DE3729338A1

DE3729338A1 - Verfahren zur abtrennung von penicillin g aus einem fermentationsmedium durch extraktion

Info

Publication number: DE3729338A1
Application number: DE19873729338
Authority: DE
Inventors: Zacharias Dr Likidis; Karl Prof Dr Schuegerl
Original assignee: Helmholtz Zentrum fuer Infektionsforschung HZI GmbH
Current assignee: Helmholtz Zentrum fuer Infektionsforschung HZI GmbH
Priority date: 1987-09-02
Filing date: 1987-09-02
Publication date: 1989-03-23

Description

Penicillin G wird in der Industrie durch den Schlauchpilz Penicillium chrysogenum biotechnologisch gewonnen. Dazu wird das Penicillin G aus dem zellfreien Medium extrahiert. Die Trennung des Mediums von der pilzmycelhaltigen Fermentationsbrühe erfolgt durch Drehfilter. Der dabei anfallende Filterkuchen wird gewaschen, um auch das an der Oberfläche des Pilzmycels haftende Penicillin zu gewinnen. Penicillin G, das sich in den Zellen befindet, kann auf diese Weise nicht gewonnen werden.

Das zellfreie Medium wird auf 0 bis 2°C gekühlt, mit Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2,0 bis 2,5 eingestellt und mit organischen Lösungsmitteln, beispielsweise n-Butylacetat, in Zentrifugalextraktoren behandelt; vgl. beispielsweise Podbielniak der Firma Baker Perkins Inc., 1000 Hess Street, Saginaw, Michigan 48601, USA. Bei diesen niedrigen pH-Werten liegt der überwiegende Teil des Penicillins G (pK_s = 2,75) als freie Säure vor; nur diese freie Säure läßt sich durch organische Lösungsmittel extrahieren. Die Rückextraktion erfolgt im pH-Bereich von 6,8 bis 8,0 mit Hilfe eines Karbonat- oder Phosphatpuffers. Der Nachteil dieser Methode besteht darin, daß die Extraktion in einem pH-Bereich erfolgt, in dem das Penicillin G sehr labil ist. Trotz der geringen Temperatur und der kurzen Extraktionszeit treten während der Extraktion erhebliche Penicillin-G-Verluste auf, die bis zu 15% ausmachen können.

Die Verluste des vorstehend genannten Stands der Technik kann man dadurch stark reduzieren, daß man die Extraktion aus dem zellfreien Medium in einem pH-Bereich von 4,5 bis 5,0 und die Re-extraktion aus der organischen Phase in einem pH-Bereich von 7 bis 8 durchführt. Die Begrenzung des Gesamt- pH-Bereichs auf 4,5 bis 8,0 läßt sich dadurch erreichen, daß man langkettige sekundäre oder tertiäre Amine oder quaternäre Ammoniumsalze als Carrier in den konventionellen Lösungsmitteln anwendet. Auf diese Weise lassen sich die Penicillin- G-Verluste unter 1% senken; vgl. Reschke & Schügerl 1984a, 1984b und 1984c. Diese Methode läßt sich sowohl im Technikumsmaßstab (Reschke & Schügerl 1985 und 1986) in verschiedenen Extraktionskolonnen (Likidis & Schügerl 1987a und 1987b) und im Pilotmaßstab (Müller et al. 1987a, 1987b und 1987c) durchführen. Die genannte Methode läßt sich auch in Mixer- Settlern (Likidis & Schügerl 1987c) und in Zentrifugalextraktoren (Likidis & Schügerl 1987d) sowohl im Technikums- als auch im Pilotmaßstab anwenden.

Bei dem vorstehend beschriebenen Stand der Technik wird also das Pilzmycel vom Medium abgetrennt und gewaschen, wobei sich das im Pilzmycel selbst enthaltene Penicillin G nicht extrahieren läßt und verlorengeht. Außerdem wird die Penicillin-G-Konzentration des Mediums durch das Waschen des Filterkuchens herabgesetzt.

Durch direkte Extraktion des Pilzmycels und des Mediums kann man das Penicillin G aus den Zellen und dem Medium gewinnen. Eine Abtrennung des Pilzmycels und Waschen des Filterkuchens vor der Extraktion erübrigt sich damit; vgl. Katinger et al. 1981 und Brunner et al. 1981. Die Extraktion mit organischen Lösungsmitteln, beispielsweise n-Butylacetat, muß jedoch im pH-Bereich von 2,0 bis 2,5 durchgeführt werden, bei der nicht nur das Penicillin G labil ist, sondern auch der Proteingehalt des Mediums wegen der Schädigung der Zellen stark ansteigt. Man erhält infolgedessen eine stabile Emulsion, wodurch die wirtschaftliche Verwertung der Direktextraktion stark erschwert wird.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Abtrennung von Penicillin G aus einem Fermentationsmedium vorzusehen, bei dem das Fermentationsmedium und das Pilzmycel gleichzeitig extrahiert werden und ohne weiteres eine Anwendung in technischem Maßstab möglich ist.

Erfindungsgemäß wird dazu ein Verfahren zur Abtrennung von Penicillin G aus einem Fermentationsmedium durch Extraktion vorgesehen, bei dem man

- das mycelhaltige Fermentationsmedium einsetzt und
- mit einem Extraktionsmittel extrahiert, das als Carrier ein oder mehrere sekundäre Amine, tertiäre Amine und/oder quaternäre Ammoniumsalze und als Lösungsmittel einen oder mehrere Essigsäureester umfaßt, und die Extraktionsmittelphase vom extrahierten Fermentationsmedium abtrennt,
- gegebenenfalls die Extraktionsmittelphase in an sich bekannter Weise mit einem Re-extraktionsmedium re-extrahiert und die Re-extraktionsmediumphase abtrennt und
- gegebenenfalls das Penicillin G in an sich bekannter Weise aus der Re-extraktionsmediumphase gewinnt.

Überraschenderweise wird die bei der Extraktion gebildete Emulsion möglicherweise wegen geringer Zellschädigung und eines vergleichsweise geringen Proteingehalts nicht stabilisiert, so daß die Phasentrennung unproblematisch ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren bietet den Vorteil, daß das Penicillin G gleichzeitig aus dem Medium und dem Pilzmycel extrahiert wird.

Man kann den Carrier auch als Reaktivextraktionsmittel ansehen. Vorzugsweise verwendet man einen Carrier, der in organischen Lösungsmitteln, aber nicht in Wasser löslich ist und auch nicht bei einem pH-Wert im Bereich von 4,0 bis 9,0 durch Dissoziation in das Fermentationsmedium oder in das wässerige Re-extraktionsmedium übergeht.

Beispielsweise kann man einen Carrier mit einem oder mit mehreren Kohlenwasserstoffresten verwenden, die jeweils 15 oder mehr und insbesondere 20 oder mehr Kohlenstoffatome umfassen.

In der Regel wird der Carrier während der Re-extraktion regeneriert, so daß nur in seltenen Fällen eine besondere Reinigung der Carrierlösung erforderlich wird. Dazu kann man die Carrierlösung waschen, beispielsweise mit einer basischen Flüssigkeit. Wegen der geringen Löslichkeit des Carriers sind die Carrierverluste gering.

Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann man mit der 2- bis 5-fachen Carriermenge extrahieren, bezogen auf Penicillin G.

Erfindungsgemäß kann man die Extraktion in einem pH-Bereich von 4,0 bis 5,0 (bezogen auf das Fermentationsmedium) und/oder die Re-extraktion in einem pH-Bereich von 7,0 bis 9,0, bezogen auf das Re-extraktionsmedium, durchführen.

Bei einer Extraktion im pH-Bereich von 4,5 bis 5,0 und bei einer Re-extraktion im pH-Bereich von 7 bis 8 werden besonders hohe Extraktionsgrade und Re-extraktionsgrade erreicht. Die Penicillin-G-Verluste durch Zerfall sind sehr gering und liegen unter 1%.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann man den pH-Wert im Bereich von 4,0 bis 5,0 mit einer Mineralsäure einstellen, beispielsweise mit Phosphorsäure oder Schwefelsäure. Dazu kann man die Mineralsäure zu dem zu extrahierenden Fermentationsmedium zugeben.

Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens extrahiert man und/oder re-extrahiert man bei Raumtemperatur.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren können sowohl die Extraktion als auch die Re-extraktion kontinuierlich durchgeführt werden, beispielsweise mit einem Gegenstromextraktionsdekanter. Dazu kann man einen Standard-Gegenstromextraktionsdekanter verwenden (beispielsweise der Firma Westfalia, Typ CA 22).

Nachstehend wird die Erfindung durch Beispiele und Figuren näher erläutert. Es zeigen

Fig. 1 die Abhängigkeit der Schubspannung und der Viskosität vom Schergefälle;

Fig. 2 die Abhängigkeit des Penicillin-G-Restanteils und des pH-Wertes im Raffinat und der Zunahme der Penicillin-G- Konzentration in der organischen Phase von der Extraktionszeit;

Fig. 3 die Abhängigkeit des Penicillin-G-Restanteils und des pH-Wertes in der wässerigen Phase von der Extraktionszeit;

Fig. 4 die Abhängigkeit des Penicillin-G-Restanteils und des pH-Wertes im Raffinat von der Extraktion;

Fig. 5 die Abhängigkeit des Penicillin-G-Restanteils und des pH-Wertes von der Extraktionszeit während einer physikalischen Extraktion; und

Fig. 6 die Abhängigkeit des Penicillin-G-Anteils von der Extraktionszeit während einer physikalischen Extraktion.

Beispiel 1

Die Produktion von Penicillin G erfolgte in 750-l- und 300-l- Bioreaktoren mit Penicillium chrysogenum bei 25°C und einem pH-Wert von 6,0. Nach 230 h wurde der Produktionsprozeß abgeschlossen und die Fermentationsbrühe aus dem Fermenter entnommen. Die Extraktion erfolgte mit Diisotridecylamin (DITDA) in n-Butylacetat in einem Gegenstromextraktionsdekanter. Die physikalischen Daten der Fermentationsbrühe und die maschinentechnischen Daten des Gegenstromextraktionsdekanters sind der folgenden Tabelle 1 zu entnehmen.

Tabelle 1: Physikalische Daten der Fermentationsbrühe und maschinentechnische Daten des Gegenstromextraktionsdekanters (Firma Westfalia, CA 22 6-290)

Dichte der Suspension\|1,0035 g ml^-1
Sediment (naß)	38% (v v^-1)
Zelltrockenmasse	18,6 g l^-1
Viskosität vgl. Fig. 1 @	Temperatur	25°C
pH	6,0
Dichte des Extraktionsmittels	0,881 g ml^-1
Durchmesser der Regulierscheibe	111,5 mm
und	114,0 mm
Länge des Einlaufrohres der organischen Phase	56,5 cm
Länge des Einlaufrohres der wässerigen Phase	46,0 cm
Differenzdrehzahl	25 min^-1
Durchsatz	1,0 bis 1,5 m³ h^-1
Kein Netzmittel

Nach Beendigung der Produktbildung wurde der pH-Wert der Suspension durch Zugabe von konzentrierten Pufferlösungen (Citronensäure/Citrat) von 6,0 auf 4,8 herabgesetzt. Da kein optimierter Penicillium-chrysogenum-Stamm zugänglich war, wurde die Penicillinkonzentration durch Zugabe von Rohpenicillin G (Penicillin-G-K-Salz) auf 40,9 g l^-1 eingestellt. Auf 250 l Fermentationsbrühe wurden 120 l Extraktionsmittel eingesetzt.

Fig. 2 sind die Betriebsdaten der Extraktion sowie die Verläufe der Konzentration an Penicillin G in der organischen Phase, der relativen Konzentration in der wässerigen Phase und des pH-Wertes nach dem Anfahren der Anlage und während des stationären Betriebes zu entnehmen. Wie aus Fig. 2 zu ersehen ist, wurde der stationäre Zustand in etwa 10 bis 15 min erreicht. Der pH-Wert stieg nach einem Sprung nach 8 min auf 5,0 an und betrug im stationären Betrieb 5,07. Bei einem Phasenverhältnis von 2,5 betrug der Extraktionsgrad 85%. Der Extrakt war frei vom Feststoff und von der wässerigen Phase und stellte eine schwach gelb gefärbte, klare Flüssigkeit dar, die bei leichtem Schütteln schäumte. Die Schaumbildung war auf den relativ hohen Penicillin-G-Gehalt von etwa 82 g l^-1 zurückzuführen.

Beispiel 2

Beispiel 1 wurde mit der Ausnahme wiederholt, daß auf die Verwendung von Puffersalzen verzichtet wurde. Der pH-Wert wurde durch Zugabe verdünnter Phosphorsäure eingestellt, wobei die Säure der organischen Phase vor dem Eintritt in die Dekantertrommel zugeführt wurde.

Fig. 3 sind die Betriebsdaten und die Verläufe der relativen Penicillin-G-Konzentration in der wässerigen Phase und des pH-Wertes zu entnehmen. Der pH-Wert ließ sich im stationären Betrieb im Bereich von 5,1 bis 5,2 konstant halten. Der Extraktionsgrad war mit 70% relativ niedrig, was darauf beruhte, daß die Säure in die organische Phase eingeleitet und dadurch der Gegenstrom teilweise aufgehoben wurde. Die auf Zersetzung zurückzuführenden Penicillin-G-Verluste blieben wie im Beispiel 1 unter 1%.

Beispiel 3

Beispiel 1 wurde mit der Ausnahme wiederholt, daß die konzentrierte Phosphorsäure in die wässerige Phase eingeleitet wurde. Die Betriebsbedingungen und die Verläufe der relativen Penicillin-G-Konzentration in der wässerigen Phase sowie des pH-Wertes sind Fig. 4 zu entnehmen. Der Verlauf der Extraktion war bezüglich der Phasentrennung mit Beispiel 1 vergleichbar. Wiederum war beim leichten Schütteln der organischen Phase infolge des hohen Penicillin-G-Gehaltes eine Schaumbildung zu beobachten. Bei einem Phasenverhältnis von 2 wurde ein Extraktionsgrad von 92% erreicht.

Vergleichsbeispiel

Beispiel 1 wurde mit den Ausnahmen wiederholt, daß die Extraktion ohne Carrier bei einem pH-Wert von 5,0 und einer Penicillin- G-Konzentration von 4,28 g l^-1 durchgeführt wurde.

Fig. 5 sind die Betriebsdaten und die Verläufe der relativen Penicillin-G-Konzentration in der wässerigen Phase und des pH-Wertes zu entnehmen. Der Extraktionsgrad betrug nur 19%, so daß nur etwa 1/4 des Extraktionsgrades der Reaktivextraktion erreicht wurde. Für höhere Extraktionsgrade muß der pH-Wert herabgesetzt werden.

Fig. 6 sind die relative Penicillin-G-Konzentration in der wässerigen Phase (die sich ohne Carrier einstellt) bei verschiedenen pH-Werten sowie die Betriebsdaten zu entnehmen. Auch bei dem niedrigen pH-Wert von 2,3 ließ sich nur ein Extraktionsgrad von 61% erreichen. Dabei betrug der durch Zerfall bedingte Penicillin-G-Verlust 6,5%.

Beispiel 4

Beispiel 1 wurde mit der Ausnahme wiederholt, daß die ursprüngliche Extraktionslösung 7-fach verwendet wurde. Weder chemische Analyse noch gleichbleibender Extraktionsgrad sprachen für einen Carrierverlust.

Literatur

Brunner, K. H., Scherfler, H., Stölting, M. (1981)
Erfahrungen mit dem Gegenstrom-Extraktionsdekanter bei der Gewinnung von Antibiotika aus Fermentationsbrühen
vt-Verfahrenstechnik 15 (1981) 619-622

Katinger, H., Wibbelt, F., Scherfler, H. (1981)
Kontinuierliche direkte Extraktion von Antibiotika mit Separatoren und Dekantern
vt-Verfahrenstechnik 15 (1981) 179-182

Likidis, Z., Schügerl, K. (1987a)
Continuous reactive extraction of penicillin G and its reextraction in three different column types. A comparison.
Chem. Eng. Sci. (in press)

Likidis, Z., Schügerl, K. (1987b)
Simulation of the continuous reextraction of penicillin G from the solution of its ion-pair complex in three different types of bench-scale columns
Chem. Eng. Sci. (submitted)

Likidis, Z., Schügerl, K. (1987c)
Recovery of penicillin G from fermentation broth with reactive extraction in a mixer-settler
Biotechnol. Letters 9 (1987) 229-232

Likidis, Z., Schügerl, K. (1987d)
Recovery of penicillin by reactive extraction in centrifugal extractors
Biotechnol. Bioengng. (in press)

Müller, B., Schlichting, E., Bischoff, L., Schügerl, K. (1987a)
Reactive extraction of penicillin G in a pilot plant Karr column. I. Model media.
Appl. Microbiol. Biotechnol. 26 (1987) 36-41

Müller, B., Schlichting, E., Bischoff, L., Schügerl, K. (1987b)
Reactive extraction of penicillin G in a pilot plant Karr- column. II. Fermentation broths.
Appl. Microbiol. Biotechnol. 26 (1987) 206-210

Müller, B., Schlichting, E., Schügerl, K. (1987c)
Reactive extraction of penicillin G in a pilot plant Karr- column III. Modelling and simulation of the extraction process
Appl. Microbiol. Biotechnol. (in press)

Reschke, M., Schügerl, K. (1984a)
Reactive extraction of penicillin I: Stability of penicillin G in the presence of carriers and relationships for distribution coefficients and degrees of extraction.
The Chem. Eng. J. 28 (1984) B1-B9

Reschke, M., Schügerl, K. (1984b)
Reactive extraction of penicillin II: Distribution coefficients and degrees of extraction
The Chem. Eng. J, 28. (1984) B11-B20

Reschke, M., Schügerl, K. (1984c)
Reactive extraction of penicillin III: Kinetics
The Chem. Eng. J. 29 (1984) B25-B29

Reschke, M., Schügerl, K. (1985)
Continuous reactive extraction of penicillin G in a Karr column
Chem. Eng. J. 31 (1985) B19-B26

Reschke, M., Schügerl, K. (1986)
Simulation of the continuous reactive extraction of penicillin G in a Karr column

13. Symbolverzeichnis

Griechische Symbole

Indices
a, i
außen, innen
aq	wäßrige Phase
G, ges	Gesamtextraktion
H, Hin	Hinextraktion
i	Phasengrenze
org	organische Phase
R, Rück	Rückextraktion
S	Sedimentaition
Z	Zentrifugation
0	Ausgangszustand

Claims

1. Verfahren zur Abtrennung von Penicillin G aus einem Fermentationsmedium durch Extraktion, dadurch gekennzeichnet, daß man

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Carrier verwendet, der in organischen Lösungsmitteln, aber nicht in Wasser löslich ist und auch nicht bei einem pH im Bereich von 4,0 bis 9,0 durch Dissoziation in das Fermentationsmedium oder in das wässerige Re-extraktionsmedium übergeht.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Carrier mit einem oder mehreren Kohlenwasserstoffresten verwendet, die jeweils 15 oder mehr und insbesondere 20 oder mehr Kohlenstoffatome umfassen.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man mit der 2- bis 5-fachen Carriermenge extrahiert, bezogen auf Penicillin G.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man

- die Extraktion in einem pH-Bereich (Fermentationsmedium) von 4,0 bis 5,0 und/oder
- die Re-extraktion in einem pH-Bereich (Re-extraktionsmedium) von 7,0 bis 9,0 durchführt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert im Bereich von 4,0 bis 5,0 mit einer Mineralsäure einstellt, beispielsweise Phosphorsäure oder Schwefelsäure.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mineralsäure zu dem zu extrahierenden Fermentationsmedium zugibt.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man bei Raumtemperatur extrahiert und/oder re-extrahiert.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Extraktion und/oder die Re-extraktion kontinuierlich durchführt, beispielsweise mit einem Gegenstromextraktionsdekanter.