DE1967074C3 - Verfahren zur Herstellung von a-Aminobenzylpenicillin - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von a-Aminobenzylpenicillin

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Description

eines Enzyms, das durch Züchten von Pseudomonas ι ο aeroben Bedingungen erhalten wurde, umsetzt
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von a-Aminobenzylpenicillin.
Ä-Aminobenzylpenicillin stellt eine therapeutisch wertvolle Substanz dar und man ist seit langem bestrebt, diese Substanz auf möglichst einfache und möglichst wirtschaftliche Weise herzustellen.
Es wurde nun gefunden, daß dieses Ziel überraschenderweise dadurch erreicht wird, daß man Penicillin G, Penicillin V oder ein Natrium- oder Kaliumsalz davon mit dem Kalium- oder Natriumsalz, dem Methyl- oder Äthylester oder dem Amid der Λ-Aminophenylessigsäure in Gegenwart eines Enzyms, das durch Züchten von Pseudomonas sp. ATCC 21284, Kluyvera citrophila
NH2
•»-Aminophenylacetat
is ATCC 21285, Streptomyces phaeochromogenes ATCC 21289, Nocardia globerula ATCC 21292, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15246, Arthrobacter simplex ATCC 15799 oder Comynebacterium fascians ATCC 12975 in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen erhalten wurde, umsetzt
Der Ablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens kann durch die nachfolgend angegebenen Reaktionen schematisch dargestellt werden.
Wird Penicillin G als Substrat verwendet, dann verläuft die Reaktion nach folgendem Reaktionsmechanismus:
HHS CH,
I l/\/
CH2CONH C-C C
CH3
C-N C—COOH
y η
<C~\- CH2COOH + <T^-CHCONH
Penicillin G
HHS
! I/ \ -c—c (
CH3
NH2
CH,
C-N-
-C-COOH
H
Zur Züchtung der erfindungsgemäß eingesetzten Mikroorganismenstämme kann sowohl ein künstliches als auch ein natürliches Nährmedium verwendet werden, vorausgesetzt jedoch, daß es die für das Wachstum der Mikroorganismenstämme erforderlichen Nährstoffe enthält. Die dafür erforderlichen Nährstoffe sind bekannt. Es handelt sich dabei in erster Linie um eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Verbindungen und übliche Zusätze.
Als Kohlenstoffquelle kommen beispielsweise Kohlehydrate, wie Glukose, Fruktose, Maltose, Rohrzucker, Stärke, Stärkehydrolysate, Melassen oder Sorbit in Frage. Man kann auch organische Säuren verwenden, wie z. B. Essigsäure oder Milchsäure. Diese Substanzen können entweder einzeln oder in Form von Mischungen aus zwei oder mehreren Substanzen verwendet werden. Bei Verwendung von Kohlenwasserstoffe assimilierenden Mikroorganismen können Kohlenwasserstoffe, wie η-Paraffine, Erdölbestandteile, Kerosin, Leichtöle oder Schweröle, in dem Nährmedium als einzige Kohlenstoffquelle oder als Hauptkohlenstoffquelle verwende! werden.
Als Stickstoffquelle kommen verschiedene Arten vor anorganischen oder organischen Salzen oder Verbindungen in Frage. Erwähnt seien beispielsweise Harnstoff, flüssiges Ammoniak oder Ammoniumsalze, wie beispielsweise Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat oder Ammoniumphosphat. Ferner kommen natürliche Substanzen ir Frage, die Stickstoff enthalten, wie beispielsweise Mais quellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fisch mehl, Fleischbrühe, Kaseinhydrolysate, Kasaminosäure lösliche Fischbestandteile oder Reiskleieextrakt. Diese Substanzen können ebenfalls entweder für sich alleir oder in Kombination aus zwei oder mehreren Substan zen verwendet werden.
Anorganische Verbindungen, die dem Kulturmedium zugesetzt werden können, sind beispielsweise Magnesiumsulfat, Natriumpbospbat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphai, Eisensulfat, Manganchlorid, Calciumchlorid, Natriumchlorid oder Zinksulfat
Das Züchten wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, beispielsweise durch aerobes Schütteln der Kultur oder durch Rühren und Belüften einer Submerskultur, und zwar bei einer Temperatur von beispielsweise ungefähr 20 bis 500C und bei einem pH-Wert von beispielsweise 5,0 bis 9,0. Das Züchten wird im allgemeinen während einer Zeitspanne von etwa 1 bis 7 Tagen durchgeführt.
Die Enzyme, die zur Durchführung der erfindungsgemäßen Reaktionen erforderlich sind, werden in den Mikroorganismenzellen sowie in der Kulturbrühe selbst synthetisiert. Das Enzym kann den Ausgangsmaterialien entweder in Form der Kulturbrühe selbst, der Mikroorganismenzellen, der Kulturbrühe, die nach der Entfernung der Mikroorganismenzellen anfällt, oder in Form einer Enzymlösung, die durch Reinigen dieser Substanzen nach bekannten Methoden erhalten worden ist, beispielsweise durch Aussalzen mittels Ammoniumsulfat, durch eine Dialyse, durch Ausfällen durch Aceton oder Äthanol oder durch Säurenchromatographie, zugesetzt werden. Wenn Mikroorganismenzellen eingesetzt werden, werden sie als solche, in Form von Suspensionen oder in Form getrockneter Zellen verwendet (das Trocknen kann unter Verwendung von Aceton durchgeführt werden). Wird eine Kulturbrühe selbst verwendet, dann wird das Substrat-Penicillin der Kulturbrühe als solches zugesetzt. Die Reaktion wird durchgeführt, nachdem der pH-Wert auf beispielsweise 6,5 bis 7,0 eingestellt worden ist.
Im allgemeinen wird die Reaktion in einer Reaktionslösung durchgeführt, die durch Zugabe der zwei Substrate sowie entsprechender Mengen der Enzymmaterialien zu einer Pufferlösung mit einem definierten pH-Wert hergestellt worden ist. Außerdem kann die Reaktion in einer Gärungsflüssigkeit, wie sie vorstehend erwähnt wurde, durchgeführt werden. Dieser Gärungsflüssigkeit werden die zwei Substrate zugesetzt. Die Reaktion kann innerhalb eines breiten pH-Bereiches durchgeführt werden, beispielsweise innerhalb eines pH-Bereiches von 3 bis 8. Ein optimaler pH-Bereich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Reaktion liegt zwischen 5,5 und 7,5 und vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,3. Die Reaktion wird bei 25 bis 50° C und vorzugsweise bei einem Wert zwischen 35 und 38° C während einer Zeitspanne von 1 bis 24 Stunden durchgeführt.
Das nach Beendigung der Reaktion erhaltene <x-Aminobenzylpenicillin läßt sich in einfacher Weise nach üblichen Methoden abtrennen. In vorteilhafter Weise werden diese Verbindungen in der Weise gewonnen, daß ein? Überführungsextraktion oder eine Ausfällung mittels organischer Lösungsmittel mit einer Ausfällung am isoelektrischen Punkt,einer lonenaustauscher-Harzbehandlung oder einer Säulenchromatographie kombiniert wird.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Sofern nicht anders angegeben, beziehen sich die Prozentangaben auf das Gewicht pro Liter Wasser.
Beispiel 1
Als Impfmikroorganismus wird Kluyvera citrophila ATCC 21285 verwendet. Eine Platinöse des Impfmikroorganismus wird in einen 250-mI-Erlenmeyer-Kolben überimpft, der 20 ml Impfkultur enthält, die besteht aus 1% Pepton, 1% Fleischextrakt, 0,5% Hefeextrakt und 03% Natriumchlorid, Die Kultivierung wird unter aerobem Schüttlen bei 30°C während einer Zeitspanne von 24 Stunden durchgeführt 2 ml der dabei erhaltenen Impfkulturbrühe werden in einen 250-ml-Erlenmeyer-Kolben überimpft, der 20 ml eines Fermentationsmediums der nachfolgend angegebenen Zusammensetzung enthält:
0,5% Pepton
0,5% Hefeextrakt -
2,5% Maisquellwasser
0^% Natriumchlorid
0,5% Natrium-L-glutamat
0,2% Ammoniumphenylacetat
Der pH-Wert des Fermentationsmediums vor der Sterilisation beträgt 7,3. Der pH-Wert wird mit 5 n-NaOH eingestellt
Nach 43stündiger Kultivierung unter aerobem Schütteln bei 30°C werden die dabei erhaltenen Mikroorganismenzellen durch Zentrifugenabscheidung von der Fermentationsbrühe abgetrennt und danach zweimal mit einer 0,9%igen Natriumchloridlösung gewaschen.
Anschließend werden die Zellen in einem 1/30-M-Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,8 in einer Menge von 10 mg/ml, .bezogen auf die getrockneten Zellen, suspendiert. Es werden das Kaliumsalz von Penicillin G und a-Aminophenylacetatamid in Mengen
jo von 3 mg/ml bzw. 10 mg/ml zugegeben. Anschließend läßt man die Reaktionsiösung 5 Stunden lang bei 37° C reagieren.
Die Menge an in der Reaktionslösung gebildetem <x-Aminobenzylpeniciliin beträgt 2,52 mg/ml.
Beispiel 2
Als Impfmikroorganismen werden Streptomyces
phaeochromogenes ATCC 21289 und Nocardia globerula ATCC 21292 verwendet. Außerdem wird ein Fermentationsmedium der nachfolgend angegebenen Zusammensetzung verwendet:
3% lösliche Stärke
2% Sojabohnenpulver
0,2% Natriumchlorid
0,5% Hefeextrakt
0,5% Pepton
Das Fermentationsmedium hat vor der Sterilisierung einen pH-Wert von 7,3. Die übrigen Kultivierungsbedingungen sind die gleichen wie in Beispiel 1.
Nach 4tägiger Kultivierung werden bei Verwendung von Streptomyces phaeochromogenes ATCC 21289 25 mg/ml Penicillin V und bei Verwendung von Nocardia globerula ATCC 21292 25 mg/ml Penicillin G jeweils zusammen mit 10 mg/ml des Λ-Aminophenylacetatmethylesters der Fermentationsbrühe zugesetzt. Der pH-Wert der Fermentationsbrühe wird auf 6,8 eingestellt, anschließend wird die Kultivierung fortgesetzt. Während der Kultivierung wird der pH-Wert der Fermentationsbrühe unter Verwendung von Chlorwasserstoff säure oder Natriumhydroxid alle 30 min auf 6,8 eingestellt. Die Menge des 6 Stunden nach der Zugabe des Substrats zu Streptomyces phaeochromogenes ATCC 21289 in der Fermentationsflüssigkeit angereichertes Λ-Amonobenzylpenicillins beträgt 1,27 mg/ml. Bei Verwendung von Nocardia globerula ATCC 21292 erhält man 2,04 mg/ml «-Aminobenzylpenicillin in der Fermentationsbrühe.
Beispiel 3
Als Impfmikroorganismus verwendet man Corynebacterium fascians ATCC 12975. Das Impfkulturmedium enthält 1% Pepton, 1% Fleischextrakt,0,5% Hefeextrakt und 0,25% Natriumchlorid.
Eine Platinöse des Impfmikroorganismus wird in einem 250-ml-Erlenmeyer-Kolben überimpft, der 20 ml des Impfmeriiums enthält, und die Kultivierung wird 24 Stunden lang unter aerobem Schütteln bei 30° C durchgeführt.
2 ml der dabei erhaltenen Impfkulturbrühe werden in einen 250-ml-Erlenmeyer-K.olben überimpft, der 20 ml eines Fermentationsmediums der nachfolgend angegebenen Zusammensetzung enthält:
5% n-Paraffin-Mischung (eine Mischung aus
äquivalenten Mengen von Cn bis Cu-n-
Paraffinen)
03% Phenylacetat
2% (NH4J2SO4
0,15% KH2PO4
0,05% MgSO4 · 7 H2O
0,001% MnSO4 · 4 H2O
0,01% FeSO4 - 7 H2O
0,5% Hefeextrakt
0,2% Maisquellwasser
2% CaCO3
Der pH-Wert des Fermentationsmediums vor der Sterilisierung beträgt 73.
Nach 72stündiger Kultivierung bei 30°C unter aerobem Schütteln der Kultur werden die Mikroorganismenzellen durch Zentrifugieren von der Fermentationsbrühe abgetrennt, zweimal mit einer 0,9%igen Natriumchloridlösung gewaschen und dann in einem l/30-M-Phosphatpuffer mit einem pH-Weil von b,9 in einer Menge 8 mg/ml (bezogen auf die getrockneten Zellen) suspendiert. Danach werden 3 mg/ml des ■ Kaliumsalzes von Penicillin G und 10 mg/ml a-Aminophenylacetatmethylester zu der Lösung zugegeben. Die Lösung läßt man 5 Stunden lang bei 37°C reagieren.
Die Menge des danach in der Reaktionslösung erhaltenen Ä-Aminobenzylpenicillins beträgt 1,86 mg/ml.
Beispiel 4
Als Impfmikroorganismen werden Pseudomonas sp. ATCC 21284, Arthrobacter simplex ATCC 15799 und Pseudomonas aeruginosa ATCC 15246 verwendeL Die
π Impfkultur, die daraus resultierende Hauptkultur, die Abtrennung der Mikroorganismen von der Fermentaticnsbrühe und das Suspendieren derselben in einem Puffer werden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt, jedoch mit dem Unterschied, daß in der
2» Hauptkultur das Fermentationsr.-:dium kein Ammoniumphenylacetai enthält.
Es werden das Kaliumsalz von Penicillin G und Methyl-a-aminophenylacetat in Mengen von 3 mg/ml bzw. 10 mg/ml zugegeben. Danach läßt man die Re-
2") aklio-islösung 5 Stunden lang bei 37° C reagieren. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben.
Verwendeter Mikro- Menge des gebildeten
id Organismenstamm ATCC Nr. Λ-Aminobenzylpenicillins
(mg/ml)
21284
15799
15246
1,56
1,72
1,63

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Verfahren zur Herstellung von Λ-Aminobenzylpenicillin, dadurch gekennzeichnet, daß man Penicillin G, Penicillin V oder ein Natrium- oder ein Kaliumsalz davon mit dem Kalium- oder Natriumsalz, dem Methyl- oder Äthylester oder dem Amid der Λ-Aminophenylessigsäure in Gegenwart sp. ATCC 21284, Kluyvera citrophila ATCC 21285, Streptomyces phaeochromogenes ATCC 21289, Nocardia globerula ATCC 21292, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15246, Arthrobacter simplex ATCC 15799 oder Corynebacterium fascians ATCC 12975 in einem wäßrigen Nährmedium unter
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