CH642681A5

CH642681A5 - Verfahren zur herstellung neuer polysaccharide mit antikarzinogener wirkung.

Info

Publication number: CH642681A5
Application number: CH850879A
Authority: CH
Inventors: Kazuo Nakajima; Yoshiaki Hirata; Hiroyuki Uchida; Yoshie Watabe; Tsutomu Taniguchi; Akira Obayashi; Osamu Tanabe
Original assignee: Takara Shuzo Co
Priority date: 1978-09-21
Filing date: 1979-09-20
Publication date: 1984-04-30
Also published as: JPS5646792B2; GB2031446A; FR2436819A1; CA1127572A; JPS5542564A; DE2938039A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung neuer Polysaccharide mit antikarzinogener Wirkung, wobei ein Stamm eines Mikroorganismus, welcher ein antikarzinogenes Polysaccharid zu erzeugen vermag und der Gattung Polyporus aus der Klasse Basidiomycetes angehört, verwendet wird.

Erfindungsgemäss kann man einen beliebigen Stamm einer solchen Art verwenden, welche der Gattung Polyporus aus der Klasse Basidiomycetes angehört und ein antikarzinogenes Polysaccharid zu erzeugen vermag.

Zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung wurde bei den Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ein Stamm von Polyporus tuberaster (Fr.) verwendet, welcher dadurch erhalten worden ist, dass man einen Fruchtkörper (Organ oder Gewebe) einer Pilzart züchtete, welche im National Park «Izumidake», Miyagi Prefecture, Japan, im Herbst 1973 gesammelt worden ist. Die Identifizierung dieser Art wurde mit den folgenden Büchern vorgenommen: «Coloured Illustrations of Fungi of Japan», herausgegeben durch Rokuya Imazeki und Tsugio Hongo (publiziert durch Hoiku-Sha, Osaka, Japan) 1965; «Mycological flora of Japan», Herausgeber Seiya Ito (publiziert durch Yoken-Do, Tokyo, Japan), Bd. 2, Nr. 4, 1955; und Canadian Journal of Botany 29, 147-157, 1951.

Die Eigenschaften dieses Stammes sind die folgenden. Der Fruchtkörper besitzt einen Durchmesser von ungefähr 5,08 bis 15,24 cm (2 bis 6 inches) und eine ungefähr gleich grosse Höhe. Die Kappe des Fruchtkörpers ist zuerst hemisphärisch, ergibt aber bald eine Struktur, welche auf der oberen Seite schwach gebogen und an ihrer unteren Seite im wesentlichen flach ist. Diese Kappe ist hellbraun oder cha-moisfarbig und haftet durch gedrungene Stiele am Sclerotium (aus welchem der gesamte Fruchtkörper wächst). Die Kappe ist weich und käseähnlich in der Textur und beim Reifwerden mit feinen chamoisfarbenen Schuppen bedeckt. Auf der unteren Seite der Kappe befindet sich eine Schicht von Röhrchen, wobei die dem Stielende des Pilzes nahegelegenen Röhrchen kürzer und flacher sind. Das Sclerotium dieses Stammes ist nicht sphärisch oder oval, sondern in seiner Form abgeflacht. Die Sporen sind farblos (erscheinen aber in der Masse als weiss), oval und glatt, und deren Grösse liegt bei 1,2-4 p..

Aufgrund dieser charakteristischen Merkmale und unter Bezugnahme auf die obenerwähnten Literaturstellen wurde dieser Stamm mit Polyporus tuberaster (Fr.) identifiziert. Dieser Stamm ist am 30. August 1978 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industriai Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, 1-3, Higashi 1-chome, Yatabe-machi Tsubuka-gun, Ibaraki-ken 305 Japan, unter der Nr. FERM-P 4641 und am 9. Juli 1979 bei American Type Culture Collection, 12301 Parklaw Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, unter der Nr. ATCC 20544 hinterlegt worden.

Das erfindungsgemässe Verfahren besteht darin, dass man aus einem wässrigen Extrakt eines Fruchtkörpers und/oder eines Mycels eines Stammes, der ein antikarzinogenes Polysaccharid zu erzeugen vermag und zur Gattung Polyporus aus der Klasse der Basidiomycetes gehört, oder aus der filtrierten Brühe eines flüssigen Kulturmediums, in dem der besagte Stamm inkubiert worden ist, das Polysaccharid isoliert.

Das Sammeln eines solchen Fruchtkörpers in ausreichend grosser Menge ist in der Natur nicht leicht. Daher ist es von Vorteil, den Stamm zu impfen, um eine grosse Menge an Fruchtkörpern zu erhalten. Die Inkubation kann in der für die Inkubation von Pilzen der Klasse Basidiomycetes geeigneten Medien, z.B. auf Holzmehl oder Sägemehl, durchgeführt werden. So kann man beispielsweise 200 g Sägemehl, 100 g Reiskleie und 300 ml Wasser gründlich miteinander vermischen, um zu einem Kulturmedium zu gelangen, das man dann in einen geeigneten Behälter einfüllt und sterilisiert. Der getrennt davon in einem Schrägkulturmedium gezüchtete Stamm wird auf dem nach den obigen Angaben erhaltenen Kulturmedium in bekannter Weise bei 25 bis 27 ° C während ungefähr 1 Monat bis zum ausreichenden Wachstum des Mycéliums inkubiert. Das Kulturmedium wird hierauf mit Erde oder Sand bedeckt und während 1 oder 2 Monaten stehen gelassen, so dass der Fruchtkörper darauf wachsen kann. Der so gewachsene Fruchtkörper wird gesammelt und als Ausgangsmaterial für die vorliegende Erfindung verwendet.

Das für die vorliegende Erfindung verwendbare Mycélium kann nach üblichen Züchtungsmethoden, z.B. als feste Kultur oder als flüssige Kultur, erhalten werden. Handelt es sich um eine feste Kultur, so kann sie beispielsweise ein Agar-, Gelatine-, Stärke-, Holzmehl-, Pulpe- oder ein anderes übliches festes Kulturmedium oder eine Kombination davon sein. Als flüssige Kultur kommt ein solches flüssiges Kulturmedium in Frage, welches verschiedene Nährstoffe enthält, wie sie für die Züchtung von Mikroorganismen bestens bekannt sind. So kann das flüssige Züchtungsmedium, eine Kohlenstoffquelle, z.B. Glucose, Maltose, Lactose, Saccharose, Stärke, Molassen usw., eine Stickstoffquelle organischer oder anorganischer Natur, z.B. Pepton, Hefe, Hefeextrakt, Maiskornflüssigkeit, Harnstoff, Ammoniumsalze usw., und ein oder mehrere organische und/oder anorganische Salze, wie z.B. Phosphate, Magnesiumsalze usw., enthalten. Gewünschtenfalls können auch andere für das Wachstum erforderliche Materialien, wie z.B. Vitamine, hinzugegeben werden. Diese für feste und flüssige Kulturmedien einzusetzenden Materialien sind an sich für die Züchtung von Pilzen durchweg bekannt, so dass diesbezüglich keine nähere Erläuterung an dieser Stelle erforderlich ist. Die Züchtung in flüssigem Medium kann in üblicher Weise, z.B. als ortsfeste Kultur, Schüttelkultur oder submerse Kultur, durchgeführt werden. Aus wirtschaftlichen und sonstigen Gründen ist eine flüssige Kultur und insbesondere die submerse Kultur günstiger als eine feste Kultur.

Bei Durchführung der flüssigen Kultur mögen die folgenden Bedingungen zur Anwendung gelangen:

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Anfänglicher pH-Wert 2 bis 9

Inkubationstemperatur 15 bis 35 ° C

Inkubationsperiode 2 bis 20 Tage

Im Falle einer submersen Kultur muss das Medium unter Rühren bei 30 bis 500 Umdrehungen pro Minute mit 0,1 bis 2,0 L/L/Min belüftet werden.

Das in festem oder flüssigem Kulturmedium gewachsene Mycel wird in üblicher Weise gesammelt und dann als Ausgangsmaterial für die vorliegende Erfindung verwendet.

So kann man beispielsweise im Fall einer flüssigen Kultur das Mycel dadurch sammeln, dass man das entstandene flüssige Kulturmedium einem üblichen Trennvorgang, z.B. einer Zentrifugierung, einem Filtriervorgang usw., unterwirft. Das auf diese Weise erhaltene Filtrat wird als filtrierte Brühe bezeichnet, welche man ebenfalls als Ausgangsmaterial für die vorliegende Erfindung verwenden kann.

Hierauf wird der in der obigen Weise gesammelte Fruchtkörper und/oder das so gesammelte Mycélium mit einem wässrigen Lösungsmittel extrahiert. Dabei kann man den Fruchtkörper und/oder das Mycel als solche direkt extrahieren. Gewünschtenfalls kann man den Fruchtkörper und/ oder das Mycel vor dem Extrahieren einer Vorbehandlung unterziehen, z.B. durch Waschen mit Wasser, Lufttrocknung, Verkleinern und Pulverisieren oder Extrahieren mit einem nichtpolaren Lösungsmittel.

Das für die Extraktion zu verwendende, wässrige Lösungsmittel besteht aus Wasser oder einer Mischung von Wasser und mindestens einem wasserlöslichen Material, wie z.B. einer Säure, Base, einem Salz oder einem organischen Lösungsmittel.

Bei der Durchführung der Extraktion wird der vorbehandelte oder nicht vorbehandelte Fruchtkörper bzw. das Mycel mit dem wässrigen Lösungsmittel vermischt. Die Temperatur des Lösungsmittels ist nicht von besonderer Bedeutung, sollte aber unterhalb 120°C gehalten werden. Bevorzugte Temperaturbereiche liegen indessen zwischen 50 °C und 100°C. Die anzuwendende Temperatur wird den wirtschaftlichen Gegebenheiten angepasst werden. Die Extraktion erfolgt während genügend langer Zeit, um die gewünschte Extraktion zu bewirken. Im allgemeinen wird die Extraktionsdauer bei höherer Temperatur kürzer sein. Innerhalb des oben erwähnten bevorzugten Temperaturbereiches erfolgt die Extraktion vorzugsweise innerhalb von 30 Minuten bis 10 Stunden. Die Extraktion erfolgt vorzugsweise durch Schütteln in einem Behälter, welcher aus Glas oder aus mit Glas ausgefüttertem, emailliertem oder rostfreiem Stahl besteht. Die verwendete Menge kann ebenfalls innerhalb eines weiten Bereiches schwanken, liegt aber im allgemeinen bei der 10 bis lOOfachen Gewichtsmenge (bezogen auf Trockenbasis) des Fruchtkörpers und/oder des Mycels. Für die Extraktion verwendet man vorzugsweise einen pulverisierten Fruchtkörper bzw. pulverisiertes Mycel. Nach der Extraktion werden das Mycel bzw. der Fruchtkörper und andere feste Bestandteile in bekannter Weise, beispielsweise durch Filtrieren oder Zentri-fugieren, aus dem wässrigen Extrakt beseitigt. Der wässrige Extrakt wird hierauf beispielsweise durch Vakuumverdampfen oder dergleichen eingeengt, und zwar im allgemeinen auf ein Drittel bis ein Zehntel des ursprünglichen Volumens.

Der in dieser Weise erhaltene Extrakt wird hierauf in der weiter unten beschriebenen Weise gereinigt, wobei das gewünschte Polysaccharid ausgefällt und gewonnen werden kann. Die in der vorliegenden Beschreibung verwendete Bezeichnung «wässriger Extrakt» bedeutet ein Filtrat oder ein Zentrifugat, welches man nach dem Entfernen des Mycels und/oder des Fruchtkörpers und anderer fester Materialien aus dem Extrakt erhalten hat.

Die filtrierte Brühe lässt sich vorzugsweise als solche für den nachstehend beschriebenen Reinigungsvorgang verwenden, wobei man die Ausfällung und Gewinnung des beabsichtigten Polysaccharids erzielt. Die in der vorliegenden Beschreibung verwendete Bezeichnung «filtrierte Brühe bzw. Filtrierbrühe» bedeutet ein Filtrat, welches die Wirksubstanz, d.h. das Polysaccharid, enthält und durch Entfernen des Mycels und der anderen festen Bestandteile aus der Kulturbrühe, d.h. dem Züchtungsmedium, erhalten wird, in welchem der Stamm in einem flüssigen Züchtungsmedium in der oben beschriebenen Weise inkubiert worden ist. Die Filtrierbrühe wird beispielsweise durch Verdampfen im Vakuum oder dergleichen eingeengt und kann dann weiter behandelt werden. Im allgemeinen wird man die filtrierte Brühe auf ein Drittel bis ein Zehntel des ursprünglichen Volumens einengen. Die so eingeengte, filtrierte Brühe wird hierauf gereinigt.

Der wässrige Extrakt und die filtrierte Brühe können getrennt voneinander gereinigt werden. Man kann aber den wässrigen Extrakt und die Filtrierbrühe miteinander vereinigen und dann diese Mischung reinigen.

Die Reinigung kann nach einer der folgenden Methoden geschehen.

A. Ausfällung der gewünschten Substanz durch Zugabe eines hochpolaren organischen Lösungsmittels, wie z.B.

einem niederen Alkohol oder Keton, z.B. Methanol, Äthanol, Propanol, Butanol oder Aceton usw., oder durch Aussalzen durch Zugabe von wasserlöslichen anorganischen Salzen, wie z.B. Ammoniumsulfat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid usw.

B. Entfernen von Säuren, Ionen und niedermolekularen Substanzen durch Dialyse, Gelfiltrierung unter Verwendung von Dextran oder Polyacrylamidgel, wie z.B. Sephadex, Biogel usw., Ionenaustauschharzbehandlung unter Verwendung von beispielsweise verschiedenen, handelsüblichen Anionen-und Kationenaustauschharzen, wie Amberlite, Dowex, Duo-lite usw., Ultrafiltrierung oder eine Kombination davon, um auf diese Weise eine im wesentlichen reine Lösung zu erhalten, aus welcher die gewünschte Wirksubstanz gewonnen wird.

C. Behandlung zwecks Entfernung freier Proteine, beispielsweise nach der Sevag-Methode, Trifluortrichlormethan-methode, Protease-Behandlung usw.

Die vorgenannten drei Methoden sind bestens bekannt. Gewünschtenfalls kann man zwei oder mehrere davon kombinieren. Im allgemeinen wird der flüssige Extrakt bzw. die Filtrierbrühe nach dem Einengen einer Ionenaustauschharzbehandlung, Dialyse, Gelfiltrierung, Ultrafiltrierung oder einer Kombination dieser Massnahmen unterworfen, um eine Entfärbung, Entsäuerung und Entfernung der niedermolekularen Substanzen zu bewirken. Aus einer derart gereinigten Lösung kann man die gewünschte Wirksubstanz durch geeignete Massnahmen, beispielsweise durch Gefriertrocknung, gewinnen. Gewünschtenfalls kann man die obenerwähnte(n) Massnahme^) wiederholen, um das erwünschte Ausmass an Reinigung zu erzielen.

Die so erhaltene Substanz besitzt die folgenden Eigenschaften:

1. Die Substanz ist ein weisses oder gräulichweisses Pulver und nicht dialysierbar.

2. Molischreaktion und Anthronreaktion sind positiv

3. Jodreaktion, Elson-Morgan-Reaktion und Biuret-Reak-tion sind negativ.

4. Ninhydrin-Reaktion ist schwach positiv oder negativ.

5. Die Substanz ist in Wasser und in einer wässrigen Lösung einer Substanz, welche in Wasser löslich ist, z.B.

einem organischen Lösungsmittel, einer Säure, einem basischen Salz und dergleichen, löslich, hingegen in einem organischen Lösungsmittel, z.B. Petroläther, Äthyläther, Benzol, Aceton, Äthanol, Methanol usw., unlöslich.

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6. Diese Substanz besitzt keinen scharfen Schmelzpunkt und verkohlt bei starkem Erhitzen.

7. Das durch Auflösen der Substanz in wässriger 0,1-n-Schwefelsäure und Erhitzen der 0,5 Gew.-% dieser Substanz enthaltenden Lösung während 5 Stunden auf 100°C erhaltene Hydrolysat enthält mindestens eine der folgenden Substanzen: Galactose, Glucose, Mannose, Fucose und Xylose, wobei je nach Reinigungsart und Reinigungsausmass verschiedene Zuckerarten anfallen können.

Aufgrund der obigen Eigenschaften kann diese Substanz als ein hochmolekulares Polysaccharid betrachtet werden, welches sich aus einem der obengenannten Zucker zusammensetzt und ein Molekulargewicht von 8000 oder mehr aufweist.

Bezüglich der unter 2., 3. und 4. vorstehend erwähnten Reaktionen, siehe:

- H.R. Christen, Grundlagen der organischen Chemie, Verlag Sauerländer, Aarau (Schweiz) 1970, Seite 268/Ninhy-drin;

- L.F. Fieser und M. Fieser, Organic Chemistry, D.C. Heath and Co., Boston 1950, 2. Auflage, Seiten 437 und 460/Ninhydrin bzw. Biuret;

- G.A. Hill und L. Kelly, Organic Chemistry, The Blaki-ston Co., Philadelphia, Toronto 1945, Seiten 316,458,459, 480/Biuret, Ninhydrin, Molisch ;

- E. Stahl, Dünnschichtchromatographie, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York 1967, Seiten 147, 312, 824, 834/Jodreaktion, Elson-Morgan;

- The Merck Index, Merck and Co. Inc., Rahway (NJ, USA) 1960, Seiten 86 und 721/Anthron bzw. Ninhydrin.

Anthron reagiert mit Glucose und ähnlichen Zuckern, bzw. mit Hydroxymethyl-furfural, und bildet dabei Farbstoffe der Formel:

CH

0

2-Desoxyzucker hingegen reagieren nicht [Pharm. Week-blad 88 (1953), 144].

Das erfindungsgemäss erhältliche Polysaccharid besitzt keine antimikrobielle Aktivität gegen Bakterien, Fungi und Hefen, wie z.B. Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Aspergillus niger, Candida albicans, usw. Somit ist diese Substanz grundverschieden von den antibakteriellen, krebsverhindernden Mitteln, wie sie aus den der Gattung Actinomycetes angehörenden Arten erhalten werden.

Das Polysaccharid zeigt keine Cytotoxizität und auch keine Nebenwirkungen, wie sie üblicherweise mit den bekannten Mitteln in Kauf genommen werden müssen, wie z.B. eine Abnahme der Zahl der Leukozyten, eine Anämie der Leber und anderer Organe, eine Atrophie der Milz, Körperverlust und Appetitlosigkeit. Die akute Toxizität (LDso) der Polysaccharide bei der Maus liegt bei intraperitonealer Injektion über 2500 mg/kg.

Die erfindungsgemäss erhältlichen Polysaccharide besitzen eine antikarzinogene Wirkung. Diese antikarzinogene Aktivität wird durch den folgenden Test bestätigt.

Eine Maus vom IRC-JCL-Stamm mit einem Gewicht von 20 + 2 g wurde intraperitoneal mit festen Sarcoma-180-Krebszellen oder Ehrlich-Krebszellen inoculiert. Nach Ablauf einer Woche wurde eine ausreichende Zunahme der Ascitesflüssig-

keit bei der Maus beobachtet. Die vorhandenen Krebszellen wurden subkutan in die Achselhöhlen anderer Mäuse in einer Menge von 4000000 Zellen pro Maus transplantiert. Diese Mäuse wurden hierauf in verschiedene Gruppen aufgeteilt, wobei jede Gruppe aus acht Einzeltieren bestand. Der ersten Gruppe, nämlich der Kontrollgruppe, wurde lediglich Kochsalz verabreicht, während allen übrigen Tieren das Polysaccharid verabreicht wurde. Die erste Verabreichung der Kochsalzlösung oder des Polysaccharids erfolgte nach Ablauf von einem Tag nach der Transplantation, u.zw. intraperitoneal, während die nachfolgenden Verabreichungen in Abständen von jeweils einem Tag neunmal wiederholt wurden. Das in die Mäuse transplantierte feste Krebsgeschwür wurde beobachtet und 1 Tag nach der letzten Verabreichung, d.h. am zehnten Tag, wurde die durchschnittliche Körpergewichtszunahme gemessen. Dann wurden die Tiere seziert, um die Nebenwirkungen wahrzunehmen und das Tumorgewicht aus den Kontrolltieren und aus den mit Polysaccharid behandelten Tieren festzustellen. Die in den folgenden Tabellen wiedergegebene «Inhibitionsrate (IR)» wurde nach der folgenden Gleichung berechnet:

IR(%) = (C - T)/C x 100

worin C ein durchschnittliches Gewicht der Tumore, welche aus jedem Tier der Kontrollgruppe entnommen wurde, und T das durchschnittliche Gewicht der Tumore, welche aus den mit Polysaccharid behandelten Mäusen entfernt worden war, bedeuten.

Dabei zeigte sich, dass die Polysaccharide eine starke antikarzinogene Aktivität gegen sowohl Sarcom-180-Krebs als auch Ehrlich-Karzinom besass.

Die Erfindung sei durch die folgenden Beispiele unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen erläutert, wobei die Fig. 1 und 2 die Infrarotspektren der Polysaccharide wiedergeben.

Beispiel 1

Ein Stamm (FERM-P 4641, ATCC 20544) von Polyporus tuberaster (Fr.) wurde im folgenden flüssigen Kulturmedium inkubiert:

Glucose 30 g

Polypepton 5 g

Hefeextrakt (Difco) 1 g primäres Kaliumphosphat 1 g

Magnesiumsulfat (7 H2O) 0,5 g

Wasser 1 Liter anfängliches pH 5,6-5,8

(ohne Einstellung)

Die Inkubation erfolgte dadurch, dass man 100 ml des obigen Züchtungsmediums jeweils einem 500-ml-Erlenmeyer-kolben hinzugab. Die Kolben wurden mit Baumwolle verstopft und während 30 Minuten bei 120°C sterilisiert. Nach dem Kühlen wurde in üblicher Weise mit dem besagten Stamm inokuliert, welcher getrennt in einem Schrägkulturmedium, welches 2% Glucose, 0,5% Ebios und 1,5% Agar enthielt, gezüchtet worden war. Nach 7tägigem Schütteln bei 27 °C wurden die Kolbeninhalte für die nachträgliche Inkubation verwendet. 201 des in obiger Weise beschriebenen, flüssigen Kulturmediums wurden in einem 30 1 stahlfreien Fermentierbehälter während 30 Minuten bei 120°C sterilisiert und dann gekühlt. Hierauf wurde der oben erwähnte Kolbeninhalt dem Kulturmedium im besagten Fermentierbehälter zugegeben. Das Medium wurde unter Rühren (250 Umdrehungen pro Minute) während 3 Tagen bei 27 °C einer aeroben Inkubation unterworfen, wobei man mit 0,5 Liter/Liter/Min.

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belüftete. Die so erhaltene Kulturbrühe wurde filtriert, wobei man 3000 g feuchtes Mycélium und 17 1 filtrierte Brühe erhielt. Das Mycélium wurde mit 1 Liter Wasser gewaschen und die Waschflüssigkeit der Filtrierbrühe hinzugegeben. Das gewaschene Mycel wurde mit 6 Liter Wasser vermischt und 5 die Mischung während 30 Minuten in einem geschlossenen Behälter auf 120°C erhitzt. Hierauf wurde das Gemisch auf Zimmertemperatur abkühlen gelassen und anschliessend filtriert und das Filtrat (flüssiger Extrakt) auf ein Volumen von 1 Liter eingeengt. Der eingeengte, flüssige Extrakt wurde mit 10 Wasser dialysiert und hierauf unter Gefrieren getrocknet,

wobei man 12,08 g einer gräulichweissen, pulverigen Substanz erhielt. Das Infrarotspektrum dieser Substanz (als KBr-Tablette) findet sich in Fig. 1.

18 Liter der Filtrierbrühe wurden auf ein Volumen von 2 Liter eingeengt und mit Wasser dialysiert und tiefgefroren, wobei man 23,60 g einer schwachbräunlichen, pulverigen Substanz erhielt.

Bei der Hydrolyse in der oben beschriebenen Weise zeigte sich, dass jedes dieser Polysaccharide aus Galactose, Glucose, Mannose, Fucose und Xylose bestand.

Die antikarzinogenen Wirkungen dieser Polysaccharid-Substanzen finden sich in den folgenden Tabellen 1 und 2.

Tabelle 1

Substanz aus dem Mycélium Substanz aus der Filtrierbrühe

Dosis Art der Vollständige IR Dosis Art der Vollständige IR

mg/kg/Tag Verabreichung Regression % mg/kg/Tag Verabreichung Regression %

5 ip 0/8 63,8

25 ip 6/8 94,8

125 ip 5/8 92,8

5 ip 0/8 61,9

25 ip 5/8 91,8

125 ip 5/8 89,0

Krebszellen: Sarcoma-180 4x 106 Zellen/Maus.

Tierstamm: ICR-ICL 20 g ± 2 g.

Behandlung: Nach Ablauf von 1 Tag nach der Transplantation intraperitoneal verabreicht (Kontrollversuch: Kochsalzlösung) 10 Mal.

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Bestimmung: Das Gewicht des Tumors vom festen Typus. Inhibitionsrate (IR) = (C - T) / C x 100. C: durchschnittliches Gewicht der aus der Kontrollgruppe entfernten Tumore.

T: durchschnittliches Gewicht der aus den mit Polysaccharid behandelten Mäusen entfernten Tumore.

Tabelle 2

Substanz aus dem Mycélium Substanz aus der Filtrierbrühe

Dosis Art der Vollständige IR Dosis Art der Vollständige IR

mg/kg/Tag Verabreichung Regression % mg/kg/Tag Verabreichung Regression %

5 25 125

IP ip ip

1/8 7/8 5/8

69,9 92,5 88,5

5 25 125

iP ip ip

1/8 7/8 5/8

67,3 92,3 87,2

Krebszelle: Ehrlich-Carcinom 4 x 106 Zellen/Maus. Stamm der Tiere, Behandlung und Bestimmung erfolgte wie in der Tabelle 1.

Beispiel 2

Ein Gemisch von 200 g Holzmehl, 100 g Reiskleie und 300 ml Wasser wurde gründlich miteinander vermischt, um ein Züchtungsmedium zu bilden, das dann in einen zylindrischen Behälter von Î5 cm Durchmesser und 20 cm Höhe, der aus einem synthetischen Harz bestand, eingetragen wurde. Das Züchtungsmedium wurde während 60 Minuten bei 120°C sterilisiert und dann auf Zimmertemperatur abkühlen gelassen. Der Stamm FERM-P 4641, ATCC 20544, welcher getrennt davon in einem Schrägkulturmedium in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 gezüchtet worden war, wurde auf das nach den obigen Angaben erhaltene Kulturmedium bei 26 °C während 1 Monat inkubiert, um ein ausreichendes Wachsen des Mycels zu erlauben. Hierauf wurde das Kulturmedium in Erde eingebettet und während 2 Monaten darin stehen gelassen. Dabei wuchs der Fruchtkörper des Stammes in der Erde. Die Ausbeute an Fruchtkörper lag pro Behälter bei ungefähr 180 g.

Der so erhaltene Fruchtkörper wurde gesammelt, an der Luft getrocknet und pulverisiert. Dann wurden 100 g des so erhaltenen pulverigen Fruchtkörpers mit 3 1 Wasser gemischt und das Gemisch während 3 Stunden zum Sieden erhitzt. Hierauf wurde das Gemisch filtriert, wobei man einen feuch-

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ten Filterkuchen und ein Filtrat (flüssiger Extrakt) erhielt. Der feuchte Filterkuchen wurde erneut mit 3 1 Wasser versetzt, während 3 Stunden zum Sieden erhitzt und hierauf abfiltriert, wobei man ein Filtrat (flüssiger Extrakt) erhielt, so Beide Extrakte wurden miteinander vereinigt und auf ein Volumen von 1 Liter eingeengt. Der konzentrierte Extrakt wurde mit Wasser dialysiert und hierauf gefriergetrocknet, wobei man 5,40 g einer gräulichweissen, pulverigen Substanz (Polysaccharid) erhielt, welche sich aus Galactose, Glucose, ss Mannose, Fucose und Xylose zusammensetzte. Die antikarzinogene Wirkung dieser Substanz in bezug auf festes Sarcoma 180 betrug 95,5% (Dosis 25 mg/kg/Tag) und die vollständige Regression lag bei 7/8.

60 Beispiel 3

Der Stamm FERM-P 4641, ATCC 20544 wurde in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 in einem Fermentierbehälter inkubiert. Hierauf wurden 11 Liter der Filtrierbrühe in der gleichen Weise, wie sie oben beschrieben worden ist, berei-65 nigt. Die filtrierte Brühe wurde durch Vakuumverdampfen auf ein Volumen von 1,5 Liter eingeengt und das Konzentrat während 24 Stunden in fliessendem Wasser dialysiert. 1,6 Liter des Dialysats wurden durch Zugabe einer wässrigen

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Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und dann mit DEAE Sephadex behandelt. Ein Teil der durch DEAE Sephadex geführten Flüssigkeit wurde durch Tiefkühlung getrocknet, wobei man ein Polysaccharidpulver (als Probe A-l bezeichnet) erhielt, welches gräulichweiss aus- 5 sah und aus Galactose, Glucose, Mannose, Fucose und Xylose bestand. Der Rest der besagten Flüssigkeit, nämlich 1,5 Liter, wurde mit 0,5 Liter Äthanol versetzt, wobei ein Niederschlag eintrat, welcher in 1 Liter Wasser gelöst wurde. Die so erhaltene Lösung wurde in fliessendem Wasser während 24 io Stunden dialysiert. Das Dialysat wurde mittels Salzsäure auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt und dann einer SP-Sepha-dex-Behandlung unterworfen. Die durch das SP-Sephadex geflossene Flüssigkeit wurde mit Äthanol versetzt, um eine 25%ige Alkoholkonzentration zu erhalten. Dabei erhielt man 15 einen Niederschlag, welcher in 1 Liter Wasser gelöst und erneut in fliessendem Wasser während 24 Stunden dialysiert wurde. Das Dialysat wurde durch Tiefkühlung getrocknet, wobei man 3,0 g einer festen Substanz (Polysaccharid) erhielt, welche in 1 Liter einer 0,3 molare Essigsäure und 0,3 molares 20 Natriumchlorid enthaltenden Lösung gegeben wurden; es bildete sich dabei ein Niederschlag. Das Gemisch wurde zentri-fugiert, wobei man eine feste Substanz und ein Filtrat erhielt. Das Filtrat wurde dialysiert und das Dialysat gefriergetrocknet, wobei man 0,18 g eines säurelöslichen Polysaccharidpul-vers (als Probe A-3 nachstehend bezeichnet) erhielt, welches eine schwach gräulichweisse Farbe aufwies und sich als Mannose, Fucose, Xylose und Galactose zusammensetzte.

Die beim Zentrifugieren erhaltene, feste Substanz wurde in 1 Liter Wasser gelöst und in fliessendem Wasser während 24 Stunden dialysiert. Das Dialysat wurde zentrifugiert,

wobei man ein Filtrat und einen festen Niederschlag erhielt. Das Filtrat wurde gefriergetrocknet, wobei man 1,27 g eines Polysaccharidpulvers (nachstehend als Probe A-4 bezeichnet) erhielt, welches schwach gräulichweiss aussieht und aus Glucose bestand. Der feste Niederschlag wurde gleichfalls gefriergetrocknet, wobei man ein in Alkali lösliches Polysaccharidpulver (nachstehend als Probe A-5 bezeichnet) erhielt, welches eine schwach gräulichweisse Farbe aufwies und sich aus Glucose, Mannose und Xylose zusammensetzte.

Das Infrarotspektrum der Probe A-4 findet sich in Fig. 2.

Die antikarzinogene Wirkung dieser Proben bei Mäusen war die folgende:

Antikarzinogene Wirkung bei der Maus (Sarcoma-180)

Krebszellen: Sarcoma-180 4x 106 Zellen/Maus.

Tierstamm: ICR-JCL 20 g ± 2 g.

Behandlung: Nach Ablauf von 1 Tag nach der Transplantation intraperitoneal verabreicht (Kontrollprobe: Kochsalzlösung 7 Mal).

Bestimmung: Gewicht des Tumors von fester Beschaffenheit.

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IR (Inhibitionsrate).

IR = (C - T/C x 100.

C: durchschnittliches Gewicht der aus der Kontrollgruppe entfernten Tumore.

T: durchschnittliches Gewicht der aus einer mit Polysaccharid behandelten Gruppe entfernten Tumore.

Pro

Dosis

Art der

Vollstän

Durchschnitt Blind-

IR

be mg/kg/

Verab dige

± Standard probe

%

Tag reichung

Repression

Dev.

A-l

5

ÎP

3/8

0,41+0,42

2,29 ±

1,0482,1

50

ÌP

4/8

0,28 + 0,15

do.

87,8

A-3

2

ÌP

2/8

0,52 + 0,25

do.

77,3

20

ÌP

3/8

0,41+0,27

do.

82,1

A-4

5

ip

6/8

0,20 + 0,19

do.

91,3

50

ÌP

1/8

0,54 + 0,32

do.

76,4

A-5

5

ÌP

4/8

0,27 + 0,21

do.

88,2

50

ÌP

3/8

0,40 + 0,38

do.

82,5

Antikarzinogene Aktivität bei der Maus (Ehrlichcarcinom) Krebszellen: Ehrlichcarcinom 4 x 106 Zellen/Maus Tierstamm: ICR-JCL 20 g ± 2 g

Behandlung: Nach Ablauf von 1 Tag nach der Transplantation intraperitoneal verabreicht (Kontrollversuch mit Kochsalzlösung) 7 Mal

Bestimmung: Gewicht des Tumors von fester Beschaffenheit

IR (Inhibitionsverhältnis) = (C — T) / C x 100 C: durchschnittliches Gewicht der aus der Kontrollgruppe beseitigten Tumore

T: durchschnittliches Gewicht der aus der mit Polysaccharid behandelten Gruppe entfernten Tumore

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Pro

Dosis

Art der

Kom

Durchschnitt Blindver- IR

be mg/kg/

Verab plette

+ Standard such %

Tag reichung

Regression

Dev.

A-3

0,169

ÌP

2/8

0,69 + 0,64

1,74 ±0,93 60,3

1,690

ÌP

5/8

0,30 + 0,28

do. 82,8

16,90

ÌP

3/8

0,51+0,46

do. 70,7

A-4

0,2

ÌP

1/8

0,93 + 0,65

do. 46,6

2,0

ÌP

5/8

0,20 ±0,19

do. 88,5

20,0

ÌP

7/8

0,13 + 0,17

do. 92,5

A-5

0,2

ÌP

0/8

1,09 ±0,67

do. 37,4

2,0

ÌP

6/8

0,21 ±0,10

do. 87,9

20,0

ÌP

4/8

0,21+0,11

do. 87,9

2 Blatt Zeichnungen

Claims

642 681

1. Verfahren zur Herstellung von eine antikarzinogene Wirkung ausübenden Polysacchariden, dadurch gekennzeichnet, dass man aus einem wässrigen Extrakt eines Fruchtkörpers und/oder eines Mycels eines Stammes, der ein antikarzinogenes Polysaccharid zu erzeugen vermag und zur Gattung Polyporus aus der Klasse der Basidiomycetes gehört, oder aus der filtrierten Brühe eines flüssigen Kulturmediums, in dem der besagte Stamm inkubiert worden ist, das Polysaccharid isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Stamm der Art Polyporus tuberaster angehört.

2

PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Stamm Polyporus tuberaster Fr. FERM-P 4641, ATCC 20544 ist.

4. Nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1 hergestellte Polysaccharide mit antikarzinogener Wirkung, dadurch gekennzeichnet, dass sie bei der Molisch- und Anthronreak-tion positiv, bei der Jod-, Elson-Morgan- und Biuret-Reak-tion negativ und bei der Ninhydrin-Reaktion schwach positiv oder negativ reagieren, dass ihr Hydrolysat mindestens eines der Kohlenhydrate Galactose, Glucose, Mannose, Fucose und Xylose enthält und dass ihr Molekulargewicht 8000 oder mehr beträgt.