DE2108404C3 - Verfahren zur Erzeugung von L-Arginin durch Mikroorganismen - Google Patents
Verfahren zur Erzeugung von L-Arginin durch MikroorganismenInfo
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Description
I.-Arginin ist eine wichtige Aminosäure und ist als Lebensmittelzusatzstoff, in der Medizin und als Tier
futtermittelzusatzstoff angewendet worden.
L-Argmin ist in technischem Umfang aus naturh
< hem Protcinhydrolysat mit verhältnismäßig hohen
Kosten in einer komplexen Isolierungsarbeitsweise hergestellt worden Hs ist bekannt, daß gewisse Bakterien
von Corvnebacterium olcophila und Brevibacteiium
inccrtum !.-Arginin aus Kohlenwasserstoffen
in sehr geringer Konzentration erzeugen (l'.S.-P. 322225X und IS-P. 3440141)
Gemäß der US-PS 3 222 25H werden Aminosäuren
durch Mikroorganismen in Kulturmedien hergestellt, die Kohlenwasserstoffe oder Mischungen davon als
Hauptquellc von assimilierbarem Kohlenstoff enthüllen.
Die Ausbeute an 1 -Arginin bei dem bekannten Verfahren ist sehr gering und betragt maximal 0.3Vf.
Gemäß der IS-PS .1440 141 betragt die Höchst
ausbeute 0.0532 g ill und ist ebenfalls als sehr gering /u bezeichnen
Aufgabe der Lrfindung ist die Hereltstellung eines
Verfahrens zur I r/eugiing von I.-Arginin durch Mi
kroorganismcn an einem eine Kohlenstoffqucllc eiithaltenden
Kulturmedium, wobei im Vergleich mit den bekannten V erfahren eine wesentlich hohrere Aus
beute erzielt wird
Das Verfahren pe maß der I rliiuliing zur Herste!·
lung vim I Arginin durch Mikroorganismen in einem eine Kohlcnstnffquclle enthaltenden Kulturmedium
ist dadurch gekennzeichnet, daß man ein Hakterium.
das zur Galtung Brevibaeterium oder ( orynehactcriuni
gehurt und die I .ihigkcü hat.!. Arginin aus einem
Kohlenhydrat zu erzeugen, auf einem Kulturmedium /lichtet, das wenigstens ein assimilierbares
Kolilcnhydnil. eine assimilierbare organische Siiure
oder einen assimilierbaren Alkohol als Kohlenstoffquelle enthalt, und angesammeltes I.-Arginin aus der
Züchtungshrühe gewinnt.
Mikroorganismen, die bei der vorliegenden lirfinilung
angewendet werden können, haben die fiihigkeit, L-Arginin in einem Kulturmedium zu erzeugen,
das ein KohJenhydrat, eine organische Säure, einen Alkohol oder eine Mischung davon enthält, und sie
schließen Brevibacterium flavum ATCC 21493 und
• Coryneb&cterium acetoacidophilum AJ-3278 (FERM
P-630, wobei die FERM P-No. sich auf den Mikroorganismus bezieht, der in dem Fermentation Research
Institute, Agency of Industrial Science and Technology, the Ministry of the Industrial Trade and Industry,
in Japan, hinterlegt worden ist) ein.
Es können auch geringere Mengen von organischen und anorganischen Stoffen, wie Vitamine, Aminosäuren,
Maiseinweichflüssigkeit, Proteinhydrolysat oder Pepton, den Kulturmedien zugesetzt werden. Bei-
'. spiele von assimilierbaren Kohlenhydraten sind Glucose.
Sucrose, Stärkehydrolysat und Stärke, wobei die assimilierbaren organischen Säuren ac Essigsäure,
Glucosesäure, Bernsteinsäure und Citronensäure bestehen, und der Alkohol kann /um Beispiel aus Ätha-
•i· nol bestehen.
Zur Erzielung einer guten Ausbeute von L-Arginin wird die Gärung aerob unter Rühren, Belüftung und
oder anderer Bewegung ausgeführt. Die Gärung wird bei 24 bis 37 ° C 2 bis 7 Tage bei einem pH-Wert von
. 5,0 bis y,0 durchgeführt. Der gewünschte pH-Wert kann durch Zusatz von anorganischer oder organischer
Säure oder einer alkalischen Verbindung, wie Harnstoff, Calciumkarbonat oder gasförmigem Ammoniak
zu dem Medium aufrechterhalten werden.
;■· Das in der Gärungsbrühe angesammelte L-Arginin
kann durch übliche Verfahren, wie /.. B. durch Anwendung
eines Ionenaustauscherharze in Kombinationmiteiner Fällung gewonnen werden. Das !.-Arginin
wurde durch die Hrgehnis.se einer Ninhydrinreak-
,. tion auf einem Papicrchrotnatogramm. Rf-Werten auf
dem Papierchromatogramm, einer positiven Sakagtichi Reaktion und Wachstumskurven von Arginin erfordernden
Mutanten \on Milchsaurebakterien. bestätigt. Das I -Arginin in der Brühe wurde durch
in Bioerprobung unter Anwendung von I euconostoc
mcsenteroides AK C XO42 bestimmt
Is wurde cmc MIO ml-Menge eines Mediums mit
-.. einem Gehalt von 10 g dl Glucose. 0,1 g/dl KILPO1.
0.04 g dl MgSO1 7H.O. 4 g dl (NH1J1SO4. H)Oy I
Biotin. 200 γ I Vitamin B1 HCI, 2 I eile je Million
I-C und Mn-Ionen. I ml dl Sojahohnenprotcin-Hydrolysat
und 5 g/dl ( a( O1. mit e ;em pH-Wert von
.., 7.0. in ein Glasgargcf.iß eingebracht, nach Sterilisierung
wurde das Medium mit Hrcvibacterium flavum
ATCC 2141M. das zuvor auf einer Bouillonschrage
bei 10 C 24 Stunden gezüchtet worden war. angeimplt
und bei 11 (IM Stunden urler Belüften ge-
., /lichtet und ge ι uhr) Die /licht ungsbriihe enthielt, wie
gefunden wurde. 2.1 g dl I Arginin
I I lter der /iii htiingsliriihe wurde zentrifugiert,
um bakterielle /eilen und andere feste Substanzen zu entfernen, wobei die liberstehende Flüssigkeit aiii
... eine Saufe, die nut K.iiinnsaustiiuschharz gefüllt w;ir.
geführt und L-Arginin wurde mit 2n-Animoniakwasser cluicrt. Das Hluat wurde konzentriert, rohes kristallines
L-Arginin wurde aus Wasser umkristallisicrt und 12 g reines I -Arginin wurden erhalten.
Corynchiictei'ium aeetoacidophilum AJ-32 7S
(IKKM P-MO) wurde auf einem 20 ml-Mcdium. das
IU g/dl Sucrose, 0,1 g/dl KH1PO4, 0,04 g/dl
MgSO, 7H2O, 4 g/dl (NHJ2SO4," 200 y/l Biotin,
200 y/l Vitamin F., · HCl, 2 Teile je Million Fe und Mn-Ionen und 5 g/dl CaCo1, mit einem pH-Wert von
7,0 enthält, bei 30° C 72 Stunden unter Schütteln gezüchtet.
Die Züchtungsbrühe enthielt, wie gefunden wurde, 1,8 g/dl L-Arginin.
Brevibacterium flavum ATCC 21493 wurde bei
31,5° C 12 Stunden auf einem Saatkulturmedium, das 3,0 g/dl Stärkehydrolysat (Glucoseäquivalent),
0,3 g/dl Ammoniumazetat, 0,15 g/dl KH1PO4,
0,04 g/dl MgSO4 7H,O, 2 Teile je Million Fe" und
Mn-Ionen, 3,0 ml/dl Sojabohnenprotein-Hydrolysat 50 y/I Biotin, 300 y/I Vitamin B1 HCl und 0,2 g/dl
Harnstoff mit einem pH-Wert von 7,0 enthält, gezüchtet.
15 ml der Saatkultur wurden zugegeben, um ein
300 ml Hauptzüchtungsmedium anzuimpfen, das je di 0,8 g Ammoniumazetat, 0,41 g Natriumazetat, 0,10 g
KH2PO4, 0,04 g MgSO4 7H2O, 2 Teile je Million
(2 ppm) Fc und Mn-Ionen, 0,2 g/dl Harnstoff, 2 ml Sojabohnenprotein-Hydrolysat, 50 y/l Biotin und
200 y/l Vitamin B1 HCl enthielt und wurde in einem 500 ml Gärgefäß bei 31,5" C mit 1350 U/min und
unter Einführung von einem halben Volumen Luft je Minute, gezüchtet.
Als der pH-Wert des Mediums nach 6 Stunden nach der Animpl^rig 8,2 erreichte, begann man mit
dem Zusatz 60%iger Essigsäure und gasförmigen Ammoniaks, während der nH-Wert des Mediums
zwischen 7,5 und 8,0 gehalter. wi."-<le. Die Gärung
wurde 48 Stunden ausgeführt, 18 Vulumen-ri Essigsäure
je Volumen des ursprünglichen Mediums wurden verbraucht, und die Züehtungsbrühc enthielt, wie
gefunden wurde, 2,60 g L-Arginin pro dl. (KU)Vr Ausbeute bezogen auf die verwendete Lssigsaure.)
Aus 500 ml Züchtungsbrühe erhielt man 10.0 g L-Arginin.
Corynebacterium acetoacidophilum FERM P-630 wurde 55 Stunden in gleicher Weise wie in Beispiel 3
gezüchtet, 16 Volumen-% Essigsäure je Volumen des ursprünglichen Mediums wurden verwendet und
1,22 g/dl L-Arginin wurden in der Züchtungsbrühe gefunden.
Ein Züchtungsmedium von einem pH-Wert von 7,2, das 1,5 ml/dl Äthanol, 0,5 g/dl (NH4),SO4,
0,1 g/dl KH2PO4,0,04 g/dl MgSO4 7H2O, 2 Teile je
Million Fe-lonen, 2 ml dl Sojabohnenprotein-Hydrolysat,
100 y/l Biotin, 50 y/l Vitamin B1 HCl und 0, i ml/dl Maiseinweichflüssigkeit enthält, wurde hergestellt,
eine 300 ml-Menge des Mediums wurde in ein Glasgärgefäß eingebracht und mit 30 ml einer
Saatkultur von Brevibacterium flavum ATCC 114"J3
angeimpft, die in gleicher Weise wie in Beispiel 3, hergestellt worden ist. Die Fermentation oder Gärung
wurde durch Rühren bei M)' C bei 1500 U/min und
unter Einführung des gleichen Luftvolumens wie dem des Mediums je Minute während der Fermentation
oder Gärung wurde der pH-Wert des Mediums innerhalb eines Bereiches von 7,0 bis 7,5 unter Zusatz gasförmigen
Ammoniaks aufrechterhalten. Äthanol wurde dem Medium von Zeit zu Zeit zugeführt, als
die Äthanolmenge in dem Medium während der Mengenbestimmung durch Gaschromatographie unter
0,1 ml/dl absank.
Nach 48 Stunden Züchtung wurden 0,"6gdl L-Arginin
in der Züchtungsbrühe gefunden. (K.2rv Ausbeute bezogen auf das verwendete Äthanol.)
Heispiel 6
Corynehactcrium aceioacidophilum FHRM P-MO
wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 5 gezüchtet und die /iichtungsbrühe en'hieit. wie gefunden
wurde,0.7S g/dl L-Arginin. (7.3'; Ar Ix-ute bezogen
auf das verwendete Äthanol.)
Claims (3)
1. Verfahren zur Herstellung von L-Arginin
durch Mikroorganismen in einem eine Kohlenstoffquelle enthaitenden Kulturmedium, dadurch
gekennzeichnet, daß man ein Bakterium, das zur Gattung Brevibacterium oder
Corynebacterium gehört und die Fähigkeit hat, L-Arginin aus einem Kohlenhydrat zu erzeugen,
auf einem Kulturmedium züchtet, das wenigstens ein assimilierbares Kohlenhydrat, eine assimilierbare
organische Säure oder einen assimilierbaren Alkohol als Kohlenstoffquelle enthält, und angesammeltes
L-Arginin aus der Züchtungsbrühe gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß das Bakterium aus Brevibacterium flavum ATCC 21493 besteht.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß das Bakterium aus Corynebacterium acetoacidophilum FERM P-630 besteht.
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