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Gebiet der
Erfindung und technischer Hintergrund
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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von Penicillinen,
die an der 6-Aminogruppe deacyliert sind, indem man eine Fermentation
eines Penicillin erzeugenden Mikroorganismus in Gegenwart einer
Seitenkettenvorstufe durchführt
und das fermentativ erzeugte N-substituierte Penicillin deacyliert.
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6-Aminopenicillansäure (6-APA)
stellt ein wichtiges Zwischenprodukt in der pharmazeutischen Industrie
dar, das im Allgemeinen durch chemische oder enzymatische Spaltung
("Deacylierung") von Penicillin
G oder Penicillin V erhalten wird.
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Penicilline
selbst werden durch Fermentation unter Verwendung von Stämmen von
Penicillium chrysogenum erhalten. Bei einem typischen Verfahren
zur Gewinnung von Penicillin G wird die Gärbrühe filtriert und gewaschen.
Penicillin G wird nach Ansäuern
des Filtrats in Butylacetat oder Methylisobutylketon extrahiert.
Anschließend
wird das Lösungsmittel
mit Aktivkohle entfärbt
und Penicillin G-säure wird
nach Neutralisation mit einer wässrigen
Kaliumsalzlösung,
wie Kaliumacetat, in Wasser rückextrahiert.
Diese Lösung
wird mit einer ausreichenden Menge an Butanol vermischt. Nach Verringern
des Wassergehalts durch Eindampfen des Butanol-Wasser-Azeotrops werden die gebildeten
Penicillin G-Kristalle durch Filtration gewonnen und anschließend gewaschen
und getrocknet.
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Bei
einem weiteren Verfahren wird das kristalline Material direkt aus
der organischen Lösung
erhalten, indem man Kaliumacetat oder andere Kaliumsalze zusetzt
und das Azeotrop eindampft, wonach die Kristalle abfiltriert, mit
Butanol gewaschen, filtriert und getrocknet werden. Für Penicillin
V kann das gleiche Verfahren herangezogen werden. Jedoch kann Penicillin
V aufgrund seiner besseren Stabilität unter sauren Bedingungen
auch in Säureform
anstelle des Kaliumsalzes kristallisiert werden, ohne dass unannehmbare
wirtschaftliche Verluste eintreten.
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6-Aminopenicillansäure wird
im Allgemeinen aus einer Lösung
von gelöstem,
festem Penicillin G oder V erhalten, die mit immobilisierter Penicillin G-acylase
bzw. Penicillin V-acylase in Kontakt gebracht wird. Die Umwandlungslösung wird
sodann einer Kristallisationsvorrichtung zugeführt, wo das feste Produkt durch
Fällung
bei einem pH-Wert von etwa 3,5 bis 4,5 gebildet wird. Im Allgemeinen
wird bei diesem Kristallisationsverfahren der pH-Wert stufenweise
gesenkt, um eine Verunreinigung des Endprodukts 6-APA mit hohen
Anteilen an Seitenketten und gefärbten
Verbindungen zu vermeiden. Ferner werden Lösungsmittel, wie Methanol,
Ethanol und Isopropylalkohol, zugegeben, um diese inakzeptable Verunreinigung
zu vermeiden. Es ist ersichtlich, dass diese Arten von Herstellungswegen
für 6-APA
langwierig und kostspielig sind.
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Erfindungsgemäß wird ein
verbessertes Verfahren zur Herstellung von 6-APA beschrieben, wobei
die Isolierung von Penicillin G oder V als festes Zwischenprodukt
nicht erforderlich ist und wobei Maßnahmen zur Farbkorrektur überflüssig sind.
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Beschreibung
der Erfindung
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Erfindungsgemäß wird ein
verbessertes Verfahren zum Herstellen von 6-Aminopenicillansäure (6-APA)
aus einer Fermentationsbrühe
eines Penicillin erzeugenden Mikroorganismus beschrieben.
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Im
Allgemeinen umfasst das neuartige Herstellungs- und Reinigungsverfahren
die folgenden Stufen:
Ein Penicillin erzeugender Mikroorganismus
wird in Gegenwart einer geeigneten Seitenkettenvorstufe fermentiert.
Die Fermentationsbrühe
wird filtriert, wonach das Filtrat mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert
wird, um eine organische Phase zu erhalten, die den Großteil an
N-substituierter Penicillansäure
enthält.
Anschließend
wird die N-substituierte Penicillansäure in Wasser rückextrahiert.
Die wässrige
Phase wird gegebenenfalls abgestreift, um Spurenmengen an Lösungsmittel
zu entfernen. Die verbleibende wässrige
Lösungsphase
wird enzymatisch unter Bildung von 6-APA und einer Seitenkette,
z.B. Phenoxy- oder Phenylessigsäure,
behandelt.
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Anschließend wird
6-APA aus der wässrigen Umwandlungslösung nach
Ansäuern
dieser Lösung ausgefällt und
als kristallines Produkt isoliert. Jedoch umfasst eine bevorzugte
Ausführungsform
der Erfindung die Ansäuerung
der Umwandlungslösung
und die anschließende
Extraktion der Seitenkette in ein organisches Lösungsmittel, wonach 6-APA aus
der wässrigen
Phase unter Anwendung einer pH-Verschiebung ausgefällt wird.
Nachstehend werden die folgenden Stufen des erfindungsgemäßen Verfahrens
ausführlich
beschrieben.
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Eine
Fermentationsbrühe
mit einem Gehalt an N-substituiertem Penicillin wird durch ein beliebiges
geeignetes Fermentationsverfahren erhalten, z.B. durch Fermentation
eines Stammes von Penicillium chrysogenum in Gegenwart einer geeigneten Seitenkettenvorstufe,
z.B. Phenylessigsäure
oder Phenoxyessigsäure.
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Die
Biomasse wird aus der Fermentationsbrühe unter Anwendung einer beliebigen
geeigneten Technik, z.B. durch Zentrifugation oder Filtration, abgetrennt,
wodurch man eine Penicillin enthaltende Fermentationsflüssigkeit
erhält.
Vorzugsweise wird zur Erzielung dieser Trennung eine Filtrationsstufe durchgeführt. Die
verbleibenden Feststoffe werden gegebenenfalls gewaschen.
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Die
Fermentationsbrühe
oder -flüssigkeit wird
auf einen pH-Wert
im Bereich von 2-4 und vorzugsweise auf einen pH-Wert im Bereich
von 2,5-3 angesäuert,
indem man eine Säure,
wie Schwefelsäure,
Salzsäure,
Salpetersäure
oder eine Kombination davon, zusetzt. Das N-substituierte Penicillin wird
sodann aus der angesäuerten
wässrigen
Phase durch Extraktion in ein organisches Lösungsmittel abgetrennt. Beim
vorzugsweise verwendeten organischen Lösungsmittel handelt es sich
um Amylacetat, Butylacetat, Ethylacetat, Methylisobutylketon, Cyclohexanon,
Isobutanol oder n-Butanol. Die Zugabe eines geeigneten Deemulgators
kann die Extraktion in erheblichem Maße verbessern.
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Bei
einer Ausführungsform
der Erfindung kann ein Teil des organischen Lösungsmittels der Fermentationsbrühe oder
-flüssigkeit
vor der Ansäuerung
zugesetzt werden. Es wurde festgestellt, dass dadurch in zufriedenstellender
Weise eine Ausfällung vermieden
wird, wobei eine derartige Ausfällung
gelegentlich als eine unerwünschte
Nebenwirkung bei der Ansäuerung
der Fermentationsbrühe
oder -flüssigkeit
auftritt. Eine Ausfällung
ist deswegen unerwünscht,
weil sie zu einem Verlust an Produkt führt und anschließende Schwierigkeiten
bei der Aufarbeitung hervorrufen kann.
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Bei
der nächsten
Stufe wird das N-substituierte Penicillin, das im organischen Lösungsmittel vorhanden
ist, bei einem pH-Wert
von 6-10 und vorzugsweise von 7-9 in Wasser rückextrahiert. Bei der für die pH-Einstellung
verwendeten Base kann es sich beispielsweise um Ammoniak oder um
eine Alkali- oder Erdalkalihydroxidlösung handeln.
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Nach
der Phasentrennung wird die wässrige Phase
gegebenenfalls abgestreift, um das organische Lösungsmittel zu entfernen.
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Anschließend wird
die wässrige
Phase oder Lösung
mit einer geeigneten Penicillin-acylase behandelt.
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Nachstehend
werden Beispiele für
Organismen aufgeführt,
die Penicillin-acylase bilden: Acetobacter, Aeromonas, Alcaligenes,
Aphanocladium, Bacillus sp., Cephalosporium, Escherichia, Flavobacterium,
Kluyvera, Mycoplana, Protaminobacter, Providentia, Pseudomonas oder
Xanthomonas species. Enzyme, die sich von Acetobacter pasteurioanum,
Alcaligenes faecalis, Bacillus megaterium, Escherichia coli, Providentia
rettgeri und Xanthomonas citrii ableiten, haben sich im erfindungsgemäßen Verfahren
als besonders erfolgreich erwiesen. In der Literatur werden Penicillin-acylasen
auch als Penicillin-amidasen bezeichnet.
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Die
Penicillin-acylase kann in Form eines freien Enzyms verwendet werden,
es kann sich aber auch um beliebige geeignete immobilisierte Formen handeln,
wie sie beispielsweise in EP-0 222 462 und WO-97/04086 beschrieben
sind.
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Durch
die vorliegende Erfindung wurde in erfolgreicher Weise gezeigt,
dass es möglich
ist, eine fermentativ erhaltene N-substituierte Penicillinverbindung,
wie Penicillin G, einer enzymatischen Umwandlung zu 6-APA zu unterziehen,
ohne dass es erforderlich ist, vorher die N-substituierte Penicillinverbindung
in kristalliner Form zu isolieren.
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Die
vorliegende Erfindung sieht auch die Möglichkeit vor, die Fermentationsflüssigkeit
mit Penicillin-acylase zu behandeln, d.h. ohne eine vorherige Extraktions-
und Rückextraktionsstufe
vorzunehmen.
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Die
Umwandlungslösung,
die sich aus der vorstehend angegebenen enzymatischen Umsetzung
ergibt, enthält
6-APA, eine Seitenkette, wie Phenyl- oder Phenoxyessigsäure, gefärbte Produkte und
Spurenmengen an nicht-umgewandeltem Produkt.
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Gemäß einer
Ausführungsform
der Erfindung wird das als Produkt gebildete 6-APA aus der Umwandlungslösung durch Kristallisation
unter sauren Bedingungen isoliert. Typischerweise wird die Kristallisation
von 6-APA aus einer wässrigen 6-APA-Lösung durchgeführt, indem
man den pH-Wert der 6-APA-Lösung
auf einen sauren Wert einstellt, wobei man ein Titrationsmittel
zu der 6-APA-Lösung
gibt, bis der pH-Wert
einen Wert im Bereich von 2,5-4,5 und vorzugsweise einen Wert von
3-4 erreicht hat.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird die Kristallisation von 6-APA aus einer wässrigen
Lösung
durch Zugabe der 6-APA-Lösung in
ein Kristallisationsgefäß durchgeführt, das
unter Verwendung eines geeigneten Titrationsmittels auf einen fixierten
pH-Wert im Bereich von 2,5-4,5 gehalten wird.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird diese Kristallisation durch stufenweise Einstellung
des pH-Werts der 6-APA-Lösung
auf einen endgültigen
Wert im Bereich von 2,5-4,5 vorgenommen, indem man die 6-APA-Lösung zu
einer Reihe von untereinander verbundenen Kristallisationsgefäßen gibt,
d.h. indem man die 6-APA-Lösung
in ein erstes Gefäß gibt,
gleichzeitig den Inhalt des ersten Gefäßes in ein zweites Gefäß gibt,
gleichzeitig den Inhalt des zweiten Gefäßes in ein drittes Gefäß gibt und
dergl. wobei ein pH-Wert in den miteinander verbundenen Gefäßen unter
Verwendung eines geeigneten Titrationsmittels angewandt wird, wobei
man im ersten Gefäß bei einem pH-Wert
beginnt, der um etwa 0,5-2 pH-Einheiten vom pH-Wert der 6-APA-Lösung abweicht,
und im letzten Gefäß mit einem
pH-Wert endet, der im Bereich von 2,5-4,5 liegt. Zweckmäßigerweise
wird der pH-Wert
der wässrigen
6-APA-Lösung
auf den angestrebten endgültigen
Wert eingestellt, indem man eine Reihe von 2 bis 6 miteinander verbundenen
Gefäßen verwendet.
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Beispielsweise
kann zur Erzielung einer Kristallisation von 6-APA aus der Umwandlungslösung ein
von 8 auf 3 sinkender pH-Bereich angewandt werden, indem man ein
Titrationsmittel verwendet, bei dem es sich um eine Säure, wie
Schwefelsäure, Salzsäure und/oder
Salpetersäure
handelt, wobei man sich einer Reihe von 3 bis 4 miteinander verbundenen
Kristallisationsgefäßen bedient.
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Die
beiden vorstehend beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen werden vorzugsweise kontinuierlich
durchgeführt.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird die Phenyl- oder Phenoxyessigsäure-Seitenkette
vor der Kristallisation von 6-APA durch Extraktion in ein organisches
Lösungsmittel
entfernt. Die Umwandlungslösung
wird angesäuert
und sodann mit einem organischen Lösungsmittel, wie Amylacetat,
Butylacetat, Ethylacetat, Methylisobutylketon, Cyclohexanon, Isobutanol
oder n-Butanol, extrahiert. Das Ansäuern der Umwandlungslösung wird
mit einer Säure,
wie Schwefelsäure,
Salzsäure
oder Salpetersäure
oder einer Kombination davon, vorzugsweise mit Schwefelsäure, auf einen
pH-Wert unter 3 und vorzugsweise unter 2 durchgeführt. Es
wurde in überraschender
Weise festgestellt, dass bei Anwendung dieser Extraktionsstufe auch
ein hoher Wirkungsgrad in Bezug auf die Entfernung von gefärbten Verunreinigungen
erreicht wird.
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung wird die Extraktion mit dem organischen Lösungsmittel
in 2 bis 4 Stufen einer intensiven Kontaktextraktion durchgeführt, beispielsweise
durch Kombination eines intensiven Mischers, z.B. eines Mischers
von hoher Scherkraft, mit einer Zentrifugaltrennung, wobei die Stufen
vorzugsweise im Gegenstromverfahren betrieben werden.
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Das
organische Lösungsmittel,
das Phenyl- oder Phenoxyessigsäure
und gefärbte
Verbindungen enthält,
kann eine geringe Menge an 6-APA enthalten. Dieses 6-APA kann in
Wasser rückextrahiert werden,
vorzugsweise in 2 bis 4 Extraktionsstufen, die im Gegenstrommodus
betrieben werden. Das Wasser für
diese Rückextraktion
wird auf einen pH-Wert unter 6 und vorzugsweise unter 3 angesäuert. Das
bevorzugte Wasser/Lösungsmittel-Verhältnis beträgt 1:5,
insbesondere 1:20 und ganz besonders 1:10. Die auf diese Weise erhaltene
wässrige Phase
kann der 6-APA-Kristallisation zugeführt oder in die Seitenkettenextraktion
zurückgeleitet
werden.
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Nach
Extraktion der Seitenkette mit dem organischen Lösungsmittel kann das 6-APA-Produkt aus
der wässrigen
Phase auf verschiedene Weise kristallisiert werden, beispielsweise
gemäß den vorstehend
angegebenen Möglichkeiten
für die
Kristallisation von 6-APA aus einer wässrigen Lösung.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird der pH-Wert der wässrigen
Phase auf einen Bereich von 2,5-5 und vorzugsweise auf einen Bereich
von 3,5-4,5 erhöht,
indem man die 6-APA-Lösung in
einer Stufe in ein Kristallisationsgefäß, das auf dem erwünschten
pH-Wert gehalten wird, oder in eine Reihe von 2 bis 6 miteinander
verbundenen Kristallisationsgefäßen gibt,
wobei man einen steigenden pH-Bereich anwendet. Diese Verfahren
werden zweckmäßiger Weise
kontinuierlich durchgeführt.
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Bei
Anwendung dieses Aspekts des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Anteil
an Seitenketten, z.B. Phenyl- oder Phenoxyessigsäure, und gefärbten Verbindungen,
die in den 6-APA-Kristallen vorhanden sind, gering, verglichen mit
herkömmlichen
Verfahren, bei denen die Seitenkette nicht extrahiert wird und eine
absatzweise Kristallisation aus einer neutralen Lösung vorgenommen
wird.
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Sämtliche
vorerwähnten
Stufen, d.h. die Extraktion, Rückextraktion
und Kristallisation, lassen sich absatzweise oder halbkontinuierlich
("fed batch") durchführen, wobei
aber aus Gründen
der Stabilität
eine kontinuierliche Ausführungbevorzugt wird.
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Die
auf diese Weise erhaltenen 6-APA-Kristalle werden durch Filtration
oder Zentrifugation isoliert und in einem herkömmlichen kontinuierlichen oder
absatzweisen Trockner getrocknet.