DE4134854C2

DE4134854C2 -

Info

Publication number: DE4134854C2
Application number: DE19914134854
Authority: DE
Inventors: Ikuo Minamata Kumamoto Jp Satoh; Kazunori Izumi Kagoshima Jp Mieno; Kyouko Mizokami; Yasuhiro Minamata Kumamoto Jp Kurokawa; Masahiro Tokio/Tokyo Jp Fujii
Original assignee: Chisso Corp
Current assignee: JNC Corp
Priority date: 1990-10-23
Filing date: 1991-10-22
Publication date: 1993-03-04
Also published as: GB2249315B; JPH04158796A; JPH0630605B2; DE4134854A1; GB2249315A; GB9122504D0

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer wäßrigen Lösung aus Natriumhyaluronat mit hoher Reinheit aus einer Fermentationsbrühe von Hyaluronsäure.

Hyaluronsäure wird als ein Bestandteil in Bindegeweben, Glaskörperflüssigkeiten, Nabelschnüren, Knorpel, Haut, Hahnenkämmen und dergleichen gefunden und spielt in einem lebenden Körper eine wichtige Rolle. Natriumhyaluronat ist eine hochmolekulare Substanz. Da die Lösung davon eine hohe Viskosität, Elastizität und Wasserrückhalteeigenschaft aufweist, wird sie bei kosmetischen Materialien in großem Umfang angewandt. Sie wird ebenfalls in Arzneimitteln für Augenleiden, Wunden und Arthropatie verwendet.

Natriumhyaluronat, das für die oben genannten Zwecke verwendet wird, muß ein hohes Molekulargewicht und eine hohe Reinheit aufweisen.

Natriumhyaluronat wird industriell durch Extraktion aus Hahnenkämmen oder durch Inkubation von Mikroorganismen mit der Fähigkeit, Hyaluronsäure in einem Kulturmedium zu erzeugen, hergestellt.

Bisher wurde eine wäßrige Lösung von hochreinem Natriumhyaluronat durch ein Verfahren hergestellt, umfassend die Behandlung einer Lösung, die Hyaluronsäure enthält, die durch Extraktion oder Fermentation erhalten ist, mit einem quartären Ammoniumsalz unter Erhalt eines Präzipitates, erneutes Auflösen dieses Präzipitates in Wasser, Behandeln der Lösung mit Protease und mit Aktivkohle, Zugabe von Alkohol zu der behandelten Lösung, Ausfällen von Natriumhyaluronat, Abtrennen des Präzipitates von der Alkohollösung, Trocknen des Präzipitates unter Erhalt eines Natriumhyaluronatpulvers und erneutes Auflösen des Pulvers in Wasser.

Bei einem derartigen Verfahren sind schwierige Verfahren nach der Reinigung eines Kulturmediums erforderlich, ein Ausfällmittel wie Ethanol wird zu der gereinigten Lösung zugegeben, um Natriumhyaluronatpulver auszufällen und das Pulver wird in Wasser erneut aufgelöst, um eine wäßrige Lösung aus hochreinem Natriumhyaluronat zu erhalten.

Eine wäßrige Lösung aus hochreinem Natriumhyaluronat wird nicht ohne ein Ausfällverfahren aus einer Fermentationsbrühe von Hyaluronsäure durch konventionelle Verfahren hergestellt.

Das Ziel dieser Erfindung liegt darin, ein Verfahren zur direkten Herstellung einer wäßrigen Lösung aus hochreinem Natriumhyaluronat aus einer Fermentationsbrühe vorzuschlagen, ohne daß die oben genannten schwierigen Verfahrensvorgänge angewandt werden müssen.

Diese Erfindung ist im Patentanspruch 1 angegeben. Der Patentanspruch 2 nennt eine Ausgestaltung der Erfindung.

Der Ausdruck "hochrein" gemäß der Beschreibung hat die folgende Bedeutung. Die Reinheit von Natriumhyaluronat ist zumindest 85 Gew.% eines gefriergetrockneten Materials, welches durch Gefriertrocknen einer wäßrigen Lösung aus Natriumhyaluronat erhalten wird, der Abdampfungsrückstand der Lösung liegt bei 100 bis 130 Gew.% an Natriumhyaluronat, und das Protein in der Lösung ist weniger als 0,1 Gew.% von Natriumhyaluronat.

Natriumhyaluronat, das erfindungsgemäß verarbeitet wird, wird aus einem Kulturmedium erhalten, worin ein Mikroorganismus mit der Fähigkeit, Hyaluronsäure zu produzieren, in diesem Kulturmedium inkubiert wird. Erfindungsgemäß können Mikroorganismen, die die Fähigkeit zur Erzeugung von Hyaluronsäure haben, verwendet werden, beispielsweise ist Genus Streptococcus bevorzugt. Streptococcus pyogenes, Streptococcus equi, Streptococcus equisimilis, Streptocossus dysgalactiae und Streptococcus zooepidemicus sind beispielsweise angegeben.

Das Kulturmedium kann ein übliches Kulturmedium sein, das für die Inkubation von Mikroorganismen, die Hyaluronsäure produzieren, verwendet wird. Als ein Beispiel kann ein Kulturmedium, das 2,0 bis 3,0% Dextrose, 0,5% Hefeextrakt, 0,3% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,2% Dikaliumphosphat, 0,01% Natriumthiosulfat, 0,01% Magnesiumsulfat 7 H₂O, 0,002% Natriumsulfit, 0,001% Kobaltchlorid, 0,001% Manganchlorid und 0,5% eines Antischaummittels enthält, bei einem pH von 6,0 bis 8,5 verwendet werden (in der Lösung bedeutet % g/dl). Die Inkubation wird durch Schütteln oder durch Sauerstoffzufuhr unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Die Inkubationstemperatur liegt bei 25 bis 40°C und vorzugsweise bei 30 bis 35°C. Der pH-Wert wird bei 6,5 bis 8,0 und vorzugsweise 7.0 kontrolliert, nach 1 bis 3 Tagen der üblichen Inkubationsspannen wird Hyaluronsäure in dem Kulturmedium akkumuliert. Das Kulturmedium ist dann eine Mischung aus Kulturrestbestandteilen, hochmolekularen Bestandteilen, niedermolekularen Bestandteilen, Färbungsstoffen, Mikroorganismen und Hyaluronsäure.

Hochmolekulare Bestandteile mit Ausnahme von Hyaluronsäure, Farbstoffen und einem Teil der niedermolekularen Bestandteile werden durch Aktivkohlenadsorption entfernt. Insbesondere ist es wesentlich, daß Protein der hochmolekularen Bestandteile, durch das eine allergische Reaktion verursacht wird, sorgfältig entfernt wird. Kulturmedium wird mit Aktivkohle behandelt, und die Aktivkohle und die Mikroorganismen werden durch Filtration entfernt.

Die Erfinder dieser Erfindung haben die Bedingungen für die Adsorption und die Entfernungen dieser hochmolekularen Bestandteile, insbesondere Protein, unter Verwendung von Aktivkohle untersucht. Als ein Ergebnis haben sie festgestellt, daß der größere Anteil des Proteins durch Behandlung mit Aktivkohle in der Gegenwart von zumindest 0,2 M Natriumchlorid adsorbiert und entfernt werden kann. Die Beziehung zwischen der Konzentration und Natriumchlorid bei der Behandlung mit Aktivkohle und dem Proteingehalt des erhaltenen Natriumhyaluronates ist in Tabelle 1 dargestellt.

Konzentration an Natriumchlorid bei der Behandlung mit Aktivkohle (M)
Proteingehalt pro Natriumhyaluronat (Gew.-%)
0
0,93
0,01	0,67
0,05	0,32
0,1	0,16
0,2	0,09
0,3	0,05
0,4	0,04

Wie in Tabelle 1 gezeigt ist, ist es erforderlich, die Behandlung mit Aktivkohle in der Gegenwart von wenigstens 0,2 M, vorzugsweise 0,3 bis 0,4 M , Natriumchlorid durchzuführen. Das Filtrat, das mit Aktivkohle behandelt worden ist, kann einer Ultrafiltration unterworfen werden, zur Entfernung der restlichen niedermolekularen Bestandteile, die sich aus dem Kulturmedium ableiten oder die bei dem Fermentationsverfahren erzeugt worden sind, und zur Entfernung von Natriumchlorid, das bei der Behandlung mit Aktivkohle zugegeben worden ist.

Hyaluronsäure in der Fermentationsbrühe weist üblicherweise ein Molekulargewicht von wenigstens 700 000 bis 800 000 auf. Auf der anderen Seite haben Dextrose und Mineralsalze, die als Ausgangsmaterialien für die Fermentation verwendet werden, und ein Salz von organischen Säuren, das während der Fermentationsspanne erzeugt wird, üblicherweise ein Molekulargewicht von weniger als 5000.

Demgemäß können, wenn die Ultrafiltrationsbehandlung mit einer Ultrafiltrationsmembran durchgeführt wird, die Verbindungen mit einer Molmasse von 6000 bis 50 000 oder weniger durchlassen kann, die oben erwähnten niedermolekularen Bestandteile entfernt werden. Da jedoch niedermolekulare Bestandteile nicht dann zufriedenstellend entfernt werden können, wenn nur einmal ein Ultrafiltrationsvorgang durchgeführt wird, ist es erforderlich, den Ultrafiltrationsvorgang durch Zugabe von gereinigtem Wasser absatzweise oder kontinuierlich zu wiederholen. Wenn die niedermolekularen Bestandteile wie Natriumchlorid entfernt sind, wird die elektrische Leitfähigkeit des Filtrates erniedrigt. Demzufolge wird der Reinigungsvorgang durch Bestimmung der elektrischen Leitfähigkeit beurteilt. Beispielsweise wird gereinigtes Wasser zu einem Filtrat zugegeben, das durch Aktivkohlenbehandlung der Fermentationsbrühe von Hyaluronsäure erhalten wird. Mit der Mischung wird eine Ultrafiltration mit Minitan durchgeführt (cut-off Molekulargewicht: 30 000), und die Beziehungen zwischen der elektrischen Leitfähigkeit der Mischung, der Reinheit an Natriumhyaluronat und der Menge an verdampftem Rest sind in Tabelle 2 dargestellt. Der Wert der elektrischen Leitfähigkeit ändert sich mit der Konzentration an Natriumhyaluronat, so daß die zuerst genannte Angabe in bezug auf 0,2 Gew.% (bei 25°C) des zuletzt genannten dargestellt ist.

Tabelle 2

Als ein Ergebnis ist es zur Herstellung einer hochreinen Natriumhyaluronatlösung erforderlich, die Lösung durch Ultrafiltration zu behandeln, bis der Wert der elektrischen Leitfähigkeit sich auf weniger als 0,4 mS/cm erniedrigt.

Weiterhin wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren, nachdem die Lösung mit Aktivkohle behandelt ist und nachdem die Aktivkohle abgetrennt und aus der Lösung entfernt ist, die Ultrafiltrationsbehandlung festgesetzt. Auf der anderen Seite kann die Lösung durch Ultrafiltration, Aktivkohlenbehandlung, Abtrennung und Entfernung der Aktivkohle und durch Ultrafiltration behandelt werden. In diesem Fall ist eine Flüssigkeit, die für die erste Ultrafiltration geeignet ist, eine Flüssigkeit, die durch Filtration erhalten ist, um die Mikroorganismen aus der Fermentationsbrühe zu entfernen. Bevor die Lösung mit Aktivkohle behandelt wird, wird die Lösung durch Ultrafiltration behandelt. Demgemäß wird im Vergleich zu dem Fall, bei dem die Lösung nicht durch Ultrafiltration vor der Aktivkohlenbehandlung behandelt wird, wenn die Lösung durch Ultrafiltration vor der Aktivkohlenbehandlung behandelt wird, der gleiche Effekt mit einer geringen Menge an Aktivkohle erzielt.

Unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann eine wäßrige Lösung aus Natriumhyaluronat mit hoher Reinheit direkt aus einer Fermentationsbrühe ohne ein Ausfällverfahren hergestellt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren stellt ein einfaches Verfahren dar, ohne daß übliche schwierige Verfahrensvorgänge erforderlich sind. Die Kosten des Verfahrens werden erniedrigt. Es ist möglich, ein hochreines Produkt zu erhalten, das als Kosmetikmaterial, für Arzneimittel, etc. verwendbar ist.

Weiterhin kann, unter Berücksichtigung der Verwendung, die Lösung schließlich mit einer Ultrafiltrationsmembran oder einem Konzentrat durch ein konventionelles Verfahren konzentriert werden.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung noch näher erläutern.

Beispiel 1

300 ml einer Fermentationsbrühe mit Hyaluronsäure wurde dreimal mit Wasser verdünnt, Natriumchlorid wurde zu der Lösung zugegeben unter Erhalt einer Lösung mit einer Konzentration von 0,3 M Natriumchlorid. 60 g Aktivkohle (Warenname: Shirasagi A-50W, Wassergehalt: 50 Gew.%) wurde zu der Lösung zugegeben. Die Lösung wurde eine Stunde lang gerührt und die Aktivkohle wurde abfiltriert. Die elektrische Leitfähigkeit der Lösung lag bei 22,0 mS/cm. Mit dem Filtrat wurde eine Ultrafiltration mit einer Ultrafiltrationsmembran (Warenname: Minitan), die ein Cut-off Molekulargewicht von 30 000 aufwies, durchgeführt, unter Verwendung von gereinigtem Wasser, unter Erhalt einer behandelten Lösung mit einer elektrischen Leitfähigkeit von 0,24 mS/cm. Der Proteingehalt der behandelten Lösung lag bei 0,06 Gew.% Natriumhyaluronat, der Rest bei dem Verdampfen lag bei 115 Gew.% Natriumhyaluronat, und die Reinheit von Natriumhyaluronat lag bei 90,4 Gew.% des gefriergetrockneten Materials. Eine Lösung aus Natriumhyaluronat mit hoher Reinheit, das für Kosmetika geeignet ist, wurde erhalten.

Vergleichsbeispiel 1

Unter Verwendung der gleichen Fermentationsbrühe wie bei Beispiel 1 wurde die Ultrafiltration durchgeführt, mit der Ausnahme, daß Aktivkohle nicht zugegeben wurde, und ein Filtrat mit einer elektrischen Leitfähigkeit von 0,30 mS/cm wurde erhalten. Der Proteingehalt der behandelten Lösung lag bei 2,74 Gew.% an Natriumhyaluronat, der Rest bei dem Verdampfen war 125 Gew.% Natriumhyaluronat und die Reinheit bei Natriumhyaluronat lag bei 85,5 Gew.% der gefriergetrockneten Materialien. Demgemäß war die Entfernung des Proteins aus der Lösung unvollständig.

Vergleichsbeispiel 2

Unter Verwendung der gleichen Fermentationsbrühe wie bei Beispiel 1 wurde die Ultrafiltration durchgeführt, mit der Ausnahme, daß Natriumchlorid nicht zugegeben wurde, und ein Filtrat mit einer elektrischen Leitfähigkeit von 0,20 mS/cm wurde erhalten.

Der Proteingehalt der behandelten Lösung lag bei 1,12 Gew.% Natriumhyaluronat, der Rest bei der Verdampfung lag bei 120 Gew.% Natriumhyaluronat, und die Reinheit von Natriumhyaluronat lag bei 86,3 Gew.% der gefriergetrockneten Materialien. Demgemäß war die Entfernung des Proteins aus der Lösung unvollständig.

Beispiel 2

300 ml einer Fermentationsbrühe mit Hyaluronsäure wurden dreimal mit Wasser verdünnt, Natriumchlorid wurde zu der Lösung zugegeben unter Erhalt einer Lösung mit einer Konzentration von 0,4 M Natriumchlorid. Die elektrische Leitfähigkeit der Lösung lag bei 28.3 mS/cm. Nach der Filtration zur Entfernung von Mikroorganismen aus der Lösung wurde mit dem Filtrat eine Ultrafiltraton mit einer Ultrafiltrationsmembran mit einem Cut-off Molekulargewicht von 6000 (Ultrafiltrationsmodul: SIP-1013) durchgeführt, indem gereinigtes Wasser verwendet wurde, unter Erhalt einer behandelten Lösung mit einer elektrischen Leitfähigkeit von 0,38 mS/cm. Natriumchlorid wurde zu der behandelten Lösung zugegeben, unter Erhalt einer Lösung mit 0,4 M Natriumchlorid. 30 g Aktivkohle (Warenname: Taiko S, Wassergehalt: 50 Gew.%) wurden zu der Lösung zugegeben, die Lösung wurde eine Stunde lang gerührt, und die Aktivkohle wurde abfiltriert.

Das Filtrat, das durch die Filtration der Aktivkohle erhalten wurde, wurde einer Ultrafiltration mit der gleichen Ultrafiltrationsmembran, wie oben erwähnt, unterworfen, indem Wasser zugegeben wurde, und ein Filtrat mit einer elektrischen Leitfähigkeit von 0,2 mS/cm wurde erhalten.

Der Proteingehalt der behandelten 0,2%igen wäßrigen Lösung aus Natriumhyaluronat lag bei 0,04 Gew.% Natriumhyaluronat, der Rest bei der Verdampfung war 114 Gew.% Natriumhyaluronat und die Reinheit an Natriumhyaluronat lag bei 92,2 Gew.% des gefriergetrockneten Materials. Die 0,2%ige wäßrige Lösung wurde einer Ultrafiltration mit der gleichen Ultrafiltrationsmembran unterworfen und eine 1%ige wäßrige Lösung aus Natriumhyaluronat wurde leicht hergestellt.

Vergleichsbeispiel 3

Unter Verwendung der gleichen Fermentationsbrühe wie bei Beispiel 2 wurde die Ultrafiltration durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die zweite Ultrafiltrationsbehandlung beendet wurde, sobald die elektrische Leitfähigkeit des Filtrates 3,6 mS/cm ausmachte.

Der Proteingehalt der erhaltenen 0,2%igen wäßrigen Lösung aus Natriumhyaluronat lag bei 0,09 Gew.% Natriumhyaluronat, der Rest bei der Verdampfung war bei 320 Gew.% Natriumhyaluronat und die Reinheit von Natriumhyaluronat lag bei 36,7 Gew.% des gefriergetrockneten Materials. Demgemäß verblieb der Rest bei der Verdampfung in einer beachtlichen Menge, und die Reinheit an dem Natriumhyaluronat, das erhalten wurde, war gering.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer wäßrigen Lösung aus Natriumhyaluronat mit hoher Reinheit, gekennzeichnet durch

a) Behandeln einer Fermentationsbrühe aus Hyaluronsäure-Fermentationsverfahren mit Aktivkohle, wobei die Aktivkohlebehandlung in Anwesenheit von Natriumchlorid mit einer Konzentration von 0,2 M oder mehr durchgeführt wird. und anschließendes Behandeln durch Ultrafiltration zur Entfernung der restlichen niedermolekularen Bestandteile und zur Entfernung von Natriumchlorid, das bei der Behandlung mit Aktivkohle zugegeben worden ist, bis der Wert der elektrischen Leitfähigkeit sich auf weniger als 0,4 mS/cm erniedrigt, oder
b) Behandeln der durch Filtrieren von den Mikroorganismen befreiten Fermentationsbrühe aus Hyaluronsäure-Fermentationsverfahren durch Ultrafiltration, Behandeln mit Aktivkohle und anschließendes Behandeln durch Ultrafiltration.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Ultrafiltrationsbehandlung mit einer Ultrafiltrationsmembran durchgeführt wird, deren Cut-off Molekulargewicht unter 100 000 liegt, daß die behandelte Lösung dialysiert wird unter Erhalt einer Lösung mit einer elektrischen Leitfähigkeit von weniger als 0,4 mS/cm und daß die Lösung konzentriert wird.