DE2407026A1 - Verfahren zur erzeugung von hefezellen - Google Patents

Description

• Verfahren zur Erzeugung von Hefezellen Priorität: 14. Februar 1973, Nr. 18004/1973, Japan Die Erfindung betrifft die Herstellung von Hefezellen, speziell ein Verfahren zur Erzeugung von Hefezellen aus einer neuartigen Kohlenstoffquelle.
• Hefezellen bilden einen wertvollen Eiweißzusatz zu Futtermitteln für Rinder und Hühner. Es ist bekannt, daß einige Hefen auf Kulturmedien wachsen, in denen Erdölkohlenwasserstoffe in Gasform oder in flüssiger Form die Hauptkohlenstoffquelle darstellen und derartige Kohlenstoffquellen sind im allgemeinen weniger kostspielig als Kohlenhydrate, die üblichste bisher verwendete Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff.
• Es wurde nun gefunden, daß zahlreiche Hefen befähigt sind, auf sonst üblichen Kulturmedien zu wachsen und sich zu vermehren, in denen Ionen von Propionsäure und Buttersäure die Hauptquelle oQer die einzig-wesentliche Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff darstellen. Propionsäure und Buttersäure sind Nebenprodukte der petrochemischen Industrie, die zur Zeit nur sehr wenigen technischen Anwendungszwecken zugänglich sinds so daß ein großer Anteil der von der petrechemischen Industrie erzeugten Propionsäure und n-Buttersäure als Abfallstoffe beseitigt werden müssen, was zu Schwierigkeiten bei der Beseitigung führt.
• Propionsäure wird in der Medizin als Fungizid angewendet und es ist daher überraschend, daß sie in ausgezeichneten Ausbeuten in Hefezellsubstanz übergeführt werden kann. Es hat sich jedoch gezeigt, daß viele Hefestämme befähigt sind, Propionsäure und n-Buttersäure auszunutzen, während das Wachstum einiger Stämme auf Isobuttersäure und höheren Alkancarbonsäuren gewöhnlich enttäuschend gering ist. Alle Hefestämme, die zum Wachstum auf Propionsäure und n-Buttersäure befähigt sind, sind auch fähig, die relativ teure Essigsäure als Kohlenstoffquelle auszunutzen.
• Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zum Erzeugen von Hefezellen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man a) einen zum Assimilieren von Propionat- und n-Butyrationen befähigten Hefestamm in einem wässrigen Kulturmedium züchtet, das Propionationen, n-Butyrationen oder Propionat-und n-Butyrationen als Hauptquelle für assimilierbaren Kohlenstoff, eine assimilierbare Stickstoffquelle, anorganische Salze und organische Spurennährstoffe enthält, bis die Zellen des verwendeten Stammes sich in dem Kulturmedium vermehrt haben, und b) die durch Vermehrung gebildeten Zellen aus dem Medium gewinnt.
• Es wurde gefunden, daß Hefen, die zur Umwandlung von Propionsäure und Buttersäure in wirtschaftlich bedeutenden Mengen in Hefezellenfeststoffe befähigt sind, den Genera Saccharomyces, Pichia, Candida, Hansenula, Debaryomyces, Trichosporon, Endomycopsis und Kluyveromyces angehören. Zu diesen Hefen gehören folgende Stämme: Candida maltosa AJ 4718 FERN P-733 Candida lipolytica AJ 4549 FERM P-1863 Saccharomyces cerevisiae AJ 4005 FERN P-1859 Saccharomyces carlsbergensis AJ 4033 FERM P-1860 Pichia etchellsii AJ 5554 FERN P-1585 Pichia ohmeri AJ 5085 FERN P-1866 Debaryomyces vanriji AJ 5058 FERN P-1865 Debaryomyces hansenii AJ 4179 IFO 0023 EndQmycopsis burtonii AJ 4275 PERM P-1861 Kluyveromyces polysporus AJ 4278 FERN P-1862 Trichosporon fermentas AJ 5152 FERN P-1867 Hansenula anomala AJ 5027 FERN P-1864 Die durch FERM P-Nummern bezeichneten Mikroorganismen sind frei erhältlich durch das Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry for Industrial Trade and Industry, Chiba, Japan. Die durch IFO-Nummern bezeichneten Stämme sind von dem Institute for Fermentation, Osaka, Japan, erhältlich.
• Die zum Züchten von Zellen dieser Hefen verwendeten Kulturmedien sind in ihrer Zusammensetzung übliche Medien, mit Ausnahme des Vorliegens der Alkancarbonsäuren. Die verwendeten Alkancarbonsäuren können dem Kulturmedium vor der Inokulation zugesetzt werden oder sie können allmählich während der Züchtung zugegeben werden, um eine gleichförmige Konzentration an Propionat- und Butyrationen aufrechtzuerhalten.
• Die für das Wachstum der Hefen erforderliche assimilierbare Stickstoffquelle kann durch Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, -chlorid, -phosphat oder -carbonat, Harnstoff, gasförmiges Ammoniak oder Ammoniumhydroxidlösung vorgesehen werden. Ferner sollten Quellen für Phosphationen vorliegen, wie KX2P04, K2HP04, Na3PQ4 und ähnliche Verbindungen.
• Organische Spurennährstoffe, wie Vitamine -und Aminosäuren, können in Form von Maisquellflüssigkeit, Pepton, Fleischextrakt, MaLzextrakt, Hefeextrakt und Sojabohnenproteinhydrolysat zugeführt werden.
• Das Kulturmedium sollte leicht sauer oder neutral sein. Eine Erhöhung des pE-Werts während der Züchtung kann durch Zugabe von Schwefelsäure, Chlorwasserstoffsäure, Propionsäure oder n-Buttersäure kompensiert werden. Die verwendeten Mikroorganismen sind aerob. Sie können bei einer Temperatur zwischen 23 und 400 C gezüchtet werden und Temperaturen von 250 bis 340 C sind normalerweise am besten geeignet. Die Hefezellen werden durch Zentrifugieren und/oder Filtration aus der Kulturbrühe isoliert. Da sowohl Propionsäure als auch Buttersäure wasserlöslich ist, lassen sich die gewonnenen Zellen leicht durch Waschen mit Wasser reinigen. Die Ausbeute an Zellsubstanz, bezogen auf die verbrauchten Alkancarbonsäuren, beträgt 40 % oder mehr.
• Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert. Die in den Beispielen durch Angabe von Genus und Spezies identifizierten Mikroorganismen gehören zu den vorstehend aufgezählten spezifischen Stämmen.
• Beispiel 1 C.maltosa, D.hansenii, P.etchellsii, H.anomala, T.fermentas und S.carlsbergensis wurden 24 Stunden bei 300 C auf Schrägagar (10 g/l Hefeextrakt, 10 g/l Malzextrakt, 5 g/l NaCl, 20 g/l Agar) gezüchtet. Eine Platinöse mit jeder der so gebildeten Impfkulturen wurde zum Animpfen von 20 ml-Anteilen von Kulturmedien verwendet, die 5 g/l AlkarCtrbonsäure gemäß Tabelle 1, 5 g/l (NH4)2S04, 2 g/l KH2P04, 1 g/l MgS04, 1 g/l Fleischextrakt und 10 ml/l Maisquellflüssigkeit (pH 6,0) enthielten und sich in 500 ml-Schüttelkolben befanden, in denen sie sterilisiert worden waren. Jedes Medium wurde 48 Stunden unter Schütteln bei 280 C gehalten und das Wachstum jeder Hefe wurde durch Messen der optischen Dichte des Kulturmediums in 26-facher Verdünnung mit Wasser bei 560 bestimmt. Die Meßwerte sind in Tabelle 1 für jede Kombination der-sechs Mikroorganismen und neun Kohlenstoffquellen aufgeführt. Die optische Dichte jeder frisch angeimpften Kultur betrug gemäß einer-Bestimmung in der vorstehend angegebenen Weise 0,02.
• Beispiel 2 Eine Impfkultur von S.cerevisiae wurde bei 31O C, sonst Jedoch unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen hergestellt und eine Öse dieser Kultur wurde zum Animpfen von 20 ml eines wässrigen Kulturmediums in einem 500 ml-Schüttelkolben verwendet, das sterilisiert worden war.
• Das Kulturmedium enthielt 5 g/l Natriumpropionat, 5 g/l (§H4)2S04, 2 g/iKH2P04, 1 g/l MgS04, 1-g/l Fleischextrakt, 10 ml/l Maisquellflüssigkeit und ppm jedes der Spurenelemente Fe+2, Mn+2 und Zn+2 (pH 6,o).
• Die Kultur wurde 48 Stunden unter Schütteln bei 280 C gehalten, während Propionsäure in einer solchen Rate zugesetzt wurde, daß leicht saure Bedingungen aufrechterhalten wurden. Die Hefezellen wurden dann durch Zentrifugieren gewonnen, zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen und gefriergetrocknet. Es wurden 94 mg des trockenen Zellmaterials erhalten. Die Ausbeute betrug 45 , bezogen auf den Gesamtverbrauch an Propionsäure.
• C.lipOlytica ergab unter den gleichen Bedingungen 352 mg trockene Zellsubstanz entsprechend einer Ausbeute von 59,4 %, bezogen auf die verbrauchte Propionsäure.
• a. maltosa führte zu 224 mg trockenem Zellmaterial entspreehend einer Ausbeute von 64,6 %, bezogen auf die verbrauchte Propionsäure.
• Beispiel 3 P.etchellsii, P.ohmeri, D.vanriji, E.burtonii, K.polysporus, T.fermentas, H.anomala und S.carlsbergensis wurden praktisch in gleicher Weise wie in Beispiel 2 drei Tage bei 28° C gezüchtet und die Zellen wurden gewonnen und gefriergetrocknet. Die Menge des gewonnenen trockenen Zellmaterials betrug in der Reihenfolge, die für die vorstehend angegebenen Hefen eingehalten wurde, 64 mg, 56 mg, 48 mg, 44 mg, 40 mg, 60 mg, 56 mg bzw. 66 mg. -Beispiel 4 Impfkulturen von C.maltose, P.etchellsii, H.anomala, T.fermentas, S.carlsbergensis, D.hansenii, E.burtonii und K.polysporus wurden wie in Beispiel 2 hergestellt und in 20 ml-Anteile eines Kulturmediums eingeimpft, das 5 g/l n-Buttersäure, 5 g/l (NH4)2S04, 2 g/l KH2P04, 1 g ß MgSO4, 1 g/l Fleischextrakt und 10 ml/l Maisquellflüssigkeit (pH 6,0) enthielt. Jede Kultur wurde bei 280 C unter Schütteln 60 Stunden bebrütet, während n-Buttersäure zugesetzt wurde, um leicht saure Bedingungen aufrechtzuerhalten.
• Die Zellen wurden durch Zentrifugation gewonnen, zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen und gefriergetrocknet.
• Die Ausbeuten des so erhaltenen trockenen Zellmaterials in mg und in % des Gesamtverbrauchs an n-Buttersäure sind in Tabelle 2 aufgeführt.
• Tabelle 2 Hefe Ausbeute an trockenem Zellmaterial C.maltosa 244 62.3 P. etchellsii 148 51.2 H. anomala 90 55.0 T. fermentas 208 59.1 S.carlsbergensis 70 45.0 D. hansenii 84 40.0 E.burtonii 75 38.5 K.polysporus 90 42.4 Beispiel 5 Impfkulturen der sechs in Beispiel 1 angegebenen Stämme wurden in gleicher Weise wie in diesem Beispiel hergestellt und mit diesen Impfkulturen wurden sterilisierte 20 ml-Anteile von Kulturmedien beimpft, die jeweils 1 g/l Essigsäure, Propionsäure, n-Buttersäure, jeweils 0,5 g/l Valeriansäure, Capronsäure, Heptansäure, Caprylsäure und Pelargonsäure, 5 g/l (NH4)2S04, 2 g/l KH2P04, 1 g/l MgSO4, 1 g/l Fleischextrakt und 10 ml/l Maisquellflüssigkeit (pH 6,0) enthielten.
• Jedes Medium wurde in einem 500 ml-Kolben 60 Stunden bei 280 C geschüttelt, während es mit Hilfe einer wässrigen Lösung aus gleichen Volumteilen Essigsäure, Propionsäure und n-Buttersäure, die mit Hilfe einer Natriumhydroxidlösung auf einen pH von 4,0 eingestellt war, leicht sauer gehalten wurde.
• Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gewonnen, zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen und gefriergetrocknet. Die Ausbeuten an trockenem Zellmaterial sind in Tabelle 3 angegeben.
• Tabelle 3 Hefe Ausbeute, mg C.maltosa 290 P. etchellsii 156 H. anomala 136 T. ferinentas 118 S.carlsbergensis 250 D.hansenii 90 Wie aus Beispiel 1 ersichtlich ist, können brauchbare Mengen an Hefezellen auch aus Isobuttersäure und höheren Alkancarbonsäuren bis zu neun Kohlenstoffatomen erfindungsgemäß hergestellt werden. Diese anderen Carbonsäuren sind jedoch gegenwärtig nicht in wirtschaftlich geeigneter Weise erhältlich und die erhaltenen Ausbeuten sind in fast allen Fällen niedriger als die unter Verwendung von Propionsäure und n-Buttersäure erhaltenen. Ihre Löslichkeit in Wasser fällt rasch mit steigender Zahl der Kohlenstoffatome, so daß die Reinigung der gewonnenen Hefezellen weniger einfach wird. Aus diesen Gründen werden Propionsäure und n-Buttersäure stark bevorzugt.
• Im Hinblick auf die leichte Zugänglichkeit von Propionsäure und n-Buttersäure zu geringem Preis ist es wirtschaftlich nicht vorteilhaft, die Alkancarbonsäuren als Kohlenstoffquellen mit üblicheren Kohlenstoffquellen zu kombinieren, wie Kohlenhydraten. Die Mikroorganismen, die zum Abbau der Alkancarbonsäuren, speziell von Propionsäure und n-Buttersäure befähigt sind, können diese Verbindungen jedoch auch in Gegenwart ton üblichen Kohlenstoffquellen, wie Melassen oder Stärkehydrolysaten, in Zellmaterial umwandeln.
• Tabelle 1 S ä u r e Stamm Essig- Propion- n-Butter- i-Butter- n-Valerian- Capron- Heptan- Capryl- Pelargonsäure säure säure säure säure säure säure säure säure C.maltosa 0.43 0.36 0.33 0.15 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 D.hansenii 0.355 0.28 0.15 0.09 0.08 0.09 0.09 0.09 0.09 P.etchellsii 0.52 0.25 0.185 0.08 0.08 0.08 0.08 0.08 0.09 H.anomala 0.41 0.305 0.15 0.10 0.17 0.12 0.11 0.10 0.11 T.fermentus 0.35 0.245 0.19 0.08 0.19 0.11 0.13 0.11 0.10 S.carlsbergensis 0.34 0.205 0.115 0.08 0.08 0.07 0.09 0.08 0.07

Claims (4)

1. Patentansprüche Verfahren zum Erzeugen von Hefezellen durch Züchten eines Hefestammes in einem eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, assimilierbare Stickstoffquelle, anorganische Salze und organische Spurennährstoffe enthaltenden wässrigen Kulturmedium, bis die Zellen sich in dem Kulturmedium vermehrt haben, und Gewinnen der durch Vermehrung gebildeten Zellen aus dem Medium, dadurch g e -k e n n z e i c h n e t , daß man einen zum Assimilieren von Propionat- und n-Butyrationen befähigten Hefestamm in einem wässrigen Kulturmedium züchtet, das als Hauptquelle für assimilierbaren Kohlenstoff Propionationen, n-Butyrationen oder Propionat- und n-Butyrationen enthält.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g ek e n n z e i c h -n e t , daß man ein Kulturmedium verwendet, in welchem die Propionat- oder n-Butyrationen die einzig wesentliche Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff darstellen.
3. 3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch g e -k e n n z e i c h n e t , daß man als Hefestamm einen Stamm der Genera Saccharomyces, Pichia, Candida, Hansenula, Debaryomyces, Trichosporon, Endomycopsis oder Kluyveromyces verwendet.
4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß man als Hefestamm Candida maltosa FERM P-733, Candida lipolytica FERM P-1863, Saccharomyces cerevisiae FERM P-1859, Saccharomyces carlsbergensis FERM P-1860, Pichia etchellsii FERM P-1585, Pichia ohmeri FERM P-1866, Debaryomyces vanriji FERM P-1865, Debaryomyces hansenii IF0 0023, Endomycopsis burtonii FERM P-1861, Kluyveromyces polysporus FERM P-1862, Trichosporon fermentas FERN P-1867 oder Hansenula anomala FERM P-1864 verwendet.