CH648595A5 - Verfahren zur herstellung von polysacchariden mit antikarzinogener aktivitaet. - Google Patents

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CH648595A5
CH648595A5 CH6003/80A CH600380A CH648595A5 CH 648595 A5 CH648595 A5 CH 648595A5 CH 6003/80 A CH6003/80 A CH 6003/80A CH 600380 A CH600380 A CH 600380A CH 648595 A5 CH648595 A5 CH 648595A5
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mycelium
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stromatoid
polysaccharide
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CH6003/80A
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Kazuo Nakajima
Yoshiaki Hirata
Hiroyuki Uchida
Yoshie Kimizuka
Tsutomu Taniguchi
Akira Obayashi
Osamu Tanabe
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Takara Shuzo Co
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Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Hersteilung von Polysacchariden mit antikarzinogener Wirkung. Das Verfahren besteht darin, dass man einen Stamm, welcher ein antikarzinogenes Polysaccharid zu erzeugen vermag und zur Gattung Isaria aus der Klasse Hyphomycetes gehört, inkubiert und aus dem Kulturmedium eine filtrierte Brühe bzw. aus dem Stromatoid oder Mycel einen flüssigen Extrakt bildet und aus der filtrierten Brühe oder aus dem flüssigen Extrakt ein Polysaccharid in reiner Form gewinnt.
Erfindungsgemäss kann man einen beliebigen Stamm der zur Gattung Isaria der Klasse Hyphomycetes (Fadenpilze, Fungi imperfecti) gehörenden Arten, welcher ein antikarzinogenes Polysaccharid zu erzeugen vermag, verwenden.
Gemäss den nachstehend geoffenbarten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wurde ein Stamm von Isaria atypicola Yasuda K-25S3 benützt, welcher durch Züchtung eines Stromatoids, d.h. eines Gewebes, einer Pilzart, die bei «Kiyotaki», Kyoto Prefecture, Japan, im Sommer 1965 gesammelt werden konnte, erhalten worden ist. Die Identifizierung dieser Art wurde anhand der folgenden Bücher vorgenommen, nämlich «Icônes of Japanese Fungi», Verlag Seiichi Kawamura (publiziert durch Kazama-shobo, Tokyo, Japan) 8, 854-857, 1968; «Colored Illustrations of Fungi of Japan», Verlag Rokuya Imazeki und Tsugio Hongo (publiziert durch Hoiku-sha, Osaka, Japan) 1965.
Somit lassen sich die Eigenschaften dieses Stammes wie folgt beschreiben. Der Stamm ist parasitär auf Kishinouyeus typicus Kishida, eine Art von Spinnen, und der tote Körper einer solchen Spinne ist mit Mycel dieses Stammes am Boden bedeckt, wobei sich das Stromatoid entwickelt. Das Stromatoid ist 5 bis 8 cm hoch, weiss, zylindrisch und fleischig. Oben am Stamm, welcher einen Durchmesser von 2,5 bis 4,0 mm und eine glatte Oberfläche aufweist, findet sich ein tragender Teil, welcher etwas dicklich und etwas länglich ist wie der Stamm. Der tragende Teil besitzt helle, samtartige, violette Sporen, welche zylindrisch, halbglatt und farblos sind und eine Grösse von 4-5 x 1,5-2,0 u. aufweisen.
Aus diesen Eigenschaften und Merkmalen und unter Berücksichtigung der Ausführungen in den oben zitierten Büchern wurde dieser Stamm nun als Isaria atypicola Yasuda identifiziert. Dieser Stamm wurde am 25. Juli 1979 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industriai Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chôme, Yatabe-cho, Tsu-kuba-gun, Ibaragi-ken, Japan, unter FERM-P 5086 und überdies am 15. Juli 1980 bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852,
USA, unter ATCC 20603 hinterlegt.
Die erfindungsgemässen antikarzinogenen Polysaccharide lassen sich aus einem flüssigen Extrakt von Stromatoid und/ oder Mycel dieses Stammes, welcher inkubiert worden war, oder aus einer filtrierten Kulturbrühe, in welcher ein solches Mycélium inkubiert worden war, herstellen.
Es ist indessen nicht leicht, solches Stromatoid in ausreichend grosser Menge auf natürlichem Wege zu sammeln. Daher ist es von Vorteil, den Stamm zu inkubieren, um das Stromatoid in reichlicher Menge zu erhalten. Die Inkubation kann in an sich für die Inkubation von Fungi der Klasse Hyphomycetes bestens bekannter Weise, beispielsweise auf Holzmehl oder einem Holzmehlmedium, geschehen. So kann man beispielsweise 200 g Sägemehl, 100 g Reiskleie und 300 ml Wasser gründlich miteinander vermischen, um ein Kulturmedium zu erhalten, das man dann in einem geeigneten Behälter einträgt und sterilisiert. Der getrennt davon in einem Schrägkulturmedium gezüchtete Stamm wird in an sich bekannter Weise bei 25 bis 27 °C während ungefähr 1 Monat zur Erzielung eines ausreichenden Wachstums des Mycéliums gebrütet. Hierauf wird das Kulturmedium während ca. 1 Monat bei 20 bis 25 °C stehengelassen, damit das Stromatoid darauf wächst. Das so gewachsene Stromatoid wird gesammelt und als Ausgangsmaterial für die vorliegende Erfindung verwendet.
Das erfindungsgemäss zu verwendende Mycélium kann erhalten werden durch bekannte Züchtungsmethoden, z.B. als feste Kultur oder flüssige Kultur. Bei der Züchtung in fester Phase kann man beispielsweise Agar, Gelatine, Stärke, Holzmehl, Pulpe oder andere übliche feste Kulturmedien oder eine Kombination davon verwenden. Bei der Züchtung in flüssigem Medium kann man ein flüssiges Züchtungsmedium verwenden, welches verschiedene Nährstoffe, welche für die Züchtung von Mikroorganismen bestens bekannt sind, enthält. So kann das flüssige Züchtungsmedium Kohlenstoffquellen, wie z.B. Glucose, Maltose, Lactose, Saccharose, Stärke, Molasse usw., Stickstoffquellen organischen oder anorganischen Ursprungs, wie z.B. Pepton, Hefeextrakt,
Hefe, Maisquellflüssigkeit, Harnstoff, Ammoniumsalze usw., und mindestens ein organisches und/oder anorganisches Salz, wie z.B. Phosphate, Magnesiumsalze usw., enthalten. Gewünschtenfalls kann man auch andere für das Wachstum erforderliche Materialien, wie z.B. Vitamine, zugeben. Diese für feste und flüssige Züchtungsmedien in Frage kommenden Materialien sind bei der Züchtung von Fungi an sich bestens bekannt, weswegen ausführlichere Angaben nicht erforderlich sind. Die Züchtung in flüssigem Medium kann in üblicher Weise, z.B. stationär, durch Schütteln oder submers, geschehen. Aus wirtschaftlichen Überlegungen und wegen der leichten Handhabung ist die Züchtung in flüssigem Medium vorteilhafter als die Züchtung in einem festen Medium.
Bei der Durchführung der flüssigen Züchtung kann man sich an die folgenden Bedingungen halten:
anfänglicher pH-Wert 2 bis 9
Inkubationstemperatur 12 bis 35 °C
Inkubationsdauer 3 bis 30 Tage
Bei der submersen Züchtung wird in der Regel das Medium belüftet mit einer Geschwindigkeit von 0,1 bis 2,0 1/min unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 30 bis 500 U/min.
Das aus der festen bzw. flüssigen Kultur gewachsene Mycel wird in an sich bekannter Weise gesammelt und als Ausgangsmaterial für die vorliegende Erfindung verwendet.
Bei der flüssigen Kultur kann man das Mycélium beispielsweise dadurch sammeln, dass man das entstandene flüs5
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sige Kulturmedium in an sich bekannter Weise, z.B. durch Zentrifugierung, Filtrieren usw., einem Trennprozess unterwirft. Das bei dieser Trennung erhaltene Filtrat wird als filtrierte Brühe oder Filterbrühe bezeichnet, die man ebenfalls als Ausgangsmaterial für die vorliegende Erfindung einsetzen kann.
Erfindungsgemäss wird das in der oben erwähnten Weise gesammelte Stromatoid und/oder Mycélium mit einem, vorzugsweise wässrigen Lösungsmittel extrahiert. In diesem Falle kann das Stromatoid und/oder das Mycélium als solches direkt der Extraktion unterworfen werden. Gewünschtenfalls kann man das Stromatoid und/oder das Mycélium vor einer solchen Extraktion einer Vorbehandlung, beispielsweise einem Waschvorgang mit Wasser, einer Trocknung an der Luft, einer Zerkleinerung oder Pulverisierung oder einer Extraktion mit einem nichtpolaren Lösungsmittel, unterwerfen.
Das für die Extraktion zu verwendende Lösungsmittel besteht normalerweise aus Wasser oder einer Mischung von Wasser und mindestens einem wasserlöslichen Material, z.B. einer Säure, einer Base, einem Salz oder einem organischen Lösungsmittel.
Bei der Durchführung der Extraktion wird das vorbehandelte oder nicht vorbehandelte Stromatoid oder Mycélium mit dem, z.B. wässrigen, Lösungsmittel vermischt. Die Temperatur des Lösungsmittels ist nicht von Bedeutung, soll aber unterhalb 120 °C liegen. Die bevorzugte Temperatur wird nach dem wirtschaftlichen Standpunkt gewählt. Die Extraktion erfolgt während einer genügend langen Zeitdauer, um die gewünschte Extraktion zu gewährleisten. Im allgemeinen ist die Extraktionsdauer bei höherer Temperatur kürzer. Innerhalb des oben erwähnten bevorzugten Temperaturbereiches erfolgt die Extraktion vorzugsweise während einer Dauer von 30 Minuten bis 10 Stunden. Die Extraktion erfolgt vorzugsweise unter Schütteln in einem Glasbehälter, einem mit Glas ausgefütterten Behälter, einem emaillierten Behälter oder einem rostfreien Stahlbehälter. Die zu verwendende Lösungsmittelmenge kann innerhalb eines grossen Bereiches schwanken. Im allgemeinen wird man die 10- bis lOOfache Gewichtsmenge, bezogen auf Trockenbasis, des Stromatoids und/oder Mycels einsetzen. Für die Extraktion wird man mit Vorteil pulverisiertes Stromatoid oder Mycélium verwenden. Nach erfolgter Extraktion werden das Mycélium bzw. das Stromatoid und die anderen festen Bestandteile in an sich bekannter Weise, beispielsweise durch Filtrieren oder Zentri-fugieren, aus dem flüssigen Extrakt entfernt. Der flüssige Extrakt wird beispielsweise durch Verdampfen im Vakuum oder mittels einer ähnlichen Behandlung eingeengt. Im allgemeinen wird der wässrige Extrakt auf Vi bis '/io des Volumens eingeengt.
Der nach den obigen Angaben erhaltene Extrakt wird hierauf in der unten näher beschriebenen Weise gereinigt, wodurch man eine Ausfällung erzielt und das gewünschte Polysaccharid gewinnen kann. Die Bezeichnung «flüssiger Extrakt», wie sie hier Verwendung findet, bedeutet ein Filtrat oder Zentrifugat, das sich nach dem Entfernen des Mycéliums und/oder Stromatoids und anderen festen Bestandteilen aus dem Extrakt ergibt.
Die Filtrierbrühe kann auch und dies mit Vorteil zwecks Reinigung in der weiter unten beschriebenen Weise behandelt werden, wobei man eine Ausfällung und Gewinnung des gewünschten Polysaccharids erzielt. Die Bezeichnung «filtrierte Brühe», wie sie hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Filtrat, das die Wirksubstanz, d.h. das Polysaccharid, enthält und nach der Entfernung des Mycéliums und anderer fester Bestandteile aus der Kulturbrühe, d.h. dem Züchtungsmedium, in welchem der Stamm durch die flüssige Kultur in der oben beschriebenen Weise, inkuiert worden ist, erhalten wird. Die filtrierte Brühe wird hierauf beispielsweise durch Verdampfen im Vakuum oder in ähnlicher Weise eingeengt, um dann weiter behandelt zu werden. Im allgemeinen wird die filtrierte Brühe auf 'A bis Mo des ursprünglichen Volumens eingeengt und die so eingeengte filtrierte Brühe anschliessend gereinigt.
Der flüssige Extrakt und die filtrierte Brühe können getrennt voneinander gereinigt werden. Der flüssige Extrakt und die filtrierte Brühe können aber auch miteinander vermischt werden, um dann das so erhaltene Gemisch nachträglich zu reinigen.
Die Reinigung kann nach einer der nachstehend beschriebenen Methoden geschehen.
(A) Ausfällung der gewünschten Substanz durch Zugabe eines stark polaren, organischen Lösungsmittels, wie z.B.
eines niederen Alkohols oder Ketons, wie z.B. Methanol, Äthanol, Propanol, Butanol, Aceton usw., oder durch Aussalzen, durch Zugabe von wasserlöslichen, anorganischen Salzen, wie z.B. Ammoniumsulfat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid usw.
(B) Entfernung der Säuren, Ionen und niedrigmolekularen Substanzen durch Dialyse, Gelfiltrierung unter Verwendung von Dextran oder Polyacrylamidgel, wie z.B. Sephadex, Bio-Gel usw., Ionenaustauschharzbehandlung unter Verwendung von beispielsweise verschiedenen im Handel vorhandenen Anionen- und Kationenaustauschharzen, wie z.B. Amber-lite, Dowex, Duolite usw., Ultrafiltration und eine Kombination dieser Massnahmen unter Bildung einer im wesentlichen reinen Lösung, aus welcher die gewünschte Wirksubstanz gewonnen wird.
(C) Behandlung beispielsweise nach der Sevag-Methode, Trifluortrichlormethan-Methode, Proteasebehandlung usw. zwecks Entfernung der freien Proteine.
Alle diese Massnahmen sind dem Fachmann bestens bekannt. Gewünschtenfalls kann man zwei oder mehrere dieser Methoden kombinieren. Im allgemeinen wird der flüssige Extrakt oder die filtrierte Brühe nach erfolgter Einengung, beispielsweise einer Ionenaustauschharzbehandlung, einer Dialyse, einer Gelfiltrierung, einer Ultrafiltration oder einer Kombination dieser Methoden unterworfen, um eine Entfärbung, Entsäuerung und Entfernung der niedermolekularen Substanzen zu bewirken. Aus der so gereinigten Lösung kann man dann die gewünschte Wirksubstanz unter Anwendung der geeigneten Methode, z.B. durch Gefriertrocknung, gewinnen. Gewünschtenfalls kann man die oben erwähnte Methode bzw. Methoden wiederholen, um das gewünschte Ausmass an Reinheit zu erzielen.
Die so erhaltene Substanz besitzt die folgenden Eigenschaften:
(1) Sie ist ein weisses oder schwach braunes, nicht dialy-sierbares Pulver;
(2) sie reagiert auf Molisch-Reaktion, Anthronreaktion und Ninhydrinreaktion positiv;
(3) die Elson-Morgan-Reaktion ist schwach positiv oder negativ;
(4) die Jodreaktion und Bialreaktion sind negativ;
(5) diese Substanz ist in Wasser oder in einer wässrigen Lösung einer mit Wasser mischbaren Substanz, z.B. einem organischen Lösungsmittel, einer Säure, einer Base, einem Salz oder dergleichen, löslich, jedoch in einem organischen Lösungsmittel, wie z.B. Petroläther, Äthyläther, Benzol, Aceton, Äthanol, Methanol usw., unlöslich.
(6) Diese Substanz besitzt keinen scharfen Schmelzpunkt und verkohlt bei starkem Erhitzen.
(7) Das Hydrolysat dieser Substanz, welches durch Lösen derselben in einer wässrigen 0,ln-Schwefelsäurelösung und durch Erhitzen dieser 0,5 Gew.-% Substanz enthaltenden Lösung während 5 Stunden bei 100 °C erhalten wird, enthält
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mindestens Glucose, Galactose oder Mannose, wobei die Art bzw. Arten der Zucker je nach der Art oder dem Ausmass der Reinigung schwankt.
(8) Die Elementaranalyse dieser Substanz ist folgende: C = 35,78%; H = 6,28%; N = 0,65%.
Aus den obigen Daten darf geschlossen werden, dass es sich um hochmolekulare Polysaccharide handelt, welche sich aus den obenerwähnten Zuckern zusammensetzen und ein Molekulargewicht von mindestens 8000 und ein durchschnittliches Molekulargewicht von ungefähr 2 x 105 aufweisen.
Die erfindungsgemässen Polysaccharide zeigen weder eine Cytotoxizität noch die üblicherweise bei der Anwendung von üblichen Mitteln feststellbaren Nebenwirkungen, wie z.B. die Abnahme der Leukozytenzahl, eine Leberanämie und Anämien anderer Organe, eine Atrophie der Milz, eine Körpergewichtsabnahme oder eine Appetitlosigkeit. Die akute Toxizität (LDso) dieser Polysaccharide bei Mäusen liegt bei über 2000 mg/kg bei intraperitonealer Injektion.
Die erfindungsgemässen Polysaccharide besitzen eine antikarzinogene Aktivität. Diese Wirkung wird durch den folgenden Test bestätigt.
Eine Maus vom ICR-JCL-Stamm mit einem Gewicht von 20 ±2 g wurde intraperitoneal mit Sarcoma-180-Krebszellen oder Ehrlich-Krebszellen geimpft. Nach Ablauf von 1 Woche nach erfolgter Impfung wurde eine ausreichende Zunahme der Ascitesflüssigkeit in der Maus festgestellt. Die darin vorhandenen Krebszellen wurden subkutan in die Achselhöhlen von anderen Mäusen in einem Umfang von 4 Millionen Zellen pro Maus transplantiert. Diese Mäuse wurden in verschiedene Gruppen aufgeteilt, und zwar in Gruppen von jeweils fünf bis acht Tieren. Die erste Gruppe, d.h. die sogenannte Vergleichsgruppe, wurde nur mit Kochsalzlösung behandelt, während man sämtlichen anderen Tieren ein erfindungsge-mässes Polysaccharid verabreichte. Die erste Verabreichung der Kochsalzlösung bzw. des Polysaccharids erfolgte intraperitoneal nach Ablauf von 1 Tag seit dem Zeitpunkt der Transplantation, während die nachfolgende Verabreichung nach Ablauf von jeweils 1 Tage 5mal wiederholt wurde. Es wurde der den Mäusen transplantierte feste Tumor beobachtet und am 18. Tage nach der letzten Verabreichung wurde die durchschnittliche Gewichtszunahme gemessen, und die Tiere wurden seziert, um die Nebenwirkungen festzustellen und das Gewicht der Tumore, welche aus der Vergleichsgruppe sowie aus den mit Polysaccharid behandelten Gruppen entfernt worden waren, zu bestimmen. Das Hemmungsverhältnis (IR), wie es in den folgenden Tabellen zum Ausdruck gelangt, wurde nach der folgenden Formel errechnet:
IR (%) = (C — T)/C x 100
worin C das durchschnittliche Gewicht der Tumore bedeutet, welche aus jedem der Tiere aus der Vergleichsgruppe entfernt worden waren, und T das durchschnittliche Gewicht der Tumore wiedergibt, die aus den mit Polysaccharid behandelten Mäusen entfernt worden waren.
Die antikarzinogene Wirkung gegenüber einem syngeneti-schen Tumor in den Mäusen wurde gleichfalls festgehalten. Die Testmethode war dieselbe mit Ausnahme des Tumors, des Bestandes an Mäusen und der Verabreichungsmethode. Durch 3-Methylcholanthren induziertes Sarcom (Meth A) von BALB/C-Ursprung wurde in der festen Form bei Mäusen desselben Stammbaums angewandt. Der Mäusevorrat für diesen Test bestand aus Mäusen der Gattung BALB/C aus den Charles River Breeding Laboratories in Japan. Die Verabreichung erfolgte i.t., d.h. intratumoral.
Dabei konnte festgestellt werden, dass die erfindungsgemässen Polysaccharide eine starke antikarzinogene Aktiviät 5 in bezug auf Sarcoma-180, Ehrlich-Carçinom und Meth A zeigten.
Die Erfindung sei durch die folgenden Beispiele unter Zuhilfenahme der beiliegenden Zeichnung, worin die Fig. 1,2 und 3 die Infrarotspektren der erfindungsgemässen Poly-i« saccharide (als KBR-Tabletten) darstellen, erläutert.
Beispiel 1
Der Stamm (FERM-P 5086, ATCC 20603) von Isaria atypicola Yasuda wurde im folgenden Züchtungsmedium inku-15 biert:
Glucose
Polypepton (Daigo) Hefeextrakt (Difco) 20 Primäres Kaliumphosphat Magnesiumsulfat 7 H2O Wasser anfänglicher pH-Wert
25
20 g
5g 1 g 1 g 0,5 g 1 Liter
5,6-5,8 (ohne Einstellung)
Die Inkubation erfolgte dadurch, dass man jeweils 500-ml-Erlenmeyerkolben mit 100 ml des obigen Züchtungsmediums beschickte. Dann wurden die Kolben mit Baumwolle zugestopft und während 30 Minuten bei 120 °C sterilito siert. Nach dem Abkühlen wurde in üblicher Weise mit dem gleichen Stamm, welcher getrennt in einem Schrägkulturmedium, das 2% Glucose, 0,5% Ebios und 1,5% Agar enthielt, gezüchtet worden war, inokuliert. Nach 7tägigem Schütteln bei 27 °C wurden die Kolbeninhalte für die weitere Inkuba-35 tion verwendet. 20 Liter des oben beschriebenen flüssigen Züchtungsmediums wurden in einem 30 Liter fassenden, rostfreien Stahlgefäss während 30 Minuten bei 120 °C sterilisiert und dann abkühlen gelassen. Hierauf wurde das aus diesen Kolben erhaltene Material im Züchtungsmedium im besagten 40 Fermentiergefäss inokuliert. Dann wurde das Medium unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 250 Umdrehungen pro Minute während 16 Tagen bei 27 °C aerob inkubiert, wobei man gleichzeitig mit 0,5 Liter/Liter/Minuten belüftete. Die so erhaltene Kulturbrühe wurde filtriert; sie ergab 1700 g Mycel 45 in feuchtem Zustande und 15 Liter filtrierte Brühe. Dann wurde das Mycélium mit 1 Liter Wasser gewaschen und das Waschwasser mit der filtrierten Brühe vereinigt. Das gewaschene Mycélium wurde mit 2 Liter Wasser vermischt und das Ganze dann während 30 Minuten in einem verschlossenen 50 Gefäss auf 120 °C erhitzt. Hierauf wurde das Gemisch auf Zimmertemperatur abkühlen gelassen und anschliessend filtriert, worauf man das Filtrat auf ein Volumen von 1 Liter einengte. Der eingeengte flüssige Extrakt wurde mit Wasser dialysiert und hierauf gefriergetrocknet, wobei man 4,0 g 55 einer weissen bis hellbraunen, pulverigen Substanz erhielt. Das Infrarotspektrum dieser Substanz entspricht der Fig. 1.
16 Liter der filtrierten Brühe wurden auf ein Volumen von 2 Liter eingeengt und mit Wasser dialysiert und dann gefriergetrocknet, wobei man 26,5 g einer weissen bis hellbraunen, 60 pulverigen Substanz erhielt. Das Infrarotspektrum dieser Substanz entspricht Fig. 2.
Die antikarzinogenen Wirkungen dieser Polysaccharid-substanzen finden sich in den folgenden Tabellen 1 und 2.
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Tabelle 1
Substanz aus dem Mycélium
Dosis Verabreichungs- Komplette IR
mg/kg/Tag methode Regression %
Substanz aus der filtrierten Brühe
Dosis Verabreichungs- Komplette IR
mg/kg/Tag methode Regression %
10 ip 2/8 83,8 0,5 ip 0/8 -9,8
50 ip 7/8 94,1 5 ip 3/8 73,0
250 ip 4/8 79,5 50 ip 7/8 96,0
Krebszellen: Sarcoma 180,4x 106 Zellen/Maus Tierart: ICR-JCL 20 g ± 2 g
Behandlung: ab dem der Transplantation folgenden Tag 5mal intraperitoneal (lmal täglich) verabreicht (Vergleichsversuch: Kochsalz)
Bestimmung: Gewicht der festen Tumore IR (Hemmungsverhältnis) = (C — T)/C x 100
C: Durchschnittsgewicht der aus der Vergleichsgruppe entfernten Tumore
T: Durchschnittsgewicht der aus den mit einem Polysaccharid behandelten Gruppe entfernten Tumore
Tabelle 2
Substanz aus dem Mycélium
Substanz aus der filtrierten Brühe
Dosis
Verabreichungs
Komplette
IR
Dosis
Verabreichungs
Komplette
IR
mg/kg/Tag methode
Regression
%
mg/kg/Tag methode
Regression
%
10
IP
2/8
81,5
0,5
iP
0/8
-9,7
50
ÎP
7/8
94,3
5
iP
4/8
75,2
250
ÌP
5/8
80,9
50
iP
7/8
96,3
Krebszellen: Ehrlich-Carcinoma 4x 106 Zellen/Maus Tierart: Behandlung und Bestimmung gleich wie in Tabelle 1
Beispiel 2
Der Stamm FERM-P 5086, ATCC 20603 wurde in einem Fermentiergefäss in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 inkubiert. Hierauf wurden 16 Liter der filtrierten Brühe in folgender Weise gereinigt. Die filtrierte Brühe wurde durch Eindampfen im Vakuum auf ein Volumen von 2 Liter eingeengt und das Konzentrat während 24 Stunden gegen fliessendes Wasser dialysiert. 2,5 Liter dieses Dialysates wurden mit Hilfe von wässriger Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und dann mit «DEAE-Sephadex» behandelt. Die durch das «DEAE-Sephadex» geführte Flüssigkeit wurde mit Hilfe von Salzsäure auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt und dann mit «SP-Sephadex» behandelt. Die durch das «SP-Sephadex» fliessende Flüssigkeit wurde mit so viel Äthanol versetzt, um eine 50%ige Alkoholkonzentration zu erzielen, wodurch ein Niederschlag gebildet wurde, welcher in 1 Liter Wasser gelöst und dann erneut gegen fliessendes Wasser während 24 Stunden dialysiert wurde. Das Dialysat wurde gefriergetrocknet, wobei man 24,9 g einer festen Substanz, nämlich eines Polysaccharids, erhielt, welches eine weisse bis hellbraune pulverige Substanz darstellte und sich aus Glucose, Galactose und Mannose zusammensetzte. Das Infrarotspektrum dieser Substanz entspricht Fig. 3.
Die antikarzinogenen Wirkungen dieser Substanz bei Mäusen war die folgende:
(A) Antikarzinogene Wirkung bei Mäusen (Sarcoma-180) 45 Krebszellen: Sarcoma-180 4 x 106 Zellen/Maus
Tierbestand: ICR-JCL 20 + 2 g
Behandlung: ab dem der Transplantation folgenden Tag 5mal intraperitoneal verabreicht (täglich liiial) (Vergleichstest: Kochsalzlösung)
so Bestimmung: Gewicht der Tumore von festem Typus IR (Hemmungsverhältnis) = (C — T)/C x 100 C: durchschnittliches Gewicht der aus der Vergleichsgruppe entnommenen Tumore
T: durchschnittliches Gewicht der aus der mit Polysaccha-55 rid behandelten Gruppe entnommenen Tumore
(B) Antikarzinogene Wirkung bei Mäusen (Sarcoma-180) Behandlung: ab dem der Transplantation folgenden Tag
5mal intravenös verabreicht (täglich lmal) (bei den Vergleichstieren lediglich Kochsalzlösung)
60 Die Krebszellen, der Tierbestand und die Bestimmung erfolgten gemäss obigem Absatz (A).
(C) antikarzinogene Aktivität bei Mäusen (Meth A) Krebszellen: Meth A2 x 104 Zellen/Maus Tierbestand: BALB/C 20 g±2 g
65 Behandlung: ab dem der Transplantation folgenden Tag lOmal intratumoral verabreicht (täglich lmal) (Vergleichstiere: lediglich Kochsalzlösung)
Bestimmung: genau gleich wie im Absatz (A)
648 595 6
Tabelle 3 (A)
Dosis
Verabreichungs
Komplette
IR
mg/kg/Tag methode
Regression il.. " U
0,15
ip
2/5
79,0
0,80
iP
4/5
98,2
4,00
iP
5/5
100,0
20,00
iP
5/5
100,0
Kont.
iP
0/6
-
(B)
Dosis
Verabreichungs
Komplette
IR
mg/kg/Tag methode
Regression
%
0,02
iv
0/5
-19,8
0,10
iv
1/5
46,2
0,50
iv
6/6
100,0
2,50
iv
6/6
100,0
Kont.
iv
0/7
-
(C)
Dosis
Verabreichungs
Komplette
IR
mg/kg/Tag methode
Regression
- %
10
it
3/6
65,0
50
it
0/7
16,0
Kont.
it
0/7
-
3 Blatt Zeichnungen

Claims (4)

648 595
1. Verfahren zur Herstellung von Polysacchariden mit antikarzinogener Aktivität, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Stamm, welcher ein antikarzinogenes Polysaccharid zu erzeugen vermag und zur Gattung Isaria aus der Klasse Hyphomycetes gehört, inkubiert und aus dem Kulturmedium eine filtrierte Brühe bzw. aus dem Stromatoid oder Mycel einen flüssigen Extrakt bildet und aus der filtrierten Brühe oder aus dem flüssigen Extrakt ein Polysaccharid in reiner Form gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Stamm ein Stamm der Art Isaria atypicola ist.
2
PATENTANSPRÜCHE
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Stamm Isaria atypicola Yasuda, FERM-P 5086, ATCC 20603, ist.
4. Nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1 hergestellte Polysaccharide mit antikarzinogener Aktivität.
CH6003/80A 1979-08-08 1980-08-07 Verfahren zur herstellung von polysacchariden mit antikarzinogener aktivitaet. CH648595A5 (de)

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FR2463185B1 (de) 1983-08-12
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GB2055873B (en) 1983-05-05
US4409385A (en) 1983-10-11
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