DE3205074C2

DE3205074C2 -

Info

Publication number: DE3205074C2
Application number: DE3205074A
Authority: DE
Inventors: Kenzo Kanazawa Jp Tamai; Isamu Saikawa; Takashi Yasuda; Shohachi Toyama Jp Murakami; Toyoo Kanazawa Jp Maeda; Hisatsugu Toyama Jp Tsuda; Hiroshi Takaoka Jp Sakai; Masatoshi Toyama Jp Sugita; Yoshiko Namekawa Jp Yamamoto; Hisashi Minami; Takako Toyama Jp Hori
Original assignee: Toyama Chemical Co Ltd
Current assignee: Toyama Chemical Co Ltd
Priority date: 1981-02-19
Filing date: 1982-02-12
Publication date: 1987-09-24
Also published as: NZ199771A; US4591558A; CA1184864A; ATA64682A; FI69096C; FI69096B; FR2499855B1; NO157426B; BE892204A; NL8200640A; DK69282A; CH651052A5; GB2093347B; SE8201016L; DK151640C; DK151640B; NO157426C; FI820527L; SE457000B; DE3205074A1

Description

Als Mittel zur Behandlung von Patienten mit verschiedenen Krebsarten werden in jüngster Zeit Mittel zur Steigerung der immunologischen Funktion des Patienten intensiv untersucht. Diese Mittel führen durch Unterstützung der immunologischen Funktion zu einem carcinostatischen Effekt. Derartige Antitumormittel werden aus verschiedensten Organismen, z. B. aus verschiedenen Bakterien oder aus den Kulturen verschiedener Bakterien, gewonnen oder sie liegen in Form von Polysacchariden vor, welche aus Fruchtkörpern von Basidiomycetes gewonnen werden oder aus kultivierten Funguskörpern derselben.

Die Erfinder haben die pharmakologische Wirksamkeit der überstehenden Flüssigkeit untersucht, welche erhalten wird bei der Kultivierung von Bakterien der Gattung Fusobacterium, und zwar nach Entfernung der Organismen von der Kulturbrühe. Es wurde festgestellt, daß eine spezifische Komponente in der überstehenden Flüssigkeit eine carcinostatische Wirkung entfaltet. Ferner wurde festgestellt, daß diese Komponente eine indirekte carcinostatische Wirkung zeitigt, und zwar durch Steigerung der Wirt-vermittelten Antitumoraktivität oder der Immunität des Wirts. Somit wird die Wirkung der Immunität ausgenützt. Ferner wurde festgestellt, daß diese Komponente eine äußerst geringe Toxizität hat. Schließlich wurde festgestellt, daß diese Komponente durch Aufarbeitung der Kultur isoliert werden kann.

Es ist Aufgabe der Erfindung, neue carcinostatische Substanzen zu schaffen sowie Verfahren zur Herstellung derselben.

Als Bakterien für die Gewinnung der neuen Substanzen wählt man am günstigsten Fusobacterium nucleatum TF-031 ATCC 31647.

Das Fusobacterium nucleatum TF-031 hat die folgenden bakteriologischen Eigenschaften:

(I) Form

(1) Form der Zellen: spindelförmig (

Fig.

1)
(2) Polymorphismus der Zellen: abwesend
(3) Motilität: abwesend
(4) Sporen: abwesend
(5) Gram-Färbung: gramnegativ
(6) Säurebeständigkeit: negativ

(II) Wuchszustand im Kulturmedium

(1) TF-a Agarplatte und Schrägkulturmedien
externe Form: runde Gestalt
Größe: etwa 1 mm
Protuberanz: halbkugelförmige Gestalt
Struktur: tautropfenartig
Oberfläche: glatt
Kanten: glatt
Farbe: milchig gelblich-weiß
Transparenz: opak

(2) TF-a Flüssigkulturmedium
Wachstumsgrad: heftig
Turbidität: Koagulum
Präzipitat: keines
Oberflächenwachstum: keines; kein Wachstum bis zu einer Tiefe von etwa 5 mm
Gas: keines

(III) Physiologische Eigenschaften

(1) Entwicklung von Schwefelwasserstoff: +
(2) Reduktion von Nitraten: -
(3) Produktion von Buttersäure: +
(4) Produktion von Indol: +
(5) Urease: -
(6) Catalase: -
(7) Stärkehydrolyse: -
(8) Verhalten gegenüber Sauerstoff: anaerob
(9) Erzeugung von Ammoniak: +
(10) Erzeugung von Kohlendioxid: +
(11) Wachstumsbereich: pH 5,0 bis 8,5; 30° bis 45°C
(12) Produktion von Gas aus Sacchariden:
L-Arabinose (-), D-Xylose (-), D-Glucose (-), D-Mannose (-), D-Fructose (-), D-Galactose (-), Malzzucker (-), Saccharose (-), Trehalose (-), Sorbit (-), Mannit (-), Inosit (-), Glycerin (-), Stärke (-).

Die neuen TF-2..-Substanzen können z. B. schematisch auf folgende Weise hergestellt werden.

Das oben beschriebene Herstellungsverfahren soll im folgenden näher erläutert werden.

(1) Kultivierung des Bakterienstamms

Die Kultivierung des Bakterienstamms wird auf herkömmliche Weise, wie bei anaeroben Bakterien üblich, durchgeführt. Es wird ein Kulturmedium mit einem Gehalt einer Stickstoffquelle, wie Rinder-Hirn-Herz- Extrakt, verschiedene Peptone oder dgl., verwendet. Ferner enthält das Medium eine Vitaminquelle, wie Hefeextrakt oder dgl.; anorganische Salze, wie Natriumchlorid oder dgl.; eine Kohlenstoffquelle, wie Glucose, Lactose oder dgl.; ein Reduktionsmittel, wie L-Cystin, Natriumsulfit, Thioglykolat oder dgl., und der pH-Wert wird auf 6 bis 8,5 und vorzugsweise auf 6,5 bis 7,5 eingestellt. Das Bakterium wird in das Kulturmedium eingeimpft. Danach erfolgt eine Fließgleichgewichtskultur unter anaeroben Bedingungen bei 30 bis 42°C und vorzugsweise 32 bis 37°C während 1 bis 5 Tagen und vorzugsweise 24 bis 96 Stunden. Es ist insbesondere erwünscht, ein Kulturmedium gemäß Tabelle 1 zu verwenden. Dieses wird im folgenden als "TF- Kulturmedium" bezeichnet. Es ist jedoch nicht unbedingt ein Hirn-Herz-Infusionsmedium erforderlich (dabei handelt es sich um einen Rinder-Hirn-Herz-Extrakt) (als Kohlenstoffquelle). Dieses Medium kann ersetzt werden durch ein Herzinfusionsmedium. Dabei handelt es sich um einen Rinderherzextrakt. Ferner kann man einen Rindfleischextrakt, einen Fischextrakt oder Maisquellwasser oder dgl. verwenden. Unter den verschiedenen Peptonen kommen Proteasepepton und Phytonpepton in Frage. Sie sind jedoch nicht stets erforderlich. Man kann das Trypticasepepton auch durch Polypepton ersetzen. Wenn kein Agar verwendet wird, so wird eine Rührkultur durchgeführt.

Tabelle 1

(2) Abtrennung der überstehenden Flüssigkeit von der Kulturmasse (Entfernung der Organismen)

Die Organismen werden aus der erhaltenen Kultur entfernt, wobei die überstehende Flüssigkeit gewonnen wird. Zur Entfernung der Organismen eignen sich herkömmliche Methoden, z. B. Zentrifugierverfahren oder Filterverfahren. Man kann dabei eine Filterhilfe verwenden, z. B. Hyflo-Super-Cel. Das Zentrifugierverfahren ist bevorzugt vom Standpunkt der Arbeitsweise, der Gründlichkeit der Beseitigung der Organismen und der Ausbeute an überstehender Flüssigkeit.

(3) Gewinnung der carcinostatischen Substanz TF-2..

(i)(a) Ein hydrophiles, organisches Lösungsmittel wird der überstehenden Flüssigkeit oder der Kulturmasse zugesetzt und der Niederschlag wird abgetrennt. In dieser Stufe wird die überstehende Flüssigkeit oder die Kulturmasse vorzugsweise auf pH 1,5 bis 7 eingestellt und bevorzugt auf einen pH in der Nähe von pH 2 (pH 1,5 bis 2,5). Als hydrophile, organische Lösungsmittel kommen z. B. Alkohole in Frage, wie Äthanol, Methanol oder dgl.; Ketone, wie Aceton oder dgl., obwohl Alkohole und insbesondere Äthanol bevorzugt sind, da sie die besten Ergebnisse erbringen. Das hydrophile, organische Lösungsmittel wird derart zugesetzt, daß seine Konzentration 30 bis 80 Vol.-% und speziell 50 bis 80 Vol.-% beträgt. Nach dem Zusatz des hydrophilen, organischen Lösungsmittels wird die erhaltene Mischung bei niedriger Temperatur stehengelassen, vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa 5°C, und zwar während mehrerer Stunden bis mehrerer Tage, bis zur beendeten Bildung des Präzipitats. Der gebildete Niederschlag wird mit herkömmlichen Verfahren abgetrennt, z. B. durch Dekantieren, Zentrifugieren, Filtrieren oder dgl.

(b) Zu dem abgetrennten Niederschlag gibt man Wasser, und zwar die 5- bis 20fache Menge des Niederschlags. Sodann wird der Niederschlag in Abhängigkeit vom pH fraktioniert. Dieses Verfahren wird im einzelnen wie folgt durchgeführt.

(b-1) Die Mischung des Niederschlags und des Wassers wird auf pH 7,5 bis 8 eingestellt. Falls erforderlich, werden unlösliche Bestandteile entfernt. Sodann wird die Mischung auf einen pH in der Nähe von pH 4 (3,5 bis 4,5) eingestellt. Die gebildeten, wasserunlöslichen und wasserlöslichen Bestandteile werden sodann voneinander getrennt, und zwar durch Verwendung herkömmlicher Verfahren, wie Zentrifugieren, Filtrieren oder dgl. Der wasserunlösliche Anteil (TF-210) hat die in Tabelle 2 angegebenen Eigenschaften.

(b-2) Sodann wird der in Stufe (a) erhaltene Niederschlag gesondert mit Wasser versetzt, und zwar mit der 5- bis 20fachen Menge des Niederschlags. Die Mischung wird auf pH 7,5 bis 8 eingestellt. Nachdem man erforderlichenfalls die unlöslichen Bestandteile entfernt hat, wird der pH in die Nähe von pH 6 gebracht (5,5 bis 6,5). Die erhaltenen, wasserunlöslichen und wasserlöslichen Bestandteile werden voneinander auf übliche Weise, z. B. durch Zentrifugieren, Filtrieren oder dgl., getrennt. Der erhaltene, wasserlösliche Anteil (TF-220) hat die in Tabelle 2 angegebenen Eigenschaften.

(b-3) Der wasserlösliche Anteil der Stufe (b-2) wird auf einen pH in der Nähe von 4 (3,5 bis 4,5) gebracht. Der Niederschlag und der wasserlösliche Anteil werden voneinander auf übliche Weise durch Zentrifugieren, Filtrieren oder dgl. getrennt. Der erhaltene Niederschlag (TF-230) hat die in Tabelle 2 angegebenen Eigenschaften.

(b-4) Der in Stufe (b-1) oder (b-3) abgetrennte, wasserlösliche Anteil wird auf einen pH in der Nähe von pH 2 gebracht (1,5 bis 2,5), worauf ein Niederschlag gebildet wird. Dieser Niederschlag wird vom wasserlöslichen Anteil durch Zentrifugieren, Filtrieren oder dgl. abgetrennt. Der erhaltene Niederschlag (TF-240) hat die in Tabelle 2 angegebenen Eigenschaften.

(b-5) Der in Stufe (a) erhaltene Niederschlag wird mit Wasser versetzt, und zwar mit der 5- bis 20fachen Wassermenge, bezogen auf die Menge an Niederschlag, worauf der pH der Mischung auf z. B. 7,5 bis 8 eingestellt wird. Dann wird der pH in die Nähe von pH 2 gebracht (1,5 bis 2,5). Zu dem so erhaltenen, wasserlöslichen Anteil oder zu dem in Stufe (b-4) abgetrennten, waserlöslichen Anteil gibt man, falls erforderlich, nach dem Einengen der Menge des wasserlöslichen Anteils auf 1/3 bis 1/7 ein hydrophiles, organisches Lösungsmittel zu, vorzugsweise einen Alkohol, so daß die Konzentration 20 bis 80 Vol.-% und vorzugsweise 20 bis 60 Vol.-% beträgt. Dabei wird ein Niederschlag gebildet, welcher mit TF-250 bezeichnet wird. Die erhaltene, carcinostatische Substanz TF-250 hat die in Tabelle 2 angegebenen Eigenschaften.

Die so erhaltenen, carcinostatischen Substanzen TF-210, TF-220, TF-230, TF-240 und TF-250 können jeweils mehrmals der gleichen Fraktionierung in Abhängigkeit vom pH-Wert unterzogen werden und auf diese Weise gereinigt werden. Die so erhaltenen, carcinostatischen Substanzen können nach üblichen Verfahren in pharmazeutisch aktzeptable Salze umgewandelt werden, z. B. in Alkalimetallsalze, wie Natriumsalze, Kaliumsalze und dgl., und in Erdalkalimetallsalze, wie Magnesiumsalze, Calciumsalze oder dgl.

(ii) Die Fraktionen mit carcinostatischer Aktivität, welche in Stufe (i) erhalten wurden, nämlich TF-210, TF- 220, TF-230, TF-240 und TF-250, werden jeweils einer Deproteinisierungsbehandlung unterworfen. Diese erfolgt in üblicher Weise. Dabei erhält man die folgenden Substanzen:

TF-310, TF-320 und TF-330, TF-340 und TF-350.

Zur Deproteinisierungsbehandlung kann man bekannte Verfahren heranziehen, wobei Verfahren der Zersetzung mit proteolytischen Enzymen besonders bevorzugt sind. Wenn es erwünscht ist, die Deproteinisierung durch Behandlung mit einem proteolytischen Enzym durchzuführen, so reicht es aus, daß jede der Fraktionen mit carcinostatischer Aktivität der Stufe (i) in Wasser oder einer Pufferlösung aufgelöst oder suspendiert wird, worauf man ein Protein zersetzendes Enzym zur erhaltenen Lösung oder Suspension zusetzt und danach die Enzymbehandlung in üblicher Weise durchführt.

Als proteolytische Enzyme kann man z. B. Pronase, Papain, Trypsin, Chymotrypsin oder dgl. verwenden. Pronase und Trypsin sind bevorzugt. Es ist insbesondere bevorzugt, vor oder während der Enzymbehandlung die wäßrige Lösung auf pH 7 bis 8 einzustellen und zu halten. Zu diesem Zweck kann man Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumcarbonat, Natriumhydrogencarbonat oder dgl. verwenden. Zur Verhinderung einer Putrefaktion des Reaktionsgemisches während der Enzymbehandlung ist es erwünscht, eine geringe Menge eines organischen Lösungsmittels, wie Chloroform, Toluol oder dgl., zuzusetzen. Das Enzym wird gewöhnlich in einer Menge von 1 bis 2 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des der Enzymbehandlung zu unterwerfenden Pulvers (Festkörper), zugesetzt.

Die obige Enzymbehandlung erfolgt üblicherweise bei 30 bis 40°C innerhalb von 1 bis 72 Stunden und vorzugsweise 24 bis 48 Stunden. Sie kann auch durchgeführt werden, indem man zunächst z. B. etwa 1 Gew.-% des Enzyms zum Pulver (Festkörper) gibt und sodann das Pulver (Festkörper) der Enzymbehandlung während 1 bis 24 Stunden aussetzt, worauf man nochmals etwa 1 Gew.-% des Enzyms für zusätzliche Enzymbehandlung zugibt.

Nach der obigen Enzymbehandlung werden, falls erforderlich, unlösliche Bestandteile abzentrifugiert, filtriert oder dgl.. Sodann gewinnt man aus den wasserlöslichen Anteilen jeweils Fraktionen carcinostatischer Substanzen, nämlich TF-310, TF-320, TF-330, TF-340 und TF- 350. Auf diese Weise gewinnt man TF-310 von TF-210; TF- 320 von TF-220; TF-330 von TF-230; TF-340 von TF-240 und TF-350 von TF-250. Die Isolierung der Fraktionen TF-310, TF-320, TF-330, TF-340 und TF-350 kann durchgeführt werden durch mindestens eine Fraktionierung in Abhängigkeit vom pH-Wert sowie durch gesonderte Fällung mit einem hydrophilen, organischen Lösungsmittel, durch Fraktionierung mit einem Ionenaustauscher, durch Ultrafiltration oder dgl. Alternativ kann man auch eine oder mehrere dieser Operationen mehrmals wiederholen. Genau gesprochen werden die vorliegenden, carcinostatischen Substanzen, nämlich TF-310, TF-320, TF-330, TF-340 und TF-350, erhalten durch Einstellen des pH-Wertes des obigen wasserlöslichen Anteils auf vorzugsweise einen pH von nicht mehr als 2,5, wobei man erforderlichenfalls Trichloressigsäure zusetzt. Dann wird der erhaltene Niederschlag abgetrennt. Nun gibt man zum löslichen Anteil ein hydrophiles, organisches Lösungsmittel, wie Alkohol, so daß seine Konzentration 30 bis 80 Vol.-% und vorzugsweise 60 bis 80 Vol.-% beträgt. Dann wird der gebildete Niederschlag abgetrennt. Es handelt sich dabei um die Fraktion der angestrebten Verbindung. Nachfolgend kann, falls erforderlich, dieser Niederschlag mit einem starken Anionenaustauscherharz behandelt werden, z. B. mit Dowex 1 oder Amberlite IRA-400. Diese Behandlung kann mehrmals durchgeführt werden. Auf diese Weise isoliert man die nichtadsorbierten Fraktionen, und diese werden, falls erforderlich, einer Ultrafiltration unterworfen. Hierzu verwendet man z. B. ein Toyo Ultrafilter UK-50 mit einem nominellen Molekulargewichtsabbruch von 50 000 oder ein Toyo Ultrafilter UK-200 mit einem nominellen Molekulargewichtsabbruch von 200 000. Sodann werden die Substanzen weiteren Behandlungen unterzogen, wie einer Einengung, Entsalzung oder Aussalzung, Trocknung oder Ausfällung mit Hilfe eines hydrophilen, organischen Lösungsmittels oder dgl.. Die so erhaltenen, carcinostatischen Substanzen TF-310, TF-320, TF-330, TF-340 und TF-350 haben die in Tabelle 2 angegebenen Eigenschaften.

Die carcinostatischen Substanzen TF-310, TF-320, TF-330, TF-340 und TF-350 können in pharmazeutisch akzeptable Salze umgewandelt, und zwar nach herkömmlichen Verfahren. Man kann z. B. Alkalimetallsalze, wie Natriumsalze oder Kaliumsalze, und Erdalkalimetallsalze, wie Magnesiumsalze, Calciumsalze oder dgl., verwenden. Diese Salze sind pharmazeutisch akzeptabel.

Tabelle 2

Fortsetzung

Die pharmakologischen Aktivitäten der erfindungsgemäßen carcinostatischen Substanzen TF-210, TF-220, TF-230, TF- 240, TF-250, TF-310, TF-320, TF-330, TF-340 und TF-350 werden im folgenden erläutert. Bei den nachfolgenden pharmakologischen Tests wird die Testsubstanz TF-210 des Beispiels 1 eingesetzt sowie die Testsubstanz TF-220 des Beispiels 3, TF-230 des Beispiels 5, TF-240 des Beispiels 7, TF-250 des Beispiels 9, TF-310-1 des Beispiels 11(1), TF-310-2 des Beispiels 18, TF-320 des Beispiels 12, TF-330 des Beispiels 13, TF-340 des Beispiels 19, TF-350 des Beispiels 24 und TF-310 bis 330 der Beispiele 11 bis 18.

(1) Immunostimulierende Wirkung

Drei Mäuse vom ICR-Stamm (weiblich, 6 Wochen alt) werden in jeder Gruppe verwendet. Jede der Testsubstanzen wird in einer physiologischen Salzlösung aufgelöst und 0,2 ml einer jeden Lösung werden intraperitoneal verabreicht. 24 h nach der Verabreichung werden in den Schwanz der Maus 0,2 ml einer Kohlenstoffsuspension intravenös injiziert. Diese wird bereitet durch Vermischen von 1 ml Pelikan Zeichentusche Nr. 17, schwarz (Günther Wagner GmbH.) mit 2 ml einer physiologischen Salzlösung, enthaltend 3 Gew.-% Gelatine. 1, 5, 10 und 15 min nach der Injektion werden aus der Orbita 0,02 ml Blut gewonnen, wobei man eine Haematokritkapillare verwendet, die mit Heparin beschichtet ist. Das Blut wird sofort verdünnt und haemolysiert, und zwar mit 1,6 ml einer 0,1 Gew.-% wäßrigen Natriumcarbonatlösung. Diese Lösung wird colorimetriert, und zwar bei 675 nm. Der Phagocytose- Index (K-Wert) wird aus der Gleichung von Halpern et al. ermittelt. Die Mäuse der Blindgruppe erhalten 0,2 ml einer physiologischen Salzlösung.

C₀ bezeichnet den Kohlenstoffpulvergehalt im Blut zum Zeitpunkt t₀; C bezeichnet den Kohlenstoffpulvergehalt im Blut zum Zeitpunkt t. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 3 bis 5 aufgeführt.

Tabelle 3

Tabelle 4

Tabelle 5

(2) Carcinostatische Wirkung (i) Antitumorwirkung gegen Ehrlich Ascites-Tumor

Ehrlich's Ascites-Tumorzellen werden intraperitoneal in Mäuse vom ICR-Stamm (weiblich, 6 Wochen alt) in einer Menge von 1×10⁵ Zellen/Maus eingeimpft. Nachfolgend wird jeweils die Testsubstanz, aufgelöst in einer physiologischen Salzlösung, in einer Menge von 0,2 ml intraperitoneal an die Mäuse verabreicht, und zwar einmal pro Tag an sieben aufeinanderfolgenden Tagen vom ersten Tag nach der Einimpfung der Tumorzellen ab. Der Vergleichsgruppe gibt man 0,2 ml einer physiologischen Salzlösung, und zwar in gleicher Weise. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 6 und 7 zusammengestellt.

Tabelle 6

Tabelle 7

(ii) Antitumorwirkung gegen Sarcoma-180-Zellen

(a) Sarcoma 180-Zellen werden intraperitoneal transplantiert, und zwar in Mäuse vom ICR-Stamm (weiblich, 6 Wochen alt) in einer Menge von 1×10⁵ Zellen/Maus. Nachfolgend wird eine jede der Testsubstanzen in einer physiologischen Salzlösung aufgelöst, und 0,2 ml einer jeden der erhaltenen Lösungen werden intraperitoneal verabreicht, und zwar einmal pro Tag an sieben aufeinanderfolgenden Tagen, beginnend mit dem ersten Tag nach der Transplantation der Sarcoma-Zellen. Einer Vergleichsgruppe werden 0,2 ml einer physiologischen Salzlösung in gleicher Weise verabreicht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 zusammengestellt.

Tabelle 8

(b) Sarcoma 180-Zellen werden subkutan transplantiert, und zwar in die Achselhöhle von Mäusen des ICR- Stamms (weiblich, 6 Wochen alt) in einer Menge von 1×10⁷ Zellen/Maus. Nachfolgend wird eine jede der Testsubstanzen, aufgelöst in einer physiologischen Salzlösung oder in einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung, verabreicht. Es werden jeweils 0,2 ml der erhaltenen Lösung intravenös (iv) oder intramuskulär (im) injiziert, und zwar einmal pro Tag an sieben aufeinanderfolgenden Tagen, beginnend mit dem ersten Tag nach der Transplantation der Sarcoma- Zellen. Die Vergleichsgruppe erhält 0,2 ml einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung oder einer physiologischen Salzlösung, und zwar in gleicher Weise. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8-(2) zusammengestellt.

Tabelle 8-(2)

(iii) Antitumorwirkung gegenüber Ehrlich's solidem Tumor

Ehrlich Tumorzellen werden subkutan in die Achselhöhle von Mäusen des ICR-Stamms (weiblich, 6 Wochen alt) in einer Menge von 4×10⁶ Zellen/Maus transplantiert. Nachfolgend werden die jeweiligen Testsubstanzen in einer physiologischen Salzlösung oder einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung aufgelöst. 0,2 ml einer jeden der Lösungen werden intraperitoneal den Mäusen verabreicht, und zwar einmal pro Tag an sieben aufeinanderfolgenden Tagen, beginnend mit dem ersten Tag nach der Transplantation der Tumorzellen, oder einmal an jedem zweiten Tag an insgesamt 10 Tagen, beginnend am 8. Tag nach der Transplantation der Tumorzellen. Der Vergleichsgruppe werden auf gleiche Weise 0,2 ml einer physiologischen Salzlösung oder einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung verabreicht. Das Gewicht eines jeden Tumors wird ermittelt. Die Ermittlung des Tumorgewichts erfolgt durch Messen des großen Durchmessers (a mm) und des kleinen Durchmessers (b mm) mittels einer Schieblehre. Die Werte werden für a und b in der folgenden Gleichung eingesetzt:

Die Ergebnisse sind in den Tabellen 9-(1) und 9-(2) aufgeführt.

Tabelle 9-(1)

Tabelle 9-(2)

(iv) Antitumoraktivität gegen B-16 Melanom-Zellen

(a) B-16 Melanom-Zellen werden subkutan in die Achselhöhle von Mäusen des BDF₁-Stamms (männlich, 7 Wochen alt) in einer Menge von 1×10⁶ Zellen/Maus transplantiert. Nachfolgend wird die jeweilige Testsubstanz in physiologischer Salzlösung aufgelöst und jeweils 0,2 ml der jeweiligen Lösung werden intraperitoneal verabreicht, und zwar einmal am Tag während sieben aufeinanderfolgender Tage, beginnend mit dem ersten Tag nach der Transplantation der Tumorzellen. Die Vergleichsgruppe erhält in gleicher Weise 0,2 ml physiologische Salzlösung. Die Tumorgewichte werden am 17. oder 23. Tag nach der Transplantation der Tumorzellen ermittelt. Die Bestimmungsmethode ist die gleiche wie im Testverfahren (iii). Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 aufgeführt.

Tabelle 10

(b) B-16 Melanom-Zellen werden subkutan in die Achselhöhle von Mäusen des BDF₁-Stamms (männlich, 6 Wochen alt) in einer Menge von 1×10⁶ Zellen/Maus transplantiert. Nachfolgend wird die Testsubstanz in einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung aufgelöst. 0,2 ml der gebildeten Lösung werden verabreicht, und zwar gleichzeitig intratumorös und intraperitoneal, und zwar einmal an jedem zweiten Tag an insgesamt 12 Tagen, beginnend mit dem 13. Tag nach der Transplantation der Tumorzellen. Die Vergleichsgruppe erhält jeweils 0,2 ml einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung auf gleiche Weise. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10-(2) aufgeführt.

Tabelle 10-(2)

Das Tumorgewicht wird am 23. Tag bestimmt.

(3) Akute Toxizität

LD₅₀-Werte werden bei Mäsusen (ICR-Stamm, weiblich, 6 Wochen alt, intravenöse Verabreichung) gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 zusammengestellt.

Tabelle 12

SubstanzLD₅₀ (mg/kg)

TF-210über 100 TF-220über 200 TF-230über 100 TF-240über 200 TF-250über 200 TF-310, TF-320, TF-330über 10 TF-340über 200 TF-350über 200

Man erkennt aus den obigen pharmakologischen Experimenten, daß die TF-2..-Substanzen der Erfindung brauchbare carcinostatische Mittel sind. Es kann eine Wirksamkeit gegen verschiedenste Krebserkrankungen erwartet werden. Insbesondere kann eine beträchtliche Wirksamkeit gegen solide Tumoren erwartet werden. Alle TF-2..-Substanzen der Erfindung zeigen ausgezeichnete Effekte.

Die TF-2..-Substanzen der Erfindung können zu verschiedensten pharmazeutischen Darreichungsformen verarbeitet werden. Insbesondere können orale Mittel hergestellt werden oder Injektionsmittel oder Suppositorien oder dgl. Bevorzugt sind Injektionsmittel. Im Falle oraler Mittel können diese verschiedene Hilfsstoffe enthalten und in Form von Kapseln, Tabletten, Pulvern oder Granulat vorliegen. Im Falle von Injektionsmitteln können diese für subkutane Injektion, intramuskuläre Injektion und intravenöse Injektion vorgesehen sein. Es kann sich dabei um Suspensionen oder Lösungen handeln oder um Pulver, welche vor Gebrauch in einer Salzlösung oder einer Glucose oder ein Lokalanaesthetikum enthaltenden Lösung aufgelöst werden. Die Dosis der TF-2..-Stubstanzen (TF-210, 220, 230, 240, 250, 310, 320, 330, 340 und 350) kann je nach dem Zustand des Patienten ausgewählt werden. Es ist jedoch im allgemeinen erwünscht, einem Erwachsenen 0,005 bis 50 mg/kg einmal oder mehrmals am Tag zu verabreichen. Was die Verabreichungsmethode anbelangt, so ist die subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektion oder die Injektion in den erkrankten Bereich bevorzugt.

Ausführungsbeispiele

Im folgenden wird die Erfindung im einzelnen anhand von Beispielen und Zeichnungen näher erläutert; es zeigt

Fig. 1 eine mikroskopische Photographie der Form des Fusobacterium nucleatum TF-031;

Fig. 2 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-210 des Beispiels 1;

Fig. 3 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. 4 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-220 des Beispiels 3;

Fig. 5 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. 6 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-230 des Beispiels 5;

Fig. 7 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. 8 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-240 des Beispiels 7;

Fig. 9 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. 10 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-250 des Beispiels 9;

Fig. 11 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. 12 ein Infrarot-Absoprtionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-310 des Beispiels 11;

Fig. 13 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. 14 ein Hochleistungs-Flüssigchromatogramm dieser Substanz;

Fig. 15 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-320 des Beispiels 12;

Fig. 16 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. 17 ein Hochleistungs-Flüssigchromatogramm dieser Substanz;

Fig. 18 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-330 gemäß Beispiel 13;

Fig. 19 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. 20 ein Hochleistungs-Flüssigchromatogramm dieser Substanz;

Fig. 21 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-330 (gereinigt) des Beispiels 13;

Fig. 22 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. 23 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-310 (gereinigt) des Beispiels 18;

Fig. 24 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. 25 ein Hochleistungs-Flüssigchromatogramm dieser Substanz;

Fig. 26 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-340 des Beispiels 19;

Fig. 27 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. 28 ein Hochleistungs-Flüssigchromatogramm dieser Substanz;

Fig. 29 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-350 des Beispiels 24;

Fig. 30 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. 31 ein Hochleistungs-Flüssigchromatogramm dieser Substanz.

Beispiel 1

(1) In ein 10 l Fermentationsgefäß gibt man 8 l TF-e Kulturmedium, enthaltend 17 g Trypticasepepton, 10 g Herzinfusion, 3 g Hefeextrakt, 7,5 g Natriumchlorid, 12 g Glucose, 10 g Lactose, 0,1 g Natriumsulfit und 0,5 g Natriumthioglykolat, und zwar pro Liter destilliertes Wasser. Das Kulturmedium wird 30 min bei 120°C sterilisiert. Nach dem Abkühlen des Kulturmediums wird Stickstoffgas während einer Stunde mit einem Durchsatz von 100 ml/min hindurchgeleitet. Nun wird das Kulturmedium mit 1 l einer Vorkulturlösung von Fusobacterium nucleatum TF-031 ATCC-31647 geimpft, das zuvor hergestellt wurde durch Kultivierung in einem TF-e Kulturmedium der gleichen Zusammensetzung. Die Zellen werden 3 Tage bei 37°C unter Rühren (30 U/min) kultiviert, wobei Stickstoffgas mit 65 ml/min hindurchgeleitet wird. Nach der Kultivierung wird die Kultur mit 160 g Celite und 80 g Cellulosepulver versetzt und die Mischung wird gerührt und unter vermindertem Druck abfiltriert. Man erhält 7,8 l einer bakterienfreien, überstehenden Flüssigkeit der Kultur.

(2) Zu 7,8 g der überstehenden Flüssigkeit gibt man 117 ml konz. Salzsäure, um den pH auf 2,0 einzustellen. Sodann gibt man 11,7 l Äthanol hinzu, wobei eine 60%ige wäßrige Äthanollösung erhält. Diese wird sodann während 24 h bei 4°C stehengelassen. Nachfolgend wird die überstehende Flüssigkeit abdekantiert und der verbleibende Anteil wird zentrifugiert (6×10³ U/min; 5 min), und zwar bei 4°C. Dabei wird der Niederschlag gewonnen. Das Präzipitat wird mit 400 ml einer 60%igen wäßrigen Äthanollösung vom pH 2,0 gewaschen sowie mit 400 ml Äthanol, 200 ml Aceton und 200 ml Diäthyläther in dieser Reihenfolge. Dann wird der Niederschlag unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 3,9 g eines Pulvers.

(3) Das Pulver der Stufe (2) wird in 25 ml Wasser suspendiert. Der pH-Wert der erhaltenen Suspension wird durch Zugabe von 1 N wäßriger Natriumhydroxidlösung auf 7,5 bis 8,0 eingestellt, und danach wird 30 min bei Zimmertemperatur gerührt und 1 N Salzsäure wird zugegeben, um den pH auf 4,0 einzustellen. Sodann wird unter Eiskühlung während 2 h gerührt, und die Mischung wird mit 1×10⁴ U/min während 10 min zentrifugiert, um den Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit abzutrennen. Der Niederschlag wird mit 10 ml Wasser vom pH 4,0 gewaschen und sodann wird der Niederschlag von der Waschflüssigkeit durch Zentrifugieren (1×10⁴ U/min; 10 min) abgetrennt. Die Waschflüssigkeit und die oben erwähnte überstehende Flüssigkeit werden kombiniert und der Behandlung gemäß Beispiel 9 unterworfen. Der Niederschlag wird mit 10 ml Äthanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 1,5 g der carcinostatischen Substanz TF-210. Die so erhaltene carcinostatische Substanz TF-210 hat die Eigenschaftender Tabelle 2. Das Infrarot(IR)-Absorptionsspektrum und das Ultraviolett(UV)-Absorptionsspektrum sind in den Fig. 2 bzw. 3 dargestellt.

Beispiel 2

(1) In ein 10 l Fermentationsgefäß gibt man 8 l eines TF-d Kulturmediums, enthaltend 17 g Trypticasepepton, 20 g Herzinfusion, 3 g Hefeextrakt, 7,5 g Natriumchlorid, 12 g Glucose, 10 g Lactose, 0,1 g Natriumsulfit und 0,5 g Natriumthioglykolat/1 l destilliertes Wasser. Das Kulturmedium wird 30 min bei 120°C sterilisiert und nach dem Abkühlen wird Stickstoffgas während 1 h mit 100 ml/min durchgeleitet. In dieses Kulturmedium gibt man 1 l einer Vorkulturlösung von Fusobacterium nucleatum TF-031 ATCC-31647, welche zuvor bereitet wurde durch Kultivieren in einem TF-d Kulturmedium der gleichen Zusammensetzung. Die Zellen werden 3 Tage bei 37°C unter Rühren mit 30 U/min kultiviert, wobei Stickstoffgas mit einem Durchsatz von 65 ml/min hindurchgeleitet wird. Nach der Kultivierung wird der Ansatz mit 160 g Celite und 80 g Cellulosepulver versetzt und das erhaltene Gemisch wird gerührt und filtriert (unter vermindertem Druck), wobei man 7,8 l einer bakterienfreien, überstehenden Flüssigkeit erhält.

(2) Zu 7,8 l der überstehenden Flüssigkeit gibt man 117 ml konz. Salzsäure, um den pH auf 2,0 einzustellen. Sodann gibt man 11,7 l Äthanol zu der übsterstehenden Flüssigkeit, wobei eine 60%ige wäßrige Äthanollösung erhalten wird. Diese läßt man 24 h bei 4°C stehen. Nachfolgend wird die überstehende Flüssigkeit abdekantiert und die Restmenge wird zentrifugiert (6×10³ U/min; 5 min) bei 4°C, wobei der Niederschlag erhalten wird. Dieser wird mit 400 ml einer 60%igen wäßrigen Äthanollösung vom pH 2,0, 400 ml Äthanol, 200 ml Aceton und 200 ml Diäthyläther in dieser Reihenfolge gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 4,5 g eines Pulvers.

(3) Das Pulver wird der gleichen Behandlung wie in Beispiel 1(3) unterworfen, wobei man 1,6 g der carcinostatischen Substanz TF-210 erhält. Die so erhaltene, carcinostatische Substanz TF-210 hat die in Tabelle 2 gezeigten Eigenschaften. Das IR-Absorptionsspektrum und das UV-Absorptionsspektrum sind mit denjenigen des Beispiels 1 identisch.

Beispiel 3

(1) In ein 10 l Fermentationsgefäß gibt man 8 l eines TF-e Kulturmediums der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 1. Das Kulturmedium wird 30 min bei 120°C sterilisiert. Nach dem Abkühlen des Kulturmediums wird Stickstoffgas hindurchgeleitet, und zwar während 1 h mit einem Durchsatz von 100 ml/min. In dieses Kulturmedium gibt man nun 1 l einer Vorkulturlösung von Fusobacterium nucleatum TF-031 ATCC-31647, welche zuvor durch Kultivieren in TF-e Kulturmedium bereitet wurde. Die Zellen werden 5 Tage bei 37°C unter Rühren (30 U/min) kultiviert, und zwar unter Einleiten von Stickstoffgas mit einem Durchsatz von 65 ml/min. Nach beendeter Kultivierung wird das Kulturmedium mit 160 g Celite und 80 g Cellulosepulver versetzt und das erhaltene Gemisch wird gerührt und unter vermindertem Druck filtriert. Man erhält 7,8 l einer bakterienfreien, überstehenden Flüssigkeit.

(2) Zu 7,8 l der überstehenden Flüssigkeit der Stufe (1) gibt man 117 ml konz. Salzsäure, um den pH der überstehenden Flüssigkeit auf 2,0 einzustellen. Sodann werden 11,7 l Äthanol zur überstehenden Flüssigkeit gegeben, wobei man eine 60%ige wäßrige Äthanollösung erhält. Diese läßt man nun während 24 h bei 4°C stehen. Sodann wird die überstehende Flüssigkeit abdekantiert und die Restmenge wird bei 4°C zentrifugiert (6×10³ U/min; 5 min); der dabei erhaltene Niederschlag wird mit 400 ml einer 60%igen wäßrigen Äthanollösung vom pH 2,0, 400 ml Äthanol, 200 ml Aceton und 200 ml Diäthyläther in dieser Reihenfolge gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet, wobei man 4,9 g eines Pulvers erhält.

(3) Das Pulver der Stufe (2) wird in 49 ml Wasser suspendiert. Der pH der erhaltenen Lösung wird durch Zusatz von 1 N wäßriger Natriumhydroxidlösung auf 7,5 bis 8,0 eingestellt und 30 min bei Zimmertemperatur gerührt, worauf der pH der Suspension mit 1 N Salzsäure auf 6,0 eingestellt wird. Nachfolgend wird die Suspension 2 h unter Eiskühlung gerührt, worauf das Gemisch abzentrifugiert wird (1×10⁴ U/min; 10 min), um den Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit abzutrennen. Das Präzipitat wird mit 5 ml Wasser vom pH 6,0 gewaschen. Nun wird der Niederschlag von der Waschflüssigkeit abzentrifugiert, und zwar während 10 min bei 1×10⁴ U/min, und mit 10 ml Äthanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 1,8 g der carcinostatischen Substanz TF-220. Die so erhaltene, carcinostatische Substanz TF-220 hat die Eigenschaften der Tabelle 2. Das IR-Absorptionsspektrum und das UV-Absorptionsspektrum sind in den Fig. 4 bzw. 5 gezeigt.

Beispiel 4

(1) In ein 10 l Fermentationsgefäß gibt man 8 l TF-d Kulturmedium der Zusammensetzung des Beispiels 2. Das Kulturmedium wird 30 min bei 120°C sterilisiert. Nach dem Abkühlen wird Stickstoffgas während 1 h mit 100 ml/min hindurchgeleitet. In dieses Kulturmedium gibt man 1 l der Vorkulturlösung von Fusobacterium nucleatum TF-031 ATCC-31647, welche zuvor im TF-d Kulturmedium der gleichen Zusammensetzung bereitet wurde. Die Zellen werden 5 Tage bei 37°C unter Rühren (30 U/min) kultiviert, wobei Stickstoffgas mit 65 ml/min hindurchgeleitet wird. Nach der Kultivierung wird die Kulturlösung mit 160 g Celite und 80 g Cellulosepulver versetzt und das erhaltene Gemisch wird gerührt und unter vermindertem Druck abfiltriert. Man erhält 7,8 l einer bakterienfreien, überstehenden Flüssigkeit.

(2) Zu 7,8 l der überstehenden Flüssigkeit gibt man 117 ml konz. Salzsäure, um den pH auf 2,0 einzustellen. Dann werden 11,7 l Äthanol zugegeben, wobei die überstehende Flüssigkeit zu einer 60%igen wäßrigen Äthanollösung wird. Diese läßt man nun 24 h bei 4°C stehen. Nachfolgend wird ein Lösungsanteil durch Abdekantieren entfernt und der restliche Anteil wird bei 4°C zentrifugiert, und zwar 5 min bei 6×10³ U/min. Hierdurch wird der Niederschlag gewonnen. Er wird mit 400 ml einer 60%igen wäßrigen Äthanollösung vom pH 2,0, 400 ml Äthanol, 200 ml Aceton und 200 ml Diäthyläther in dieser Reihenfolge gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 5,07 g eines Pulvers.

(3) Das erhaltene Pulver wird gemäß Beispiel 3(3) behandelt, wobei man 1,9 g der carcinostatischen Substanz TF-220 erhält. Die so erhaltene, carcinostatische Substanz TF-220 hat die Eigenschaften der Tabelle 2. Das IR-Absorptionsspektrum und das UV-Absorptionsspektrum sind im wesentlichen identisch mit denjenigen des Beispiels 3.

Beispiel 5

(1) In ein 10 l Fermentationsgefäß gibt man 8 l TF-e Kulturmedium der Zusammensetzung des Beispiels 1. Dieses wird 30 min bei 120°C sterilisiert. Nach dem Abkühlen des Kulturmediums läßt man Stickstoffgas während 1 h mit 100 ml/min hindurchperlen. Nun wird mit 1 l einer Vorkulturlösung von Fusobacterium nucleatum TF-031 ATCC-31647, welche zuvor im TF-e Kulturmedium der gleichen Zusammensetzung bereitet wurde, geimpft. Die Zellen werden 2 Tage bei 37°C unter Rühren (30 U/min) unter Einleiten von Stickstoffgas mit einem Durchsatz von 65 ml/min kultiviert. Sodann wird die Kulturlösung mit 160 g Celite und 80 g Cellulosepulver versetzt und das erhaltene Gemisch wird gerührt und unter vermindertem Druck abfiltriert, wobei man 7,8 l einer bakterienfreien, überstehenden Flüssigkeit erhält.

(2) Zu 7,8 g der überstehenden Flüssigkeit der Stufe (1) gibt man 117 ml konz. Salzsäure, um den pH auf 2,0 einzustellen. Sodann werden 11,7 l Äthanol zu der überstehenden Flüssigkeit unter Bildung einer 60%igen wäßrigen Äthanollösung zugegeben, die man anschließend 24 h bei 4°C stehenläßt, bis sich der Niederschlag vollständig abgeschieden hat. Nachfolgend wird die überstehende Flüssigkeit abdekantiert und der restliche Anteil wird während 5 min mit 6×10³ U/min bei 4°C zentrifugiert. Sodann wird der Niederschlag mit 400 ml einer 60%igen wäßrigen Äthanollösung vom ph 2,0, 400 ml Äthanol, 200 ml Aceton und 200 ml Diäthyläther in dieser Reihenfolge gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet; man erhält 2,73 g eines Pulvers.

(3) Das in Stufe (2) erhaltene Pulver wird in 25 ml Wasser suspendiert. Der pH der erhaltenen Suspension wird durch Zusatz von 1 N wäßriger Natriumhydroxidlösung auf 7,5 bis 8,0 eingestellt. Die Suspension wird 30 min bei Zimmertemperatur gerührt, worauf 1 N Salzsäure zugesetzt wird, um den pH auf 6,0 einzustellen. Nachfolgend wird die Suspension 2 h unter Eiskühlung gerührt und sodann während 10 min bei 1×10⁴ U/min zentrifugiert. Auf diese Weise wird der Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit abgetrennt. Der Niederschlag wird mit 5 ml Wasser vom pH 6,0 gewaschen. Sodann wird der Niederschlag von der Waschflüssigkeit abzentrifugiert (1×10⁴ U/min; 10 min). Die Waschflüssigkeit und die überstehende Flüssigkeit werden kombiniert, und die erhaltene Lösung wird mit 1 N Salzsäure auf pH 4,0 eingestellt und sodann 12 h bei einer Temperatur von nicht mehr als 5°C stehengelassen und sodann während 10 min mit 1×10⁴ U/min zentrifugiert, um den Niederschlag abzutrennen. Dieser wird nun mit 15 ml Wasser vom pH 4,0 gewaschen und dann wird der Niederschlag von der Waschflüssigkeit abgetrennt, und zwar während 10 min mit 1×10⁴ U/min. Nun wird der Niederschlag wiederum mit 10 ml Äthanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 0,58 g der carcinostatischen Substanz TF-230, die die in Tabelle 2 aufgeführten Eigenschaften hat. Das IR-Absorptionsspektrum und das UV-Absorptionsspektrum sind in den Fig. 6 bzw. 7 dargestellt.

Beispiel 6

(1) In ein 10 l Fermentationsgefäß gibt man 8 l TF-d Kulturmedium der Zusammensetzung des Beispiels 2. Dieses wird 30 min bei 120°C sterilisiert. Nach dem Kühlen des Kulturmediums wird Stickstoffgas während 1 h mit einem Durchsatz von 100 ml/min hindurchgeleitet. Nun wird das Kulturmedium mit 1 l einer Vorkulturlösung von Fusobacterium nucleatum TF-031 ATCC-31647 geimpft, die zuvor in dem gleichen Kulturmedium bereitet wurde. Die Zellen werden 2 Tage bei 37°C unter Rühren (30 U/min) kultiviert, wobei Stickstoffgas mit 65 ml/min eingeleitet wird. Nach der Kultivierung wird die Kulturlösung mit 160 g Celite und 80 g Cellulosepulver versetzt; das erhaltene Gemisch wird gerührt und unter vermindertem Druck filtriert. Man erhält 7,8 l einer bakterienfreien, überstehenden Flüssigkeit.

(2) Zu 7,8 l der überstehenden Flüssigkeit der Stufe (1) gibt man 117 ml konz. Salzsäure, um den pH auf 2,0 einzustellen. Dann werden 11,7 l Äthanol zu der überstehenden Flüssigkeit unter Bildung einer 60%igen wäßrigen Äthanollösung zugegeben, die dann 24 h bei 4°C stehengelassen wird. Die überstehende Flüssigkeit wird nun abdekantiert und die verbleibende Restmenge wird bei 4°C während 5 min bei 6×10³ U/min zentrifugiert, um den Niederschlag zu gewinnen. Dieser wird nun mit 400 ml einer 60%igen wäßrigen Äthanollösung vom pH 2,0, 400 ml Äthanol, 200 ml Aceton und 200 ml Diäthyläther in dieser Reihenfolge gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 3,15 g eines Pulvers.

(3) Das in Stufe (2) erhaltene Pulver wird gemäß Beispiel 5(3) behandelt. Man erhält 0,8 g der carcinostatischen Substanz TF-230 mit den in Tabelle 2 aufgeführten Eigenschaften. Das IR-Absorptionsspektrum und das UV-Absorptionsspektrum sind im wesentlichen mit denjenigen des Beispiels 5 identisch.

Beispiel 7

(1) In 25 ml Wasser werden 3,9 g des Pulvers suspendiert, welches in gleicher Weise erhalten wie in Beispiel 1(1) und (2). Durch Zusatz von 1 N wäßriger Natriumhydroxidlösung wird der pH der entstehenden Suspension auf 7,5 bis 8,0 eingestellt, und nach dem Rühren der Suspension bei Zimmertemperatur während 30 min wird der pH wiederum durch Zusatz von 1 N Salzsäure auf 6,0 eingestellt. Nach 2stündigem Rühren unter Eiskühlung wird die Suspension 10 min mit 1×10⁴ U/min abzentrifugiert; der abgetrennte Niederschlag wird mit 5 ml Wasser vom pH 6,0 gewaschen und nun wird der Niederschlag während 10 min mit 1×10⁴ U/ min von der Waschflüssigkeit abzentrifugiert. Die Waschflüssigkeit und die obige, überstehende Flüssigkeit werden kombiniert und der nachfolgenden Stufe (2) unterworfen. Der Niederschlag wird mit 10 ml Äthanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 1,06 g der carcinostatischen Substanz TF-220 mit den Eigenschaften der Tabelle 2. Das IR-Absorptionsspektrum und das UV-Absorptionsspektrum sind im wesentlichen mit denjenigen des Beispiels 3 identisch.

(2) Zu der kombinierten Lösung der überstehenden Flüssigkeit und der Waschflüssigkeit der Stufe (1) gibt man 1 N Salzsäure, um den pH auf 4,0 einzustellen. Dann wird das Gemisch 12 h bei nicht mehr als 5°C stehengelassen. Nachfolgend wird die Mischung 10 min mit 1×10⁴ U/min zentrifugiert, um den Niederschlag abzutrennen. Dieser wird mit 5 ml Wasser vom pH 4,0 gewaschen. Der Niederschlag und die Waschflüssigkeit werden 10 min mit 1×10⁴ U/min zentrifugiert. Die Waschflüssigkeit wird mit der obigen überstehenden Flüssigkeit kombiniert und die kombinierte Lösung wird der Behandlung der nachfolgenden Stufe (3) unterzogen. Der Niederschlag wird mit 5 ml Äthanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 0,48 g der carcinostatischen Substanz TF-230 mit den Eigenschaften der Tabelle 2. Das IR-Absorptionsspektrum und das UV-Absorptionsspektrum sind im wesentlichen mit denjenigen des Beispiels 5 identisch.

(3) Die kombinierte Lösung, bestehend aus der überstehenden Flüssigkeit und der Waschflüssigkeit der Stufe (2), wird mit 1 N Salzsäure zur Einstellung des pH auf 2,0 versetzt. Dann läßt man das Gemisch 2 h unter Eiskühlung stehen. Die Mischung wird 10 min mit 6×10³ U/min zentrifugiert, wobei der Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit getrennt wird. Das Präzipitat und die Waschflüssigkeit werden 10 min bei 6×10³ U/min zentrifugiert. Die Waschflüssigkeit wird nun mit der obigen überstehenden Flüssigkeit kombiniert und die kombinierte Lösung wird der im folgenden beschriebenen Stufe (4) unterzogen. Der Niederschlag wird mit 5 ml Äthanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 0,10 g der carcinostatischen Substanz TF-240 mit den Eigenschaften der Tabelle 2. Das IR-Absorptionsspektrum und das UV-Absorptionsspektrum sind in den Fig. 8 bzw. 9 gezeigt.

(4) Äthanol wird zu der kombinierten Lösung der überstehenden Flüssigkeit und der Waschflüssigkeit der Stufe (3) unter Bildung einer 80%igen wäßrigen Äthanollösung zugesetzt. Die wäßrige Äthanollösung wird 12 h bei nicht mehr als 5°C stehengelassen. Dann wird die abgeschiedene Substanz während 10 min mit 6×10³ U/min zentrifugiert und der Niederschlag wird mit 10 ml einer 80%igen wäßrigen Äthanollösung und 10 ml in dieser Reihenfolge gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 2,08 g der carcinostatischen Substanz TF-250 mit den in Tabelle 2 gezeigten Eigenschaften. Das IR-Absorptionsspektrum und das UV-Absorptionsspektrum sind im wesentlichen identisch mit denjenigen des Beispiels 9.

Beispiel 8

In 45 ml Wasser werden 4,5 g eines Pulvers suspendiert, das auf ähnliche Weise wie in Beispiel 2(1) und (2) hergestellt wurde. Durch Zusatz einer 1 N wäßrigen Natriumhydroxidlösung wird der pH der Suspension auf 7,5 bis 8,0 eingestellt, worauf 30 min bei Zimmertemperatur gerührt wird. Dann wird der pH wiederum mit 1 N Salzsäure auf 4,0 eingestellt. Die Suspension wird 10 min mit 1× 10⁴ U/min zentrifugiert und der Niederschlag wird von der überstehenden Flüssigkeit getrennt. Der Niederschlag wird mit 5 ml Wasser vom pH 4,0 gewaschen und der Niederschlag und die Waschflüssigkeit werden 10 min mit 1×10⁴ U/min zentrifugiert. Die Waschflüssigkeit und die überstehende Flüssigkeit werden kombiniert und der pH der erhaltenen Lösung wird durch Zusatz von 1 N Salzsäure auf 2,0 eingestellt. Danach wird die Lösung 2 h unter Kühlung mit Eis-Wasser stehengelassen und schließlich 10 min mit 6× 10³ U/min zentrifugiert. Hierdurch wird der Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit getrennt. Der Niederschlag wird mit 3 ml Wasser vom pH 2,0 gewaschen und sodann werden der Niederschlag und die Waschflüssigkeit 10 min mit 6×10³ U/min zentrifugiert. Der Niederschlag wird mit 5 ml Äthanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 0,12 g der carcinostatischen Substanz TF-240 mit den Eigenschaften der Tabelle 2. Das IR-Absorptionsspektrum und das UV-Absorptionsspektrum sind im wesentlichen identisch mit denjenigen des Beispiels 7.

Beispiel 9

(1) Zu der kombinierten Lösung aus überstehender Flüssigkeit und Waschflüssigkeit des Beispiels 1(3) gibt man 1 N Salzsäure zur Einstellung des pH auf 2,0 und läßt das Gemisch 2 h unter Eiskühlung stehen. Anschließend wird das Gemisch 10 min mit 6×10³ U/min zentrifugiert, um den Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit abzutrennen. Der Niederschlag wird mit 3 ml Wasser vom pH 2,0 gewaschen. Das Präzipitat und die Waschflüssigkeit werden 10 min mit 6×10³ U/min zentrifugiert. Die Waschflüssigkeit wird mit der obigen überstehenden Flüssigkeit vereinigt und die kombinierte Lösung wird der in der folgenden Stufe (2) beschriebenen Behandlung unterzogen. Das Präzipitat wird mit 5 ml Äthanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 0,11 g der carcinostatischen Substanz TF-240 mit den in Tabelle 2 aufgeführten Eigenschaften. Das IR-Absorptionsspektrum und das UV-Absorptionsspektrum sind im wesentlichen mit denjenigen des Beispiels 7 identisch.

(2) Äthanol wird zu der Lösung, bestehend aus der überstehenden Flüssigkeit und der Waschflüssigkeit der obigen Stufe (1) zugesetzt, um eine 80%ige wäßrige Äthanollösung zu bilden, die 12 h bei nicht mehr als 5°C stehengelassen wird. Die abgeschiedene Substanz wird 10 min mit 6×10³ U/min zentrifugiert und der Niederschlagt mit 10 ml einer 80%igen wäßrigen Äthanollösung und 10 ml Äthanol in dieser Reihenfolge gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 2,1 g der carcinostatischen Substanz TF-250 mit den in Tabelle 2 aufgeführten Eigenschaften. Das IR-Absorptionsspektrum und das UV-Absorptionsspektrum sind in den Fig. 10 bzw. 11 gezeigt.

Beispiel 10

In 45 ml Wasser werden 4,5 g eines Pulvers suspendiert, das auf gleiche Weise wie in dem Beispiel 2(1) und (2) erhalten wurde. Durch Zugabe von 1 N wäßriger Natriumhydroxidlösung wird der pH der Suspension auf 7,5 bis 8,0 eingestellt. Dann rührt man 30 min bei Zimmertemperatur und stellt den pH erneut durch Zusatz von 1 N Salzsäure auf 2,0 ein. Das Gemisch wird 10 min mit 6×10³ U/min zentrifugiert, um das Präzipitat von der überstehenden Lösung abzutrennen. Der Niederschlag wird mit 10 ml Wasser vom pH 2,0 gewaschen, und das Präzipitat und die Waschflüssigkeit werden 10 min mit 6×10³ U/min zentrifugiert. Die Waschflüssigkeit und die überstehende Flüssigkeit werden kombiniert und diese Lösung wird mit Äthanol unter Bildung einer 80%igen wäßrigen Äthanollösung versetzt. Die Lösung wird 12 h bei nicht mehr als 5°C stehengelassen und dann 10 min mit 6×10³ U/min zentrifugiert, wobei man einen Niederschlag erhält. Dieser wird mit 10 ml einer 80%igen wäßrigen Äthanollösung und 10 ml Äthanol in dieser Reihenfolge gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 2,68 g der carcinostatischen Substanz TF-250 mit den in Tabelle 2 aufgeführten Eigenschaften. Das IR- Absorptionsspektrum und das UV-Absorptionsspektrum sind im wesentlichen mit denjenigen des Beispiels 9 identisch.

Beispiel 11

(1) In 15 ml Wasser werden 1,5 g der carcinostatischen Substanz TF-210 des Beispiels 1 suspendiert. Zu der resultierenden Suspension gibt man unter Rühren eine 1 N wäßrige Natriumhydroxidlösung, um den pH auf 7,8 einzustellen. Die Suspension wird auf 37°C erhitzt und mit 15 mg Pronase E (1 000 000 Tyrosin-Einheiten/g) und einigen Tropfen Toluol versetzt. Unter Schütteln wird die Mischung 24 h einer Enzymbehandlung bei pH 7,8 bis 8,0 und einer Temperatur von 37 bis 40°C unterzogen. Nach der Behandlung wird die Mischung 10 min mit 4000 U/min zentrifugiert, um das Präzipitat von der überstehenden Flüssigkeit abzutrennen. Zu dem Niederschlag gibt man 3 ml Waser vom pH 8,0 und zentrifugiert die Mischung 10 min bei 4000 U/min zur Abtrennung des Präzipitats aus der Waschflüssigkeit. Die Waschflüssigkeit und die obige überstehende Flüssigkeit werden vereinigt und mit 1 N Salzsäure versetzt, um den pH auf 2,0 einzustellen, worauf sich ein Niederschlag bildet. Diese Mischung wird 12 h bei 5°C stehengelassen und dann 10 min mit 1×10⁴ U/min zur Abtrennung des Präzipitats aus der überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert. Das Präzipitat wird mit 3 ml Wasser vom pH 2,0 versetzt und die Mischung wird 10 min mit 1×10⁴ U/min zentrifugiert, um das Präzipitat von der Waschflüssigkeit abzutrennen. Die Waschflüssigkeit und die überstehende Flüssigkeit werden vereinigt, und die Lösung wird mit Äthanol zur Bildung einer 80%igen wäßrigen Äthanollösung versetzt. Die wäßrige Äthanollösung wird 2 h unter Eiskühlung gerührt und dann 10 min mit 4000 U/min zur Abtrennung des Niederschlags aus der überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert. Das Präzipitat wird mit 5 ml einer 80%igen wäßrigen Äthanollösung und 5 ml Äthanol in dieser Reihenfolge gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 327 mg der carcinostatischen Substanz TF-310-Fraktion.

In 5 ml Wasser werden 327 mg dieses Pulvers aufgelöst, und der pH der Lösung wird durch Zusatz von 1 N wäßriger Natriumhydroxidlösung auf 7,0 eingestellt. Die so bereitete Lösung wird in eine mit 45 ml Amberlite IRA-400 gepackte Säule gegeben, welche zuvor auf den OH-Typ eingestellt wurde, und zwar mit 1 N wäßriger Natriumhydroxidlösung. Nachfolgend gibt man 200 ml Wasser durch die Säule. Alle Eluate werden vereinigt und der pH derselben wird mit 1 N Salzsäure auf 7,0 eingestellt. Diese Lösung wird nun unter vermindertem Druck eingeengt und über Millipore-Filter mit einem Porendurchmesser von 0,3 µm filtriert und schließlich gefriergetrocknet. Man erhält 210 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-310. Die so gewonnene, carcinostatische Substanz TF-310 hat die Eigenschaften der Tabelle 2 und ihr Saccharidgehalt liegt im allgemeinen bei etwa 20 bis 60%, ausgedrückt als Glucose. Das IR-Absorptionsspektrum, das UV-Absorptionsspektrum und das Hochleistungs- Flüssigchromatogramm einer typischen Probe sind in den Fig. 12, 13 bzw. 14 dargestellt.

(2) In 50 ml Wasser werden 140 mg der carcinostatischen Substanz TF-310 aufgelöst, und die erhaltene Lösung wird auf die 100fache Konzentration, bezogen auf die anfängliche Konzentration, eingeengt. Hierzu wird ein Ultrafilter UK-50 (nomineller Molekulargewichtsabbruch: 50 000) verwendet. Dieses Konzentrat wird nun über ein Millipore- Filter mit einem Porendurchmesser von 0,2 µm filtriert und sodann gefriergetrocknet. Man erhält 88 mg der gereinigten, gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-310. Diese gereinigte, carcinostatische Substanz TF- 310 hat die Eigenschaften der Tabelle 2 und ihr Saccharidgehalt liegt im allgemeinen bei etwa 16 bis 30%, ausgedrückt als Glucose.

Beispiel 12

(1) In 10 ml suspendiert man 1 g der carcinostatischen Substanz TF-220 des Beispiels 7(1). Zu der erhaltenen Suspension gibt man 1 N wäßrige Natriumhydroxidlösung unter Rühren, um den pH auf 7,8 einzustellen. Die Mischung wird auf 37°C erwärmt und mit 15 mg Pronase E und mit mehreren Tropfen Toluol versetzt. Unter Schütteln wird die Mischung der Enzymbehandlung bei 37 bis 40°C während 24 h und bei pH 7,8 bis 8,0 unterzogen. Nach der Behandlung wird die Mischung während 10 min bei 4000 U/min zentrifugiert, um den Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit abzutrennen. Der Niederschlag wird mit 3 ml Wasser vom pH 8,0 versetzt und die Mischung wird sodann 10 min bei 4000 U/min zentrifugiert, um den Niederschlag von der Waschflüssigkeit zu trennen. Die Waschflüssigkeit und die vorerwähnte, überstehende Flüssigkeit werden kombiniert und die erhaltene Lösung wird mit 1 N Salzsäure zur Einstellung des pH auf 2,0 versetzt, wobei sich ein Niederschlag bildet. Die Mischung wird 12 h bei 5°C stehengelassen und sodann 10 min bei 1×10⁴ U/min zentrifugiert, um den Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit abzutrennen. Zum Niederschlag gibt man nun 3 ml Wasser vom pH 2,0 und zentrifugiert die Mischung 10 min mit 1×10⁴ U/min, um den Niederschlag von der Waschflüssigkeit zu trennen. Die Waschflüssigkeit und die vorerwähnte, überstehende Flüssigkeit werden kombiniert, und die Lösung wird zur Bildung einer 80%igen wäßrigen Äthanollösung mit Äthanol versetzt. Die wäßrige Äthanollösung wird 2 h unter Eiskühlung gerührt und sodann zentrifugiert (4000 U/min; 10 min), um den Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit zu trennen. Der Niederschlag wird mit 5 ml einer 80%igen wäßrigen Äthanollösung und 5 ml Äthanol in dieser Reihenfolge gewaschen und dann unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 163 mg der carcinostatischen Substanz TF-320-Fraktion.

In 5 ml Wasser werden 150 mg dieses Pulvers aufgelöst, und die erhaltene Lösung wird durch Zusatz von 1N wäßriger Natriumhydroxidlösung auf 7,0 eingestellt. Die so bereitete Lösung wird in eine Säule gegossen, welche mit 25 ml Amberlite IRA-400 gepackt ist. Dieses wurde zuvor mit 1N wäßriger Natriumhydroxidlösung auf den OH-Typ eingestellt. Nachfolgend läßt man 100 ml Wasser durch die Säule laufen. Alle Eluate werden vereinigt und 1N Salzsäure wird zur Einstellung des pH auf 7,0 zugesetzt. Die Lösung wird unter vermindertem Druck eingeengt, sodann über ein Millipore- Filter mit einem Porendurchmesser von 0,3 µm filtriert und schließlich gefriergetrocknet. Man erhält 110 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-320. Die so erhaltene, carcinostatische Substanz TF- 320 hat die Eigenschaften der Tabelle 2 und ihr Saccharidgehalt liegt im allgemeinen bei etwa 20 bis 60%, ausgedrückt als Glucose. Das IR-Absorptionsspektrum, das UV- Absorptionsspektrum und das Hochleistungs-Flüssigchromatogramm einer typischen Probe sind in den Fig. 15, 16 bzw. 17 dargestellt.

(2) In 50 ml Wasser werden 100 mg der carcinostatischen Substanz TF-320 aufgelöst, und die erhaltene Lösung wird auf das 100fache der anfänglichen Konzentration eingeengt. Hierzu verwendet man das Ultrafilter UK-50. Das Konzentrat wird über ein Millipore-Filter mit einem Porendurchmesser von 0,2 µm filtriert und sodann gefriergetrocknet. Man erhält 72 mg der gereinigten, gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz Tf-320. Die gereinigte, carcinostatische Substanz TF-320 hat die Eigenschaften der Tabelle 2 und ihr Saccharidgehalt liegt im allgemeinen bei etwa 16 bis 30%, ausgedrückt als Glucose.

Beispiel 13

(1) In 5 ml Wasser werden 0,48 g der carcinostatischen Substanz TF-230 des Beispiels 7(2) suspendiert. Zu der Suspension gibt man 1N wäßrige Natriumhydroxidlösung unter Rühren zur Einstellung des pH auf 7,8. Die Mischung wird auf 37°C erwärmt und mit 5,0 mg Pronase E sowie mit mehreren Tropfen Toluol versetzt. Unter Schütteln wird die Mischung 24 h bei pH 7,8 bis 8,0 und bei 37 bis 40°C der Enzymbehandlung unterzogen. Nach dieser Behandlung wird das Gemisch zentrifugiert (4000 U/min; 10 min), um den Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit zu trennen. Zu dem Niederschlag gibt man 3 ml Wasser vom pH 8,0. Die Mischung wird zentrifugiert (4000 U/min; 10 min), um den Niederschlag von der Waschflüssigkeit zu trennen. Die Waschflüssigkeit und die vorerwähnte, überstehende Flüssigkeit werden vereinigt und die erhaltene Lösung wird mit 1N Salzsäure zur Einstellung des pH auf 2,0 versetzt, worauf sich ein Präzipitat bildet. Diese Mischung wird 12 h bei 5°C stehengelassen und dann zentrifugiert (1× 10⁴ U/min; 10 min), um den Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit zu trennen. Der Niederschlag wird mit 3 ml Wasser vom pH 2,0 versetzt und die Mischung zur Abtrennung des Präzipitats aus der Waschflüssigkeit zentrifugiert (1×10⁴ U/min). Die Waschflüssigkeit und die vorerwähnte, überstehende Flüssigkeit werden vereinigt und Äthanol wird zugesetzt, um eine 80%ige wäßrige Äthanollösung zu erhalten. Die wäßrige Äthanollösung wird 2 h unter Eiskühlung gerührt und dann zentrifugiert (4000 U/ min; 10 min), um den Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit abzutrennen. Der Niederschlag wird mit 5 ml einer 80%igen wäßrigen Äthanollösung und 5 ml Äthanol in dieser Reihenfolge gewaschen und dann unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 100 mg der carcinostatischen Substanz TF-330-Fraktion.

In 5 ml Wasser werden 100 mg des vorerwähnten Pulvers aufgelöst und der pH der erhaltenen Lösung wird durch Zusatz von 1N wäßriger Natriumhydroxidlösung auf 7,0 eingestellt. Die erhaltene Lösung wird auf eine Säule gegeben, welche mit 15 ml Amberlite IRA-400 gepackt ist. Dieses wurde zuvor mit 1N wäßriger Natriumhydroxidlösung auf den OH-Typ eingestellt. Nachfolgend läßt man 60 ml Wasser durch die Säule laufen. Alle Eluate werden vereinigt und durch Zusatz von 1N Salzsäure auf pH 7,0 eingestellt. Diese Lösung wird unter vermindertem Druck eingeengt und über ein Millipore-Filter mit einem Porendurchmesser von 0,3 µm filtriert und schließlich gefriergetrocknet. Man erhält 70 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-330 mit den Eigenschaften der Tabelle 2. Das IR-Absorptionsspektrum, das UV-Absorptionsspektrum und das Hochleistungs-Flüssigchromatogramm typischer Proben sind in den Fig. 18, 19 bzw. 20 dargestellt.

(2) In 50 ml Wasser werden 70 mg der carcinostatischen Substanz TF-330 aufgelöst, und die erhaltene Lösung wird auf die 100fache Konzentration, bezogen auf die Anfangskonzentration, eingeengt, und zwar durch Verwendung des Ultrafilters UK-50. Das Konzentrat wird über Millipore- Filter mit einem Porendurchmesser von 0,2 µm filtriert und sodann gefriergetrocknet. Man erhält 49 mg gereinigte, gefriergetrocknete, carcinostatische Substanz TF-330. Die gereinigte, carcinostatische Substanz TF-330 hat die Eigenschaften der Tabelle 2 und ihr Saccharidgehalt liegt im allgemeinen bei etwa 16 bis 30%, ausgedrückt als Glucose. Das IR-Absorptionsspektrum und das UV-Absorptionsspektrum einer typischen TF-330-Probe sind in den Fig. 21 bzw. 22 dargestellt.

Beispiel 14

(1) Gemäß Beispiel 2(3), 7(1) oder 7(2) wird die Behandlung von 4,5 g der jeweiligen Substanz des Beispiels 2(1) und (2) durchgeführt, wobei man die carcinostatische Substanz TF-210, TF-220 bzw. TF-230 erhält.

(2) Die carcinostatischen Substanzen TF-210, TF-220 oder TF-230 werden nun weiterbehandelt, und zwar gemäß den Beispielen 11(1), 12(1) oder 13(1), wobei man gefriergetrocknete, carcinostatische Substanz TF-310, TF-320 oder TF-330 in Mengen von 220, 120 bzw. 75 mg erhält. Die so erhaltenen, carcinostatischen Substanzen TF-310, TF-320 und TF-330 haben die Eigenschaften der Tabelle 2. Die IR-Absorptionsspektren, die UV-Absorptionsspektren und die Hochleistungs-Flüssigchromatogramme sind im wesentlichen mit denjenigen der Beispiele 11, 12 bzw. 13 identisch.

Beispiel 15

Nach dem Verfahren des Beispiels 11 werden 1,5 g der carcinostatischen Substanz TF-210 des Beispiels 1 behandelt, wobei man jedoch (a) 15 mg Trypsin anstelle der Pronase E bei der Enzymbehandlung einsetzt und (b) eine 60%ige wäßrige Äthanollösung anstelle der 80%igen wäßrigen Äthanollösung bereitet, wenn man den Niederschlag von dem wasserlöslichen Anteil mit einem pH von 2 nach der Enzymbehandlung abtrennt. Man erhält 200 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-310.

In ähnlicher Weise werden die folgenden gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanzen TF-320 und TF-330 erhalten.

Die obigen carcinostatischen Substanzen TF-310, TF-320 und TF-330 haben die Eigenschaften der Tabelle 2. Die IR-Absorptionsspektren, die UV-Absorptionsspektren und die Hochleistungs- Flüssigchromatogramme sind im wesentlichen mit denjenigen der Beispiele 11, 12 bzw. 13(1) identisch.

Beispiel 16

Die carcinostatischen Substanzen TF-210, TF-220 und TF-230 der Beispiele 1, 7(1) bzw. 7(2) werden nach den Verfahren der Beispiele 11(1), 12(1) bzw. 13(1) behandelt, mit der Ausnahme, daß nach der Enzymbehandlung eine 60%ige wäßrige Äthanollösung anstelle der 80%igen wäßrigen Äthanollösung bereitet wird, wenn der Niederschlag aus dem wasserlöslichen Anteil vom pH 2,0 abgetrennt wird. Man erhält die gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanzen TF-310, TF-320 und TF-330 in Mengen von 190, 98 bzw. 66 mg. Die erhaltenen, carcinostatischen Substanzen TF-310, TF-320 und TF-330 haben die Eigenschaften gemäß Tabelle 2. Die IR-Absorptionsspektren, die UV-Absorptionsspektren und die Hochleistungs-Flüssigchromatogramme sind im wesentlichen mit denjenigen der Beispiele 11, 12 bzw. 13(1) identisch.

Beispiel 17

Die carcinostatischen Substanzen TF-210, TF-220 und TF-230 der Beispiele 1, 7(1) bzw. 7(2) werden nach den Verfahren der Beispiele 11(1), 12(1) bzw. 13(1) behandelt, wobei jedoch nach der Enzymbehandlung beim Abtrennen des Niederschlags vom waserlöslichen Anteil vom pH 2,0 eine 60%ige wäßrige Äthanollösung anstelle der 80%igen wäßrigen Äthanollösung bereitet wird. Im übrigen wird die gleiche Nachbehandlung wie bei den entsprechenden Beispielen durchgeführt, wobei man 192 mg, 102 mg bzw. 65 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanzen TF-310, TF-320 und TF-330 erhält. Die erhaltenen, carcinostatischen Substanzen TF-310, TF-320 und TF-330 haben die Eigenschaften der Tabelle 2. Die IR-Absorptionsspektren, die UV-Absorptionsspektren und die Hochleistungs-Flüssigchromatogramme sind im wesentlichen mit denjenigen der Beispiele 11, 12 bzw. 13(1) identisch.

Beispiel 18

(1) In ein 90 l Fermentationsgefäß gibt man TF-f Kulturmedium. Dieses wurde dadurch bereitet, daß man 70 l destilliertes Wasser mit 1190 g Trypticasepepton, 1050 g Herzinfusion, 210 g Hefeextrakt, 525 g Natriumchlorid, 840 g Glucose, 700 g Lactose, 7 g Natriumsulfit, 35 g Natriumthioglykolat und 175 g Kalium-sek.-phosphat versetzt. Das Kulturmedium wird 15 min bei 118°C sterilisiert. Nach dem Abkühlen leitet man während 1 h Stickstoffgas mit einem Durchsatz von 250 ml/min hindurch.

Dieses Kulturmedium wird nun mit etwa 900 ml einer Vorkulturlösung von Fusobacterium nucleatum TF-031 ATCC-31647 geimpft. Diese wurde zuvor bereitet durch Kultivierung in einem TF-f Kulturmedium der gleichen Zusammensetzung. Die Zellen werden 4 Tage bei etwa 33°C unter Rühren (90 U/min) kultiviert, wobei man Stickstoffgas mit einem Durchsatz von 250 ml/min einleitet. Nach dem Kultivieren wird die Kulturlösung mit 10 g/l Celite und 5 g/l Cellulosepulver versetzt und die Mischung wird gerührt und unter vermindertem Druck filtriert, wobei man etwa 65 l einer bakterienfreien, überstehenden Flüssigkeit erhält.

(2) Zu 7,5 l der überstehenden Flüssigkeit gibt man 113 ml konz. Salzsäure zur Einstellung des pH auf 2,0. Sodann gibt man 11,4 l Äthanol zur überstehenden Flüssigkeit, um eine 60%ige wäßrige Äthanollösung zu erhalten. Diese läßt man nun 24 h bei 4°C stehen. Nachfolgend wird der Lösungsanteil abdekantiert und der verbleibende Anteil wird bei 4°C während 10 min mit 4×10³ U/min zur Gewinnung des Niederschlags zentrifugiert. Dieser wird mit zwei 100 ml-Portionen einer 60%igen wäßrigen Äthanollösung vom pH 2,0, einer 150 ml-Portion Äthanol, einer 150 ml-Portion Methanol und schließlich einer 150 ml-Portion Aceton in dieser Reihenfolge gewaschen und dann wird das Pulver an der Luft getrocknet. Man erhält 3,0 g des Pulvers.

(3) Das Pulver der Stufe (2) wird in 30 ml Wasser suspendiert. Der pH der erhaltenen Suspension wird mit 4N wäßriger Natriumhydroxidlösung auf 7,5 bis 8,0 eingestellt. Dann rührt man 15 min bei Zimmertemperatur und stellt erneut den pH durch Zusatz von 4N Salzsäure auf 4,0 ein. Nachfolgend läßt man die Suspension 2 h unter Eiskühlung stehen. Das Gemisch wird 10 min mit 1×10⁴ U/min zur Abtrennung des Niederschlags aus der überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert. Zum abgetrennten Niederschlag gibt man 6 ml Wasser als Waschflüssigkeit. Hierdurch wird eine Suspension gebildet, welche man mit einer 4N wäßrigen Natriumhydroxidlösung zur Einstellung des pH auf 7,5 bis 8,0 versetzt. Die Suspension wird 15 min bei Zimmertemperatur gerührt, worauf man 4N Salzsäure zusetzt, um den pH auf 4,0 einzustellen. Nun läßt man die Suspension 2 h unter Eiskühlung stehen. Sodann wird die Suspension 10 min mit 1×10⁴ U/min zentrifugiert, wobei der Niederschlag gewonnen wird. Dieser wird mit 4 ml Wasser vom pH 4,0 gewaschen und dann wiederum zentrifugiert (1×10⁴ U/min; 10 min). Man erhält 6,2 g (Naßgewicht) eines Niederschlags (TF-210) gewinnt. Die so erhaltene, carcinostatische Substanz TF-210 hat die Eigenschaften der Tabelle 2. Das IR- und das UV-Absorptionsspektrum sind im wesentlichen mit denjenigen des Beispiels 1 identisch.

(4) 6,2 g (Naßgewicht) des Niederschlags der Stufe (3) werden in 6 ml Wasser suspendiert. Zur Suspension gibt man unter Rühren eine gesättigte, wäßrige Ammoniumcarbonatlösung, um den pH der Suspension auf 7,8 einzustellen. Die Suspension wird auf 37°C erwärmt und mit 21 mg Pronase E und mehreren Tropfen Toluol versetzt. Das erhaltene Gemisch wird unter Schütteln einer Enzymbehandlung unterworfen, und zwar während 24 h bei 37 bis 40°C und bei einem pH von 7,8 bis 8,0. Der pH der erhaltenen Mischung wird unter Zusatz von 4N Salzsäure auf 1,0 einstellt, worauf der Niederschlag gebildet wird. Die Suspension wird nun 2 h unter Eiskühlung stehengelassen und sodann zentrifugiert (1×10⁴ U/min; 10 min), um die überstehende Flüssigkeit zu gewinnen. Diese überstehende Flüssigkeit wird mit 29 ml Äthanol unter Bildung einer 60%igen wäßrigen Äthanollösung versetzt, worauf sich ein Niederschlag bildet. Man läßt die Aufschlämmung 2 h unter Eiskühlung stehen. Sie wird sodann zentrifugiert (6×10³ U/min; 10 min), um den Niederschlag abzutrennen. Dieser wird mit 5 ml einer 60%igen wäßrigen Äthanollösung, 10 ml Äthanol und 10 ml Aceton in dieser Reihenfolge gewaschen und sodann an der Luft getrocknet. Man erhält 315 mg rohe Kristalle der carcinostatischen Substanz TF-310.

Die rohen Kristalle (315 mg) werden in 30 ml Wasser aufgelöst und eine 4N wäßrige Natriumhydroxidlösung wird zur Einstellung des pH auf 8,0 zugesetzt. Die erhaltene Lösung wird auf eine Säule gegossen, welche mit 30 ml Dowex 1×4 gepackt ist, das auf den Cl-Typ eingestellt wurde. Nachfolgend läßt man 100 ml Wasser durch die Säule laufen. Alle Eluate werden vereinigt und der pH wird auf 6,5 bis 7,0 eingestellt. Sodann wird die Lösung über Ultrafilter UK-50 filtriert, worauf das Filtrat auf die 100fache Konzentration der ursprünglichen Konzentration eingeengt wird. Das Konzentrat wird über Millipore-Filter mit einem Porendurchmesser von 0,3 µm filtriert und dann gefriergetrocknet. Man erhält 230 mg der gefriergetrockneten, gereinigten, carcinostatischen Substanz TF-310. Die erhaltene, carcinostatische Substanz TF-310 hat die Eigenschaften gemäß Tabelle 2; ihr Saccharidgehalt liegt im allgemeinen bei etwa 16 bis 30%, ausgedrückt als Glucose. Das IR-Absorptionsspektrum, das UV-Absorptionsspektrum und das Hochleistungs-Flüssigchromatogramm typischer Proben sind in den Fig. 23, 24 bzw. 25 dargestellt.

Beispiel 19

In 10 ml Wasser werden 0,9 g der carcinostatischen Substanz TF-240 des Beispiels 7(3) suspendiert und der pH wird unter Rühren durch Zusatz von 1 N wäßriger Natriumhydroxidlösung zur erhaltenen Suspension auf 7,8 eingestellt. Nach der Erwärmung auf 37°C gibt man zur Suspension 9 mg Pronase E sowie mehrere Tropfen Toluol in dieser Reihenfolge. Das erhaltene Gemisch wird unter Schütteln einer Enzymbehandlung während 24 h bei 37 bis 40°C und bei einem pH von 7,8 bis 8,0 unterzogen. Die behandelte Mischung wird sodann zentrifugiert (4000 U/min; 10 min), um den Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit abzutrennen. Zu dem Niederschlag gibt man 3 ml Wasser vom pH 8,0 und zentrifugiert die erhaltene Suspension (4000 U/min; 10 min) zur Abtrennung des Niederschlags von der Waschflüssigkeit. Die Waschflüssigkeit und die vorerwähnte, überstehende Flüssigkeit werden vereinigt und durch Zusatz von 1N Salzsäure wird der pH auf 2,0 eingestellt. Dabei wird ein Niederschlag gebildet. Die erhaltene Aufschlämmung wird 12 h bei 5°C stehengelassen und sodann zentrifugiert (1×10⁴ U/min; 10 min), um den Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit zu trennen. Der Niederschlag wird mit 5 ml Wasser vom pH 2,0 versetzt und die erhaltene Suspension wird zentrifugiert (1×10⁴ U/min; 10 min), um den Niederschlag von der Waschflüssigkeit zu trennen. Die Waschflüssigkeit und die vorerwähnte, überstehende Flüssigkeit werden vereinigt und zu der vereinigten Lösung wird Äthanol zur Bildung einer 80%igen wäßrigen Äthanollösung gegeben. Die wäßrige Äthanollösung wird 2 h unter Eiskühlung gerührt und sodann zentrifugiert (1×10⁴ U/min; 10 min), um den Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit zu trennen. Der Niederschlag wird mit 5 ml einer 80%igen wäßrigen Äthanollösung und 5 ml Äthanol in dieser Reihenfolge gewaschen und bei vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 170 mg der carcinostatischen Substanz TF-340-Fraktion.

In 5 ml Wasser 150 mg dieses Pulvers aufgelöst und der pH der erhaltenen Lösung wird durch Zusatz einer 1N wäßrigen Natriumhydroxidlösung auf 7,0 eingestellt. Die Lösung wird sodann auf eine Säule gegeben, die mit 25 ml Amberlite IRA-400 gepackt ist. Dieses wurde zuvor mit einer 1N wäßrigen Natriumhydroxidlösung auf den OH-Typ eingestellt. Sodann läßt man 100 ml Wasser durch die Säule laufen. Alle Eluate werden vereinigt und der pH wird durch Zusatz von 1N Salzsäure auf 7,0 eingestellt. Die erhaltene Lösung wird unter vermindertem Druck eingeengt und über Millipore-Filter mit einem Porendurchmesser von 0,3 µm filtriert und sodann gefriergetrocknet. Man erhält 110 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-340. Die erhaltene, carcinostatische Substanz TF-340 hat die Eigenschaften der Tabelle 2. Das IR-Absorptionsspektrum, das UV-Absorptionsspektrum und das Hochleistungs-Flüssigchromatogramm sind in den Fig. 26, 27 bzw. 28 gezeigt.

Beispiel 20

Gemäß dem Verfahren des Beispiels 19 werden 0,9 g der carcinostatischen Substanz TF-240 des Beispiels 8 behandelt. Man erhält 115 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-340. Die erhaltene, carcinostatische Substanz TF-340 hat die Eigenschaften gemäß Tabelle 2. Das IR-Absorptionsspektrum, das UV-Absorptionsspektrum und das Hochleistungs-Flüssigchromatogramm sind im wesentlichen mit denjenigen des Beispiels 19 identisch.

Beispiel 21

Gemäß dem Verfahren des Beispiels 19 werden 0,9 g der carcinostatischen Substanz TF-240 des Beispiels 7(3) behandelt, wobei man aber (a) die Enzymbehandlung unter Verwendung von 9 mg Trypsin anstelle der Pronase E durchführt und (b) nach der Enzymbehandlung den Niederschlag vom wasserlöslichen Anteil vom pH 2,0 abtrennt und eine 60%ige wäßrige Äthanollösung anstelle einer 80%igen wäßrigen Äthanollösung bereitet. Man erhält 105 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF- 340. Dieses Produkt hat die Eigenschaften der Tabelle 2. Das IR- und das UV-Absorptionsspektrum sind im wesentlichen mit denjenigen des Beispiels 19 identisch.

13518 00070 552 001000280000000200012000285911340700040 0002003205074 00004 13399Beispiel 22

Die carcinostatische Substanz TF-240 des Beispiels 7(3) wird gemäß Beispiel 19 behandelt, wobei jedoch nach der Enzymbehandlung beim Sammeln des Niederschlags aus dem wasserlöslichen Anteil vom pH 2,0 eine 60%ige wäßrige Äthanollösung anstelle der 80%igen Äthanollösung bildet. Man erhält 101 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-340. Die erhaltene, carcinostatische Substanz TF-340 hat die Eigenschaften der Tabelle 2. Das IR- und das UV-Absorptionsspektrum sowie das Hochleistungs- Flüssigchromatogramm sind im wesentlichen mit denjenigen des Beispiels 19 identisch.

Beispiel 23

Die carcinostatische Substanz TF-240 des Beispiels 7(3) wird der Enzymbehandlung des Beispiels 19 unterzogen, worauf man anstelle der Abtrennung des Niederschlags vom wasserlöslichen Anteil mit pH 2,0 den Niederschlag durch Zusatz von 40%iger Trichloressigsäurelösung bis zu einer Trichloressigsäure-Konzentration von 10% abtrennt und den gebildeten, wasserlöslichen Anteil in eine 80%ige wäßrige Äthanollösung umwandelt, worauf sich die Behandlungsstufen des Beispiels 19 anschließen. Man erhält 99 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF- 340. Diese hat die Eigenschaften gemäß Tabelle 2. Das IR- und das UV-Absorptionsspektrum sowie das Hochleistungs- Flüssigchromatogramm sind im wesentlichen mit denjenigen des Beispiels 19 identisch.

Beispiel 24

In 10 ml Wasser werden 0,82 g der carcinostatischen Substanz TF-250 des Beispiels 7(4) suspendiert und eine 1N wäßrige Natriumhydroxidlösung wird unter Rühren zur Einstellung des pH auf 7,8 zugesetzt. Nach dem Erwärmen auf 37°C gibt man 8 mg Pronase E und mehrere Tropfen Toluol in dieser Reihenfolge zur Suspension. Die erhaltene Mischung wird sodann unter Schütteln der Enzymbehandlung, und zwar bei pH 7,8 bis 8,0 bei 37 bis 40°C während 24 h.

Die behandelte Mischung wird zur Abtrennung des Niederschlags von der überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert (4000 U/min; 10 min). Der Niederschlag wird mit 3 ml Wasser vom pH 8,0 versetzt und die erhaltene Suspension wird zur Abtrennung des Niederschlags von der Waschflüssigkeit zentrifugiert (4000 U/min; 10 min). Die Waschflüssigkeit und die vorerwähnte, überstehende Flüssigkeit werden vereinigt und zur Einstellung des pH auf 2,0 mit 1N Salzsäure versetzt, worauf sich ein Niederschlag bildet. Die erhaltene Aufschlämmung wird 12 h bei 5°C stehengelassen und zentrifugiert (1×10⁴ U/min; 10 min), um den Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit zu trennen. Zu dem Niederschlag gibt man 5 ml Wasser vom pH 2,0 und zentrifugiert die erhaltene Suspension (1×10⁴ U/min; 10 min), um den Niederschlag von der Waschflüssigkeit zu trennen. Die Waschflüssigkeit und die vorerwähnte, überstehende Flüssigkeit werden vereinigt und zu dieser Lösung gibt man Äthanol zur Bildung einer 80%igen wäßrigen Äthanollösung. Diese wird 2 h unter Eiskühlung gerührt und sodann 10 min mit 1×10⁴ U/min zur Abtrennung des Niederschlags von der überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert. Der Niederschlag wird mit 5 ml einer 80%igen wäßrigen Äthanollösung und 5 ml Äthanol in dieser Reihenfolge gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 430 mg der carcinostatischen Substanz TF-350-Fraktion.

In 5 ml Wasser werden 300 mg des Pulvers aufgelöst. Zu der erhaltenen Lösung gibt man 1N wäßrige Natriumhydroxidlösung, um den pH auf 7,0 einzustellen. Die Lösung wird auf eine Säule gegossen, welche mit 45 ml Amberlite IRA- 400 gepackt ist. Dieses wurde zuvor mit 1N wäßrigen Natriumhydroxidlösung auf den OH-Typ eingestellt. Sodann gibt man 200 ml Wasser durch die Säule. Alle Eluate werden nun vereinigt und der pH wird durch Zusatz von 1N Salzsäure auf 7,0 eingestellt. Die erhaltene Lösung wird unter vermindertem Druck eingeengt und über Millipore-Filter mit einem Porendurchmesser von 0,3 µm filtriert und sodann gefriergetrocknet. Man erhält 260 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-350. Diese hat die Eigenschaften gemäß Tabelle 2. Das IR- und das UV- Absorptionsspektrum sowie das Hochleistungs-Flüssigchromatogramm sind in den Fig. 29, 30 bzw. 31 dargestellt.

Beispiel 25

Gemäß Beispiel 24 werden 0,85 g der carcinostatischen Substanz TF-250 des Beispiels 9 der Enzymbehandlung unter Verwendung von 8 mg Pronase E unterworfen. Man erhält 265 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-350 mit den Eigenschaften der Tabelle 2. Das IR- und das UV-Absorptionsspektrum sowie das Hochleistungs- Flüssigchromatogramm sind im wesentlichen mit denjenigen des Beispiels 24 identisch.

Beispiel 26

Gemäß Beispiel 24 werden 0,80 g der carcinostatischen Substanz TF-250 des Beispiels 10 der Enzymbehandlung unter Verwendung von 8 mg Pronase E unterzogen. Man erhält 253 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-350. Diese hat die Eigenschaften der Tabelle 2. Das IR- und das UV-Absorptionsspektrum sowie das Hochleistungs- Flüssigchromatogramm sind im wesentlichen mit denjenigen des Beispiels 24 identisch.

Beispiel 27

Gemäß Beispiel 24 werden 0,85 g der carcinostatischen Substanz TF-250 des Beispiels 7(4) behandelt, mit der Ausnahme, daß (a) die Enzymbehandlung unter Verwendung von 8 mg Trypsin anstelle von Pronase E durchgeführt wird und (b) nach der Enzymbehandlung bei der Gewinnung des Niederschlags von dem wasserlöslichen Anteil vom pH 2,0 eine 60%ige wäßrige Äthanollösung anstelle der 80%igen wäßrigen Äthanollösung bereitet wird. Man erhält 247 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-350. Die erhaltene, carcinostatische Substanz TF-350 hat die in Tabelle 2 aufgeführten Eigenschaften. Das IR- und das UV-Absorptionsspektrum sowie das Hochleistungs- Flüssigchromatogramm sind im wesentlichen mit denjenigen des Beispiels 24 identisch.

Beispiel 28

0,85 g der carcinostatischen Substanz TF-250 des Beispiels 7(4) werden gemäß Beispiel 24 behandelt, mit der Ausnahme, daß nach der Enzymbehandlung bei der Gewinnung des Niederschlags aus dem wasserlöslichen Anteil mit pH 2,0 eine 60%ige wäßrige Äthanollösung anstelle der 80%igen wäßrigen Äthanollösung hergestellt wird. Man erhält 242 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF- 350 mit den Eigenschaften der Tabelle 2. Das IR- und das UV-Absorptionsspektrum sowie das Hochleistungs-Flüssigchromatogramm sind im wesentlichen mit denjenigen des Beispiels 24 identisch.

Beispiel 29

0,8 g der carcinostatischen Substanz TF-250 des Beispiels 7(4) werden der Enzymbehandlung gemäß Beispiel 24 unterzogen, worauf man bei der Abtrennung des Niederschlags von dem wasserlöslichen Anteil vom pH 2,0 diese Abtrennung derart vornimmt, daß man eine 40%ige Trichloressigsäure bis zu einer Trichloressigsäure-Konzentration von 10% zusetzt und aus dem dabei erhaltenen, wasserlöslichen Anteil eine 80%ige wäßrige Äthanollösung bereitet und nachfolgend die Behandlungsstufen des Beispiels 24 durchführt. Man erhält 238 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-350 mit den Eigenschaften gemäß Tabelle 2. Das IR- und das UV-Absorptionsspektrum sowie das Hochleistungs-Flüssigchromatogramm sind im wesentlichen mit denjenigen des Beispiels 24 identisch.

Präparat 1

Eine verdünnte, wäßrige Natriumhydroxidlösung wird mit 3 bis 4 mg der carcinostatischen Substanz TF-210 (Pulver) versetzt, wobei eine Lösung mit einem pH von 7,0 bis 7,5 gebildet wird. Der wasserlösliche Anteil der erhaltenen Lösung wird in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet. Das erhaltene Produkt wird vor Gebrauch in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0,5%igen Lidocainlösung, einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung oder dergl. aufgelöst und die dabei erhaltene Lösung wird für Injektionszwecke verwendet.

Präparat 2

Eine verdünnte, wäßrige Natriumhydroxidlösung wird zu 2 bis 3 mg der carcinostatischen Substanz TF-220 (Pulver) unter Bildung einer Lösung vom pH 7,0 bis 7,5 gegeben. Der wasserlösliche Anteil der erhaltenen Lösung wird in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet. Vor Gebrauch wird das Pulver mit einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0,5%igen Lidocainlösung, einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung oder dergl. aufgelöst und die erhaltene Lösung wird als Injektionsflüssigkeit verwendet.

Präparat 3

Eine verdünnte, wäßrige Natriumhydroxidlösung wird zu 1 mg der carcinostatischen Substanz TF-230 (Pulver) unter Bildung einer Lösung mit einem pH von 7,0 bis 7,5 gegeben. Diese Lösung wird in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet. Vor Gebrauch wird das Produkt in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0,5%igen Lidocainlösung, einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung oder dergl. aufgelöst. Die erhaltene Lösung wird als Injektionsflüssigkeit verwendet.

Präparat 4

Eine verdünnte, wäßrige Natriumhydroxidlösung wird mit 1 mg der carcinostatischen Substanz TF-240 (Pulver) unter Bildung einer Lösung mit einem pH von 7,0 bis 7,5 versetzt. Die Lösung wird in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet. Vor Gebrauch wird dieses Produkt in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0,5%igen Lidocainlösung, einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung oder dergl. gelöst. Die erhaltene Lösung wird als Injektionsflüssigkeit verwendet.

Präparat 5

Eine verdünnte, wäßrige Natriumhydroxidlösung wird mit 1 mg der carcinostatischen Substanz TF-250 (Pulver) unter Bildung einer Lösung mit einem pH von 7,0 bis 7,5 versetzt. Die Lösung wird in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet. Vor Gebrauch wird das Produkt in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0,5%igen Lidocainlösung, einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung oder dergl. aufgelöst. Die erhaltene Lösung wird als Injektionsflüssigkeit verwendet.

Präparat 6

Eine wäßrige Lösung vom pH 7,0 bis 7,5 mit einem Gehalt der carcinostatischen Substanz TF-310-1 wird in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet, wobei man ein gefriergetrocknetes Präparat der carcinostatischen Substanz TF-310 erhält, und zwar als 0,5 mg Einheit oder 1 mg Einheit. Vor Gebrauch wird das Produkt in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0,5%igen Lidocainlösung, einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung oder dergl. aufgelöst. Die erhaltene Lösung wird für Injektionszwecke verwendet.

Präparat 7

Eine wäßrige Lösung vom pH 7,0 bis 7,5 mit einem Gehalt der carcinostatischen Substanz TF-310-2 wird in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet. Man erhält ein gefriergetrocknetes Präparat der carcinostatischen Substanz TF-310, und zwar als 0,5 mg Einheit oder 1 mg Einheit. Vor Gebrauch wird das Produkt in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0,5%igen Lidocainlösung, einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung oder dergl. aufgenommen. Die erhaltene Lösung wird für Injektionszwecke verwendet.

Präparat 8

Eine wäßrige Lösung vom pH 7,0 bis 7,5 mit einem Gehalt der carcinostatischen Substanz TF-320 wird in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet. Man erhält ein gefriergetrocknetes Präparat der carcinostatischen Substanz TF-320, und zwar als 0,5 mg Einheit oder 1 mg Einheit. Vor Gebrauch wird das Produkt in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0,5%igen Lidocainlösung, einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung oder dergl. aufgenommen. Die erhaltene Lösung wird für Injektionszwecke verwendet.

Präparat 9

Eine wäßrige Lösung vom pH 7,0 bis 7,5 mit einem Gehalt der carcinostatischen Substanz TF-330 wird in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet. Man erhält ein gefriergetrocknetes Präparat der carcinostatischen Substanz TF-330, und zwar als 0,5 mg Einheit oder 1 mg Einheit. Vor Gebrauch wird das Produkt in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0,5%igen Lidocainlösung, einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung oder dergl. aufgelöst. Der erhaltene Lösung wird für Injektionszwecke verwendet.

Präparat 10

Eine wäßrige Lösung vom pH 7,0 bis 7,5 mit einem Gehalt der carcinostatischen Substanz TF-340 wird in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet. Man erhält ein gefriergetrocknetes Präparat der carcinostatischen Substanz TF-340, und zwar als 0,5 mg Einheit oder 1 mg Einheit. Vor Gebrauch wird das Produkt in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0,5%igen Lidocainlösung, einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung oder dergl. aufgenommen. Die erhaltene Lösung wird für Injektionszwecke verwendet.

Präparat 11

Eine wäßrige Lösung vom pH 7,0 bis 7,5 mit einem Gehalt der carcinostatischen Substanz TF-350 wird in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet. Man erhält ein gefriergetrocknetes Präparat der carcinostatischen Substanz TF-350, und zwar als 0,5 mg Einheit oder 1 mg Einheit. Vor Gebrauch wird das Produkt in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0,5%igen Lidocainlösung, einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung oder dergl. aufgenommen. Die erhaltene Lösung wird für Injektionszwecke verwendet.

Claims

1. Carcinostatische Substanz TF-210 mit den folgenden Eigenschaften:

(a) grauweißes-hellbraunes Pulver;
(b) es verhindert die Proliferation von Ehrlich Ascites-Tumor, Ehrlich's solidem Tumor, Sarcoma 180 und B-16 Melanom bei Mäusen und hat eine immunostimulierende Wirkung;
(c) es ist unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Diäthyläther;
(d) es hat keinen deutlichen Schmelzpunkt und zersetzt sich bei 160 bis 235°C;
(e) das Infrarot-Absorptionsspektrum, erhalten mit der KBr-Tablettenmethode, hat Absorptionsbanden in der Nähe von 3600-3200, 2950-2920, 1680-1620, 1550-1510, 1440, 1380, 1240-1220 und 1120-1020 cm^-1;
(f) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum einer wäßrigen Lösung der wasserlöslichen Fraktion bei pH 7,0 zeigt eine starke Absorption bei der Absorptionskante und einen Absorptionspeak in der Nähe von 248 bis 265 nm;
(g) positiv ist die Molisch-Reaktion, die Phenol- Schwefelsäure-Reaktion, die Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, die Indol-Salzsäure-Reaktion und die Lowry-Folin- Reaktion;
(h) Elementaranalyse: C 40-43% H 5-7% N 9-10%;
(i) der Saccharidgehalt der wasserlöslichen Fraktion bei pH 7, bestimmt nach der Phenol-Schwefelsäure- Methode, beträgt 5 bis 25 Gew.-%, ausgedrückt als Glucose, und der Proteingehalt, bestimmt nach der Lowry- Folin-Methode, beträgt 20 bis 50 Gew.-%, ausgedrückt als Rinderserumalbumin,

sowie die pharmazeutisch akzeptablen Salze davon.

2. Carcinostatische Substanz TF-220 mit den folgenden Eigenschaften:

(a) grauweißes-hellbraunes Pulver;
(b) es verhindert die Proliferation von Ehrlich Ascites-Tumor, Ehrlich's solidem Tumor, Sarcoma 180 und B-16 Melanom bei Mäusen und hat eine immunostimulierende Wirkung;
(c) es ist unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Diäthyläther;
(d) es hat keinen deutlichen Schmelzpunkt und zersetzt sich bei 160 bis 240°C;
(e) das Infrarot-Absorptionsspektrum, erhalten mit der KBr-Tablettenmethode, hat Absorptionsbanden in der Nähe von 3600-3200, 2950-2920, 1680-1620, 1550-1510, 1440, 1380, 1240-1220 und 1120-1020 cm^-1;
(f) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum einer wäßrigen Lösung der wasserlöslichen Fraktion bei pH 7,0 zeigt eine starke Absorption bei der Absorptionskante und einen Absorptionspeak in der Nähe von 248 bis 266 nm;
(g) positiv ist die Molisch-Reaktion, die Phenol- Schwefelsäure-Reaktion, die Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, die Indol-Salzsäure-Reaktion und die Lowry-Folin- Reaktion;
(h) Elementaranalyse: C 40-42% H 5-7% N 7-9%;
(i) der Saccharidgehalt der wasserlöslichen Fraktion bei pH 7, bestimmt nach der Phenol-Schwefelsäure- Methode, beträgt 5 bis 20 Gew.-%, ausgedrückt als Glucose, und der Proteingehalt, bestimmt nach der Lowry- Folin-Methode, beträgt 10 Gew.-% oder weniger, ausgedrückt als Rinderserumalbumin,

sowie die pharmazeutisch akzeptablen Salze davon.

3. Carcinostatische Substanz TF-230 mit den folgenden Eigenschaften:

(a) grauweißes-hellbraunes Pulver;
(b) es verhindert die Proliferation von Ehrlich Ascites-Tumor, Ehrlich's solidem Tumor, Sarcoma 180 und B-16 Melanom bei Mäusen und hat eine immunostimulierende Wirkung;
(c) es ist unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Diäthyläther;
(d) es hat keinen deutlichen Schmelzpunkt und zersetzt sich bei 185 bis 225°C;
(e) das Infrarot-Absorptionsspektrum, erhalten mit der KBr-Tablettenmethode, hat Absorptionsbanden in der Nähe von 3600-3200, 2950-2920, 1680-1620, 1550-1510, 1440, 1380, 1240-1220 und 1120-1020 cm^-1;
(f) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum einer wäßrigen Lösung der wasserlöslichen Fraktion bei pH 7,0 zeigt eine starke Absorption bei der Absorptionskante und einen Absorptionspeak in der Nähe von 249 bis 264 nm;
(g) positiv ist die Molisch-Reaktion, die Phenol- Schwefelsäure-Reaktion, die Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, die Indol-Salzsäure-Reaktion und die Lowry-Folin- Reaktion;
(h) Elementaranalyse: C 42-45% H 5-7% N 10-11%;
(i) der Saccharidgehalt der wasserlöslichen Fraktion bei pH 7, bestimmt nach der Phenol-Schwefelsäure- Methode, beträgt 5 bis 25 Gew.-%, ausgedrückt als Glucose, und der Proteingehalt, bestimmt nach der Lowry- Folin-Methode, beträgt 30 bis 60 Gew.-%, ausgedrückt als Rinderserumalbumin,

sowie die pharmazeutisch akzeptablen Salze davon.

4. Carcinostatische Substanz TF-240 mit den folgenden Eigenschaften:

(a) grauweißes-hellbraunes Pulver;
(b) es verhindert die Proliferation von Ehrlich Ascites-Tumor, Ehrlich's solidem Tumor, Sarcoma 180 und B-16 Melanom bei Mäusen und hat eine immunostimulierende Wirkung;
(c) es ist unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Diäthyläther;
(d) es hat keinen deutlichen Schmelzpunkt und zersetzt sich bei 200 bis 215°C;
(e) das Infrarot-Absorptionsspektrum, erhalten mit der KBr-Tablettenmethode, hat Absorptionsbanden in der Nähe von 3600-3200, 2950-2920, 1680-1620, 1550-1520, 1410-1360, 1280-1210, 1060, 960 und 820 cm^-1;
(f) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum einer wäßrigen Lösung der wasserlöslichen Fraktion bei pH 7,0 zeigt eine starke Absorption bei der Absorptionskante und einen Absorptionspeak in der Nähe von 250 bis 265 nm;
(g) positiv ist die Molisch-Reaktion, die Phenol- Schwefelsäure-Reaktion, die Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, die Indol-Salzsäure-Reaktion und die Lowry-Folin- Reaktion;
(h) Elementaranalyse: C 35-38% H 4-5% N 12-14%;
(i) der Saccharidgehalt, bestimmt nach der Phenol- Schwefelsäure-Methode, beträgt 15 bis 35 Gew.-%, ausgedrückt als Glucose, und der Proteingehalt, bestimmt nach der Lowry-Folin-Methode, beträgt 20 bis 30 Gew.-%, ausgedrückt als Rinderserumalbumin,

sowie die pharmazeutisch akzeptablen Salze davon.

5. Carcinostatische Substanz TF-250 mit den folgenden Eigenschaften:

(a) grauweißes-hellbraunes Pulver;
(b) es verhindert die Proliferation von Ehrlich Ascites-Tumor, Ehrlich's solidem Tumor, Sarcoma 180 und B-16 Melanom bei Mäusen und hat eine immunostimulierende Wirkung;
(c) es ist löslich in Wasser, aber unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Diäthyläther;
(d) es zeigt keinen deutlichen Schmelzpunkt und zersetzt sich bei 165 bis 210°C;
(e) das Infrarot-Absorptionsspektrum, erhalten mit der KBr-Tablettenmethode, hat Absorptionsbanden in der Nähe von 3600-3200, 2950-2920, 1680-1620, 1550-1510, 1410-1380, 1240-1210, 1150-1120, 1080-1020, 980 und 810 cm^-1;
(f) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum einer wäßrigen Lösung mit pH 7,0 zeigt eine starke Absorption bei der Absorptionskante und einen Absorptionspeak in der Nähe von 248 bis 269 nm;
(g) positiv ist die Molisch-Reaktion, die Phenol- Schwefelsäure-Reaktion, die Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, die Indol-Salzsäure-Reaktion und die Lowry-Folin-Reaktion;
(h) Elementaranalyse: C 30-33% H 3-5% N 3-5%;
(i) der Saccharidgehalt, bestimmt nach der Phenol- Schwefelsäure-Methode, beträgt 60 bis 80 Gew.-%, ausgedrückt als Glucose, und der Proteingehalt, bestimmt nach der Lowry-Folin-Methode, beträgt 5 bis 20 Gew.-%, ausgedrückt als Rinderserumalbumin,

sowie die pharmazeutisch akzeptablen Salze davon.

6. Carcinostatische Substanzen TF-310, TF-320, TF-330, TF-340 oder TF-350, erhältlich mit den entsprechenden Maßnahmen des Anspruchs 14, sowie pharmazeutisch akzeptale Salze davon.

7. Carcinostatische Substanz TF-340 gemäß Anspruch 6 mit den folgenden Eigenschaften:

(a) grauweißes-hellbraunes Pulver;
(b) es verhindert die Proliferation von Ehrlich Ascites-Tumor bei Mäusen und hat eine immunostimulierende Wirkung;
(c) es ist löslich in Wasser, jedoch unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Diäthyläther;
(d) es zeigt keinen klaren Schmelzpunkt, beginnt sich bei etwa 140°C zu zersetzen und zersetzt sich stark bei 200°C oder darüber;
(e) das Infrarot-Absorptionsspektrum, erhalten mit der KBr-Tablettenmethode, hat Absorptionsbanden in der Nähe von 3500-3300, 2920, 2850, 1660-1640, 1480-1520, 1460-1440, 1410-1340, 1250-1220, 1120-1030, 970 und 835 cm^-1;
(f) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum einer wäßrigen Lösung vom pH 7,0 zeigt eine starke Absorption an der Absorptionskante und einen Absorptionspeak in der Nähe von 250 bis 265 nm;
(g) positiv ist die Molisch-Reaktion, die Phenol- Schwefelsäure-Reaktion, die Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, die Indol-Salzsäure-Reaktion und die Lowry-Folin- Reaktion; die Ninhydrin-Reaktion ist jedoch negativ;
(h) Elementaranalyse: C 32-34% H 4-6% N 3-5%;
(i) der Saccharidgehalt, bestimmt nach der Phenol- Schwefelsäure-Methode, beträgt 20 bis 50 Gew.-%, ausgedrückt als Glucose, und der Proteingehalt, bestimmt nach der Lowry-Folin-Methode, beträgt 10 Gew.-% oder weniger, ausgedrückt als Rinderserumalbumin,

sowie pharmazeutisch akzeptable Salze davon.

8. Carcinostatische Substanz TF-350 gemäß Anspruch 6 mit den Eigenschaften:

(a) grauweißes-hellbraunes Pulver;
(b) es verhindert die Proliferation von Ehrlich Ascites-Tumor bei Mäusen und hat eine immunostimulierende Wirkung;
(c) es ist löslich in Wasser, jedoch unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Diäthyläther;
(d) es hat keinen deutlichen Schmelzpunkt und beginnt sich bei etwa 110°C zu zersetzen und zersetzt sich stark bei 180°C und darüber;
(e) das Infrarot-Absorptionsspektrum, erhalten mit der KBr-Tablettenmethode, hat Absorptionsbanden in der Nähe von 3500-3300, 2920-2900, 1660-1630, 1580-1520, 1460-1340, 1140-1100, 1080-1020, 970 und 820-800 cm^-1;
(f) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum einer wäßrigen Lösung vom pH 7,0 zeigt eine starke Absorption an der Absorptionskante und einen Absorptionspeak in der Nähe von 245 bis 264 nm;
(g) positiv ist die Molisch-Reaktion, die Phenol- Schwefelsäure-Reaktion, die Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, die Indol-Salzsäure-Reaktion und die Lowry-Folin- Reaktion; negativ ist jedoch die Ninhydrin-Reaktion;
(h) Elementaranalyse: C 34-37% H 5-6% N 1-2%;
(i) der Saccharidgehalt, bestimmt nach der Phenol- Schwefelsäure-Methode, beträgt 80 bis 95 Gew.-%, ausgedrückt als Glucose, und der Proteingehalt, bestimmt nach der Lowry-Folin-Methode, beträgt 10 Gew.-% oder weniger, ausgedrückt als Rinderserumalbumin,

sowie pharmazeutisch akzeptable Salze davon.

9. Verfahren zur Herstellung der carcinostatischen Substanz TF-210 des Anspruchs 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) Fusobacterium nucleatum ATCC 31647 züchtet, der Kulturmasse oder der überstehenden Flüssigkeit ein hydrophiles, organisches Lösungsmittel derart zusetzt, daß seine Konzentration 30 bis 80 Vol.-% beträgt, die erhaltene Mischung bei niedriger Temperatur stehen läßt bis zur beendeten Bildung des Präzipitats, den gebildeten Niederschlag abtrennt, dann
b) zum abgetrennten Niederschlag Wasser in der 5- bis 20fachen Menge des Niederschlags zugibt, die Mischung des Niederschlags und des Wassers auf pH 7,5 bis 8 einstellt, erforderlichenfalls unlösliche Bestandteile entfernt, sodann die Mischung auf einen pH von 3,5 bis 4,5 einstellt, die gebildeten wasserunlöslichen und wasserlöslichen Bestandteile voneinander trennt und den wasserunlöslichen Anteil als carcinostatische Substanz TF-210 gewinnt.

10. Verfahren zur Herstellung der carcinostatischen Substanz TF-220 des Anspruchs 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den mit den Maßnahmen des Anspruchs 9 a) abgetrennten Niederschlag

b) mit Wasser in der 5- bis 20fachen Menge des Niederschlags versetzt, die Mischung auf pH 7,5 bis 8 einstellt, erforderlichenfalls die unlöslichen Bestandteile entfernt, den pH auf 5,5 bis 6,5 bringt, die erhaltenen wasserunlöslichen und wasserlöslichen Bestandteile voneinander trennt und den wasserlöslichen Anteil als carcinostatische Substanz TF-220 gewinnt.

11. Verfahren zur Herstellung der carcinostatischen Substanz TF-230 des Anspruchs 3, dadurch gekennzeichnet, daß man den nach Stufe b) des Anspruchs 10 erhaltenen wasserlöslichen Anteil auf einen pH von 3,5 bis 4,5 bringt, den dabei entstandenen Niederschlag und wasserlöslichen Anteil voneinander trennt und den Niederschlag als carcinostatische Substanz TF-230 gewinnt.

12. Verfahren zur Herstellung der carcinostatischen Substanz TF-240 des Anspruchs 4, dadurch gekennzeichnet, daß man den mit den Maßnahmen des Anspruchs 9 b) oder den nach Anspruch 11 abgetrennten wasserlöslichen Anteil auf einen pH von 1,5 bis 2,5 bringt, den dadurch gebildeten Niederschlag vom wasserlöslichen Anteil trennt und als carcinostatische Substanz TF-240 gewinnt.

13. Verfahren zur Herstellung der carcinostatischen Substanz TF-250 des Anspruchs 5, dadurch gekennzeichnet, daß man den mit den Maßnahmen des Anspruchs 9 a) erhaltenen Niederschlag mit Wasser in der 5- bis 20fachen Menge des Niederschlags versetzt, den pH der Mischung auf 7,5 bis 8 einstellt, hierauf den pH auf 1,5 bis 2,5 bringt, zu dem so erhaltenen wasserlöslichen Anteil oder zu dem nach Anspruch 12 abgetrennten wasserlöslichen Anteil nach dem Einengen der Menge des wasserlöslichen Anteils auf 1/3 bis 1/7 ein hydrophiles, organisches Lösungsmittel in einer Menge gibt, daß die Konzentration 20 bis 80 Vol.-% beträgt und den dabei gebildeten Niederschlag als carcinostatische Substanz TF-250 gewinnt.

14. Verfahren zur Herstellung der carcinostatischen Substanzen TF-310, TF-320, TF-330, TF-340 und TF-350 gemäß Anspruch 6 bzw. 7 bzw. 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die nach den Ansprüchen 9 bis 13 erhaltenen carcinostatischen Substanzen TF-210, TF-220, TF-230, TF-240 oder TF-250 einer üblichen Deproteinisierungsbehandlung unterwirft und die entsprechenden wasserlöslichen Anteile aus TF-210 als TF-310, aus TF-220 als TF-320, aus TF-230 als TF-330, aus TF-240 als TF-340 und aus TF-250 als TF-350 gewinnt.

15. Verwendung der carcinostatischen Substanzen TF-210, TF-220, TF-230, TF-240, TF-250, TF-310, TF-320, TF-330, TF-340 oder TF-350 bei der Behandlung von Krebserkrankungen bei Säugetieren.