DE2504108C2

DE2504108C2 - Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von Pullulan

Info

Publication number: DE2504108C2
Application number: DE2504108A
Authority: DE
Inventors: Koso Kato; Tatsuo Okayama Nomura
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1974-01-31
Filing date: 1975-01-31
Publication date: 1984-05-30
Also published as: DE2504108A1; US4004977A; JPS50105887A; FR2259905B1; JPS5542635B2; CA1037887A; FR2259905A1; GB1443918A

Description

Zur Herstellung von Polysacchariden sind bereits verschiedene Verfahren einschließlich der flüssigen Kultivierung von Mikroorganismen bekannt, bei der eine extrazellulare Bildung des Polysaccharids sowie die anschließende Isolierung und Gewinnung des gebildeten Polysaccharids erfolgen. Bei den bekannten 'erfahren wird die Kulturlösung von Zellen befreit und die erhaltene Lösung reichlich mit wasserlöslichen, organischen Lösungsmitteln, wie niedrigmolekularen Alkoholen oder Aceton, versetzt, bis eine hinreichende Lösungsmittelkonzentration zur vollständigen Ausfällung des Polysaccharids erreicht ist; anschließend wird die erhaltene Ausfällung isoliert und gewonnen.

Diese Verfahren erfordern eine übermäßige Zugabe von organischen Lösungsmitteln, die gewöhnlich mehr als das 2 bis 3fache Volumen der ursprünglichen Kulturlösung ausmachen. Außerdem ist ein 2 bis 3maiiges Waschen mit absolutem Lösungsmittel erforderlich, um eine vollständige Entwässerung zu erzielen. Das erhaltene Gemisch besitzt demzufolge gewöhnlich mehr als das 3—4fache Volumen der ursprünglichen Kulturlösung. Demgemäß ist mit diesem Verfahren der Nachteil verbunden, daß sie größere Anlagen und lange Zeiträume für die Reinigungsstufe erfordern. Außerdem beträgt das Verhältnis von erforderlichem Lösungsmittel zu erzeugtem Polysaccharid gewöhnlich ein Vielfaches von 10:1. Wenngleich das Lösungsmittel beispielsweise durch Destillation wiedergewinnbar ist, besitzen die Verfahren noch den weiteren Nachteil, daß für das Lösungsmittel ein großer Teil der Produktionskosten anfällt. Schließlich besteht ein weiterer Nachteil der bekannten Verfahren darin, daß die weitere Reinigung, Lösung und Ausfällung wiederholt werden muß, um die Verunreinigungen, d. h. Restzucker, wie beispielsweise Mono- und Oligosaccharide, Pigmente, Eiweiß und anorganische Salze zu entfernten, die aus der Kulturlösung stammen und im Niederschlag vorhanden sind.

Beim Studium der Verfahren zur Abtrennung und Reinigung von Pullulan, einem wasserlöslichen Saccharid, wurde nun gefunden, daß bestimmte Lösungsmittel von höherem Molekulargewicht und leicht geringeren hydrophilen Eigenschaften für derartige Verfahren besser geeignet sind, als niedrigmolekulare, stärker hydrophile Lösungsmittel, wie sie bisher in Gestalt von beispielsweise Methanol, Äthanol und Aceton verwendet wurden.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von Pullulan, bei dem man einen Stamm der Art Aureobasidium pullulans in einem flüssigen Nährmedium kultiviert, die Zellen aus der Kulturlösung entfernt, das in der Kulturlösung enthaltene Pullulan mit einem Lösungsmittel ausfällt und es danach dehydratisiert oder trocknet. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man als Lösungsmittel wenigstens eine der folgenden Verbindungen Propylalkohol, Isopropylalkohol, n-Buthylalkohol. sek.-Butylalkohol, Methylacetat, Tetrahydrofuran, Dioxan, Äthylenglycolmonomethyläther, Äthylenglycolmonoäthyläther, Äthylenglycolmonobutyläther. Diäthylenglycolmonomethyläther. Methyläthylketon, Diacetonalkohoi oder Acetylaceton einsetzt. y

Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß die Ausfällung des in der Kulturlösung ||

vorhandenen Polysaccharids mit verhältnismäßig wenig Lösungsmittel möglich ist. ?;■}

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß bei der Verwendung der erfin- i>j

dungsgemäß ausgewählten Lösungsmittel weniger Verunreinigungen aus der Kuituriösung ausgefällt werden p]

und daher ein reineres Polysaccharid erhalten wird. (i:;

Schließlich besteht ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens darin, daß die im Polysaccharid enthaltenen £'j

Verunreinigungen sowohl mit der wäßrigen als auch der Lösungsmittelphase eluiert werden, weil durch die Äj

Verwendung eines teilweise wasserlöslirhen Lösungsmittels die Bildung von zwei bis drei Phasen aus dem

System aus Lösungsmittel und Kulturlösung bewirkt wird, nämlich einer Fällungsphase aus Polysaccharid, einer ':■;■

flüssigen Phase mit Wasser als Hauptbestandteil (wäßrige Phase) sowie einer flüssigen Phase mit Lösungsmittel Jj

als Hauptbestandteil (Lösungsmittelphase): auf diese Weise wird eine günstigere Reinigung erzielt als bei den :'

bekannten Verfahren, bei denen nur zwei Phasen gebildet werden, nämlich eine Fällungsphase aus Polysaccharid φ

sowie eine homogene Phase aus Wasser und Lösungsmittel. ^!£

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist also eine Abtrennung und Reinigung von Pullulan mit weniger |

bo Lösungsmittel möglich als bisher. Demgemäß werden auch der Verlust an Lösungsmittel sowie die Kosten für it}

die Wiedergewinnung des verbrauchten Lösungsmittels verringert und die technische Herstellung des Polysac- ?■

charids in kleineren Anlagen ermöglicht. Weiterhin ist die Leichtigkeit der Entfernung der Verunreinigungen aus H

dem Polysaccharid ein großer Fortschritt bei der Reinigung des Polysaccharids. ί

Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders wirkungsvoll bei der Kultivierung zur Erzeugung von PuIIu- :._:;

b5 lan. bei dem gleichzeitig eine große Menge an Pigmenten gebildet wird, weil die Reinigung der Kulturlösung bis £j

zu einem farblosen Zustand mit Leichtigkeit durchgeführt werden kann. Auf diese Weise wird nach dem ä;

erfindungsgemiißen Verfahren die Herstellung von verunreinigungsfreiem Pullulan in großtechnischem Maß- ί·

stab möglich.

Die Erfindung wird im folgenden anhand eines typischen Beispiels im Einzelnen näher erläutert. Die Kulturlösung, die man durch Kultivierung eines Stammes von Aureobasidium pullulans unter Verwendung eines partiellen Stärkehydrolysats als Kohlenstoffquelle und von Ammoniumacetat als Stickstoffquelle unter aeroben Bedingungen erhält, ist eine dunkelbraune, viskose Lösung, die je 100 cm³ 3 bis 10 g Pullulan enthält.

Wenn in großen Mengen wasserlösliches Methanol verwendet wird, bewirkt die Methanolzugabe in dreifaeher Volumenmenge, bezogen auf die beim Zentrifugieren erhaltene zelifreie Kulturlösung, die Abtrennung des Pullulans in hellbraun gefärbter Form aus dem homogenen Methanol/Wasser-System. In diesem Falle v/erden die Farbstoffe, die in der Kulturlösung enthalten sind, an dem Pullulan absorbiert und mit ihm ausgefült, wodurch die Reinigung des Pullulans erschwert wird. Selbst ein Zusatz von Aktivkohle vor dem Ausfällen bewirkt keine vollständige Entfärbung, führt dagegen außerdem zu Schwierigkeiten beim Filtrieren wegen der !0 hohen Viskosität der Kulturlösung, so daß deren Verdünnung in einem gewissen Ausmaße ohnehin notwendig ist. Daher ist bei den herkömmlichen Verfahren zum Ausfällen und Abtrennen von Pullulan wesentlich mehr Lösungsmittel erforderlich.

Im Gegensatz dazu führt bei der Verwendung von Methyläthylketon, einer nur teilweise wasserlöslichen Substanz, die sich nur zu 22,6 Gew.-% in Wasser löst, die Zugabe von über 22,6 Gew.-°/o Lösungsmittel zu einer Sättigung der Kulturlösung und einer gleichzeitigen vollständigen Ausfällung des Pullulans. In diesem Fall ist die Volumenerhöhung der zu behandelnden Lösung wesentlich geringer, und zwar beträgt sie etwa Vu derjenigen, die bei der Zugabe von Methanol erforderlich ist. Da sich das Lösungsmittel ferner lediglich zu einem geringen Teil in Wasser löst und umgekehrt, bilden sich zwei Phasen aus. Der größte Teil der Pigmente und andere Verunreinigungen !ösen sich in der erhaltenen wäßrigen Phase, so daß diese Verunreinigungen kaum mit dem Pullulan ausfallen. Auf diese Weise erhält man ein weißes Pullulan, wenn man das ausgefällte Pullulan abtrennt und anschließend in absolutem Lösungsmittel dehydratisiert oder trocknet. Eine wäßrige Lösung, die man mit dem erhaltenen Pullulan herstellt, ist farblos. Verunreinigungen, wie Proteine, Mono- und Oligosaccharide und anorganische Salze, sind in den? getrockneten oder wäßrigen Pullulan kaum vorhanden.

Mehr als die Hälfte der Gesamtherstellungkosten für das Pullulan entfällt auf die Ausfällung mit Lösungsmitteln sowie den Lösungsmittelverbrauch. Nach dem erfindungsgemäßen Verfafe;en können die verwendeten Lösungsmittelmengen sowie die Mengen an zu behandelnder Lösung im Vergleich zu den bei herkömmlichen k Verfahren erforderlichen Mengen bedeutend verringert werden. Da auch die Wiedergewinnung des verbrauchst ten Lösungsmittels leicht durchgeführt werden kann, ist der durch das erfindungsgemäße Verfahren erzielte

S wirtschaftliche Fortschritt bedeutend.

■Ι Das Reinigungsverfahren gemäß der Erfindung ist nahezu unabhängig von der angewandten Züchtungsme-

H thode. Vorzugsweise werden jedc^-h Stämme der Art Aureobasidium pullulans verwendet, die wenig Pigmente

|i erzeugen, da die Herstellung von Pullulan mit Hilfe von Mikroorganismen im allgemeinen von einer starken

I* Pigmentbildung begleitet ist.

i Nach dem Hitzesterilisieren der im Submersverfahren erhaltenen Kulturlösung wird diese auf eine Konzen-

U tration verdünnt, die sich für die nachfolgende Reinigung eignet, falls die Kulturlösung übermäßig viskos ist.

\i Danach wird die Kulturlösung filtriert oder zentrifugiert, um die Zellen abzutrennen. Das Filtrat bzw. die

jäi überstehende Lösung wird mit Aktivkohle versetzt und erneut filtriert oder zentrifugiert, um zu eirier entfärbten,

ff durchsichtigen Lösung zu gelangen. Danach kann die Lösung bis zu einer Konzentration eingeengt werden, die

% sich für die nachfolgende Behandlung mit Lösungsmittel eignet, was gewöhnlich bei einer Konzentration von

rj nicht über 30 g/100 cm³ der Fall ist.

^h-_: Die für Ausfällung des Pullulans erfindungsgemäß verwendeten Lösungsmittel mit verhältnismäßig geringen

j'j hydrophilen Eigenschaften bewirken eine leichte Ausfällung und Reinigung von Pullulan schon bei Verwendung

;1 in geringen Mengen. Besonders Methyläthylketon. Methylacetat und sek.-Butylalkohol besitzen eine geringe

^!: Wasserlöslichkeit von etwa 20 bis 25%, so daß sie sich nur teilweise mit dem Wasser vermischen und zwei

■■■..: Phasen gebildet werden. Der Zusatz eines Drittels bis eines Viertels des Kulturlösungsvolumens an diesen

3 Lösungsmitteln führt bereits zu einer Sättigung des erhaltenen Gemisches und bewirkt die vollständige Ausfäl-

J-Ά lung des Pullulans. Dieser Zusatz beträgt weniger als ein Zehntel desjenigen lösungsmittelzusatzes, der bei

;· Verwendung von Aceton oder niedrigmolekularen Alkohoisn erforderlich wäre.

ν'-' Die meisten der Restzucker, wie beispielsweise Mono- und Oligosaccharide, sowie der Pigmente und anderen

i'i Verunreinigungen werden in die wäßrige Phase übergeführt. Außerdem können geringe Mengen an Verunreini-

;'i gungen, die zusammen mit Wasser in dem ausgefällten Pullulan verblieben sind, entfernt werden, indem man

!f erneut eine geringe Menge des Lösungsmittels dem ausgefällten Pullulan zusetzt. Auf diese Weise erhält man ein

! Produkt mit höherer Reinheit als bei der Durchführung der Ausfällung mit Methanol oder Aceton.

% Im Vergleich zu den herkömmlicherweise verwendeten Lösungsmitteln, wie Methanol oder Aceton, die in

■; etwa dem dreifachen Volumen der Kulturlösung eingesetzt werden mußten, um eine Ausfällung zu erzielen und

i, die im Hinblick auf die Entfernung von Verunreinigungen weniger wirksam waren, sind einige Vertreter der

• '■> erfindungsgemäß einsetzbaren Lösungsmittel, die sich in großem Ausmaße mit Wasser mischen, jedoch verhält-

¹ . nismäßig geringe hydrophile Eigenschaften aufweisen, wie beispielsweise Propanol, Isopropanol, Tetrahydrofu-

ψ ran, Diöxan und Äthylenglycolmonobutyläther, ebenfalls in der Lage, eine vollständige Ausfällung von Pullulan

i, zu bewirken, wenn man von ihnen weniger als die Hälfte des Volumens der Kulturlösung zusetzt. Außerdem

i₍: besitzen sie eine hinreichende Wirksamkeit bei der Entfernung von Verunreinigungen, wenngleich sie weniger

ν geeignet als das obenerwähnte Methyläthylketon oder Methylacetat sind.

Die Abtrennung und Gewinnung des Pullulans umfaßt den Zusatz des Lösungsmittels zu der wäßrigen Pullulanlösung, d. h der Kulturlösung, unter Rühren, die vollständige Ausfällung des Puliulans, die Gewinnung b5 der Pullulanphase und anschließend den ein- oder zweimaligen Zusatz einer äquivalenten Lösungsmittelmenge zu der Pullulanphase unter hinreichendem Rühren, um ein nahezu wasserfreies Pullulan zu erhalten. Außerdem werden Spuren von Verunreinigungen durch das Verfahren entfernt. Das getrocknete Pullulan kann hergestellt

werden, indem man die Pullulanphase in einer beliebigen Verfahrensstufe entfernt und sie trocknet, was beispielsweise mit Hilfe der Walzentrocknung, der Fließbetttrocknung und der Sprühtrocknung erfolgen kann. Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen näher erläutert.

Beispiel I

Eine Impfkultur des Stammes Aureobasidium puüulans IFO 4464 wurde durch Beimpfen eines sterilisierten und gekühlten flüssigen Nährmediums mit diesem Stamm angesetzt. Das Nährmedium enthielt auf je 100 ml 10 g mit Säure konvertierten Stärkesirups mit einem Dextroseäquivalent von 45,0,2 g Dikaliummonohydrogenphosphat. 0,2 g Pepton 0,2 g Kochsalz, 0,04 g MgSO₄ ■ 7 H₂O und 0,001 g FeSO₄ · 7 H₂O. Es wurde 26 Stunden lang bei 27°C unter aeroben Bedingungen inkubiert. Eine Hauptkultur wurde angesetzt, indem man die Kulturlösung auf ein Medium impfte, das die gleiche Zusammensetzung, wie oben beschrieben, besaß, und das ganze unter den gleichen Bedingungen vier Tage lang inkubierte. Die auf diese Weise erhaltene hellbraune, viskose Kulturlösung wurde zur Entfernung der Zellen zentrifugiert und anschließend durch Filtrieren nach Zugabe von Aktivkohle entfärbt. Das erhaltene Filtrat besaß einen Pullulangehalt von 6 g/100 ml.

Aliquote Mengen von 50 ml der erhaltenen, viskosen, durchsichtigen, wäßrigen Pullulanlösung wurden mit jeweils 16,17,20 und 26 ml Methylethylketon versetzt. Nach hinreichendem Rühren und Vermischen wurden die einzelnen Gemische stehengelassen, damit sich die Phasentrennang vollziehen konnte. Jede der erhaltenen Phasen wurde anschließend auf ihr Volumen, Entfärbungsgrad (Differenz der optischen Dichten bei 420 und 720 nm) sowie den Restzucker- und Pullulangehalt untersucht.

In einem Kontrollversuch wurden 50 ml der wäßrigen Pullulanlösung mit dem dreifachen Mechanoivolumen versetzt und das Gemisch anschließend hinreichend gerührt und danach stehengelassen, damit sich der Niederschlag aus Pullulan von der wäßrigen Phase abscheiden konnte. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I zusammengefaßt. Das Ausmaß der Wiedergewinnung war in beiden Fällen, d. h. sowohl beim Methylethylketon als auch beim Methanol nahezu 100%ig. Jedoch waren die Puilulanprodukte, die mit den verschiedenen Lösungsmitteln erhalten wurden, hinsichtlich ihrer Reinheit stark verschieden, wie es auch die Menge an für die Ausfällung erforderlich gewesenem Lösungsmittel war. Im Falle der Anwendung von Methanol wurde wesentlich mehr Lösungsmittel benötigt, und die Pigmente waren in der wäßrigen Phase weit weniger stark vertreten als in dem Fall, in dem Methylethylketon als Lösungsmittel verwendet wurde. Der Niederschlag, der mit Methyläthylketon gebildet wurde, war nach erneuter Auflösung kaum gefärbt und demjenigen überlegen, der unter Verwendung von Methanol erhalten worden war.

Tabelle 1

35	Lösungsmittel Volumen zugesetztes	Volumen jeder Phase	0,5	Zuckergehalt	Färbungsgrad
	Lösungsmittel (ml)	(ml)	49.5	g/50 ml	(420 nm — 720 nm)
	Methyläthylketon 0	Kulturlösung	16,5	(Pullulan 6,00)	0,335
			3,0	(Restzucker 1.92)
4(1	17	Methylketon	50.0	0	0
		Wasser	16,0	1.50	0.325
		Niederschlag	9.5	6,42	0.010
	20	Methyläthylketon	49,5	0	0
		Wasser	16,0	1.52	0.323
45		Niederschlag	195,0	6.40	0.012
	26	Methyläthylketon	4,0	0	0
		Wasser	1,51	0,324
		Niederschlag	6.41	0,011
50	Methanol 150	Wasser	1,12	0,130
		Niederschlag	6.80	0,205

Das durch Ausführung der Ausfällung mit Methyläthylketon, wie oben beschrieben, erhaltene Pullulan enthielt noch etwis Wasser und Restzucker. Nach Zugabe von 25 ml frischem Methyläthylketon zu der Pullulanphase und hinreichendem Rühren wurde die Trennung der ausgefällten Phase zweimal wiederhoit und ein Pullulan in Pulverform mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 3 Gew.-% erhalten. Das Produkt war nicht gefärbt und enthielt kaum Restzucker. Im Gegensatz dazu wurde bei der Ausfällung mit Methanol ein Pullulanprodukt erhalten, das auf die gleiche Weise, wie oben beschrieben, mit 50 ml Anteile;' Methanol zu einem pulverförmigen Produkt mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 3,2 Gew.-% verarbeitet wurde. Dieses Produkt war jedoch gefärbt

>o und enthielt 3 Gew.-% Restzueker.

Beispiel 2

Die in Beispiel I beschriebene Kulturlösung wurde zur Entfernung von Zel.cn zentrifugiert. Die überstehende ,3 Flüssigkeil wurde zur Ausfällung und Reinigung mit Methylacetat versetzt. Dabei wurden zu je 50 ml Kulturlösung mit einem Geh i't von 6 Gew.-% Pullulan 30 ml Methylacetat hinzugegeben. Die gebildete Pullulanphase wurde abgetrennt und zweimal mit je 10 ml Anteilen Methylacetat zur Dehydratisierung versetzt, wonach ein Pullulanprodukl in Pulverform mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 2,5 Gew.-% erhalten wurde. Die Reinigung

erforderte weniger Lösungsmittel und ließ sich leichter durchführen als bei der Verwendung von Methanol. Die Analysenergebnissc der auf beide Weisen erhaltenen Produkte hinsichtlich ihres Pullulan- und Restzuckcrgehaltes sowie ihrer Färbung sind in Tabelle Il zusammengestellt:

Tabelle!!

Lösungsmittel

Volumen zugesetztes Lösungsmittel (ml)

Pullulan und Resi/uckeigehalt
in der ausgefüllten Phase g/50 ml

l'ärbungsgrad
(4.¹O mn-720 nm)

Methylacetai

Kulturlösung

30 + 10 + 10

Pullulan	b.00
Rest/ucker	1.92
Pullulan	b.OO
Rest/ucker	0,41
Pullulan	6.00
Rest/ucker	0.01
Pullulan	b.00
Rest/ucker	0.04
Beispiel 3

0.333
0.01
0,01
0.01

Eine Kulturlösung, die je 100 ml 7 g Pullulan enthielt, wurde unter Verwendung desselben Nährmediutns. wie in Beispiel I beschrieben, jedoch mit der Abweichung, daß der Gehalt an Dikaliumhydrogenphosphat auf 0,3 g/100 ml erhöht worden war, erhalten. Nach Entfernung der Zellen wurden aliquote Anteile der Kulturlösung zu je 50 ml mit einem der in Tabelle III angegebenen Lösungsmittel versetzt. Die gebildeten Pullulanphasen wurden abgetrennt und gewonnen und anschließend durch zweimalige Zugabe von 10 ml Anteilen jeweils desselben Lösungsmittels gereinigt. Die Analysenergebnisse des '!:>nach erhaltenen Pullulans sind ebenfalls in Tabelle III angegeben. Wie sich aus der Tabelle ersehen läßt, wies keines der Produkte eine Färbung auf, und jedes besaß einen niedrigen Restzuckergehalt.

Tabelle III

Lösungsmittel	Zugesetztes	Pullulan-	Wassergehalt	Färbung	!	nein	<esl/iicker·	.1
	Lösungsmittel	ausbcutc*)	im erhaltenen	t	nein	•ehalt im
	(ml)		Pullulan		nein	'rhaltenen
			(Gew.-"/o)	nein	»ullulan
Dmcetonalkohol	25	99	5	nein	.0
Acetylaceton	30	98	2	,5
Tetrahydrofuran	25	100	3	.1
Dioxan	50	95	2	.0
Äthylenglycolmonoäthyläther	40	99	2	.0
Äthylenglycolmonomethyläther	38	100	3	nein 0.5
sek-Butylalkohol	30	100	4	nein

*) Als Ausbeute dient das Verhältnis von gewonnenem Pullulan zu in der Kulturlösung enthaltenem Pullulan.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von Pullulan, bei dem man einen Stamm der Art Aureobasidium pullulans in einem flüssigen Nährmedium kultiviert, die Zellen aus der Kulturlösung entfernt, das in der Kulturlösung enthaltende Pullulan mit einem Lösungsmittel ausfällt und es danach dehydratisiert oder trocknet, dadurch gekennzeichnet, daß man als Lösungsmittel wenigstens eine der folgenden Verbindungen Propylalkohol, Isopropylalkohol, n-Butylalkohol, sek.-ButyIaIkohol, Methylacetat, Tetrahydrofuran, Dioxan, Äthylenglycolmonomethyläther. Äthylenglycolmonoäthyläther, Äthylenglycolmonobutyläther, Diäthylenglycolmonomethyläther, Methyläthylketon, Diacetonalkohoi oder Acetylaceton einsetzt.