DE2809092A1 - Verfahren zur herstellung von emitanin - Google Patents
Verfahren zur herstellung von emitaninInfo
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Description
1Α-2392 2. März 1978
Koji Sakakida, Tokyo, Japan
Tetsuro Ikekawa, Narashino-shi, Chiba-ken, Japan
Verfahren zur Herstellung von Emitanin
Emitanin mit einer Antitumorwirksamkeit wird hergestellt durch Impfen eines Mediums zum Wachsen von Mycel mit
einem Mycel von Tricholoma matsutake, Tricholoma baka matsutake/
Volvariella volvacea oder Tremella fuciformis und Fermentieren des gewachsenen Mycels in einem flüssigen Medium,
welches ein Kohlehydrat und eine Stickstoffquelle enthält gefolgt von einer Isolierung des Festkörpers
des Mycels von der Brühe und Extraktion des Mycelkuchens und Isolierung des Wirkstoffs.
,009836/0833
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Emitanin mit Antitumor-Aktivität durch
Fermentation des Mycels von Tricholoma matsutake, Tricholoma baka matsutake, Volvariella volvacea oder
Tremella fuciformis.
Die Erfinder haben die Antitumor-Aktivität von Inhaltsstoffen eßbarer Pilze untersucht (japanisches Patent
Nr. 74450). Dies ist die erste Studie der Antitumor-Aktivität von Produkten eßbarer Pilze.
Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von Emitanin mit Antitumor-Aktivität zu schaffen.
Ferner ist es Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Isolierung von Emitanin mit Antitumor-Aktivität
zu schaffen.
Die vorstehende Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst,
daß man mit dem Mycel von Tricholoma matsutake, Tricholoma baka-matsutake, Volvariella volvacea oder
Tie mella fuciformis ein Medium für das Wachsen von Mycel
imptt und das gewachsene Mycel in einem flüssigen Medium
fermentiert, welches ein Kohlehydrat und eine Stickstoffquelle enthält, gefolgt von einer Isolierung der festen
Substanz des Mycels von der Brühe und Extraktion der festen Substanz des Mycels mit heißem Wasser, wobei die
Wirkstoffe Emitanin- M-A,B und C; Emitanin- BM-A,B und C;
Emitanin-F-A,B und C und Emitanin-S-A, B und C isoliert werden. Zur Isolierung der aktiven Wirkstoffe von dem
Extrakt oder dem Brühenfiltrat wird ein niederer Alkohol
oder Aceton zu dem Extrakt oder dem Brühenfiltrat gegeben
worauf der gebildete Niederschlag noch weiter gereinigt
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Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das Mycel von
Tricholoma matsutake, Tricholoma baka-matsutake, oulvariella volvacea oder Tremelia fuciformis in einem
flüssigen Medium fermentiert. Es ist bevorzugt, Keim-Mycel
auf einer Agar-Platte durch Impfen mit Mycel wachsen zu lassen und dann das gewachsene Mycel in dem
flüssigen Medium, welches ein Kohlehydrat und eine Stickstoff quelle enthält, zu homogenisieren. Nach der Fermentation
des Mycels in dem flüssigen Medium wird das Mycel von der Brühe durch Filtrieren oder Zentrifugieren getrennt.
Nach der Abtrennung wird der Wirkstoff im Mycel mit heißem Wasser extrahiert und sodann durch Zusatz eines
niederen Alkohols oder von Aceton ausgefällt und schließlich gereinigt. Dabei erhält man Emitanin-A. Die überstehende
Flüssigkeit des Extrakts wird eingeengt, wobei man Emitanin-B erhält.
Andererseits wird der Wirkstoff im Brühenfiltrat durch
Zugabe eines niederen Alkohols oder von Aceton ausgefällt und gereinigt. Dabei erhält man E^itanin-C. Zur Reinigung
des Niederschlags wird dieser zu einer wässrigen Lösung aufgelöst und die Verunreinigungen werden durch Zentrifugieren
abgetrennt und der in der Lösung enthaltene Wirkstoff wird durch ein Ionenaustauscherharz, durch
Dialyse, durch Ultrafiltration mit einer Molekularsiebmembran, durch fraktionelle Fällung mit einem organischen
Lösungsmittel, einer Säure oder einem quaternären Ammoniumsalz
oder durch chromatographische Trennung gereinigt, worauf der Wirkstoff getrocknet wird.
Das erfindungsgemäß eingesetzte Mycel kann erhalten werden
von Tricholoma matsutake IFO 6915-6935, hinterlegt bei der Japanese Federation of Culture Collections of Microorganisms oder Volvariella volvacea oder Tremelia fuciformis
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identifiziert gemäß "Coloured Illustrations of Fungi of
Japan" von Rokuya Imazeki und Tsuguo Hongo, erschienen im Verlag Hoikusha und hinterlegt als FERM-P-4393 und
FERM-P-4394 sowie Tricholoma baka-matsutake, hinterlegt am Japanese Fermentation Research Institute als
FERM-P-4395.
Tricholoma matsutake, Tricholoma baka matsutake, Volvariella volvacea oder Tremella fuciformis wird mit
sterilisiertem Wasser gewaschen und die Oberfläche wird mit einem mit 70%-igem Äthanol imprägnierten Baumwolltuch
abgewischt, um eine Sterilisation herbeizuführen. Dann wird der Körper in Stücke oder Scheiben geschnitten oder
fein zerteilt oder homogenisiert. Hiermit wird sodann eine Agar-Platte unter sterilisierten Bedingungen geimpft.
Die Agar-Schrägplatte enthält vorzugsweise ein Kohlenhydrat
und eine Aminosäure oder ein Polypeptid, z. B. 2 % Glucose und 0,2 bis 0,5 % Hefeextrakt und ggfs.
andere Zusätze, wie KH2PO., MgSO4 usw. Das Mycel wächst
gewöhnlich auf der Agar-Platte bei einem pH von 4,0 bis 7,5 bei 20 bis 70 0C während 1 bis 5 Wochen. Dabei erhält
man auf einfache Weise ein Mycel mit einer hohen Fortpflanzungsaktivität
im Vergleich zu einem gelagerten Mycel. Man kann dem Agarsubstrat eine wachsturnsfördernde Substanz
für das Mycel zusetzen oder einen Inhibitor für verunreinigende Bakterien. Ferner kann das Mycel auch nach dem bekannten
Sporen-Druck-Isolierverfahren isoliert werden.
Das Mycel, welches vom Fruchtkörper gewachsen war oder von der Agarplatte, wird zur Impfung eines flüssigen
Mediums verwendet. Dieses enthält ein Kohlehydrat, z. B. eine Hexose, wie Glucose oder Saccharose als
Kohlenstoffquelle und eine Aminosäure oder ein Peptid,
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ζ, B. Aminosäuren, Hefeextrakt, und Pepton oder Ammoniumsalze
als Stickstoffquelle sowie eine geringe Menge anorganischer oder organischer Zusatzstoffe, wie
Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisen-III-citrat, Nikotinsäurederivate, Folsäure, Thiaminderivate usw.
Die Stickstoffquellen und die Kohlehydratquellen sowie
die Zusatzstoffe für das Medium sind herkömmliche Quellen, welche in verschiedenen Veröffentlichungen
beschrieben sind, z. B. in Biochemical Engineering (University of Tokyo Press).
Optimale Stickstoffquellen umfassen Ammoniumtartrat oder
-Citrat/ Hefeextrakt, Malzextrakt, Maisquellflüssigkeit,
lösliches Pepton, Aminosäuren, Trockenhefe, Soyabohnenmehl
usw. Optimale Kohlenhydratquellen umfassen Glucose, Mannose, Fructose, Sacharose, Maltose, Dextrin, Lactose
usw.
Die Fermentation wird vorzugsweise bei 20 bis 32 C und bei einem pH von 4,0 bis 7,5 im ruhenden Medium oder
im geschüttelten Medium (durch hin- und hergehende Bewegung oder durch Drehen mit 50 bis 120 Umdrehungen/min),und zwar
während 2 bis 50 Tagen durchgeführt. Nach der Fermentation wird die Brühe des fermentierten Produkts durch Feststoff-Flüssig-Trennung,
z. B. Filtrieren oder Zentrifugieren aufgetrennt, wobei der feste Mycelkuchen isoliert wird.
Die aktiven Bestandteile Emitanin-A und B sind in der festen Substanz des Mycelkuchens enthalten, welcher durch
Filtrieren oder Zentrifugieren oder dgl. erhalten wurde. Der Wirkstoff Emitanin-C ist im Filtrat der Brühe enthalten.
Der Mycelkuchen wird mit einer geeigneten Menge heißen Wassers bei 80 bis 100 0C während mehrerer Stunden behandelt,
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um den Wirkstoff zu extrahieren. Zu dem Extrakt gibt man einen niederen Alkohol oder Aceton, um
den aktiven Wirkstoff auszufällen und dieser wird sodann durch Zentrifugieren mit 3000 bis 5000 Umdrehungen/min
während 15 min abgetrennt. Der Niederschlag wird durch Lyophilisierung getrocknet, wobei man ein weißgraues
Pulver von Emitanin-A erhält. Die überstehende Flüssigkeit des Extrakts wird unter vermindertem Druck eingeengt,
wobei der niedere Alkohol oder das Aceton abdestilliert und der Rückstand wird durch Lyophilisierung getrocknet,
wobei man ein weißgraues Pulver von Emicanin-B erhält.
Andererseits wird das Brühenfiltrat, welches nach Abtrennung
des festen Mycelkuchens von der Brühe erhalten wird, durch fraktionierte Fällung aufgearbeitet, wobei
man das 1- bis 5-fache eines niederen Alkohls oder von Aceton zu dem Filtrat gibt und den gebildeten Niederschlag
durch Filtrieren oder Zentrifugieren abtrennt. Der Niederschlag wird sodann durch Lyophilisierung
getrocknet, wobei man ein weißgraues Pulver von Emitanin-C erhält.
Zur Reinigung des gebildeten Niederschlags oder des abgetrennten Pulvers wird der Niederschlag oder das Pulver
in heißem Wasser oder in einer verdünnten wässrigen alkalischen Lösung aufgelöst und die unlöslichen Verunreinigungen
werden durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt. Wenn eine verdünnte wässrige alkalische Lösung
verwendet wird,so wird sie mit einer Säure, wie Essigsäure, neutralisiert und der aktive Bestandteil wird durch fraktionierte
Fällung unter Variieren des pH-Wertes der wässrigen Lösung isoliert, sowie durch Behandlung mit
einem Ionenaustauscherharz. Zum Beispiel werden die Verunreinigungen durch Behandlung des Niederschlages
mit einem schwachen Ionenaustauscherharz, z. B. Duolite A-7 oder Duolite S-30 oder Amberlite IR-45 abgetrennt.
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- r-
Die Lösung wird ggfs. durch Ultrafiltration mit einer
Molekularsiebmembran, z. B. einer Diaflow-Membran behandelt
und der Rückstand auf der Membran wird durch fraktionale Fällung mit einem mit Wasser mischbaren organischen
Lösungsmittel, z. B. einem niederen Alkohol oder Aceton; einer Säure, wie Essigsäure, oder einem quaternären
Ammoniumsalz, wie CPC, CTA, CTAB oder dgl. gereinigt. Der aktive Bestandteil kann weiter gereinigt werden durch
Ionenaustausch-Gelchromatographie unter Verwendung von DEAE, ECTEOLA-Cellulose, Ionenaustauscher oder Sephadex
(z. B. DEAE-Sephadex) usw.. Der aktive Bestandteil kann ferner gereinigt werden durch Affinitätschromatographie
unter Verwendung eines speziellen Adsorptionsmittels, wie Concanavalin A-Sephrose. Sodann wird der aktive Bestandteil
durch Zugabe eines niederen Alkohols oder von Aceton zu der wässrigen Lösung ausgefällt und der Niederschlag
wird durch Dialyse isoliert und durch Lyophilisierung und andere ggfs. anzuwendende Operationen getrocknet.
Emitanin hat eine Antitumor-Aktivität. Vermutlich handelt
es sich dabei um ein Polysaccharid, da es die folgenden Eigenschaften aufweist:
Phenol-Schwefelsäure-Reaktion .... positiv
Molisch-Reaktion .... positiv
Anthron-Schwefelsäure-Reaktion ... positiv
Perjodid-Benzidin-Reaktion .... positiv
Naphthoresorcin-Reaktion .... positiv
Eisen-Perchlorat-Reaktion .... negativ
Magnesium-Acetat-Reaktion .... negativ.
Die Infrarot-Spektren stützen diese Annahme.
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Emitanin ist löslich in Wasser aber unlöslich in organischen Lösungsmitteln, wie Benzol, Hexan, Aceton
oder dgl. und nur gering löslich in heißem Methanol oder heißem Äthanol. Die physiko-chemisehen Eigenschaften von
Emitanin sind in Tabelle 1 zusammengestellt.
Ein Antitumor-Bioassey wird durchgeführt unter Verwendung
des bei dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen aktiven Materials. Nach 24 h, berechnet von der subkutanen Transplantation
von Sarcoma 180 Ascites auf ICR-Mäuse wird der aktive Bestandteil gemäß vorliegender Erfindung intraperitoneal
während 10 Tagen verabreicht. Nach 5 Wochen von Beginn der Inoculierung wird das durchschnittliche
feste Tumorgewicht ermittelt und die Ergebnisse bei der behandelten Gruppe werden mit denjenigen der unbehandelten
Gruppe verglichen. Es wird festgestellt, daß die prozentuale Inhibition von Emitanin-M-A, B und C, erhalten aus Tricholoma
matsutake bei einer Dosis von 10 mg/kg/Tag 78 % bzw. 78 % bzw. 80 % beträgt. Der LD,- -Wert von Emitanin-M-A, B und C
beträgt mehr als 2 000 mg/kg (i.p.).
Die prozentuale Inhibition von Emitanin-BM-A, B und C,
erhalten von Tricholoma baka matsutake bei einer Dosis von 10 mg/kg/Tag beträgt 84,6 % bzw. 68,5 % bzw. 75 %.
Der LDj- -Wert von Emitanin-BM-A, B und C beträgt mehr
als 2 000 mg/kg (i.p.).
Die prozentuale Inhibition von Emitanin-F-A, B und C,
erhalten von Volvariella volvacea beträgt bei einer Dosis von 30 mg/kg/Tag 72,5 % bzw. 75,1 % bzw. 75,5 %.
Der LDcj-j-Wert von Emitanin-F-A, B und C beträgt mehr
als 2 000 mg/kg (i.p.).
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Die prozentuale Inhibition von Emitanin-S-A, B und C,
erhalten von Tremella fuciformis beträgt bei einer Dosis von 50 mg/kg/Tag 70 % bzw. 72,5 % bzw. 72 %. Der LD1. -Wert
von Emitanin-S-A, B und C beträgt mehr als 2 000 mg/kg (i.p.)
Wenn man Emitanin-BM-B oral in einer Dosis von 300 mg/kg/Tag während 10 Tagen verabreicht, so beträgt die prozentuale
Inhibition 50,68 %.
Im folgenden sind die physiko-chemischen Eigenschaften
der aktiven Bestandteile, welche erfindungsgemäß hergestellt werden, zusammengestellt. Jede der Emitanin-Proben
zersetzt sich bei 150 bis 260 °C.
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- yf-
Emitanin-M-A Emitanin-M-B Emitanin-M-C
Molekulargewicht
<:io
<5 χ 10
Elementar-Analyse:
C: 35,94
H: 9,28
N: 2,53
O: 50,18
C: 34,14 H: 6,40 N: 2,59
C: 35,25 H: 7,12 N: 3,67
Phenol-Schwefelsäure-Reaktion
Molisch-Reaktion
Anthron-Schwefelsäure-Reaktion
+23
+22
+ 20
IR
O-H-Streckschwingung in der Region
-1
um 3300 cm
C-H-Streckschwingung in der Region
-1
um 2 900 cm
C-H-, C-O-Deformationsschwingung
in der Region um 1 000 - 1 100 cm
_ Λ
UV
keine charakteristische -Absorption
Saccharide
Glucose 30 % Glucose >80 % Glucose )>50%
Galactose 30 % Mannose 35 %
Saccharid-Gehalt 790 %
60 %
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?809092
| EMITANIN -BM-A |
EMITANIN -BM-B |
EMITANIN -BM-C |
O-H-Streckschwingung in der Region um 3300 cm C-H-Streckschwingung in der Region um 2 900 cm" C-H-, C-O-Deformationsschwingung in der Region um 1 000 - 1 100 cm |
?50% | >60% | |
| Mö.lejailär.ge.w;x:ch.t. . . . | >104 | <105 | <5 χ 104 | keine charakteristische Absorption | ||
| Elementar-Analyse: | C: 32.52 H: 7.43 N: 5.04 O: 52.21 |
C: 31.44 H: 6.67 N: 2.31 |
C: 31.79 H: 7.53 N; 3.11 |
Glucose 30 % Glucose > 80 % Glucose ^-50% Galactose 30 % Mannose 30 % |
||
| Farbreaktionen: | + | + | + | >90% | ||
| Phenol-Schwefel säure-Reaktion ft- *■ Molisch-Reaktion Anthron-Schwefel- säure-Reaktion |
+ | + | + | |||
| [ cc ] | + | + | + | |||
| IR | +25° | +19° | +10° | |||
| OV | ||||||
| Saccharide | ||||||
| Saccharid-Gehalt |
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EMITANIN ■ -F-A
EMITANIN -F-B
EMITANIN -F-C
Molekulargewicht
>104
<10
< 5 χ
Elementar-Analyse:
36.42
6.05
8.88
6.05
8.88
45.54
C:
H:
N:
42.86
7.11
10.87
C:
H:
N:
40.35
7.56
10.55
Phenol-Schwefels äure-Reaktion
f Molisch-Reaktion
Anthron-Schwefelsäure-Reaktion +13
-21"
-10
III
O-H-Streckschwingung in der Region um 3300 cm
C-H-Streckschwingung in der Region um 2 900 cm
C-H-, C-O-Deformationsschwingung
in der Region um 1 000 - 1 100 cm
UV
keine charakteristische Absorption
Saccharide
Glucose >90%
Glucose>90%
Glucose >60%
Saccharid-Gehalt >30%
?30%
>25%
- 10 -
809836/0833
EMITANIN -S-A
EMITANIN [-S-B
EMITANIN -S-C
. Mö.LeKulä.r.ge.w.i.ch.t .
< 5 χ
Elementar-Analyse:
36.68
5.71
3.46
5.71
3.46
53.15
C:
H:
N:
35.08 5.49 5.30
C:
H:
N:
32.12 6.38 6.89
Phenol-Schwefelsäure-Reaktion
Molisch-Reaktion
Anthron-Schwefelsäure-Reaktion
U]
-20
+3
-5
IR
O-H-Streckschwingung in der Region um 3300 cm
C-H-Streckschwingung in der Region
-1
um 2 900 cm
C-H-, C-O-Deformationsschwingung in der Region um 1 000 - 1 100 cm
"1
UV
keine charakteristische Absorption
Saccharide
Galactose 50%
Mannose 40%
Mannose 40%
Glucose>30%
lucose j 3 0%
Saccharid-Gehalt >55%
- 11 -
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Im folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Gelagertes Mycel von Tricholoma matsutake (S. Ito et Imai
Sing.) IFO 6915 wird zur Impfung einer Agar-Schrägplatte
mit 2 % Glucose und 0,5 % Hefeextrakt (pH 4,5) verwendet und während 3 Wochen bei 22 C fermentiert. Sodann wird
das auf der Agar-Platte gewachsene Mycel isoliert und sorgfältig homogenisiert und zur Impfung von 3 1 eines
flüssigen Mediums verwendet, welches 2 % Glucose und 0,5 % trockene Hefe (pH 4,5) enthält. Dann erfolgt eine
Fermentation bei 24 C während 5 Wochen unter langsamem Schütteln des flüssigen Mediums. Nach der Fermentation
werden das Mycel und die Brühe durch Zentrifugieren getrennt. Das Mycel wird zweimal mit je 1 1 siedendem Wasser
während 5 h extrahiert, und der Extrakt wird auf etwa 1 1 unter vermindertem Druck eingeengt. Nach dem Abkühlen
des eingeengten Extrakts gibt man die 3-fache Volumenmenge
Äthanol zu dem eingeengten Extrakt. Der Niederschlag wird durch fraktionierte Fällung und Zentrifugentrennung abgetrennt.
Der erhaltene Niederschlag wird in 100 ml Wasser aufgelöst und 30 ml einer 0,5n-NH4OH-Lösung werden hinzugegeben.
Der gebildete Niederschlag wird abzentrifugiert und dann weiter durch Dialyse und Lyophilisierung behandelt.
Man erhält 124mg eines weißen Pulvers von Emitanin-M-A.
Andererseits wird die überstehende Flüssigkeit unter vermindertem Druck erhitzt, um das Äthanol zu verdampfen.
Man erhält 193 mg eines weißen Pulvers von Emitanin-M-B.
Andererseits gibt man die dreifache Volumenmenge Äthanol zu dem Brühenfiltrat der Fermentation und der Niederschlag
wird gemäß dem oben beschriebenen Verfahren abgetrennt.
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Der aktive Bestandteil wird weiter mit Sephadex G-200
(Säulenchromatographie) gereinigt, wobei man mit entsalztem Wasser elutioniert. Man erhält 63 mg eines weißen Pulvers
von Emitanin-M-C.
Vy
Das Mycel von Volvariella volvacea (Fr.) Sing. (FERM-P-4393)
wird zur Inoculation eines flüssigen Mediums mit 1 % Glucose, 0,4 % Malzextrakt und 0,15 % Hefeextrakt bei pH
6,5 verwendet. Sodann wird während 3 Tagen bei 30 0C fermentiert
und dann noch während 3 Tagen bei 27,0 C unter hin- und hergehendem Schütteln mit 120 Umdrehungen/min.
Das Fermentationsprodukt von 3 1 des Mediums wird durch Zentrifugentrennung während 10 min bei 5 000 Umdrehungen/min
abgetrennt, wobei man 26,4 g Mycel (Naßgewicht) erhält. Das Mycel wird mit 2 1 Wasser bei 100 C während 3,5h extrahiert.
Der Extrakt wird unter vermindertem Druck eingeengt und durch Lyophilisierung behandelt, wobei man 1,463 g eines
Pulvers erhält.
In 100 ml Wasser werden 1 g des Pulvers aufgelöst und 400 ml Äthanol werden zu der Lösung gegeben und der Niederschlag
wird durch Zentrifugentrennung bei 5 000 Umdrehungen/min während 15 min abgetrennt, und dann durch Lyophilisierung
behandelt, wobei man 94 mg Emitanin-F-A erhält. Die überstehende Flüssigkeit wird unter vermindertem Druck eingeengt
und der Rückstand wird lyophilisiert, wobei man 836 mg Emitanin-F-B erhält. Andererseits gibt man
3 Volumen-Teile Äthanol zu 1 Volumen-Teil des Brühenfiltrats und der gebildete Niederschlag wird nach obigem
Verfahren weiter behandelt, wobei man 1055 mg eines Pulvers von Emitanin-F-C erhält.
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- xr-
Man arheitet nach, dem Verfahren des Beispiels 2,
wobei man mit dem Mycel von Tremella fuciformis Berk.
(FERM-P-4394) impft. Nach der Fermentierung und Abtrennung
erhält man 333 g des Myeels (Naßgewicht\ von 3 1 der Fermentationslösung. Das Mycel wird mit
siedendem Wasser extrahiert und sodann erfolgt die Ausfällung und die Trocknung,vobei man 4,4 g des
Pulvers erhält. Dieses wird gemäß Beispiels 2 weiter behandelt, wobei man 82 mg Emitanin-S-A und 851 mg
Emitanin-S-B aus 1 g Pulver erhält. Andererseits wird das Brühenfiltrat in oben beschriebener Weise aufgearheitet,
wobei man 9 85 mg eines Pulvers von Emitanin-S-C erhält.
Gelagertes Mycel von Tricholoma baka-matsutake (FERM-P-4395)
wird zur Impfung einer Agar-Schrägplatte mit 2 % Glucose und O,5 % Hefeextrakt (pH 4,5) verwendet und dann wird
während 15 Tagen bei 26 °C fermentiert. Sodann wird das auf der Agar-Platte gewachsene Myeel isoliert und
sorgfältig homogenisiert und zur Impfuagrvon 3 1 eines
flüssigen Mediums, enthaltend 2 % Glucose und O,5 % trockene
Hefe CpH 4,5>, verwendet. Das Ganze wird sodann bef 24 °C
während 3 Wochen unter leichtem- Schütteln des f lüssigert
Mediums fermentiert. Nach der Fermentation werden das Mycel und das Brühenfiltrat durch Zentrifugentrennung getrennt.
Das Mycel wird zweimal mit 1 1 siedendem Wasser während
5 h extrahiert und der Extrakt wird- unter vermindertem-Druck
auf etwa 1 1 eingeengt. Nach der- Abkühlung des
eingeengten. Extrakts gibt man 3 Volumen-Teile Äthanol
zu 1 Volumen-Teil des eingeengten Extrakts.
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Der gebildete Niederschlag wird durch fraktionierte Fällung und Zentrifugentrennung abgetrennt. Der erhaltene
Niederschlag wird in 100 ml Wasser aufgelöst und 30 ml Ο,δη-ΝΗ.ΟΗ werden hinzugegeben. Der gebildete
Niederschlag wird sodann durch Zentrifugentrennung abgetrennt und weiter durch Dialyse behandelt und sodann
lyophilisiert. Man erhält 1,7 g eines weißen Pulvers von Emitanin-BM-A. Andererseits wird die überstehende
Flüssigkeit unter vermindertem Druck erhitzt, wobei das Äthanol verdampft. Man erhält 5,7 g eines weißen
Pulvers von Emitanin-BM-B.
Andererseits gibt man 3 Volumen-Teile Äthanol zu einem Volumen-Teil des Brühenfiltrats der Fermentation und
der gebildete Niederschlag wird nach obigem Verfahren abgetrennt. Der aktive Bestandteil wird weiter durch
Säulenchromatographie an Sephadex G-200 gereinigt, wobei zur Elutionierung entsalztes Wasser verwendet wird^
Man erhält 1,3 g eines weißen Pulvers von Emitanin-BM-C.
809836/0833
Claims (20)
1. Verfahren zur Herstellung von Emitanin, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Medium zum Wachsen von Mycel
mit dem Mycel von Tricholoma matsutake, Tricholoma baka matsutake, Volvariella volvaea oder Tremella fuciformis
inoculiert und danach das gewachsene Mycel in einem flüssigen Medium fermentiert, welches ein Kohlehydrat und
eine Stickstoffquelle enthält, worauf man das feste Mycelmaterial
von der Brühe trennt und mit heißem Wasser extrahiert und die aktiven Bestandteile isoliert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zu dem durch Extraktion des von der Brühe abgetrennten
Mycels erhaltenen Extrakt einen niederen Alkohol, Aceton, eine Säure oder ein quaternäres Ammoniumsalz
als Fällungsmittel gibt und den Niederschlag unter Gewinnung von Emitanin-A reinigt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Niederschlag in Wasser oder einer wässrigen Lösung
aufgelöst wird, welche sodann durch Dialyse, Ultrafiltrierung,
fraktionierte Fällung oder chromatographische Trennung gereinigt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Abtrennung des Mycels
durch Zentrifugenabtrennung erfolgt.
5^ Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß die Abtrennung des Niederschlags durch Zentrifugentrennung erfolgt.
INSPECTED
809836/0833 fcD
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Extrakt mit dem Fällungsmittel behandelt wird und der gebildete Niederschlag
abgetrennt und das Filtrat unter Gewinnung von Emitanin-B gereinigt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß ein Fällungsmittel, nämlich
ein niederer Alkohol, Aceton, eine Säure oder ein quaternäres Ammoniumsalz zu einer Lösung gegeben wird, welche
erhalten wurde durch Abtrennung des Mycels von der Brühe, worauf der gebildete Niederschlag in Wasser
oder in einer wässrigen Lösung aufgelöst wird und die erhaltene Lösung unter Gewinnung von Emitanin-C gereinigt
wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man Emitanin-M-A von einem
Niederschlag des Extrakts isoliert, welcher durch Extrahieren des Mycels von Tricholoma matsutake erhalten
wurde.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man Emitanin-M-B von
der überstehenden Flüssigkeit des Extrakts isoliert, welcher erhalten wurde durch Extrahieren des Mycels
von Tricholoma matsutake.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man Emitanin-M-C von einem
Brühenfiltrat isoliert, welches erhalten wurde durch Kultivierung und Filtrierung des Mycels von Tricholoma
matsutake.
809836/0833
7809092
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet/ daß man Emitanin-F-A von einem
Niederschlag des Extrakts isoliert, welcher erhalten wurde durch Extrahieren des Mycels von Volvariella volvacea
(Er) Sing.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man Emitanin-F-B von der überstehenden
Flüssigkeit des Extrakts isoliert, welcher erhalten wurde durch Extrahieren des Mycels von
Volvariella volvacea (Fr) Sing.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7,
dadurch gekennzeichnet, daß man Emitanin-F-C von einem Brühenfiltrat isoliert, welches erhalten wurde
durch Kultivieren und Filtrieren des Mycels von Volvariella volvacea (Fr) Sing.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7,
dadurch gekennzeichnet, daß man Emitanin-S-A isoliert von einem Niederschlag des Extrakts, welcher erhalten
wurde durch Extrahieren des Mycels von Tremella fuciformis Berk.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man Emitanin-S-B isoliert
von der überstehenden Flüssigkeit eines Extrakts, welcher erhalten wurde durch Extrahieren des Mycels
von Tremella fuciformis Berk.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man Emitanin-S-C vom
Brühenfiltrat isoliert, welches erhalten wurde durch
Kultivieren und Filtrieren des Mycels von Tremella fuciformis Berk.
809836/0833
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man Emitanin-BM-A von
einem Niederschlag des Extrakts isoliert, welcher erhalten wurde durch Extrahieren des Mycels von
Tricholoma baka matsutake.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7,
dadurch gekennzeichnet, daß man Emitanin-BM-B von der überstehenden Flüssigkeit des Extrakts isoliert,
welcher erhalten wurde durch Extrahieren des Mycels von Tricholoma baka matsutake.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man Emitanin-BM-C
von dem Brühenfiltrat isoliert, welches erhalten wurde durch Kultivieren und Filtrieren des Mycels von
Tricholoma baka matsutake.
20. Emitanin, erhalten nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18.
OQ9836/0833
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