,0

52,5

7,5 13,5 48

_1

H098-R6/inr>3

7 5 3 1 9 Π R

Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß die in der Kulturbrühe des L-Leucin bildenden Stammes enthaltenen Aminosäuremengen sehr gering sind im Vergleich zu den Mengen Aminosäuren, die im Säurehydrolysat von Sojabohnenprotein oder Zuckerrübenmelasse enthalten sind. Daraus ist ersichtlich, daß die in der Kulturbrühe der L-Leucin bildenden Mutante enthaltenen Aminosäuren keine zusätzlichen Wirkungen bei der Bildung von L-Lysin

die Wirkung entfalten. Die Versuche lassen den Schluß zu, daß/des Zusatzes der Kulturbrühe des L-Leucin bildenden Stammes nicht auf seinem Gehalt an Aminosäuren beruht.

Beispiel 2

In diesem Beispiel werden vier verschiedene Nährmedien folgender Zusammensetzung hergestellt:

Medium B-1:

D-Glucose 150 g/l

(NtI₄J₂SO₄ 40 g/H KH₂PO₄ 1 g/l

HgSO₄-7H₂O 0.4 g/Z

PeSO₄.7H₂O 0.01 g/l.

HnSO₄^IH₂O 6 mg/£

'Biotin 300 y/l

ffrlarain . Hydrochlorid 200 γ/I

Bäurehydrolysat von , 1 g/l

Sojabohnenprotein

CaCO₃ · 5 _g/£

!.-Threonin 600 'y/rnt.

DL-Methionin 200 y/ml

L _1

5 09886/inf)3

Der pH-Wert des Mediums beträgt vor dem Sterilisieren 7,4.

Medium B-2: Medium B-1 + 20 ml/Liter der gemäß Versuchsbeispiel 1 hergestellten Kulturbrühe mit 15,6 g/Liter L-Leucin.

Medium B-3: Medium B-1 + 320 mg/Liter L-Leucin

Medium B-4: Medium B-1 + 1 g/Liter Säurehydrolysat von Sojabohnen protein.

Brevibacterium flavum ATCC 21518 (ein L-Lysin bildender Staimn) wird in 10 ml-Anteilen in die vorstehend beschriebenen Medien in 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben überimpft und 110 Stunden bei 80⁰C unter Schütteln gezüchtet. Nach beendeter Züchtung wird die L-Lysinkonzentration bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle V angegeben.

Tabelle V Ausbeute an L-Lysin, mg/1

32

60 35

46

Medium	Zusatz	L-Leucin Stammes
B-I	—
B-2	Kulturbrühe des produzierenden	von Soja
B-3	L-Leucin
B-4	Säurehydrolysat bohnenprotein
Beispiel 3

In diesem Beispiel werden als L-Lysin bildende Stämme Corynebacterium glutamicum ATCC 21516, Brevibacterium flavum ATCC 21528, Corynebacterium glutamicum ATCC 21544 und Corynebacterium glutamicum KY 10013 verwendet. Diese Stämme werden in jeweils 40 ml eines Einsaatmediums in 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben überimpft und 24 Stunden bei 28 C unter Schütteln gezüchtet.

509886/1063

7531999

Das Einsaatmedium hat folgende Zusammensetzung: D-Glucose 50

NaC£ · 2.5 g/i

Harnstoff 3 g/l

Pepton 10 _g/£

Hefeextrakt 10 g/l

Maisquellwasser 5 g/l

Biotin · so γ/£

Der pH-Wert des Einsaatmediums beträgt vor dem Sterilisieren 7,2.

Es werden 3 Nährmedien folgender Zusammensetzung hergestellt:

Medium C-1:

iuckerrübenmelasse 100 g/5. (als Glucose)

KH₃PO₄ 0.5 g/l

MgSO₄ (Anhydrid ) 0.5 g/l

(NH₄J₂SO₄ 3.3 g/l

Säurehydrolysat von ²⁰ ^A Sojabohnenprotein

Der pH-Wert des Mediums beträgt vor dem Sterilisieren 7,4.

Medium C-2: Medium C-1 + 20 ml/Liter der gemäß Beispiel 1 hergestellten Kulturbrühe mit 15,0 g/Liter L-Leucin. Medium C-3: Medium C-1 + 300 mg/Liter L-Leucin.

Die Versuchsbedingungen und die Ergebnisse der Züchtung in diesen

Medien sind in Tabelle VI zusammengefaßt. L

50988 6/1063

19 η η

	Tabelle	VI	L-Lysin-Ausbeute, g/Liter
Stamm	Medium	Zusatz	27.0
Corynebacterium	C-I C-2	Kulturbrühe des !.-•Leucin produzie	32.0
glutamicuin	C-3	renden Stammes L-Leucin	27.2
ATCC 21516

Brevibacterium

C-I

Kulturbrühe des

26.1

flavum	C-2	Jj JUCUVJXiI piUUUiJ.C renden STainmes	-	. -	28.7
ATCC 21528	C-3	L-Leucin.	Kulturbrühe des L-Leucin produzie renden Stammes	Kulturbrühe des L-Leucin produzie renden Stammes
	C-I	L-Leucin	L-Leucin	26.0
	C-2		27.8
Corynebacterium glutaniicura ATCC 21544	C-3	30.5
	C-I	26.8
	C-2	23.0
Corynebacterium glutamicum KY 10013	C-3	25.0
		22.9
Beispiel 4

Beispiel 1 wird wiederholt, jedoch wird Corynebacterium glutamicum KY 10403 (ein L-Lysin bildender Stamm) als Einsaatkultur gezüchtet.

Es v/erden 3 verschiedene Nährmedien folgender Zusammensetzung hergestellt:

L -J

Β09ΒΒ6/1ΠΓ, 3

¹

9 Ej 3 'J C] C) C) Medium D-1: Zuckerrübenmelasse 150 g/A (als Glucose)

MgSO.'7H₉O 0.3 g/A

KII₂PO₄ 0.7 g/A

Harnstoff 3 g/A

Säurehydrolysat von 10 g/A Soj abohnenprotein

Der pH-Wert des Mediums beträgt vor dem Sterilisieren 7,4.

Medium D-2: Medium D-1 + 20 ml/Liter der gemäß Beispiel 1

hergestellten Kulturbrühe mit 15,0 g/Liter L-Leucin Medium D-3: Medium D-1 + 300 mg/Liter L-Leucin

1 Liter der Einsaatkultur wird in 10 Liter der vorgenannten Medien in 30 Liter fassenden Fermentern überimpft und gemäß Beispiel 1 gezüchtet. Nach beendeter Züchtung wird die L-Lysinkonzentration bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VII zusammengefaßt.

Tabelle VII

Medium Zusatz L-Lysinkonzentration,

g/Liter

D-1 keinen . 41

D-2 Kulturbrühe des L-Leucin

bildenden Stammes 52

D-3 L-Leucin 45

509886/1 il 63

?R31999

Beispiel 5

Gemäß Beispiel 1 wird Corynebacterium glutamicum ATCC 21513 (ein L-Lysin bildender Stamm) in einer Einsaatkultur gezüchtet.

Es werden 3 verschiedene Nährmedien folgender Zusammensetzung hergestellt:

Medium E-1: wie Medium A-1

Medium E-2: Medium E-1 +13 ml/Liter einer Kulturbrühe mit 15,8

g/Liter L-Leucin.
Medium E-3: Medium E-1 + 200 mg/Liter L-Leucin.

Jeweils 1 Liter der Einsaatkultur wird in 10 Liter der vorgenannten 3 Medien in einem 30 Liter fassenden Fermenter überimpft. Die Züchtung wird 48 Stunden bei 28°C, einer Belüftungsgeschwindigkeit von 10 Liter/min und einer Rührgeschwindigkeit von 400 U/min durchgeführt. Während der Züchtung wird der pH-Wert des Mediums mit 22 %iger wäßriger Ammoniaklösung bei 6,8 gehalten. Nach beendeter Züchtung wird die L-Lysinkonzentration bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VIII zusammengefaßt.

Tabelle VIII

Medium Zusatz L-Lysinkonzentration

g/Liter

E-1 keiner 41

E-2 Kulturbrühe des L-Leucin

bildenden Stammes 57

E-3 L-Leucin 46

L _]

5 0 9 8 8 6/1063

Brevibacterium Iactofermenturn (FERM-P Nr. 1837) ATCC 21888 (ein L-Leucin bildender Stamm) wird gemäß Beispiel 1 angezüchtet. 1 Liter der Anzuchtkultur wird in 10 Liter eines Hauptfermentationsmediums in einem 30 Liter fassenden Fermenter überimpft. Das Hauptfermentationsmedium hat folgende Zusammensetzung:

Zuckerrübenmelasse 150 g/5, &ls Glucose)

MgSO₄-7H₂O 0.3 g/i,

KH₂PO₄ 0.7 g/i,

J₂SO₄ 20 g/i,

Die Züchtung wird 30 Stunden bei 30 C, einer Belüftungsgeschwindigkeit von 10 Liter/min und einer Rührgeschwindigkeit von 400 U/min durchgeführt. Der pH-Wert des Mediums wird mit 22 %iger wäßriger Ammoniaklösung auf 6,8 eingestellt. Nach beendeter Züchtung beträgt die L-Leucinkonzentration 15,8 g/Liter,

Beispiel 6

Beispiel 1 wird mit Corynebacterium glutamicum ATCC 21513 (ein L-Lysin bildender Stamm) wiederholt.

Es werden 3 verschiedene Nährmedien folgender Zusammensetzung hergestellt:

509886/106 3

Γ

*? ^ *^ I 9 9 9

Medium F-1:

Ammonium acetat	15	g/a
KH₂PO₄	• 2.	0 g/%
MgSO₄.7H₂O	0.	5 g/%
FeSO- 711 O fz 4-ß	0.	1 g/%
MnSO₄-4H₂O	0.	01 g/%
Biotin	50	y/l
Thiamin · Hydrochlorid Säurehydrolysat von Soj abohnenprotein	100 20	mg/ Jl g/£

Der pH-Wert des Mediums beträgt vor dem Sterilisieren 7,4.

Medium F-2: Medium F-1 +13 ml/Liter der gemäß Beispiel 5

hergestellten Kulturbrühe mit 15,8 g/Liter L-Leucin Medium F-3: Medium F-1 + 200 mg/Liter L-Leucin.

Jeweils 1 Liter der Anzuchtkultur wird in 10 Liter der vorgenannten 3 Nährmedien in einem 30 Liter fassenden Fermenter überimpft. Die Züchtung wird 62 Stunden bei 28 C, einer Belüftungsgeschwindigkeit von 10 Liter/min und einer Rührgeschwindigkeit von 400 U/min durchgeführt. Der pH-Wert des Mediums wird mit 60 %iger wäßriger Essigsäure bei 6,8 gehalten. 10 Stunden nach Beginn der Züchtung werden stündlich 50-mal jeweils 70 ml-Anteile einer wäßrigen Lösung zugegeben, die 13g Ammoniumacetat enthält. Während der Züchtung wird die Essigsäurekonzentration im Medium auf einem Viert von 0,5 bis 15 g/Liter gehalten. Nach beendeter Züchtung wird die L-Lysinkonzentration bestimmt. Die Ergebnisse

h 0 9 8 R B / 1 Π f; Ί

7Β31999

sind in.Tabelle IX zusammengefaßt.

Tabelle IX

Medium Zusatz L-Lysinkonzentration,

g/Liter

F-1 keiner 32

F-2 Kulturbrühe des L-Leucin

bildenden Stammes 48

F-3 L-Leucin · 35

Beispiel 7

Beispiel 6 wird wiederholt, jedoch wird die gemäß Beispiel 1 hergestellte Kulturbrühe des L-Leucin bildenden Stammes eingesetzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle X zusammengefaßt.

Tabelle X

Zusatz L-Lysinkonzentration,

g/Liter

keiner 30

Kulturbrühe des L-Leucin bildenden Stammes 49

L-Leucin 34

L -I

509886/1063

Claims

Γ Π Patentansprüche

1. Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin durch Züchtung einer L-Lysin bildenden Mutante von coryneformen Glutaminsäure bildenden Bakterien in einem Nährmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mutante in einem ersten Nährmedium züchtet, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie eine Kulturbrühe A enthält, die bei der Züchtung einer L-Leucin bildenden Mutante von coryneformen Glutaminsäure bildenden Bakterien in einem zweiten Nährmedium erhalten worden ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung in einem ersten Nährmedium durchführt, das 2 bis 150 ml/Liter der Kulturbrühe A enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß man dem ersten Nährmedium die Kulturbrühe A in Anteilen zusetzt und die gesamte Kulturbrühe A bis zum Ende der log-Phase zufügt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlenstoffquelle Melasse, Zuckerrübenmelasse, Glucose, Essigsäure oder ein Gemisch aus mindestens zwei dieser Stoffe verwendet.

509886/1 Π63

Γ Π

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als L-Lysin bildende Mutante einen Mikroorganismus der Art Brevibacterium aminogenes, Brevibacterium divaricatum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium roseum, Brevibacterium saccharolyticum, Brevibacterium
immariophilium, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium herculis, Corynebacterium liliurn, Corynebacterium callunae, Microbäcterium ammoniaphilum und
Arthrobacter species einsetzt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als L-Leucin bildende Mutante ein Mikroorganismus der Art
Brevibacterium aminogenes, Brevibacterium divaricatum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium roseum, Brevibacterium saccharolyticum, Brevibacterium
immariophilium, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium herculis, Corynebacterium lilium, Corynebacterium callunae, Microbäcterium ammoniaphilum und
Arthrobacter sp. eingesetzt worden ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung der L-Lysin bildenden Mutante bei Temperaturen von 25 bis 40°C und einem pH-Wert von 6 bis 8,5 durchführt.

8. Verfahren zur Herstellung von L-Lysin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine L-Leucin bildende Mutante von coryneformen Glutaminsäure bildenden Bakterien 48 bis 120 Stunden in einem ersten Nährmedium unter Bildung einer Kultur-

509886/1 Π 63

? R 3 i ^cs Π Π

brühe A züchtet, die Kulturbrühe A in ein zweites Nährmedium einspeist, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, in diesem Nährmedium eine L-Lysin bildende Mutante von coryneformen Glutaminsäure bildenden Bakterien züchtet und aus dem Nährmedium L-Lysin isoliert.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlenstoffquelle Melasse, Zuckerrübenmelasse, Glucose oder Essigsäure oder ein Gemisch von mindestens zwei dieser Verbindungen einsetzt.

10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kulturbrühe A der L-Leucin bildenden Mutante dem zweiten Nährmedium in einer Menge von 2 bis 150 ml/Liter, bezogen auf das Volumen des zweiten Nährmediums, zuführt.

11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man aus der Kulturbrühe A vor der Zugabe zum zweiten Nährmedium die Zellen abtrennt.

L _J

509886/10 6 3

ORIGINAL INSPECTED