DE2209591A1

DE2209591A1 - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-5-Hydroxytryptophan

Info

Publication number: DE2209591A1
Application number: DE19722209591
Authority: DE
Inventors: Shiro Saitama; Kitajima Nakao; Takeda Isao; Tokio; Watanabe (Japan). P
Original assignee: Asahi Kasei Kogyo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1971-03-04
Filing date: 1972-02-29
Publication date: 1972-09-14
Also published as: FR2128587A1

Description

ASAHI IiASPJI KOGYO KABUSHIKI KAISHA,
Osaka, Japan

" Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-5-Hydroxytryptophan "

Priorität: 4. März 1971, Japan, Nr. 10 955/71

27. September 1971, Japan, Nr. 74 670/71 -^

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-5-Hydroxytryptophan, nachstehend abgekürzt mit L-5HTP bezeichnet.

L-5HTP ist ein wichtiges Stoffwechsel-Zwischenprodukt, aus dem durch Decarboxylierung L-5-Hydroxytryptamin (Serotonin) entsteht, L-5IITP hat in neuerer Zeit besonderes Interesse als Mittel zur Behandlung von Depressionen gefunden. Dementsprechend ist ein wirtschaftliches und billiges Verfahren zur Herstellung dieser

Verbindung erv/ünscht.

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Es sind verschiedene biotechniscne Verfahren zur Herstellung von I,-5HTP bekannt. Bei einem Verfahren wird Tryptophan mit einem Enzym wie Tryptophan-5-hydroxylase aus Chromobacterium violaceum hydroxyliert; vergl. C. Mitoma et al., Arch. Biochem. Biophys., Bd. 63 (1956), S. 122. Ferner ist ein Verfahren bekannt, bei dem 5-Hydroxyindol mit einem Enzym, wie Tryptophan-Synthetase aus Claviceps purpurea, Cordyceps militaris oder Aspergillus oryzae, behandelt wird; vergl. E. Mutscher et al., Arch. Pharm., Bd. 301 (1968), S. 291. Diese Verfahren sind jedoch v/eder hinsichtlich der Ausbeute noch in anderer Hinsicht befriedigend. Verfahren zur Herstellung von L-5HTP auf chemischem Wege sind ebenfalls unwirtschaftlich. Dementsprechend ist die Verbindung zur Zeit noch nicht leicht zugänglich und daher teuer.

Es ist bekannt, daß das Enzym Tryptophan-Synthetase, das die Bildung von L-Tryptophan aus Indol katalysiert (Enzyme dieser Art v/erden im allgemeinen als Tryptophan-Synthetasen bezeichnet)» in den verschiedensten Mikroorganismen, wie Bakterien, Hefen, Actinomyceten und Pilzen vorhanden ist.

Die vorliegende Erfindung beruht auf dem überraschenden Befund, daß einige Mikroorganismen in hoher Ausbeute L-5HTP aus . 5-IIydroxyindol zu bilden vermögen.

Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-i)-Hydroxytryptophan, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen zur Bildung von L-Tryptophan aus Indol und Serin fähigen Mikroorganismus in einem Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze

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und organische Nährstoffe enthaltenden Nährmedium züchtet und die Zellen mit 5-Hydroxyindol oder einem Gemisch aus 5-Hydroxyindol und Serin zusammenbringt.

Man kann im erfindungsgemäßen Verfahren die Mikroorganismen zunächst auch in Abwesenheit von 5-Hydroxyindol oder einem Gemisch aus 5-Hydroxyindol und Serin züchten, danach die Mikroorganismen isolieren, und in einer wäßrigen Phosphat enthaltenden Lösung suspendieren, der man 5-Hydroxyindol oder ein Geraisch aus 5-Hydroxyindol und Serin einverleibt.

Im erfindungsgemäßen Verfahren werden vorzugsweise Mikroorganismen verwendet, die mindestens 0,2 mg/ml L-Tryptophan gemäß dem nachstellend erläuterten Test zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität der Tryptophan-Synthetase bilden. Dieser Test wird folgendermaßen durchgeführt:

Eine Flüssigkeit, die 2 mg/ml Indol, 2 mg/ml L-Serin, 100 mMol rhosphatpu.fier vom Pjj-VJert 8,0 und 40 mg/ml der zu untersuchenden gefrorenen Zellen enthält, wird eine bestimmte Zeit reagieren gelassen. Danach wird eine bestimmte !!enge der Flüssigkeit papierchromatographisch entwickelt und die Tryptophanfraktion nil. Y.'asser extrahiert. Anschließend wird der Extrakt colorimetrisch nach cer Xanthydrolmethode - S. R. Dickman et al., J.l-.C, Bd. 220 (1956), S. 957 - bestimmt und die Konzentration an L-Tryptoplian anhand einer Standarakurve abgelesen.

Es gibt zahlreiche Mikroorganismen, die den vorstehend beschriebenen enzyraatisehen Aktivitätstest erfüllen. Diese Mikroorganismen finden sich unter Bakterien, Hefen, Actinomyceten

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und Pilzen. Beispiele für Bakterien sind diejenigen, die der Gattung Corynebacterium, Brevibacterium, Jflicrobacterium, Micrococcus, Bacillus, Flavobacterium, Agrobacterium, Aerobacter, Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Protaminobacter, - Erwinia, Arthrobacter, Serratia, Staphylococcus,

und Achromobacter
Sarcina, Xanthomonas/angehören. Spezielle Beispiele für diese

Bakterien sind Corynebacterium sp. Nr. 14001 (FERM-P Nr. 1048), Corynebacterium melassecola ATCC 17965» Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872, Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354, Micrococcus luteus ATCC, 21102, Bacillus subtilis ATCC 14593, Flavobacterium arborescens ATCC 4358, Agrobacterium tumefaciens IFO 3058, Aerobacter aerogenes IFO 3317, Escherichia coli ATCC 9637, Proteus mirabilis IFO 3849, Pseudomonas fragi IFO 3458, Protaminobacter alboflavus IFO 3707, Erwinia carotovora IFO 3057, Arthrobacter globiformis ATCC 8010, Serratia marcescens IFO 3046, Staphylococcus citreus ATCC 4012, Sarcina lutea ATCC 15176, Xanthomonas

und Achromobacter petrophilum FEPM-P 239 pruni IFO 3511/ Besonders bevorzugte Bakterien sind Corynebacterium sp. Nr. 14001 (FERM-P Nr. 1048) und Agrobacterium tumefaciens IFO 3058. Spezielle Beispiele für verwendbare Hefen sind Hansenula anoniala IFO 0118, Candida petrophilum ATCC 20226, Brettanomyces potrophilum ATCC 20224, Torulopsis petrophilum ATCC 20225 und Saccharornyces cerevisiae ATCC 7754. Spezielle Beispiele für verwendbare Actinomyceten sind liocardia asteroides IFO 3384 und Streptorayces aureus ATCC 3309. Spezielle Beispiele für verwendbare Pilze sind Penicilliura chrysogenum ATCC 15241 und Aspergillus oryzae IFO 4075.

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"■ j ~

Stämme von Corynebacterium sp. Nr. Ί4001 sowie Agrobacterium tumefa.ciens z.B. können L-Tryptophan in Mengen von 3,80 mg/ml "bzw. 3,75 mg/ml erzeugen. Die Konzentration wurde nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren bestimmt.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendbaren Mikroorganismen sind nicht nur auf die vorstehend erwähnten Mikroorganismen beschränkt, sondern es können alle Mikroorganismen verwendet werden, die zu den Gattungen der vorgenannten Stämme gehören und die L-Tryptophan aus Indol und Serin bilden können. Varianten und Mutanxen Können ebenfalls im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.

Unter den im erfindungsgemäßen Verfahren verwendbaren Mikroorganismen ist Corynebacterium sp. Nr. 14001 (FERM-P Nr. 1048) ein neuer Stamm, dessen mycologische Eigenschaften nachstehend zusammengestellt sind.

(1) Morphologische Eigenschaften:

Schmale Stäbchen mit den Abmessungen 0,5 bis 1,0 χ 3,0 Mikron. Ziemlich verschieden in der Gestalt, stäbchenähnlich, zweigähnlich usw. Nicht beweglich, grara-positiv.

(2) Wachstumaverhalten;

(a) Einfache Bouillon-Agarkultur: Wachstum gerunzelt und erhöht, im Umfang wellig und von hellzinnoberroter Farbe.

(b) Bouillon-Agar-Schrägkultür: Wachstum warzig und mäßig. Keine Änderungen v/erden im Medium beobachtet. Hellzinnoberrote Farbe.

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(c) Kultur in flüssiger Bouillon: Mäßiges Wachstum mit geringer Trübung. Es bildet sich eine Fällung.

(d) Gelatine-Stichkultur: Keine Verflüssigung, {e) Lakmus-Milch: Unverändert.

(3) Physiologische Eigenschaften:

(a) Reduktion von Nitraten: Positiv.

(b) Bildung von Indol: Negativ.

(c) Bildung von Schwefelv/asserstoff: Geringfügig.

(d) Bildung von Ammoniak: Positiv.

(e) VP-Test: Negativ.

(f) MR-Test: Negativ.

(g) Hydrolyse von Stärke: Positiv,
(h) Katalase: Positiv.

(i) Spaltung von Sacchariden: Aus Glucose, Fructose, Mannose und Glycerin v/erden Säuren gebildet. Keine Gasbildung.

(k) V/achsturasbereich: p_H 4,0 bis 9,0; 20 bis 40°C.

Auf Grund der vorstehenden Ergebnisse und nach Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7. Auflage, gehört dieser Stamm zur Gattung Corynebacteriura. Der vorliegende Stamm unterscheidet sich jedoch von Corynebacterium pseudotuberculosis in seinem Verhalten bei der Nitratreduktion, obwohl er ähnliche Wachstumseigenscha.ften zeigt. Ferner handelt es sich bei dem vorliegenden Stamm nicht um Corynebacterium raurisepticum, da er nicht in langen Fäden wächst. Corynebacterium sp. Nr. 14001 (FERM-P Nr. 1048) wird daher als neuer Stamm angesehen. Dieser Stamm ist im Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Chiba City, Japan, unter

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der Bezeichnung FERM-P Nr. 1048 registriert. Dieser Stamm ist ferner beim United States Department of Agriculture, Northern Regional Research Laboratory, Peoria ,Illinois, unter der Nummer NRRL B-5395 hinterlegt.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Nährmedium verwendet, das Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze und natürliche organische Nährstoffe enthält, wie sie zum günstigen Wachstum der Mikroorganismen und zur guten Bildung von L-5HTP bevorzugt sind. Beispiele für verwendbare Kohlenstoff quellen sind Glucose, Fructose, Sucrose, Mannose, Stärke, Sorbit, Glycerin, Alkohole, Essigsäure und Citronensäure. Diese Kohlenstoffquellen können entweder allein oder als Gemisch von mindestens zwei der genannten Verbindungen verwendet werden. Die Menge der Kohlenstoffquelle ist nicht von entscheidender Bedeutung, vorzugsweise werden jedoch etwa 1 bis 10 Gewichtsprozent pro Volumen verwendet. Beispiele für verwendbare Stickstoff quellen sind Ammoniak, Harnstoff, Ammoniumsulfat, Ammoniumacetat, Ammoniumnitrat und Natriumnitrat. Diese Stickstoffquellen können ebenfalls entweder allein oder als Gemisch aus mindestens zwei d.er genannten Verbindungen verwendet werden. ■ Beispiele für verwendbare anorganische Salze sind Natrium-, Kalium-, Magnesium-, Mangan-, Eisen- oder Calciumsalze der Phosphorsäure oder Salzsäure. Beispiele für verwendbare organische Kährstoffe, die das Yfachstum der Mikroorganismen fördern, sind Pepten, Fleischextrakt, Maisquellwasser, Casaminosäuren, llefeextrakt und Sojabohnenmehl. Ferner können dem Nährmedium noch geringe Mengen an Vitaminen oder Nucleinsäuren einverleibt v/erden.

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Zur Herstellung von L-5HTP v/ird das Nährmedium mit dem Ausgangsmaterial, das heißt 5-Hydroxyindol allein oder mit einem

Gemisch aus dieser Verbindung und Serin, versetzt. Serin kann entweder in der L-Form oder in der DL-Form verwendet werden. Die Zugabe erfolgt folgendermaßen.

Gemäß einer ersten Ausführungsform wird das Ausgangsmaterial dem Nährmedium während der Züchtung unmittelbar einverleibt. Während des V/achstums der Mikroorganismen bildet sich gleichzeitig auch L-5HTP. Gemäß einer zweiten Ausführungsform werden die gewachsenen Zellen, die durch Züchtung C.er Mikroorganismen in dem vorgenannten Hährmedium und anschließendes Isolieren erhalten wurden, in einer wäßrigen phospliathaltigen Lösung suspendiert und hierauf mit dem Ausgangsmaterial versetzt. Bei diesem Verfahren können anstelle von lebenden Zellen auch trockene Zellen, die einer Gefriertrocknung unterworfen wurden, vermahlene Zellen, mit Ultraschall behandelte Zellen oder mit einem Lösungsmittel, wie Aceton, Äthanol oder Toluol,behandelte Zellen verwendet werden. Die Mengen an zugesetzten 5-Hydroxyindol und Serin sind nicht von entscheidender Bedeutung. Vorzugsweise werden jeweils etwa 0,02 bis 2,0 g/dl verwendet. Die Verbindungen können entweder auf einmal oder in Zeitabständen zugegeben werden.

Die Züchtung kann je nach dem verwendeten Mikroorganismus entweder durch Schütteln der· Kultur oder durch Einleiten von Luft und hierdurch bewirktes Rühren unter aeroben Bedingungen oder als stationäre Kultur durchgeführt werden. Der p„-\vert während

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der Züchtung und vor der Zugabe des 5-Hydroxyindols wird vorzugsweise auf einen Wert im Bereich von 4 bis 9 eingestellt. Die Züchtungstemperatur liegt im allgemeinen im Bereich von 20 bis 4O°C, vorzugsweise in einem Bereich von 25 bis 35⁰C. Nach der Zugabe des 5-Hydroxyindols wird der ρττ-Wert vorzugsweise auf einen Wert von 7 bis 10 und die Temperatur auf einen Wert von 25 bis 40°C eingestellt. Zur Einstellung des p_H-Wertes können die verschiedensten Basen und Säuren verwendet werden, wie Ammoniak, Natriumhydroxid, Calciumhydroxid, Calciumcarbonat und Salzsäure. Die Züchtungsdauer bzw. Reaktionszeit hängt von der Art der Zugabe des Ausgangsmaterials, der Konzentration des zugesetzten Ausgangsmaterials und der Art des verwendeten Mikroorganismus ab. Im allgemeinen bilden sich ausreichende Mengen an L-5HTP innerhalb eines Zeitraumes von 1 bis 5 Tagen. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die Konzentration an L-5HTP in der Kulturflüssigkeit oder der Reaktionsflüssigkeit 0,03 bis 1,0 g/dl betragen. Das gebildete L-5HTP kann nach üblichen Methoden isoliert werden. Beispielsweise kann man das L-5HTP an Aktivkohle oder an einem Ionenaustauscher, wie Dowex-1 (in der Acetatform) adsorbieren und mit einem organischen Lösungsmittel, wie heißem Äthanol»oder mit wäßriger Essigsäure eluieren. Das Eluat wird eingedampft und das Produkt durch Zusatz eines niederen aliphatischen Alkohols, wie Äthanol, ausgefällt. Die Bestimmung von L-5HTP erfolgte durch Bestimmung von L-Tryptophan nach der vorstehend beschriebenen Xanthydrol-Methode.

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Die Beispiele erläutern die Erfindung. Prozentangaben beziehen ' sich auf das Gev/icht pro Volumbasis.

Beispiel 1

Corynebacterium sp. Nr. 14001 (FERM-P Nr. 1048; NRRL B-5395) wird in einen Erlenmeyerkolben überimpft, der 50 ml eines wäßrigen Nährmediums mit einem p^-Wert von 7,0 enthält. Das Nährmedium enthält 1,0 Prozent Pepton, 1,0 Prozent Fleischextrakt, 0,4 Prozent Natriumchlorid und 0,1 Prozent Hefeextrakt. Die Züchtung wird 24 Stunden unter Schütteln bei 30⁰C durchgeführt. Danach werden die erhaltenen Zellen isoliert und in einer 60 millimolaren Phosphatpufferlösung vom pu-V/ert 8,5 suspendiert. Die erhaltene Suspension wird mit 40 mg 5-Hydroxyindol, 40 mg L-Serin und 120 mg Glucose versetzt. Danach wird die Suspension mit V/asser auf 20 ral aufgefüllt und 16 Stunden bei 30°C gerührt. Nach dieser Zeit haben sich in der Reaktionsflüssigkeit 2,94 mg/ml L-5HTP angesammelt. Die Reaktionsflüssigkeit wird erhitzt, die Zellen werden abzentrifugiert,und

wird
der Überstand/auf eine mit Aktivkohle gefüllte Säule gegeben, an der das L-5HTP adsorbiert wird. Zum Eluieren des L-5HTP wird v/äßriges Äthanol verwendet. Das Eluat wird unter vermindertem Druck eingedampft. Es hinterbleiben 55 mg L-5HTP.

Die vorstehend beschriebene Reaktion wird 32 Stunden durchge»- führt, und 8 Stunden, 16 Stunden und 24 Stunden nach Beginn der Reaktion werden v/eitere 20 mg 5-Hydroxyindol und 20 mg L-Serin zugesetzt. In diesem Fall haben sich in der Reaktionslösung 7,01 mg/ml L-5HTP angesammelt. '

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Beispiel 2

Die in der nachstehenden Tabelle I genannten Mikroorganismen werden in Kolben überimpft, die 50 ml eines wäßrigen Nährmediums vom p„-\7ert 7,0 enthalten. Das Nährmedium enthält 3 Prozent Glucose, 0,6 Prozent Harnstoff, 0,3 Prozent Pepton, 0,3 Prozent Hefeextrakt, 0,1 Prozent KH₂PO^, 0,1 Prozent K₂HPO^, 0,05 Prozent MgSO^.7H₂O und 0,001 Prozent MnSO^.4H₂O. Die Züchtung wird bei 30°C unter Schütteln durchgeführt. 32 Stunden nach Beginn der Züchtung werden 1,0 mg/ral 5-Hydroxyindol und 2,0 mg/ml DL-Seriii zugesetzt, und die Züchtung wird weitere 24 Stunden fortgesetzt. Die in der Kulturflüssigkeit angesammelte Menge an L-5HTP ist ebenfalls in Tabelle I angegeben. Die Isolierung erfolgt gemäß Beispiel 1.

Tabelle I

.Milypo;7^rn sinus L-5HTP, mg/ml

Corynebacterium melassecola ATCC 17965 0,39

Brevibacteriur: aiiirnoniagenes ATCC 6872 ■ 0,25

Iiicrobactcriun amrnoniaphilun ATCC 15354 0,37

Hicrococcus lutcus ATCC 21102 0,32

Bacillus subtilis ATCC 14593 0,33

Flavülaciorium arborescens ATCC 4358 0,60

Aerobücter aero^cnes IFO 3317 0,64

Eschcrichia coli ATCC 9637 0,61

Proteus miratilis IFO 3S49 0,46

Pseudononas fragi IFO 3458 ' 0,50

Protaninobacter alboflavus IFO 3707 0,51

Erwinia carotovora IFO 3057 0,61

Arthrobacter globiformis ATCC 8010 0,26

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Mikroorganismus L-5HTP_t mg/ml

Serratia marcescens IFO 304-6 _t 0,52

Staphylococcus citreus ATCC .4012 ' 0,27

Sarcina lutea ATCC 15176 0,42

Xanthomonas pruni IFO 3511 0,52

Nocardia asteroid.es IFO 3304 0,56

Streptomyces aureus ATCC 3309 0,29

Penicillium chrysogenum ATCC 15241 ■ 0,27

Aspergillus oryzae IFO 4075 · 0,30

Achromobacter petrophilum FERM-P 239 O,5O

Lcispiel 3

Die in Tabelle II angegebenen Mikroorganismen v/erden in einen Kolben überimpft, der 50 ml eines wäßrigen Nährmediums vom PjT-V/ert 6,5 enthält. Das Nährmedium enthält 5,0 Prozent Glycerin, 0,2 Prozent NH₇₊NO.,, 0,2 Prozent Harnstoff, 0,1 Prozent Hefeextrakt, 0,1 Prozent KHpPO₇₊, 0,1 Prozent K₂HPO₇₊, 0,05 Prozent MgSO₇₊.7H₂O, 0,01 Prozent KaCl, 0,001 Prozent FeSO₇₊.7H₂O und 1,0 Prozent CaCO,,. Die Züchtung wird bei 30⁰C unter Schütteln durchgeführt. 24 Stunden nach Beginn der Züchtung wird die Kulturflüssigkeit mit 1,5 mg/ml 5-Hydroxyindol versetzt und die Züchtimg weitere 24 Stunden fortgesetzt. In Tabelle II ist die gebildete Menge an L-5HTP angegeben. Die Lösung wird gornöß Beispiel 1 aufgearbeitet.

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Tabelle II

Mikroorganismus ' L-5HTP_t mg/ml

Hansenula anomala IFO 0118 · 0,59

Candida petrophilum ATCC 20226 0,38

Brettanomyces petrophilum ATCC 20224 0,37

Torulopsis petrophilum ATCC 20225 0,26

Saccharomyces cerevisiae ATCC 7754 0,28.

Beispiel 4

Beispiel 1 wird wiederholt, als Enzymquelle wird jedoch der Überstand einer Flüssigkeit von Zellen verwendet, die 10 Minuten einer Ultraschallbehandlung von 10 KHz unterworfen wurden. Es werden 0,39 mg/ml L-5HTP erhalten.

Beispiel 5

Agrobacterium tumefaciens IFO 3058 wird gemäß Beispiel 2 gezüchtet. 32 und 48 Stunden nach Beginn der Züchtung v/erden weitere 1,0 mg/ml 5-Hydroxyindol und 2,0 mg/ml DL-Serin zugesetzt, und die Züchtung wird weitere 12 Stunden fortgesetzt. Es v/erden 2,48 mg/ml L-5HTP erhalten. Die Isolierung dieser Verbindung erfolgt gemäß Beispiel 1.

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Claims

Patentansprüche

Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-5-Hydroxytryptophan, dadurch gekennzeichnet, daß man einen zur Bildung von L-Tryptophan aus Indol und Serin fähigen Mikroorganismus in einem Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze und organische Nährstoffe enthaltenden Nährmedium züchtet und die Zellen mit 5-Hydroxyindol oder einem Gemisch aus 5-Hydroxyindol und Serin zusammenbringt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus verwendet, der mindestens 0,2 mg/ml L-Tryptophan gemäß dem in der Beschreibung erläuterten Test zur Bestimmung der enzymatisehen Aktivität der Tryptophan-Synthetase bildet.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus

(a) Bakterien der Gattung Corynebacterium, Brevibacterium, Microbacterium, Microcuccus, Bacillus, Flavobacterium, Agrobacterium, Aerobacter, Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Protaminobacter, Erwinia, Arthrobacter,

Serratia, Staphylococcus, Sarcina,Xanthomonas oder Achromobacter,

(b) Hefen der Gattung Hansenula, Candida, Brettanorayces,

Torulopsiß oder Saccharomyces,

(c) Actinomyceten der Gattung Nocardia oder Streptomyces oder

(d) Pilze der Gattung Penicillium oder Aspergillus verwendet.

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4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Corynebacterium sp. Nr. 14001 (FERM-P Nr. 1048), Corynebacterium melassecola ATCC 17965, Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872, Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354, Micrococcus luteus ATCC 21102, Bacillus subtilis ATCC 14593, Flavobacterium arborescens ATCC 4358, Agrobacterium tumefaciens IFO 3058, Aerobacter aerogenes IFO 3317, Escherichia coli ATCC 9637, Proteus mirabilis IFO 3849, Pseudomonas fragi IFO 3458, Protaminobacter alboflavus IFO 3707, Erwinia carotovora IFO 3057, Arthrobacter globiformis ATCC 8010, Serratia marcescens IFO 3046, Staphylococcus citreus. ATCC 4012, Sarcina lutea

Achroraobacter petrophilum FERM-P 239, ATCC 15176, Xanthoraonas pruni IFO 3511 ,/Hansenula anomala IFO 0118, Candida petrophilum ATCC 20226, Brettanomyces petrophilurn ATCC 20224, Torulopsis petrophilura ATCC 20225, Saccharomyces cerevisiae ATCC 7754, Kocardia asteroides IFO 3384, Streptonyces aureus ATCC 3309, Penicillium chrysogenum ATCC 15241 oder Aspergillus oryzae IFO 4075 verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Kulturmedium 5-Hydroxyindol oder ein Gemisch aus 5-Hydroxyindol und Serin zusetzt und die Züchtung fortsetzt.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung abbricht, die Zellen isoliert, in einer v/äßrigen Phosphaticsung suspendiert und die Suspension mit 5-Hydroxyindol oder einem Gemisch aus 5-Hydroxyindol und Serin versetzt.

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7· Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß man das 5-Hydroxyindol oder ein Gemisch aus 5-Hydroxyindol und Serin auf einmal oder in zeitlichem Abstand zugibt.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man nach Zugabe des 5-Hydroxyindols die Züchtung bei einem PjT-V/ert im Bereich von 7 bis 10 und bei Temperaturen von bis 40⁰C durchführt.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

dam man 5-Hydroxyindol oder ein Gemisch aus 5-Hydroxyindol und Serin in einer Menge von jeweils 0,02 bis 2,0 g/dl zusetzt.

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