DE2441637C2

DE2441637C2 - Verfahren zur Herstellung von 6- Aminopenicillansäure-1-oxid

Info

Publication number: DE2441637C2
Application number: DE2441637A
Authority: DE
Inventors: Eiji Ikeda Osaka Kondo; Takashi Takaishi Osaka Mitsugi; Ryonosuke Takatsuki Osaka Muneyuki
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1973-09-21
Filing date: 1974-08-30
Publication date: 1984-04-19
Also published as: DE2441637A1; JPS5535120B2; FR2244769A1; JPS5058288A; FR2244769B1; GB1479174A; US3925155A

Description

6-Aminopenicillansäure-l-oxid ist bekannt. Die Verbindung wird durch Oxidation von 6-Aminopenicillansäure in wäßriger Lösung und unter Kühlen im Eisbad mit ozonhaltigem Sauerstoff hergestellt; vgl. E. H. Flynn, Chephalosporins and Penicillins, Academic Press New York and London (1972), S. 668.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein biotechnisches Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure-l-oxid aus Phenoxymethylpenicillin-loxid unter Verwendung von Mikroorganismen zu schaffen. Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem überraschenden Befund, daß bestimmte Pilze der Gattung Streptomyces und Mycelpräparate derselben in der Lage sind, bevorzugt die Amidbindung in der 6-SteI-lung des Phenoxymethylpenicillin-1-oxid-Moleküls anzugreifen.

Gegenstand der Erfindung ist somit das Verfahren zur Hersteilung von 6-Aminopenicillansäurc-l-oxid.

Erfindungsgemäß können auch natürliche und künstliche Mutanten oder Varianten dieser Gattung eingesetzt werden, die Penicillin-1-oxidamidase-Aktivität aufweisen. Die künstlichen Mutanten können durch übliche mutagene Behandlung, beispielsweise mit Röntgenstrahlen, UV-Licht, oder chemische Mutagene, wie StickstolT-Lost, hergestellt werden.

Die Pilze könr.en in ein natürliches oder künstliches Nährmedium überimpft und in diesem Nährmedium vermehrt werden. Die Nährmedien können folgende Bestandteile enthalten:

Stickstoff- und Kohlenstoffquellen. wie Kohlenhydrate, beispielsweise Glucose, Fructose, Maltose, Rohrzucker, Stärke, Stärkehydrolysate, Sorbit, Honig, Kartoffelmehl, Weizenmehl, Heischbrühe, Hefeextrakt, Pcpton. Maisqucllwasser, Fischmehl. Fischmehlextrakt. Caseinhydrolysal, Sojabohnenmehl, Casaminosäurc. Reiskleienextrakt. Harnstoff, Ammoniak, Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, -sulfat, -nitrat. -acetat und bzw. oder-phosphat, Carbonsäuren, wie Essigsäure oder Milchsäure, anorganische Salze, wie Magnesiumsulfat. Nalriumphosphat, Eisensulfat, Man^anchlorid, Kupferchlorid und Zinkchlorid, und bzw. oder andere Substanzen, die für das Wachstum der Pilze erforderlich sind, wie Vitamine und Aminosäuren. Die Vermehrung wird vorzugsweise unter aeroben Bedingungen, beispielsweise durch Schütteln oder statische Kultur oder unter Belüften und Rühren, bei einem pH-Wert von 5 bis 9 und vorzugsweise bei Temperaturen .von 20 bis 40° C während eines Zeitraumes von 1 bis 5 Tagen durchgeführt. Man erhält das Mycel

ίο oder die vermehrten Pilze. Die Vermehrung kann in Gegenwart eines Penicillin-1-oxids durchgeführt werden, um die Penicillin-l-oxid-amidase zu i'-.duzieren. Sodann wird das Phenoxymethylpenicillin-l-oxid oder dessen Salz in Form eines Pulvers, einer Suspension oder einer Lösung in einem wäßrigen oder hydrophilen organischen Lösungsmittel mit dem Pilz oder dessen Mycelpräparat in wäßrigem Medium zusammengebracht. Der Pilz bzw. das Mycel wird durch Filtrieren oder Zentrifugieren der Kulturbrühe und anschließendes Waschen der Festsubstanz mit Wasser oder einer Pufferlösung zur Abtrennung der Nährlösun£und anderer Verunreinigungen erhalten. Erforderlichenfalls kann der Pilz mit einem wasserlöslichen organischen Lösungsmittel, wie Aceton oder Äthanol,

2s getrocknet werden.

Der Ausdruck »Mycelpräparat« bezeichnet ein Präparat, das die Penicillin-1-oxidamidase-Aktivität des intracellulären oder extracellulären Enzymsystems des Pilzes zur Verfugung stellt. Das Präparat kann beispiels-

Jd weise in Form einer Kulturbrühe des Pilzes, in Form von Mycel oder Pilzen, als Kulturbrühe, aus der die Pilze abgetrennt wurden, oder einer Enzymlösung vorliegen. Die Enzymlösung schließt rohe Enzymlösungen ein, die ein Mycelhomogenat enthalten, das durch

ji Homogenisieren der Pilze erhalten worden ist. Ferner kommen rohe oder gereinigte Enzyme in Frage, die in an sich bekannter Weise aus dem Mycelhomogenat erhalten wurden, beispielsweise durch Aussalzen mit Ammoniumsulfat, Dialyse, Ausfällung, beispielsweise

mit Aceton oder Äthanol, Chromatographie, Gelfiltration, Zentrifugieren oder Elektrophorese. Ferner kommen Pilze oder rohe oder gereinigte Enzyme in Frage, die mit einem festen Träger kombiniert sind, wie Cephadex *, DEAE-Cellulose, Kieselgur, Aktivkohle,

4S einem Acrylpolymerisat oder Ionenaustauscherharz. Derartige Enzyme stellen feste Enzympräperate dar.

Das hydrophile organische Lösungsmittel, wie Äthanol oder Aceton, wird in solcher Konzentration verwendet, daß die Wirkung der Penicillin-1 -oxidamidase nicht

κι gehemmt wird. Beispiele Tür wäßrige Medien sind Pufferlösungen, Salzlösungen, Nährmedien zur Vermehrung der Pilze und destilliertes Wasser. Die Gegenwart von Luft ist nicht von entscheidender Bedeutung, jedoch bevorzugt. Vorzugsweise wird die Umsetzung

v, unter Schütteln und Rühren bei einem pH-Wert von 5 bis S bei Temperaturen von 20 bis 40° C und während eines Zeitraums von 5 bis 50 Stunden durchgeführt. Die Werte hängen von der Konzentration, der Art des eingesetzten Pilzes und der Art der Behandlung ab. Erforderen lichenfalls kann mit einer Säure, Base oder einer Pufferlösung der pH-Wert eingestellt werden, wenn sich der pH-Wert des Reaktionsmediums während der Umsetzung ändert. Die bevorzugte Anfangskonzentration des eingesetzten Phcnoxymethylpcnicillin-l-oxids im wäß-

h", rigen Medium beträgt 0.1 bis 5, insbesondere 0,1 bis 2 Gewichtsprozent.

Die Isolierung und Reinigung des entstandenen 6-Aminopenicillansäure-1-oxids oder dessen Salzes kann

in an sich bekannter Weise durchgeführt werdea Beispielsweise werden die Pilze, das Mycelpräparat oder unlösliche Stoffe aus dem Reaktionsgemisch abfiltriert, abgeschleudert, absorbiert oder denaturiert Es kann auch eine Kombination dieser Verfahren angewendet werden. Danach wird das 6-Aminopenicillansäure-loxid beispielsweise durch Absorption, fraktionierte Extraktion, Konzentrieren, Abtrennung oder Ausfällung isoliert Die Reinigung kann durch Umkristallisation, Absorption, Chromatographie oder Behandlung mit Ionenaustauschern erfolgen. Das 6-Arrinopenicillansäure-1-oxid kann als Salz an der Carboxylgruppe, beispielsweise als Natrium-, Kalium-, Magnesium- oder Aminsalz, oder als Salz an der Aminogruppe, beispielsweise als p-Toluolsu!fonat, Rhodanid, Hydrochlorid, Sulfat oder Nitrat, isoliert werden.

Das entstandene 6-Aminopenicillansäure 1-oxid oder Jessen Salz oder Ester kann durch Acylierung in die entsprechenden Penicillin-1-oxide oder ihre Salze oder Ester überfuhrt werden. Diese Verbindungen sind wertvolle Zwischenprodukte zur Herstellung von Penicillinen und Cephalosporine^ Zur Acylierung können die freien Säuren oder ihre Anhydride, die reaktionsfähigen Ester, reaktionsfähige Amide, Halogenide oder andere reaktionsfähige Derivate der Säure mit der entsprechenden Acylgruppe eingesetzt werden. Die Umsetzung erfolgt in an sich bekannter Weise. Gegebenenfalls kann ein Kondensationsmittel oder ein Säureacceptor, beispielsweise ein Carbodiimid, wie Dicyiohexylcarbodiimid, oder eine organische Base, wie Triäthylamin, verwendet werden.

Übliche Salze des 6-Aminopenicillansäure-l-oxids sind AIkalime.tallsalze und die S?lze organischer Basen. Übliche Ester sind der Trimethylsilylester, Trimethylzinnester, Phenacylester und Acyloxymethylester, die leicht in vitro oder in vivo abgespalten werden können.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel I

Streptomyces setonii ATCC 25497 wild in 200 ml eines sterilisierten Nährmediums überimpft, d. h. einer wäßrigen Lösung mit einem pH-Wert von 7,0, die 1 Prozent Glucose, 0,5 Prozent Pepton, 0,5 Prozent Hefeextrakt und 0,3 Prozent Natriumchlorid enthält. Der Stamm wird 2 Tage bei 28° C unter Schütteln gezüchtet. Sodann wird das Mycel abfiltriert und mit vollentsalztem Wasser gewaschen.

Das gewaschene Mycel wird in 200 ml vollentsalztem Wasser suspendiert, das 400 mg Penicillin V-l-oxid in Form des Natriumsalzes enthält. Das Salz wurde durch Neutralisation mit wäßriger Natriumcarbonatlösung hergestellt. Das Gemisch wird 24 Stunden bei 28° C geschüttelt. Sodann wird das Reaktionsgemisch £ t>f 11-triert, das Filtrat mit 4n-Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2,6 eingestellt und dreimal mit Äthylacetat extrahiert. Der Äthylacetatextrakt wird unter vermindertem Druck eingedampft. Ausbeute 145 mg Phenoxyessigsäure vom F. 98° C.

IR-Absorptionsspektrum ν ^*"¹"⁰' 1735, 1707, 1594

und 1585 cm"¹.

Die wäßrige Lösung wird mit Bariumhydroxid auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt, von festen Stollen abgeschleudert und der Überstand bei 38 bis 40° C eingedampft. Ausbeute 275 mg rohes 6-Aminopcnicillansäurc-1-oxid als Pulver.

IR-Absorptionsspektrum ν

Paraffir-ö!

1775, 1025
und 1010 cm-'.

Beispiel 2

Eine gemäß Beispiel 1 hergestellte Pilzkulturbrühe von Streptomyces setonii ATCC 25497 wird zentrifugiert. 100 ml des Überstandes werden mit 200 mg Penicillin V-l-oxid versetzt. Danach wird der pH-Wert der

i" Lösung auf 7,0 eingestellt und das Gemisch 45 Stunden bei 28° C geschüttelt Die Dünnschichtchromatographie an Kieselgel mit einem Gemisch von Aceton, Essigsäure und Wasser (85 : 6 : 8) als Entwicklungslösungsmittel zeigt kein Ausgangsmaterial, sondern

ι j große Mengen an 6-AminopenicilIansäure-l-oxid. Die kolorimetrische Bestimmung des Flecks auf dem Dünnschichtchromatogramni zeigt eine Ausbeute von 75 Prozent, bezogen auf eingesetztes Penicillin V-loxid.

Beispiel 3

Streptomyces griseorubiginosus ATCC 23627 wird in 100 ml eines sterilisierten Nährmediums überimpft, d. h. einer wäßrigen Lösung mit einem pH-Wert von 7,0,

.'·. die 1 Prozent Glucose, 0,5 Prozent Pepton, 0,5 Prozent Hefeextrakt und 0,3 Prozent Natriumchlorid enthält. Der Stamm wird 2 Tage bei 28° C unter Schütteln gezüchtet. Sodann wird das Mycel abgeschleudert, mit Wasserausgewaschenundin 100 ml einer 1/30 molaren

in Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,0 suspendiert, die 200 mg Penicillin V-l-oxid enthält. Die Suspension wird 24 Stunden bei 28° C geschüttelt. Die Dünnschichtchromatographie des Reaktionsgemisches zeigt dann die Gegenwart von 6-Aminopenicillansäure-l-

r> oxid in ähnlicher Menge an, wie in Beispiel 2. Das eingesetzte Penicillin V-I-oxidsalz ist verschwunden.

Beispiel 4

Beispiel 3 wird unter Verwendung von Streptomyces ■fo fimicarius ATCC 25449 wiederholt. Es wird 6-Aminopenicillansäure-l-oxid in ähnlicher Ausbeute erhalten wie in Beispiel 2.

Beispiel 5

■<i Beispiel 3 wird unter Verwendung von Streptomyces fasiculatus ATCC 19751 wiederholt. Es wird 6-Aminopenicillansäure-1-oxid in ähnlicher Ausbeute wie in Beispiel 2 erhalten.

-₍₁ B e i s ρ i e 1 6

Streptomyces griseorubiginosus ATCC 23627 wird in 100 ml eines sterilisierten Nährmediums überimpft, d. h. einer wäßrigen Lösung mit einem pH-Wert von 7,0, die 1 Prozent Glucose, 0,5 Prozent Pepton, 0,5 Prozent

" Hefeextrakt und 0,3 Prozent Natriumchlorid enthält. Der Stamm wird 2 Tage bei 28° C unter Schütteln gezüchtet. Sodann wird die Kulturbrühe zu einer Lösung von 200 mg Penicillin V-l-oxid in 50 ml Wasser gegeben, die mit wäßriger Natriumcarbonatlösung neu-

^W) tralisiert wurde. Das Gemisch wird 2 Tage bei 28° C geschüttelt. Sodann zeigt die Dünnschichtchromatographie des Reaktionsgcmisches die Gegenwart von 6-Aniinopenicillans;iure-l-oxid. Die kolorimetrische Bestimmung des Recks auf dem Dünnschichtchroma-

^h) togramm ergibt eine Ausbeute von 65 Prozent, bezogen auf eingesetztes Penicillin V-l-oxid.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von o-Aminopenicillansäure-1-oxid, dadurch gekennzeichnet, daß man Phenoxymethylpenicillin-l-oxid oder dessen Ammonium- oder Alkalimetallsalz bei einem pH-Wert von 5 bis 9 mit Streptomyces setonii (Millard und Burr) Waksman ATCC 25497, Streptomyces griseorubiginosus Ryabova und Preobrazhenskaya ATCC 23627, Streptomyces fimicarius (Duche) Waksman und Henrici ATCC 25449 oder Streptomyces fasiculatus (Sie) Pittenger und Nelms ATCC 19751 behandelt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung in vollentsalztem Wasser, Phosphatpufferlösung oder einer Kulturflüssigkeit durchführt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung bei Temperaturen von 20 bis 40° C durchführt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Ausgangskonzentration des eingesetzten Penicillin-1-oxids oder dessen Salz im wäßrigen Medium auf einen Wert von 0,1 bis 2 Gewichtsprozent einstellt.