DE2737944C2 - Verfahren zur Herstellung von Maltopentaose und Maltohexaose - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von Maltopentaose und MaltohexaoseInfo
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Description
40 fahrens wird der von der Anmelderin isolierte und als Stamm Streptomyces myxogenes SF-1130 bezeichnete
und bei der American Type Culture Collection USA mit der Hinterlegungsnummer ATCC 31305 hinterlegte
Stamm verwendet
Weiterhin wurde gefunden, daß Maltopentaose und Maltohexaose welche selbst keine antimikrobiell invitro-Aktivität
besitzen, einen günstigen Einfluß zur Erhöhung der Abwehraktivität des Wirtes gegenüber Infektionen
oder den ergänzenden Effekt der Potenzierung der Immunität und der antibakteriellen Aktivität der neuen
Antibiotika, der Substanzen SF-1130 Xi und X2, besitzt,
die in der gleichzeitig hinterlegten, deutschen Patentanmeldung der Anmelderin (siehe DE-OS 2737943)
beschrieben sind.
Der Stamm SF-1130 besitzt die folgenden, mikrobiologischen Eigenschaften:
1. Morphologische Beobachtung
Substratmycelien wachsen gut auf verschiedenen Kulturmedien, während die Bildung von Luftmycelen im
allgemeinen schlecht ist. Auf Stärkeagar und auf Stärke-Hefe-Extrakt-agar, wo sich Luftmycele entwickeln,
werden kurze, dichte Luftmycele aus dem Substratmycei gebildet. Die Mycele bilden einfiißige Verzweigungen,
wobei keine quirlständigen Verzweigungen beobachtet werden.
Die Luftmycele tragen an ihren Spitzen Spiralen, die meisten hiervon sind vom kompakten, geschlossenen Typ
und einige hiervon sind vom nicht-vollständigen oder offenen Typ. Es wird keine Bildung von Sklerotium beobachtet.
Die Beobachtung im Elektronenmikroskop zeigt, daß die Oberflächenstruktur der Sporen glatt ist. Die Sporen
sind von elliptischer oder zylindrischer Gestalt und besitzen eine Größe von 0,6-0,7 X 0,9-1,0 Mikron.
2. Kulturmerkmale auf verschiedenen Kulturmedien sind in der folgenden Tabelle I zusammengestellt.
Die Erfindung betrifft das im Patentanspruch angegebene Verfahren zur Herstellung von Maltopentaose und
Maltohexaose.
Bekannte Verfahren zur Herstellung von Maltopentaose und Maltohexaose umfassen die Isolierung aus
einem Maissirup (R. L. Wistler et al., J. Am. Chem. Soc. 77 [1951], S. 5761) oder die Säurehydrolyse von Stärke (W. J.
Whelan et al., J. Chem. Soc. [1953], S. 1293) oder die Behandlung von Stärke mit einer Amylase, weiche aus
Fermentationsbrühen von Bakterien oder Pilzen oder aus Verdauungssäften von Tieren isoliert wurde, (Kainuma et
al., FEBS Letters, 26 [1972]. S. 281). Diese Arbeitsweisen besitzen einige Nachteile hinsichtlich der geringen Ausbeute
von Maltopentaose und Maltohexaose oder hinsichtlich des mühseligen Arbeitsvorganges zur Isolierung
der zu verwendenden Amylase und daher sind sie auf die Produktion von Maltopentaose und Maltohexaose im
technischen Maßstab weniger anwendbar.
Aufgabe der Erfindung ist die Gestaltung eines technisch und wirtschaftlich vorteilhaften Verfahrens zur Herstellung
von Maltopentaose und Maltohexaose. Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß diese Substanzen
direkt aus der Fermentationsbrühe isoliert werden können, in welcher ein bestimmter Stamm der Gattung
Streptomyces aerob gezüchtet wurde.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Ver-
3. Physiologische Eigenschaften
Verflüssigung von Gelatine positiv
Hydrolyse von Stärke positiv
Bildung von Tyrosinase positiv
Bildung von Schwefelwasserstoff positiv
Farbgebungsvermögen positiv
Abbau von Cellulose negativ
Reduktion von Nitrat negativ
Peptonisierung von Magermilch negativ
Koagulation von Magermilch negativ Auflösung von koaguliertem Löffler-Serum negativ
Zusätzlich zu den oben genannten, physiologischen Eigenschaften bildet der Stamm SF-1130 auf Agarmedium
und in einem flüssigen Medium Schleim, wobei dies ein wesentliches Merkmal des betreffenden Stammes ist.
Auf einem Agarmedium wie einem Stärke-Hefeextrakt-agar, Stärke-agar oder Glucose-Asparagin-agarmedium
wurde beeobachtet, daß der Schleim massiv auf der Kolonie in etwa 10 Tagen nach der Inkubation gebildet
wird. Weiterhin wurde beobachtet, daß bei der Schüttelkultivierung des Stammes SF-1130 in einem flüssigen
Medium, welches geeignete Kohlenstoffquellen (Glucose, Stärke usw.) und Stickstofiquellen (Hefeextrakt, Sojabohnenmehl,
Weizenkeime usw.) enthält, die Kulturbrühe allmählich viskos unter Bildung eines Schleimes wird.
|i Kulturmedium
Wachstum Luftmycel
lösliches Pigment
Saccharose-Nilrat-agar
Giucose-Asparagin-agar
Giucose-Asparagin-agar
Glyzerin- Asparagin-agar
Calciumma'ut-agar
Calciumma'ut-agar
Glycerin-Calcium-
malat-agar
Stärkeagar (anorganische
Salze/Stärkeagar)
Hafermehlagar
Nähragar
Nähragar
Stärke-Hefeextrakt-agar
Hefeextrakt-Malzextrakt-
agar
Tyrosinagar
Kartoffelstück
Karottenstück
Gelatine (200C)
Magermilch (37°C)
Magermilch (37°C)
koaguliertes Löffler-Serum (37° C)
Ei (37° C)
Ei (37° C)
Czapek's-Glucoselösung
Cellulose
Cellulose
schlechtes Wachstum,
farblos
braun bis gräulich-braun,
die Rückseite ist matt in
roter Farbe gefärbt
braun
dünnes Wachstum,
biaß-braun
braun
blaß-braun bis braun
gut, blaß-bra"\n
gutes Wachstum mit Falten, braun auf der Rückseite
blaß-braun bis braun gut, rötlich-braun
dunkelbraun
hochstehendes Wachstum mit Falten, braun
gräulich-braunes Wachstum mit Falten cremefarbig Wachstum am Boden,
blaß-braun dunkelgrau
dunkelbrau bis dunkelbraun
Wachstum am Boden, cremefarbig kein Wachstum gering, weiß
keines
keines
keines
keines
keines
keines
pulverförmig, gräulichbraurt, Entwicklung hauptsächlich
an der Peripherie
der Kolonie
grau
keines
der Kolonie
grau
keines
gräulich-braun bis grau
keines
keines
keines
keines
keines
keines
keines
keines
keines
keines
keines
keines
keines
keines
keines keines
keines keines
keines keines
keines braun
blaß-braun braun
schwärzlich-braun braun
blaß-braun
dunkelbraun bis schwarz keines
keines
graues Pigment an der Peripherie des Wachstums keines
Anmerkung: Die Inkubationstemperatur betrug 280C, falls kein anderer Wert angegeben ist.
4. Ausnutzung von Kohlenstoffquellen
(1) Ausgenutzt: Xylose, Glucose, Galactose, Maltose, Saccharose, Lactose, Raffinose, Dextrin, Stärke, Glyzerin,
Inosit, Natriumacetat, Natriumeitrat und Mannose.
(2) zweifelhaft: Arabinose, Fructose und Salicin.
(3) nicht ausgenutzt: Rhamnose, Inulin, Dulcit, Mannit,
Sorbit, Natriumsuccinat und Cellulose.
Die zuvor genannten, mikrobiologischen Eigenschaften des Stammes SF-1130 können wie folgt zusammengefaßt
werden:
(1) Das Luftmycel bildet geschlossene Spiralen an seiner Spitze und die Oberflächenstruktur der Sporen ist
glatt.
(2) Das Luftmycel, das gräulich-braun bis grau gefärbt ist, wird nur sehr gering gebildet.
(3) Das Wachstum auf synthetischen Kulturmedien ist braun bis gräulich-braun in seiner Färbung.
(4) Auf organischen Kulturmedien wird Farbgebungsvermögen (Chromogenität) beobachtet.
(5) Auf Agarmedium und in flüssigen Medien wird Schleim gebildet.
Im Hinblick auf die zuvor beschriebenen mikrobiologischen Eigenschaften können Streptomyces phaeoochromogenes,
Streptomyces purpureochromogenes und Streptomyces noboritoensis als bekannte, mit dem Stamm
SF-1130 verwandte Stämme genannt werden. Jedoch gehörte der Stamm SF-1130 nicht zu einem dieser bekannten
Stämme, wie im folgenden gezeigt wird.:
Streptomyces phaeochromogenes erzeugt große Mengen an Luftmycel und bildet ein braunes, lösliches
Pigment auf Czapek-Saccharoseagar und Caiciummalatagar als Kulturmedien, während der Stamm SF-1130 nur
eine geringe Bildung von Luftmycel und keine Bildung von löslichem Pigment auf diesen Kulturmedien zeigt.
Obwohl Streptomyces purpureochromogenes orange bis rötlich-orange gefärbtes Wachstum auf Kartofielscheibenmedium
zeigt, bildet dieser Stamm keinen Schwefelwasserstoff und bewirkt die Koagulierung von
Magermilch, während der Stamm SF-1130 auf dem gleichen Medium ein braunes Wachstum zeigt und die
Bildung von Schwefelwasserstoff jedoch keine Koagulierung
von Magermilch hervorruft.
Streptomyces noboritoensis bildet keine Spiralen und erzeugt ein grünes, lösliches Pigment auf Stärkeagarmedium
(die Bildung des grünen, löslichen Pigmentes ist nicht in den früheren Dokumenten erwähnt, jedoch wird
sie tatsächlich für diesen Typ von Stamm in nennenswerter Weise beobachtet), während der Stamm SF-1130
Spiralen bildet, jedoch kein lösliches Pigment auf Stärkesynthetischem Agar bildet. Darüber hinaus unterscheidet
sich der Stamm SF-1130 von Streptomyces noboritoensis auch in der Ausnutzung bzw. Annahme von Mannit und
Saccharose.
Daher unterscheidet sich der Stamm SF-1130 deutlich von jedem der bekannten, verwandten Arten der Gattung
Streptomyces. Der Stamm SF-1130 unterscheidet sich weiterhin von irgendwelchen anderen bekannten Specien
von Streptomyces dadurch, daß der Stamm SF-1130 die besondere Eigenschaft der Bildung von Schleim, wie
bereits zuvor beschrieben, zeigt, während die anderen Specien von Streptomyces keinen Schleim entsprechend
den früheren Veröffentlichungen bilden.
Hieraus ergibt sich, daß der Stamm SF-1130 als neue Specie der Gattung Streptomyces identifiziert wurde,
wubei er als »Streptomyces myxogenes SF-1130« bezeichnet wurde.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann der eingesetzte Stamm in an sich bekannter Weise in einem Kulturmedium
gezüchtet werden, das Nährstoffquellen, die durch gewöhnliche Mikroorganismen assimilierbar sind,
enthält. Zu diesem Zweck kann jeder bekannte Nährstoff verwendet werden, der ganz allgemein bei der Kultivierung
von bekannten Stämmen von Streptomyces verwendet wurde. Beispiele von anwendbaren Nährstoffquellen
umfassen: Glucose, Stärke, Maltosesirup und Melassen als Kohlenstoffquellen und Sojabohnenmehl, Weizenkeime,
getrocknete Hefe, Pepton, Fleischextrakt, Maisquellwasser, Ammoniumsulfat und Natriumnitrat als
Stickstoffquellen. Gegebenenfalls können anorganische Salze wie Calciumcarbonat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid,
Phosphate und dergleichen zugesetzt werden. Zusätzlich können solche organischen und anorganischen
Materialien, welche das Wachstum des verwendeten Stammes unterstützen und die Bildung von Maltopentaose
und/oder Maltohexaose fördern, in das Kukturmedium eingegeben werden.
Als Züchtungsmethode, die gemäß der Erfindung angewandt
werden kann, ist die Flüssigkeitskultivierung, insbesondere unter aeroben Tauchbedingungen günstig, wie sie
im allgemeinen bei der Herstellung von Antibiotika angewandt wird. Die Kultivierung wird unter aeroben Bedingungen,
zweckmäßig bei einer Temperatur von 25 bis 38 °C und besonders gut bei einer Temperatur in der Nähe
von 28 0C durchgeführt. Unter diesen Umständen erreicht
die Bildung von Maltopentaose und/oder Maltohexaose in der Kulturbrühe ein Maximum nach einer Schüttelkultivierung
oder einer Tankkultivierung während einer Periode von 2 bis 5 Tagen.
Sowohl Maltopentaose als auch Maltohexaose, welche zur Kategorie der Oligosaccharide mit neutralen Eigenschaften,
wie im folgenden beschrieben, gehören, zeigen selbst keine antimikrobielle Aktivität in vitro, jedochbesitzen
sie die physikalisch-chemischen Merkmale, die im folgenden beschrieben werden. Unter Ausnützung dieser
physikalisch-chemischen Merkmale können diese Substanzen aus der Kulturbrühe, in welcher sie gebildet und
angesammelt wurden, gewonnen werden. Beispielsweise
können Maltopentaose und Maltohexaose, welche bei der Kultivierung des Stammes SF-1130 gebildet wurden, aus
der Kulturbrühe nach folgender Arbeitsweise gewonnen werden.: Die Kulturbrühe wird unter sauren Bedingungen
zur Entfernung der Mycele und der unlöslichen Anteile filtriert, und das Brühenfiltral wird bei pH = 3 durch eine
Säule eines stark sauren Ionenaustauscherharzes zur Abtrennung der in dem Brühenfiltrat aufgelösten,
basischen Substanzen durchgeschickt, anschließend wird es über eine Säule von Aktivkohle zur Absorption von
Maltopentaose und Maltohexaose auf der Aktivkohle durchgeschickt. Die Aktivkohlesäule wird dann mit
Wasser gewaschen und aufeinanderfolgend mit wäßrigen Lösungen eluiert, welche Äthanol in stufenweise ansteigenden
Konzentrationen von 10% bis 15%, 20 und 25% enthalten. Jedes der Eluate wird in Fraktionen aufgefangen
und einer Papierchromatographie unterzogen, wobei hier mit einem Lösungsmittel entwickeil wird, das aus
n-Butanol-Pyridin-Wasser-Essigsäure (6:4:3:1 im Volumen) besteht. Die Fraktionen, die einen einzigen Fleck bei
dem R-Wert für Rafiinose = 0,25 ergeben (berechnet unter
der Annahme, daß Raffinose einen Rf-Wert von 1,00 ergibt
und im folgenden als Raffinose-R-Wert bezeichnet), werden vereinigt und zur Trockne eingeengt, wobei Maltohexaose
in Form eines farblosen Pulvers erhalten wird. Die Fraktionen, die einen einzigen Fleck bei einem Raffinose-R-Wert
= 0,41 ergeben, werden ebenfalls miteinander vereinigt und zur Trockne eingeengt, wobei ein farbloses
Pulver von Maltopentaose erhalten wird.
Ähnliche Arbeitsweisen, bei denen die Papierchromatographie durch Säulenchromatographie auf Cellulose unter Anwendung eines Entwicklungslösungsmittels aus n-Butanol-Pyridin-Wasser-Essigsäure (6:4:3:1 im Volumen) verwendet wird, ermöglichen ebenfalls die Gewinnung der Maltopentaose und Maltohexaose aus der KuI-turbrühe. Gegebenenfalls können die so gewonnenen Substanzen weiter durch Auflösen in Wasser und Zugabe von Äthanol zur Wiederausfällung gereinigt werden.
Ähnliche Arbeitsweisen, bei denen die Papierchromatographie durch Säulenchromatographie auf Cellulose unter Anwendung eines Entwicklungslösungsmittels aus n-Butanol-Pyridin-Wasser-Essigsäure (6:4:3:1 im Volumen) verwendet wird, ermöglichen ebenfalls die Gewinnung der Maltopentaose und Maltohexaose aus der KuI-turbrühe. Gegebenenfalls können die so gewonnenen Substanzen weiter durch Auflösen in Wasser und Zugabe von Äthanol zur Wiederausfällung gereinigt werden.
Der Anteil von Maltopenlaose und Maltohexaose, welcher
durch Kultivieren des Stammes SF-1130 gebildet wurde, hängt von den Kulturbedingungen ab, obwohl ein
überwiegender Anteil von Maltopentaose im allgemeinen gebildet wird.
Wenn der Stamm SF-1130 entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren kultiviert wird, werden zusätzlieh
zu Maltopentaose und Maltohexaose noch die Substanzen SF-1130 -x, und -X2 (entweder nur eine oder
beide dieser Substanzen werden generisch als Substanz SF-1130-X bezeichnet) als neue Verbindungen ebenfalls
gebildet und in der Kulturbrühe angesammelt. Die Substanz SF-1130-x ist ein Oligosaccharid von schwach
basischer Natur, das eine antibakterielle Aktivität zeigt, in Wasser leicht löslich, in Methanol und Äthanol schwer löslich
und in Aceton unlöslich ist. Andererseits sind sowohl
Maltopentaose als auch Maltohexaose Oligosaccharide von neutraler Natur, die selbst keine antibakterielle Aktivität
in vitro zeigen und die in Wasser leicht löslich jedoch in Äthanol und Aceton unlöslich sind. Die den Gegenstand
der Erfindung bildenden Substanzen können von der Substanz SF-1130-x als Folge des Unterschiedes
ihrer zuvor beschriebenen Eigenschaften abgetrennt werden. Wenn beispielsweise das Filtrat, das durch Filtrieren
der angesäuerten Kulturbrühe aus der Kultivierung des Stammes SF-1130 erhalten wurde, durch eine Säule eines
stark sauren Ionenaustauscherharzes durchgeschickt wird, ist die in dem Filtrat enthaltene Substanz SF-1130-x auf
diesem Harz absorbiert, während Maltopentaose und Maltohexaose hierauf nicht adsorbiert sind. Die aus der Säule
abgegebene Flüssigkeit, welche diebeidenletztgenannten
Verbindungen enthält, wird dann über eine Aktivkohlensäure geschickt, um sie auf der Aktivkohle zu adsorbieren.
Die Aktivkohlesäule wird mit Wasser gewaschen und aufeinanderfolgend mit wäßrigen Lösungen eluiert, die
Äthanol in unterschiedlichen Konzentrationen im Bereich von 10 bis 25% enthalten, wodurch Maltopentaose und
Maltohexaose nacheinander eluiert werden. Dann werden die Fraktionen, welche nur Maltopentaose enthalten,
und die Fraktionen, welche nur Maltohexaose enthalten, getrennt voneinander dank des Unterschiedes der EIu-
- tionsfolge dieser Substanzen aufgefangen.
Das erfindungsgemäße Verfahren betrifft daher eine Arbeitsweise, bei der Streptomyces myxogenes ATCC
31305 unter aeroben Bedingungen in einem Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und assimilierbaren Stickstoff
enthaltenen Kulturmedium bei einer Temperatur von 25 bis 38 0C kultiviert wird, und das Filtrieren der Kulturbrühe
unter sauren Bedingungen, das Durchschicken des Filtrates durch eine Säule eines stark sauren Ionenaustauscherharzes,
das Durchschicken der abgegebenen Flüssigkeit aus der Säule über Aktivkohle, das Waschen
der Aktivkohlesäule mit Wasser und die anschließende, stufenweise Elution mit wäßrigen, Äthanol in unterschiedlichen
Konzentrationen enthaltenden Lösungen, das AufTabelle II
fangen der Fraktionen der Eluate, das Einengen dieser Fraktionen zur Trockne unter Bildung eines rohen
Pulvers, das ein Gemisch von Maltopentaose und Maltohexaose enthält, das Durchschicken des in Wasser
aufgenommenen, rohen Pulvers durch eine Säule von Aktivkohle, die dann mit Wasser gewaschen und mit wäßrigen
Lösungen von Äthanol eluiert wird, wobei die Eluate in Fraktionen aufgefangen werden, die Durchführung
einer Papierchromatographie an den Fraktionen unter
ίο Entwicklung mit einem Mischlösungsmittel aus n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser,
das Auffangen der Fraktionen, die einen einzelnen, für Maltopentaose charakteristischen
Fleck ergeben, die anschließende Konzentration zur Trockne unter Bildung von Maltopentaose in Form
eines farblosen, reinen Pulvers, und das Auffangen von weiteren Fraktionen, die einen einzelnen, für Maltohexaose
charakteristischen Fleck ergeben und die anschließende Konzentration zur Trockne unter Bildung
von Maltohexaose, ebenfalls in Form eines farblosen, reinen Pulvers, umfaßt.
Die gemäß der Erfindung gebildete Maltopentaose und Maltohexaose besitzen die in der folgenden Tabelle II
zusammengestellten, physikalisch-chemischen Eigenschaften:
Eigenschaften | Maltopentaose | Mallohexaose |
Aussehen | farblos, amorphes Pulver | farblos, amorphes Pulver |
Schmelzpunkt | 190°C(Zers.) | 186°C(Zers.) |
Elementaranalyse | ||
gefunden: | C = 41,3; H = 7,2; | C = 43,48; H = 6,30; |
berechnet. | C = 40,8; H = 6,62; | C = 43,63; H = 6,31; |
(Molekularformel) | (C30H52O2^OH2O) | (C3nH62O31) |
Molekulargewicht, gemessen durch Massenspektro- | ||
metrie für das vollständige methylierte Produkt | 1066 | 1270 |
spez. Drehung | + 134° | + 169° |
(c=l in Wasser) | (c= 1 in Wasser) |
Im folgenden wird auf die beigefügte Zeichnung Bezug
genommen; in der Zeichnung ist:
Fig. 1 einNMR-Spektrum(NMR=kernrnagnetische
Resonanz) der erfindungsgemäß hergestellten Maltopentaose.
Bei weiteren Versuchen wurde jede der erfindungsgemäß erzeugten Substanzen in IN Schwefelsäure auf 100 0C
für 5 bis 6 Stunden erhitzt, und das Produkt wurde einer Papierchromatographie unterzogen, wobei als Entwickler
n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (6:4:1:3 im Volumen)
verwendet wurde. Hierbei wurde in jedem Fall ein einziger Fleck erhalten, der mit demjenigen von Glucose
identisch war. Bei der gleichen Papierchromatographie von mit ß-Analyse enzymatisch abgebauten Produkten
ergab das abgebaute Produkt von Maltopentaose zwei Flecke von Maltose und Maltotriose, und das abgebaute
Produkt von Maltohexaose ergab nur einen einzigen Fleck von Maltose.
Im Hinblick auf die zuvor gemachten Ausführungen ist klar, daß die erfindungsgemäß erhaltenen Substanzen,
welche als Maltopentaose und Maltohexaose identifiziert wurden, Oligosaccharide von neutralem Charakter sind.
Ein Test auf Zellimmunität nach der verzögerten Hautreaktionstechnik bei mit Bauchwassersuchttumor
von »Sarcoma 180« infizierten Mäusen zeigte, daß sowohl Maltopentaose als auch Maltohexaose den Hilfseffekt der
Erhöhung der die Immunität potenzierenden Aktivität, welche durch die Substanz SF-1130-x ausgelöst wird,
haben.
Der Test wurde nach folgender Arbeitsweise durchgeführt: Eine Gruppe von ICR-JCL-Mäusen (männlich) mit
einem durchschnittlichen Körpergewicht von 31,58 ± 4 g (Alter 8 Wochen) (sechs Mäuse pro Gruppe) wurden mit
Bauchwassersuchttumor von »Sarcoma 180« geimpft. 24 Stunden nach der Einimpfung der Tumorzellen wurde
jede der zu untersuchenden Arzneimittelproben subkutan einmal bei den Mäusen appliziert. 2 Tage nach der
Euiirnpiung "wurde sins äthanGliSchc Losung von 5 % Picrylchlorid
auf die Bauchseite der Mäuse, wobei die Haare abrasiert waren, zur Herbeiführung der Sensibilisierung
aufgebracht Anschließend wurde jede untersuchte Arzneimittelprobe subkutan einmal am Tag an vier aufeinanderfolgenden
Tagen appliziert. 9 Tage nach der Einimpfung wurde eine Lösung von 1 % Picrylchlorid in
Olivenöl auf die beiden Seiten der beiden Ohren der Mäuse aufgebracht, um eine zweite Sensibilisierung
herbeizuführen. 24 Stunden nach derzweiten Sensibilisierung wurde das Ausmaß (%) der Zunahme der Dicke der
Ohren bei den Testmäusen bestimmt Das Ausmaß der verzögerten Hautreaktion kann aus der prozentualen
Zunahme abgeschätzt werden.
Die Testergebnisse sind in der folgenden Tabelle
zusammengestellt
zusammengestellt
ίο
Äpplizierlc Arzneimillelprobc
Dosis (mg/kg | Ausmaß der Zunahme | prozentuale |
Körpergewicht) | der Stärke (x 10"1Cm) | Zunahme (%) |
100 + 200 | 7,3 + 1,530 | 135,2 |
100 + 200 | 7,0 + 1,240 | 129,6 |
100 | 6,3 + 2,890 | 116,7 |
200 | 4,7 + 0,988 | 87,0 |
_ | 5,4+1,136 | 100,0 |
SF-Il 30-x*) + Maltohexaose
SF-1130-x*) + MaltopenUiose
SF-1130-x*)
'\1 ullohexao.se
Kontrolle (keine Behandlung)
SF-1130-x*) + MaltopenUiose
SF-1130-x*)
'\1 ullohexao.se
Kontrolle (keine Behandlung)
■'*:) Die hier genannte Substanz SF-1130-x ist ein Gemisch der Substanz SF-1130-x,
zuvor angegeben.
zuvor angegeben.
und der Substanz SF-1l30-x2, wie bereits
Weitere Untersuchungen zeigten, daß sowohl Mallopentaose
als auch Maltohexaose, die selbst keine antimikrobielle Aktivität in vitro aufweisen, die Wirkung der Verbesserung
der antibakteriel'cn Aktivität der Substanz SF-1130-x
haben.
ibieser Test wurde nach einer konventionellen Papierscheiben-Plattenmethode
durchgeführt. Hierzu wurde die Substanz SF-1130-x2 in destilliertem Wasser in einer Konzentration
von 1 mg/ml oder 2 mg/ml aufgelöst, und mit den so hergestellten Testlösungen wurden Papierscheiben
imprägniert, die aus Filtrierpapier von 8 mm Durchmesser hergestellt worden waren. Diese wurden anschließend an
der Luft getrocknet. Diese Papierscheiben wurden auf eine obere Plattenschicht des bekannten Inkubationsmediums für den Mycintest aufgebracht, welches 0,5%
Pepton, 0,3 % Fleischextrakt und 1,5 % Agar (pH = 6) enthielt, und welches die hierin zu inkubierenden Testmikroorganismen
enthielt. Diese Platte wurde über die untere Schicht des Agarmediums in der Untersuchungsschale
gelegt. Die Inkubation wurde bei einer Temperatur
von 37 0C über Nacht durchgeführt, anschließend
wurde der Durchmesser der rings um die Papierscheiben gebildeten Hemmzonen ausgemessen. Die so erhaltenen
Testergebnisse sind in der folgenden Tabelle IV zusammengeslellt. Diese Tests wurden in der gleichen Weise wie
zuvor jedoch unter zusätzlicher Eingabe von 1,25 mg/ml an Maltopentaose oder Maltohexaose in die obere Plattenschicht
des Inkubationsmediums für die Micinuntersuchung wiederholt. Die so erhaltenen Testergebnisse sind
ebenfalls in der Tabelle IV zusammengestellt, hieraus ergibt sich, daß die zusätzliche Anwesenheit von Maltopentaose
oder Maltohexaose die antibakterielle Aktivität der Substanz SF-1130-Xj erhöht. Bei gleichartigen Tests
wurde weiterhin gefunden, daß bei der Verwendung von Maltopentaose oder Maltohexaose in Kombination mit
der Substanz SF-1130-x, die erstgenannten Verbindungen im allgemeinen die antibakterielle Aktivität der Substanz
SF-1130-X] ebenfalls verbessern, jedoch mit der Ausnahme,
daß die Verbesserung der antibakteriellen Aktivitat nicht gegenüber Klebsiella pneumoniae beobachtet
wird. Kontrolltests wurden ebenfalls durchgeführt, bei denen die antibakterielle Potenz der Substanz SF-1130-x2
alleine bei Abwesenheit von Maltopentaose oder Maltohexaose abgeschätzt wurde. Alle Ergebnisse der zu
diesem Zweck durchgeführten Untersuchungen sind in der folgenden Tabelle IV zusammengestellt.
Testorganismus
Durchmesser der Hemmzone
Kontrolle
Gehalt an SF-il 30-X2
2 mg/ml 1 mg/ml
(mm)
Zusatz von Maltopentaose
Gehalt an SF-1130-X2
2 mg/ml 1 mg/ml
Zusatz von Maltohexaose Gehalt an SF-1130-X2
2 mg/ml 1 mg/ml
2 mg/ml 1 mg/ml
Escherichia coli K-12R 16,0 12,0 26,0 24,1 26,2 24,3
Escherichia coli (resistent
gegen Chloramphenicol) 14,7 13,5 23,9 21,0 24,0 21,1
Shigella sonnei 13,0 gering 20,1 18,2 20,0 18,1
Proteus vul saris gering 0 16,0 12,7 16,4 13,0
Salmonella "typhi 13,8 12,1 19,8 18,0 19,7 17,9
Weiterhin ist darauf hinzuweisen, daß keine antibaktericllc Aktivität von Maltohexaose oder Maltopentaose
selbst unter <ien oben angegebenen Testbedingungen gefunden wurde.
Noch weitere Untersuchungen haben gezeigt, daß sowohl Maltopentaose als auch Maltohexaose das ■Wirtsabwehrsystem
in lebenden Tieren gegenüber bakteriellen Infektionen stimulieren. Der Test wurde wie folgt durchgeführt:
Das in Beispiel 1 enthaltene, rohe, gelblich-braune Pulver wurde aus Wasser/Äthanol umgefällt, und der
umgefäUte Niederschlag wurde in einer mit Phosphorat
gepufferten Salzlösung bei pH= 7,2 aufgelöst. Die erhaltene Lösung, die ein Gemisch von Maltopentaose und
Maltohexaose enthielt, wurde intraperitoneal bei einer Gruppe von JCL/IRC-Mäusen (männlich) mit einem
durchschnittlichen Körpergewicht von 20 g (Alter 4 Wochen) (acht Mäuse pro Gruppe) in einer Dosismenge
von 100 mg/kg Körpergewicht bzw. 20 mg/kg Körpergewicht
appliziert. Die Applikation wurde dreimal in einem Intervall von 48 Stunden durchgeführt.
72 Stunden nach der letzten Applikation wurden die Mäuse intraperitoneal mit 0,5 ml/Maus einer Zelldispersion
von Staphylococcus aureus, Stamm Smith S-424 beimpft, der durch Verdünnung der inkubierten Kultur
mit physiologischer Salzlösung und anschließende Zugabe von 5 %Mucin hergestellt worden war.Die Anzahl
der überlebenden Mäuse wurde während 5 Tagen nach dem Impfen beobachtet, und der LD50-Wert der Bakterienzellen
(die Anzahl der zur Tötung von 50 % der Mäuse erforderlichen Bakterienzellen) wurde in jedem Fall
herechnet Weiterhin wurden Kontrolltests durchgeführt,
bei welchen die Behandlung mit dem Gemisch von Maltopentaose und Maltohexaose ausgelassen wurde.
Die Testergebnisse sind in der folgenden Tabelle V zusammengestellt. Es wurde gefunden, daß das Gemisch
von Maltopentaose und Maltohexaose eine Erhöhung des LD50-WWertes (nämlich des Preventativeffektes) um etwa
das 42,9-fache bei einer Dosis von 100 mg/kg und von etwa dem 6,2-fachen bei einer Dosis von 20 mg/kg ergibt.
Der Stamm Streptomyces myxogenes SF-1130 (ATCC 31305) wurde in 201 eines flüssigen Kulturmediums (pH =
7,0) eingeimpft, das 5 % Maltosesirup, 2,5 % Sojabohnenmehl, 1,0% Weizenkeime und 0,25% Natriumchlorid
Dosierung der Überleben der Mause bei unlerschiedliehen Dosen von eingeimpflen
Testmischung Bakterien (Zellen/Maus)
9,3x107 l,9xI07 3,7x10" 7,4x105
100 mg/kg
20 mg/kg
Kontrolle
3/8
1/8
1/8
6/8
3/8
0/8
0/8
8/8
8/8
2/8
8/8
2/8
8/8
8/8
8/8
8/8
8/8
LD50 der Baktcricnzcllen
9,Ox IO7
1,3 χ 107
2,1 χ 10"
1,3 χ 107
2,1 χ 10"
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.
enthielt. Das beimpfte Medium wurde unter Belüftung und Rühren bei 28 0C während 66 Stunden in einem
Behälter-Fermentationsgerät inkubiert. Am Ende der Inkubation wurde die erhaltene Kulturbrühe unter sauren
Bedingungen (pH·= 3) filtriert, wobei 15 1 eines Brühenfiltrates
erhalten wurden.
Das Filtrat wurde durch eine Säule von 2 1 eines stark sauren Ionenaustauscherharzes durchgeschickt, und die
aus der Säule ausströmende Flüssigkeit wurde dann über eine Säule (8 x 50 cm) mit 2,5 1 Aktivkohle geschickt.
Die Aktivkohlesäule wurde gut mit Wasser gewaschen und aufeinanderfolgend mit wäßrigen Lösungen von 10%,
15 %, 20 %, 25 % und 30 % Äthanol eluiert.
Die bei der Elution mit den 20%igen bzw. 25%igen äthanolischen, wäßrigen Lösungen erhaltenen Fraktionen
(10 1) wurden zur Trockne eingeengt, wobei 20 g eines Gemisches von roher Maltopentaose und Maltohexaose
in Form eines gelblich-braunen Pulvers erhalten wurden.
15 g des Pulvers wurden in 100 ml Wasser aufgelöst, und die Lösung wurde durch eine Säule (4,Ox 33 cm) von
350 ml Aktivkohle geschickt, um die gewünschten Substanzen auf der Aktivkohle zu adsorbieren.
Die Säule wurde gut mit Wasser gewaschen, anschließend wurde aufeinanderfolgend mit wäßrigen Lösungen
von 10%, 15%, 20% und 25% Äthanol eluiert. Das Eluat
wurde in 15-ml-Fraktionen gesammelt, und jede der Fraktionen
wurde einer Papierchromatographie unterworfen, wobei sie mit einem Mischlösungsmittel aus n-Butanol/
Pyridin/Essigsäure/Wasser(6:4:1:3 im Volumen) eluiert
wurden. Die Fraktionen 261-340, die einen einzigen Fleck bei einem R-Raffinose-Wert = 0,41 ergaben (unter der
Annahme berechnet, daß der Rf-Wert von Rafilnose = 1,00 ist), gefärbt mit Hilfe eines Silbernitratreagens, wurden
miteinander vereinigt und zur Tockne eingeengt, wobei 5,2 g eines farblosen Pulvers von Maltopentaose
erhalten wurden. Diese Pulver wurde in 20 ml Wasser aufgelöst und die Lösung wurde filtriert. 180 ml Äthanol
wurden langsam zu dem Filtrat himzugegeben, um das Produkt erneut auszufallen, wobei 4,8 g reine Maltopentaose
als farbloses Pulver erhalten wurden.
Weiterhin wurden die Fraktionen 396-500, die einen einzigen Fleck bei einem R-Raffinose-Wert — 0,25 gaben,
nach der zuvor beschriebenen Arbeitsweise behandelt, wobei 3,1 g reine Mai'tohexaose als farbloses Pulver erhalten
wurden.
4,0 g des rohen, gelblich-braunen Pulvers, das in Beispiel 1 erhalten worden war, wurde in einer kleinen Menge
Wasser aufgenommen, auf einer kleinen Menge Cellulosepulver adsorbiert und getrocknet. Das getrocknete Pulver
wurde auf eine Säule (4,5 x 18 cm) von 300 g Cellulose aufgegeben und mit einem Mischlösungsmittel aus n-Butanol/Pyridin/Essigsäure/Wasser
(6:4:1:3 im Volumen) eluiert. Das Eluat wurde in 12-ml-Fraktionen gesammelt,
und jede der Fraktionen wurde der Papierchromatographie unter Verwendung des zuvor genannten Mischlösungsmittels
als Entwickler unterzogen. Die Fraktionen 143-224, die einen einzigen Fleck bei einem R-Raffinose-Wert=
0,41 ergaben, gefärbt durch ein Silbernitratreagens, wurden miteinander vereinigt und entsprechend der
Arbeitsweise von Beispiel 1 behandelt, wobei 1,05 g farbloses Pulver von Maltopentaose erhalten wurden.
Die Fraktionen 250-345, die einen einzigen Fleck bei einem R-Rafiinose-Wert= 0,25 ergaben, wurden in gleichartiger
Weise behandelt, wobei 740 mg eines farblosen Pulvers erhalten wurden.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zur Herstellung von Maltopentaose und/ oderMaltohexaosedadurch gekennzeichnet,daß Streptomyces myxogenes ATCC 31305 unteraeroben Bedingungen in einem Kulturmedium, welches Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und assimilierbaren Stickstoff enthält, bei einer Temperatur von 25 bis 38 0C kultiviert wird, daß die Kulturbrühe unter sauren Bedingungen filtriert wird, daß das Filtrat durch eine Säule von stark sauren Ionenaustauscherharz geschickt wird, daß die austretende Flüssigkeit durch eine Aktivkohlesäule geschickt wird, daß die Aktivkohlesäule mit Wasser gewaschen wird und anschließend stufenweise mit wäßrigen, Äthanol in unterschiedlichen Konzentrationen enthaltenden Lösungen eluiert wird, daß die vorgegebenen Fraktionen der Eluate gesammelt werden, Daß die Fraktionen zur Trockne konzentriert werden, um ein rohes, ein Gemisch von Maltopentaose und Maltohexaose enthaltendes Pulver zu erhalten, daß das in Wasser aufgenommene, rohe Pulver durch eine Säule von Aktivkohle geschickt wird, welche dann mit Wasser gewaschen und mit wäßrigen Lösungen von Äthanol eluiert wird, daß die Eluate in Fraktionen gesammelt werden, daß die Fraktionen der Papierchromatographie unter Entwicklung mit einem Mischlösungsmittel aus n-Butanol/Pyridin/Essigsäure/Wasser unterworfen werden, daß die Fraktionen, die einen einzigen, für Maltopentaose charakteristischen Heck ergeben, gesammelt werden und anschließend zur Trockne unter Lieferung von Maltopentaose in Form eines farblosen, reinen Pulvers konzentriert werden, und daß die weiteren Fraktionen, welche einen einzelnen, für Maltohexaose charakteristischen Fleck ergeben, gesammelt und anschließend zur Trockne unter Lieferung von Maltohexaose ebenfalls in Form des farblosen, reinen Pulvers konzentriert werden.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP51099756A JPS5941720B2 (ja) | 1976-08-23 | 1976-08-23 | マルトペンタオ−ス及びマルトヘキサオ−スの製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2737944A1 DE2737944A1 (de) | 1978-03-02 |
DE2737944C2 true DE2737944C2 (de) | 1982-12-09 |
Family
ID=14255816
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE2737944A Expired DE2737944C2 (de) | 1976-08-23 | 1977-08-23 | Verfahren zur Herstellung von Maltopentaose und Maltohexaose |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4151041A (de) |
JP (1) | JPS5941720B2 (de) |
DE (1) | DE2737944C2 (de) |
FR (1) | FR2362926A1 (de) |
GB (1) | GB1567403A (de) |
Families Citing this family (2)
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DE4017595A1 (de) * | 1990-05-31 | 1991-12-05 | Consortium Elektrochem Ind | Maltopentaose produzierende amylasen |
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---|---|---|---|---|
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- 1976-08-23 JP JP51099756A patent/JPS5941720B2/ja not_active Expired
-
1977
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- 1977-08-22 US US05/826,762 patent/US4151041A/en not_active Expired - Lifetime
- 1977-08-22 FR FR7726379A patent/FR2362926A1/fr active Granted
- 1977-08-23 DE DE2737944A patent/DE2737944C2/de not_active Expired
Also Published As
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