DE1966521C3 - Verfahren zur Herstellung von a-Aminobenzylpenicillin - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Λ-Aminobenzylpenicillin durch Umsetzung von 6-Aminopenicillansäure mit dem Kalium- oder Natriumsalz, dem Methyl- oder Äthylester oder dem Amid der ix-Aminophenylessigsäure in Gegenwart eines Enzyms, das durch Züchten eines Mikroorganismus in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen gebildet worden ist.

Die Herstellung von at-Aminobenzylpenicillin aus 6-Aminopenicillansäure (6-APA) auf enzymatischem Wege unter Verwendung von Mikroorganismen des Genus Arthrobacter und Micrococcus ist bereits bekannt (vgl. die US-Patentschrift 30 79 307). Darin finden sich jedoch keinerlei Hinweise darauf, welche konkreten Mikroorganismenstämme bei dem bekannten Verfahren eingesetzt wurden. Auch sind die bei dem bekannten Verfahren erzielbaren Ausbeuten an a-Aminobenzylpenicillin technisch noch nicht befriedigend.

Aus der US-Patentschrift 33 25 479 ist ein Verfahren bekannt, bei dem Λ-Aminobenzylpenicillin ausgehend von 6-Aminopenicillansäure auf synthetischem Wege hergestellt wird. Dieses Verfahren führt zwar ebenfalls zu recht hohen Ausbeuten an dem gewünschten Endprodukt, es ist jedoch technisch sehr aufwendig. Es hat sich nämlich gezeigt, daß nur das D-Isomere des a-Aminobenzylpenicillins einen pharmazeutischen Effekt aufweist, so daß nach diesem konventionellen Syntheseverfahren zur Herstellung des D-Isomeren von einem D-a-Aminophenylacetat ausgegangen werden muß. Dieses D-a-Aminophenylacetat muß seinerseits aber durch optische Auftrennung des DL-a-Aminophenylacetats hergestellt werden, so daß dieses Syntheseverfahren technisch sehr umständlich ist, da das wesentlich leichter zugängliche DL-Ä-Aminophenylacetat nicht in einer einzigen Stufe in das gewünschte a-Aminobenzylpenicillin umgewandelt werden kann.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Herstellung von Λ-Aminobenzylpenicillin aus 6-Aminopenicillansäure anzugeben, das technisch einfach durchführbar ist und selektiv zu hohen Ausbeuten an (X-Aminobenzylpenicillin führt.

Es wurde nun gefunden, daß diese Aufgabe erfindungsgemäß bei einem Verfahren des eingangs genannten Typs dadurch gelöst werden kann, daß als Mikroorganismus Pseudomonas sp. ATCC 21284, Kluyvera citrophila ATCC 21285, Streptomyces phaeochromogenes ATCC 21289, Nocardia globerula ATCC 21292, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15246, Arthrobacter simplex ATCC 15799 oder Corynebacterium fascians ATCC 12975 verwendet wird.

■ο Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es auf überraschend einfache und großtechnisch durchführbare Weise möglich, selektiv a-Aminobenzylpenicillin direkt aus 6-Aminopenicillansäure in hoher Ausbiute herzustellen.

Die erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen zeichnen sich dadurch aus, daß sie eine bemerkenswert starke enzymatische Aktivität zur Herstellung von Λ-Aminobenzylpenicillin aus ö-Aminopenicillansäure (nachfolgend abgekürzt mit 6-APA) und dem verwendeten a-Aminophenylessigsäuresalz besitzen.

Sowohl ein synthetisches Kulturmedium als auch ein natürliches Nährmedium eignet sich zur Züchtung der erfindungsgemäß eingesetzten Stämme, sofern das jeweilige Medium die zum Wachstum der verwendeten Stämme wesentlichen Nährstoffe enthält. Derartige Nährstoffe sind bekannt. Es handelt sich beispielsweise um eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und anorganische Verbindungen. Diese Materialien werden von dem eingesetzten Mikroorganismus in den entsprechenden Mengen verbraucht. Als Koihlenstoffquelle kommen beispielsweise Glukose, Fruktose, Maltose, Rohrzucker, Stärke, Stärkehydrolysate, Melassen oder Sorbit in Frage. Außerdem kann man beispielsweise organische Säuren einsetzen, z. B. Essigsäure oder Milchsäure. Diese Substanzen können entweder einzeln oder in Form von Mischungen aus zwei oder mehreren Substanzen verwendet werden. Bei der Verwendung von Kohlenwasserstoff assimilierenden Mikroorganismen können Kohlenwasserstoffe, beispielsweise n-Paraffine, rohe Erdölbestandteile, Kerosin, Leichlöle oder Schweröle in dem Nährmedium als einzige Kohlenstoffquelle oder als Hauptkohlenstoffquelle verwendet werden.

Als Stickstoffquelle kommen verschiedene Arten anorganischer oder organischer Salze oder Verbindungen in Frage. Erwähnt seien beispielsweise Harnstoff, flüssiges Ammoniak oder Ammoniumsalze, wie beispielsweise Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat oder Ammoniumphosphat. Ferner kommen natürliche Substanzen in Frage, die Stickstoff enthalten, wie beispielsweise Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakte, Pepton, Fischmehl, Fleischbrühe, Kaseinhydrolysate, Kasaminosäure, lösliche Fischbestandteile oder Reiskleieextrakt. Diese Substanzen können ebenfalls entweder für sich allein oder in Kombination aus zwei oder mehreren Substanzen verwendet werden.

Anorganische Verbindungen, die dem Kulturmedium zugesetzt werden können, sind beispielsweise Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Eisensulfat, Manganchlorid, Calciumchlorid, Natriumchlorid oder Zinksulfat.

Das Züchten wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, beispielsweise durch aerobes Schütteln der Kultur oder durch Rühren und Belüften einer Submerskultur, und zwar bei einer Temperatur von

beispielsweise ungefähr 20 bis 50⁰C, sowie bei einem pH-Wert von beispielsweise 5,0 bis 9,0. Das Züchten wird im allgemeinen während einer Zeitspanne von etwa 1 bis 7 Tagen durchgeführt Die Enzyme, die zur Durchführung der erfindungsgemäßen Reaktionen erforderlich sind, werden in den Mikroorganismenzellen sowie in der Kulturbrühe selbst synthesiert Das Enzym kann den Ausgangsmaterialien entweder in Form der Kulturbrühe selbst, der Mikroorganismenzellen, der Kulturbrühe, die nach der Entfernung der Mikroorganismenzellen anfällt, oder in Form einer Enzymlösung, die durch Reinigen dieser Substanzen nach an sich bekannten Methoden erhalten worden ist, beispielsweise durch Aussalzen mittels Ammoniumsulfat, durch eine Dialyse, durch Ausfällen durch Aceton oder Äthanol oder durch Säulenchromatographie, zugesetzt werden. Falls Mikroorganismenzellen eingesetzt werden, werden sie als solche, in Form von Suspensionen oder in Form getrockneter Zellen verwendet (das Trocknen kann unter Verwendung von Aceton durchgeführt werden). Wird eine Kulturbrühe selbst verwendet, dann wird das Substrat (6-APA) der Kulturbrühe als solches zugesetzt. Die Reaktion wird durchgeführt, nachdem der pH-Wert auf beispielsweise 6,5 bis 7,0 eingestellt worden ist.

Als andere Substratausgangsmaterialien werden die Kalium- oder Natriumsalze von ct-Aminophenylessigsäure oder ihr Amid, der Methylester oder der Äthylester verwendet.

Im allgemeinen wird die Reaktion in einer Reaktionslösung durchgeführt, die durch Zugabe der zwei Substrate sowie entsprechender Mengen der Enzymmaterialien zu einer Pufferlösung mit einem definierten pH-Wert hergestellt worden ist. Außerdem kann die Reaktion in einer Gärungsflüssigkeit, wie sie vorstehend erwähnt wurde, durchgeführt werden. Dieser Gärungsflüssigkeit werden die zwei Substrate zugesetzt. Die Reaktion kann innerhalb eines breiten pH-Bereiches durchgeführt werden, beispielsweise innerhalb eines pH-Bereiches von 3 bis 8. Ein optimaler pH-Bereich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Reaktion liegt zwischen 5,5 und 7,5 und vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,3. Die Reaktion wird bei 25 bis 50⁰C und vorzugsweise bei einem Wert zwischen 35 und 38°C während einer Zeitspanne von 1 bis 24 Stunden durchgeführt.

Das nach Beendigung der Reaktion erhaltene Λ-Aminobenzylpenicillin läßt sich in einfacher Weise nach üblichen Methoden abtrennen. In vorteilhafter Weise wird die Verbindung in der Weise gewonnen, daß eine Überführungsextraktion oder eine Ausfällung mittels organischer Lösungsmittel mit einer Ausfällung am isoelektrischen Punkt, einer lonenaustauscher-Harzbehandlung oder einer Säulenchromatographie kombiniert wird.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Sofern nicht anders angegeben, beziehen sich die Prozentangaben auf das Gewicht pro Liter Wasser.

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Beispiel 1

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Als Impfmikroorganismus wird Pseudomonas sp. ATCC 21284 verwendet. Eine Platinschleife des Impfmikroorganismus wird auf einen 250-ml-Erlenmeyer-Kolben aufgeimpft, der 20 ml einer Impfkultur enthält, Diese Inipfkultur besteht aus 1% Pepton, 1% Fleischextrakt, 0,5% Hefeextrakt und 0,3% Natriumchlorid. Das Züchten wird unter aerobem Schütteln bei 30⁰C während einer Zeitspanne von 24 Stunden durchgeführt 2 ml der erhaltenen Impfkulturbrühe werden auf einen 250-ml-Erlenmeyer-Kolben aufgeimpft, der 20 ml eines Gärungsmediums enthält Dieses Gärungsmedium besitzt folgende Zusammensetzung:

0,5% Pepton
0,5% Hefeextrakt
2,5% Maisquellwasser
03% Natriumchlorid
0,5% Natrium-L-glutamat

Der pH-Wert des Mediums vor der Sterilisation beträgt 7,3- Der pH-Wert wird unter Verwendung von 5 n-NaOH eingestellt Nach der Durchführung des Züchtens während einer Zeitspanne von 48 Stunden unter aerobem Schütteln bei 30⁰C werden die erhaltenen Mikroorganismenzellen von der Gärungsbrühe abgeschleudert, worauf ein zweimaliges Waschen mit einer 0,9%igen Natriumchloridlösung erfolgt Anschließend werden die Zellen in einem 1/30-molaren Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,8 in einer Menge von 10 mg/ml, bezogen auf die getrockneten Zellen, suspendiert. 6-Aminopenicillansäure und KaIium-a-aminophenylacetat werden zur Erzeugung von Mengen von f,5 mg/ml bzw. 10 mg/ml zugesetzt. Anschließend wird die Reaktionslösung während einer Zeitspanne von 40 Stunden bei 57° C reagieren gelassen.

Die Menge an Λ-Aminobenzylpenicillin, die in der Reaktionslösung erzeugt wird, beträgt 1,53 mg/ml (Ausbeute 57 Mol%, Reinheit 92%).

Beispiel 2

Kluyvera citrophila ATCC 21285 wird als Impfmikroorganismus verwendet. Die Züchtungsbedingungen sind die gleichen wie in Beispiel 1, mit der Ausnahme, daß 0,2% Ammoniumphenylacetat dem Hauptgärungsmedium zugesetzt werden. Die Mikroorganismenzellen, die nach 48stünd;ger Züchtung erhalten werden, werden in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 umgesetzt, mit der Ausnahme, daß weitere 0,6 mg/ml 6-Aminopenicillansäure der Reaktionslösung 3 Stunden nach Beginn der Reaktion zugesetzt werden. Die Reaktion wird nach Zugabe der 6-APA während einer Zeitspanne von 1 Stunde fortgesetzt. Die Menge des in der erhaltenen Reaktionslösung erzeugten a-Aminobenzylpenicillins beträgt 2,38 mg/ml (Ausbeute 62 Mol%, Reinheil 92%).

Beispiel 3

Pseudomonas aeruginosa ATCC 15246 wird als Impfmikroorganismus verwendet. Das Impfkulturmedium enthält 1% Pepton, 1% Fleischextrakt, 0,5% Hefeextrakt und 0,25% Natriumchlorid. Eine Platin schleife des Impfmikroorganismus wird auf einen 250-ml-Erlenmeyer-Kolben aufgeimpft, der 20 ml des Impfmediums enthält. Das Züchten wurd unter aerobem Schütteln bei 30"C während einer Zeitspanne von 24 Stunden durchgeführt. 2 ml der erhaltenen Impfkulturflüssigkeit werden auf einen 250-ml-Erlenmeyer-Kolben aufgeimpft, der 20 ml eines Gärungsmediunis enthält, das folgende Zusammensetzung aufweist:
5% n-Paraffinmischung (eine Mischung aus äquivalenten Mengen an Cn-Ci-i-n-Paraffinen)
0,3% Phenylacetic
2% (NlIi)JSO*
0,15% K Η.;PO*
0,05% MgSO* · 7ΙΙ.Ό
0.001% MnSO* 4 Η.Ό

0,01% FeSO4 - 7Η2θ
0,5% Hefeextrakt
0,2% Maisquellwasser
2% CaCO₃

Der pH-Wert des Mediums betlägt vor der Sterilisierung 7,3. Nach dem Züchten während einer Zeitspanne von 72 Stunden bei 3v>^JC unter aerobem Schütteln der Kultur durchgeführt worden ist, werden die Mikroorganismenzellen von der Gärungsflüssigkeit durch Zentrifugieren abgetrennt, zweimal mit einer 0,9%igen Natriumchloridlösung gdwaschen und anschließend in einem 1/30-molaren Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,9 in einer Menge von 8 mg/ml (bezogen auf die trockenen' Zellen) suspendiert Anschließend werden 2,5 mg/ml 6-Aminopenicillansäure und 10 mg/ml Ä-Aminophenylacetatmethylester der Lösung zugesetzt Die Reaktion wird bei 37° C während einer Zeitspanne von 5 Stunden fortschreiten gelassen. Die Menge des in der erhaltenen Reaktionslösung erzeugten «-Aminobenzylpenicillins beträgt 3,05 mg/ml (Ausbeute 68 Mol%, Reinheit 92%).

Beispiel 4

Arthrobacter simplex ATCC 15799 wird als Impfmikroorganismus verwendet Es wird das gleiche Gärungs-' medium wie in Beispiel 3 eingesttzt. mit der Ausnahme, da3 7% Kerosin anstelle der n-Paraffinmischung eingesetzt werden. Außerdem wird das Phenylacetat weggelassen. Die anderen Züchtungsbedingungen sind ίο die gleichen wie in Beispiel 3. Nach 72stündigem Züchten werden jedoch 2 mg/ml 6 Aminopenicillansäure und 10 mg/ml «-Aminophenylacetat-amid der Gärungsflüssigkeit selbst ohne Abtrennung der Zellen zugesetzt Der pH-Wert der Gärungsflüssigkeit wird auf is 6,5 eingestellt, worauf das Züchten fortgesetzt wird. Während des Züchtens wird der pH-Wert der Gärungsflüssigkeit unter Verwendung von Chlorwasserstoffsäure oder Natriumhydroxid alle 30 Minuten eingestellt Sechs Stunden nach Zugabe der Substrate haben sich 2,75 mg/ml «-Aminobenzylpenicillin in der Gäningsflüssigkeit angereichert (Ausbeute 78 Mol%, Reinheit 91%).

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung von «-Aminobenzylpenicillin durch Umsetzung von 6-Amino-penicillansäure mit dem Kalium- oder Natriumsalz, dem Methyl- oder Äthylester oder dem Amid der a-Aminophenylessigsäure in Gegenwart eines Enzyms, das durch Züchten eines Mikroorganismus in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen gebildet worden ist, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Pseudomonas sp. ATCC 21284, Kluyvera citrophila ATCC 21285, Streptomyces phaeochromogenes ATCC 21289, Nocardia globerula ATCC 21292, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15246, Arthrobacter simplex ATCC 15799 oder Corynebacterium fascians ATCC 12975 verwendet wird.