KR20010012081A - 페니실린의 발효생산을 위한 개선된 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 발효액에 존재하는 N-치환 페니실린 화합물을 유기용매로 추출하는 단계, N-치환 페니실린 화합물을 물로 역추출하는 단계, 수상을 페니실린 아실라아제로 처리하는 단계 및 이렇게 얻어진 전환용액으로부터 결정화에 의해 6-APA를 분리하는 단계로 이루어지는, 발효생산된 N-치환 페니실린으로부터 6-아미노 페니실란산(6-APA)을 제조하는 개선된 방법을 개시한다. 추가의 개선점은 측쇄를 유기용매로 추출하고 이렇게 얻어진 수상으로부터 6-APA를 특정 결정화 방법을 사용하여 분리하는 것으로 이루어진다.

Description

페니실린의 발효생산을 위한 개선된 방법{IMPROVED PROCESS FOR THE FERMENTATIVE PRODUCTION OF PENICILLIN}

6-아미노 페니실란산(6-APA)은 제약산업에서 중요한 중간물질로서, 일반적으로 페니실린 G 또는 페니실린 V의 화학적 또는 효소적 분해('탈아실화')를 통해 얻어진다.

페니실린 그 자체는 Penicillium chrysogenum 균주를 사용한 발효로부터 얻어진다. 전형적인 페니실린 G 회수 방법에서는, 그 발효액을 여과 및 세척하고, 여과물을 산성화한 후 페니실린 G를 부틸아세테이트 또는 메틸이소부틸케톤으로 추출한다. 그런 다음 용매를 활성탄의 도움으로 탈색하고 페니실린 G산을 아세트산칼륨과 같은 칼륨염 수용액으로 중화하여 물로 역추출한다. 이 용액을 충분한 부탄올과 혼합하고 수분함량을 부탄올-물 공비혼합물의 증발을 이용하여 감소시키고, 그 후 형성된 페니실린 G 결정을 여과하고 이어서 세척 및 건조함으로써 회수한다.

다른 방법에서는 아세트산칼륨 또는 다른 칼륨염을 첨가하고 공비혼합물을 증발시킴으로써 결정성 물질을 유기용액으로부터 직접 얻고, 그 후 결정을 여과하고, 부탄올로 세척하고, 여과 및 건조한다. 페니실린 V에 대해서도 같은 방법을 적용할 수 있다. 그러나, 페니실린 V의 안정성은 산성 조건하에서 보다 양호하기 때문에, 페니실린 V는 경제적인 큰 손실없이 칼륨염 형태 대신 산 형태로 결정화될 수도 있다.

6-아미노 페니실란산은 일반적으로 용해된 고체 페니실린 G 또는 V의 용액으로부터 얻어지며, 그 후 고정화된 페니실린 G 아실라아제 또는 페니실린 V 아실라아제와 각각 접촉된다. 이어서 전환용액이 결정화 장치에 공급되어 거기서 고체 생성물이 약 3.5 내지 4.5의 pH에서 침전되어 형성된다. 일반적으로 이 결정화 방법에서는 최종생성물 6-APA가 높은 측쇄수준 및 착색 화합물로 오염되는 것을 피하기 위해 pH를 점차 낮춘다. 더욱이, 메탄올, 에탄올, 이소프로필알코올과 같은 용매를 첨가하여 이러한 바람직하지 못한 오염을 피한다. 6-APA로의 이들 유형의 생산경로는 길고 고가이다.

본 발명은 6-APA 제조를 위한 개선된 방법을 개시하며, 이 방법에서는 고체 중간물질인 페니실린 G 또는 페니실린 V의 분리를 요구하지 않고 색수정 수단이 여분의 수단이 된다.

본 발명은 측쇄전구물질의 존재하에 페니실린 생산 미생물을 발효시키고 발효생산된 N-치환 페니실린을 탈아실화함으로써, 6-아미노기에서 탈아실화된 페니실린을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 페니실린 생산 미생물의 발효액으로부터 6-아미노 페니실란산(6-APA)을 제조하기 위한 개선된 방법을 개시한다.

일반적으로 이 신규의 제조 및 정제방법은 다음의 단계로 이루어진다.

즉, 페니실린 생산 미생물을 적합한 측쇄 전구물질의 존재하에 발효시킨다. 발효액을 여과하고, 그 후 여과물을 유기용매로 추출하여 N-치환 페니실란산의 대부분을 포함하는 유기상을 얻는다. 이어서, N-치환 페니실란산을 물로 역추출한다. 수상을 선택적으로 스트리핑하여 미량의 용매를 제거한다. 남아있는 수용액상을 효소처리하여 6-APA와, 예컨대 페녹시 또는 페닐아세트산과 같은 측쇄를 얻는다.

이어서, 전환 수용액을 산성화한 후 6-APA를 전환 수용액으로부터 침전시켜 결정성 생성물로서 분리한다. 그러나, 본 발명의 보다 바람직한 구체예는 pH-변위를 이용하여 수상으로부터 6-APA를 침전시키기 전에 전환용액을 산성화하고, 이어서 측쇄를 유기용매로 추출하는 것으로 이루어진다.

본 발명에 따른 방법에서, 다음의 단계들을 보다 상세히 설명한다.

N-치환 페니실린을 포함하는 발효액을 어떤 적합한 발효방법, 예를 들면 페닐아세트산 또는 페녹시아세트산과 같은 적합한 측쇄 전구물질 존재하의 Penicillium chrysogenum 균주의 발효로부터 얻는다.

바이오매스를 원심분리 또는 여과와 같은 어떤 적합한 기술을 사용하여 발효액으로부터 분리하여 페니실린-함유 발효액을 얻는다. 바람직하게는 여과단계를 적용하여 상기 분리물을 얻는다. 잔류 고체를 선택적으로 세척한다.

황산, 염산 또는 질산 또는 이들의 조합과 같은 산을 첨가하여 발효액을 2-4의 범위내의 pH, 바람직하게는 2.5-3의 범위내의 pH로 산성화한다. 그런 다음 N-치환 페니실린을 유기용매로 추출함으로써 산성화된 수상으로부터 분리한다. 사용되는 유기용매는 바람직하게는 아밀아세테이트, 부틸아세테이트, 에틸아세테이트, 메틸이소부틸케톤, 시클로헥사논, 이소-부탄올 또는 n-부탄올이다. 적합한 탈유화화제의 첨가는 추출을 현저하게 개선시킬 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서는, 유기용매의 일부가 산성화 이전에 발효액에 첨가될 수 있다. 이는 침전을 피하는 데 만족스러운 것으로 나타났고 상기 침전은 때때로 발효액의 산성화 중 원하지 않는 부작용으로서 일어난다. 침전은 생성물의 손실을 가져오고 연속적인 작동문제를 불러일으킬 수 있기 때문에 바람직하지 못하다.

다음 단계에서, 유기용매에 존재하는 N-치환 페니실린은 6-10의 pH, 바람직하게는 7-9의 pH에서 물로 역추출된다. pH 조절에 사용되는 염기는 예컨대, 암모니아 또는 알칼리성 또는 토알칼리성 수산화물용액일 수 있다.

상분리 후, 수상을 선택적으로 스트리핑하여 유기용매를 제거한다.

이어서, 수상 또는 용액을 적합한 페니실린 아실라아제로 처리한다.

페니실린 아실라아제를 생산하는 것으로 알려진 유기체는 예컨대, Acetobacter, Aeromonas, Alcaligenes, Aphanocladium, Bacillus sp., Cephalosporium, Escherichia, Flavobacterium, Kluyvera, Mycoplana, Protaminobacter, Providentia, Pseudomonas 또는 Xanthomonas 종이다. 특히 Acetobacter pasteurioanum, Alcaligenes faecalis, Bacillus megaterium, Escherichia coli, Providentia rettgeri 및 Xanthomonas citrii 로부터 유래된 효소는 본 발명에 따른 방법에서 성공적인 것으로 증명되었다. 문헌에서 페니실린 아실라아제는 또한 페니실린 아미다아제로서도 언급되어 왔다.

페니실린 아실라아제는 유리효소로서 사용될 수도 있지만 어떤 적합한 고정화형태, 예컨대 EP 0 222 462 및 WO 97/04086에 기술된 바와 같은 형태로도 사용될 수 있다.

이롭게도, N-치환 페니실린 화합물을 결정형태로 사전분리할 필요없이 페니실린 G와 같은 발효 유도된 N-치환 페니실린 화합물을 6-APA로 효소 전환할 수 있음이 본 발명에 의해 보여진다.

본 발명은 또한 사전 추출 및 역추출단계를 거치지 않고 직접 발효액을 페니실린 아실라아제로 처리하는 선택을 포함한다.

상기에 나타낸 효소반응으로부터 얻어지는 전환용액은 6-APA, 페닐 또는 페녹시 아세트산과 같은 측쇄, 착색생성물 및 미량의 비전환된 생성물을 포함한다.

본 발명의 하나의 구체예에서, 생성물 6-APA는 산성 조건에서 결정화에 의해 전환용액으로부터 분리된다. 전형적으로, 6-APA 수용액으로부터의 6-APA 결정화는 6-APA 용액의 pH가 2.5-4.5의 범위내의 값, 바람직하게는 3-4의 값에 도달할 때까지 적정액을 6-APA 용액에 가하여 pH를 산성값으로 조절함으로써 실행된다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 수용액으로부터의 6-APA 결정화는 적합한 적정액을 사용하여 2.5-4.5 범위내의 값을 갖는 고정된 pH에서 유지되는 결정화 용기에 6-APA 용액을 가함으로써 실행된다.

본 발명의 보다 바람직한 구체예에서, 상기 결정화는 6-APA 용액을 서로 연결된 일련의 결정화 용기에 가함으로써, 즉 6-APA 용액을 첫번째 용기에 가하는 동시에 첫번째 용기의 내용물을 두번째 용기에 가하고, 동시에 두번째 용기의 내용물을 세번째 용기에 가함으로써 6-APA 용액의 pH를 최종값이 2.5-4.5의 범위가 되도록 점차 조절하여 실행되며, 서로 연결된 용기내에서 pH 범위는 6-APA 용액의 pH로부터 약 0.5-2의 pH 유니트를 벗어나는 첫번째 용기의 pH에서 시작하여 2.5-4.5의 범위내의 값을 갖는 최종 용기의 pH에서 종료되도록 적합한 적정액을 사용하여 적용된다. 편리하게는, 6-APA 수용액의 pH는 2-6개의 서로 연결된 일련의 용기를 사용하여 원하는 최종값으로 조절된다.

예를 들면, 전환용액으로부터 6-APA를 결정화하기 위해서, 8에서 3으로 pH 범위를 감소시키는 것은 서로 연결된 일련의 3-4개의 결정화 용기를 적용하여 황산, 염산 및/또는 질산과 같은 산인 적정액을 사용하여 적용할 수 있다.

상기한 두개의 바람직한 구체예는 바람직하게는 연속모드로 실행된다.

본 발명의 보다 바람직한 구체예에서, 페닐 또는 페녹시 아세트산 측쇄는 유기용매로의 추출에 의해 6-APA 결정화 이전에 제거된다. 전환용액은 산성화된 후 유기용매, 예컨대 아밀아세테이트, 부틸아세테이트, 에틸아세테이트, 메틸이소부틸케톤, 시클로헥사논, 이소-부탄올 또는 n-부탄올을 사용하여 추출된다. 전환용액의 산성화는 황산, 염산 또는 질산 또는 이들의 조합과 같은 산, 바람직하게는 황산을 사용하여 3보다 낮은, 바람직하게는 2보다 낮은 pH로 실행된다. 예상치못하게도 이 추출단계를 적용하면 착색된 불순물의 높은 제거효율도 또한 얻어짐을 알았다.

본 발명의 한 구체예에서, 유기용매 추출은 2 내지 4개의 집중적인 접촉추출 단계, 예를 들면 강력혼합기, 예컨대 고전단 혼합기와 원심분리의 조합으로 실행되고, 상기 단계들은 바람직하게는 역류모드로 조작된다.

페닐 또는 페녹시 아세트산 및 착색 화합물을 포함하는 유기용매는 소량의 6-APA를 포함할 수 있다. 선택적으로 상기 6-APA는 바람직하게는 2 내지 4개의 추출단계에서 역류모드로 선택적으로 물로 역추출될 수 있다. 이 역추출에 사용되는 물은 6보다 낮은, 바람직하게는 3보다 낮은 pH로 산성화된다. 바람직한 물:용매 비는 1:5, 보다 바람직하게는 1:20, 가장 바람직하게는 1:10이다. 이렇게 얻어진 수상은 6-APA 결정화로 공급되거나 또는 측쇄추출로 재순환될 수 있다.

측쇄의 유기용매 추출 후, 6-APA 생성물은 수용액으로부터의 6-APA 결정화에 대해 상술한 방법과 같은 여러가지 방법으로 수상으로부터 결정화될 수 있다.

바람직한 조작 모드에서는, 6-APA 용액을 원하는 pH 값에서 유지되는 결정화 용기에 한 단계로 가하거나 또는 증가하는 pH 범위를 적용하는 일련의 2-6개의 서로 연결된 결정화 용기에 가함으로써 수상의 pH를 2.5-5, 바람직하게는 3.5-4.5 범위내의 값을 갖도록 증가시킨다. 이들 공정은 편리하게는 연속모드로 실행될 수 있다.

본 발명의 방법의 이러한 양태를 적용하는 경우, 측쇄, 예컨대 페닐 또는 페녹시아세트산 및 6-APA 결정에 존재하는 착색화합물의 양은 측쇄가 추출되지 않고 중성용액으로부터의 배치모드 결정화가 적용되는 종래의 방법과 비교하여 적게 된다.

상기 언급된 모든 단계, 즉 추출, 역추출 및 결정화는 배치 또는 공급배치 모드로 실행될 수 있으나 안정성의 이유로 바람직한 방법은 연속모드이다.

얻어진 6-APA 결정은 여과 또는 원심분리에 의해 분리되며 종래의 연속 또는 배치 건조기에서 건조된다.

Claims (9)

1. 발효생산된 N-치환 페니실린으로부터 6-아미노 페니실란산(6-APA)을 제조하는 방법으로서, 발효액에 존재하는 N-치환 페니실린 화합물을 유기용매로 추출하는 단계, N-치환 페니실린 화합물을 물로 역추출하는 단계, 수상을 페니실린 아실라아제로 처리하는 단계 및 이렇게 얻어진 전환용액으로부터 결정화에 의해 6-APA를 분리하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
2. 제 1 항에 있어서, 아실라아제 처리 후 얻어진 전환용액에 존재하는 측쇄는 결정화에 의해 수상으로부터 6-APA를 분리하기 전에 유기용매로 추출되는 것을 더 특징으로 하는 제조방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 전환용액은 추출 이전에 3보다 낮은 pH로 산성화되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 전환용액 또는 수상으로부터의 6-APA 결정화는 적합한 적정액을 사용하여 2.5-4.5의 범위내의 값을 갖는 고정된 pH에서 유지되는 결정화 용기에 6-APA 용액을 가함으로써 실행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 전환용액 또는 수상으로부터의 6-APA 결정화는 6-APA 용액의 pH로부터 약 0.5-2의 pH 유니트를 벗어나는 첫번째 용기의 pH에서 시작하여 2.5-4.5의 범위내의 값을 갖는 최종 용기의 pH에서 종료되도록 적합한 적정액을 사용하여 pH 범위를 적용하면서 서로 연결된 일련의 결정화 용기에 6-APA 용액을 가함으로써 실행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 발효액은 추출 이전에 2-4의 범위내, 바람직하게는 2.5-3의 범위내의 pH로 산성화되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
7. 제 6 항에 있어서, 유기용매의 일부는 발효액을 산성화하기 전에 상기 발효액에 첨가되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 수상은 페니실린 아실라아제로 처리하기 전에 스트리핑되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 유기용매는 아밀아세테이트, 부틸아세테이트, 에틸아세테이트, 메틸이소부틸케톤, 시클로헥사논, 이소-부탄올 또는 n-부탄올인 것을 특징으로 하는 제조방법.