DE2351344A1

DE2351344A1 - Antibioticum bm 123 und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE2351344A1
Application number: DE19732351344
Authority: DE
Inventors: John Henry Edward James Martin; City N Y New; John Norman Porter; Homer David Tresner
Original assignee: American Cyanamid Co
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1972-10-12
Filing date: 1973-10-12
Publication date: 1974-04-25
Also published as: JPS5434838B2; YU265573A; HK42977A; ZA735897B; DD111403A5; IL43295A0; ES419574A1; PH10065A; BE806029A; IE38136L; IE38136B1; HU166799B; PL85814B1; SU618053A3; FR2202680B1; GB1439668A; CS191221B2; CH584287A5; SE398756B; BG23543A3

Description

Antibioticum BM 123 und Verfahren zu seiner Herstellung

Die Erfindung bezieht sich auf drei neue antibakterielle Mittel, ihre Herstellung durch Fermentation, Verfahren zu ihrer Gewinnung und Anreicherung aus rohen Lösungen und Verfahren zu ihrer Reinigung. Im Rahmen der Erfindung liegen auch verdünnte Formen der bakteriellen Mittel sowie Rohkonzentrate und reine kristalline Formen dieser Mittel. Die Wirkungen der neuen antibakteriellen Mittel auf bestimmte Mikroorganismen sowie ihre chemischen und physikalischen Eigenschaften unterscheiden sich von früher beschriebenen atitibakteriellen Mitteln.

Die neuen antibakteriellen Mittel, die als BM123alpha, BM123B und BM123gamma bezeichnet werden, entstehen bei der Züchtung eines neuen Stamms einer noch nicht bestimmten Species von Nocardia unter gesteuerten Bedingungen. Dieser neue Antibioticum erzeugende Stamm wurde aus einer Probe einer Gartenerde aus Oceola, Iowa isoliert und wird in der Kulturensammlung der Lederle Laboratories Division der American Cyanamid Company·, Pearl River, New York,

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als Kultur Nr. BM 123 aufbewahrt. Eine lebensfähige Kultur des neuen Mikroorganismus ist bei der Culture Collection Laboratory, Northern Utilization Research und Development Divisions, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, hinterlegt worden und ist dort in die ständige Sammlung aufgenommen worden. Bei dieser Hinterlegungssstelle ist der Mikroorganismus für jedermann unter der Zulassungsnummer NRRL 5646 ohne weiteres erhältlich.

Im folgenden wird eine allgemeine Beschreibung des Mikroorganismus Nocardia sp., NRRL 5646 anhand der beobachteten diagnostischen Eigenschaften gegeben. Es wurden die kulturellen physiologischen und morphologischen Merkmale des Organismus entsprechend den Methoden beobachtet und festgestellt , die im einzelnen von Shirling und Gottlieb, Internat. Journ. of Syst., Bacteriol. 16:313-240 (1966) beschrieben worden sind. Die chemischen Zusammensetzungen der Kultur wurden nach den Arbeitsweisen von Lechevalier et al, Adva. Appl. Microbiol. 14:47-72 (1971) ermittelt. Die unterstrichenen beschreibenden Farben und die Farbplättchenbezeichnungen wurden Jacobson et al., Color Harmony Manual, 3rd edition (1948), Container Corpor. of America, Chicago, Illinois, entnommen. Einzelheiten der Beschreibung sind in den Tabellen I bis V zusammengestellt.

Stärke des Wachstums

Mäßig auf Hefeextrakt, Asparagindextrose, Benedicts, Bennetts, Kartoffeldextrose- und Weinsteins Agar; schwach auf Hickey und Tresners,.. Tomatenmark-Hafermehl- und Pablum-Agar; lediglich eine Spur von Wachstum auf anorganischen Salzen-Stärke, Küster Haferflocken- Czapeks Lösung- und Reis-Agar.

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Luftmycel

Wenn vorhanden, ist das Luftmycel weißlich. Es wird nur auf Hefeextrakt, Asparagindextrose und Benedicts, Bennetts und Kartoffeldextrose-Agar erzeugt.

Lösliches Pigment

Es wird kein lösliches Pigment gebildet.

Farbe der Rückseite .

Farblos bis gelbliche Töne.

Verschiedene physiologische Reaktionen

Keine Gelatineverflüssigung; Reduktion von Nitraten zu Nitriten in 7 Tagen; auf Pepton-Eisen-Agar werden keine melanoiden Pigmente erzeugt; keine Peptonlsierung oder Klümpchenbiidung in Purpurmilch; NaCl-Toleranz in Hefeextrakt-Agar >4% aber ^.7%; optimale Wachsturnstemperatar: 32 ⁰C. Verwertung von Kohlenstoffquellen nach der Methode von Pridham und Gottlieb [3. Bacteriol. 5j5:107-ll4 (19482/: gute Verwertung von Glycerin, Salicin, d-Trehalose und Dextrose; mittlere Verwertung von i-Inosit und schlechte bis gar keine Verwertung von d-Fructose, Maltose, Adinit, 1-Arabinose, Lactose, 0-Mannit, d-Melibiose, d-Raffinose, 1-Rhamnose, Saccharose und d-Xylose.

Chemische Zusammensetzungen

Der Organismus gehört zum Zellwandtypus IV, d. h. er ent-« hält raeso-2,6-Diaminopimelinsäure und hat ein Gesamtzellenzuckermuster vom Typ A, d. h. er enthält Arabinose und Galactose. Hethylierte GanzZellenextrakte zeigen bei der Gaschromatographie Fettsäuremuster ähnlich denjenigen,, die von Nocardla asteroides, ATCC 3308, erzeugt werden.

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Mikromorphologie

Das Luftmycel wächst aus dem Substratmycel als spärlich verzweigte, mäßig lange, biegsame Elemente heraus, die in der Regel in längeren primitiven Spiralen enden. Die biegsamen Elemente sind unregelmäßig zu kurzen elliptischen bis zylindrischen Abschnitten (Sporen?) segmentiert, die leicht verfallen. Die spiraligen Endteile sind weniger auffällig segmentiert. Die Segmentgröße beträgt im allgemeinen 0,8 bis 1,7 ,um χ 0,3 bis 0,5 ,um, im Mittel 0,4 ,um χ 1,2 /Um.

Diagnose

Die morphologischen Eigenschaften der Kultur Nr. BM 123 lassen sich nur schwer feststellen und deuten, da auf den meisten Medien nur wenig Luftmycel entwickelt wird. Deshalb wird notwendigerweise der chemischen Analyse beträchtliche Bedeutung für die Bestimmung der Familienzugehörigkeit des Organismus beigemessen. Nach dem von Lechevalier et al. vorgeschlagenen System enthält die Kultur BM 123 meso-2,6-Diaminopimelinsäure in ihren Gesamtzellen, und die Zuckeranalyse zeigt die Gegenwart von Arabinose und Galactose. Deshalb gehört die Kultur zum Zellwandtypus IV. Ein Vergleich des gaschromatographischen Verhaltens der Kultur BM 123 mit den vom Nocardia asteroides ATCC 3308 zeigt eine bemerkenswerte Ähnlichkeit zwischen beiden. Weitere Eigenschaften der Kultur BM123. die mit den Nocardia-Gesamtbild übereinstimmen, sind ihr fragmentiertes Luftwachstum auf einigen Medien und das völlige Fehlen von Luftwachstum auf den meisten Medien. Wegen des Fehlens von angemessenen Kriterien für die Charakterisierung von Nocardia-Organismen auf Species-Ebene wurde kein Versuch unternommen, eine solche Bestimmung zu machen. Deshalb wird die Kultur BM 123 als unbestimmte Species von Nocardia angesehen, bis eine solche Diagnose möglich ist.

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Tabelle Kulturelle Eigenschaften von Npcardia sp. NRRL 5646

Inkubation: 14 Tage

Temperatur: 32 C

GJ -P-

Medium

Wachstums-' Stärke

Luftmycel und/ oder Sporen

lösliches
Pigment

Rückseiten
farbe

Bemerkungen

Hefeextrakt- mäßig Agar

Luftmycel weiß lich , schwach

keines

Mustard
(3 le)

dunkle Flecken im Substratmycel,Coremia auf dem Oberflächenmycel gebildet.

Hickey und Tresners-Agar	schwach	kein Luftmycel	keines	farblos bis gelblich grün	Ränder der Kolonien werden olivgrün
Asparagin-Dex^fa	mäßig	Spur von weißli	keines	Amber	I Oberfläche schwach
trose-Agar		chem Luftmycel		(3 Ic)	gerunzelt
Benedi ets-Agar	mäßig	Luftmycel weiß- *	keines	Nude Tan	reiche Coremia-Bildung
		lieh, schwach		(4 ge)	auf dem Oberflächen- mycel
Bennetts-Agar	mäßig	Spuren von weißli	keines	Camel	Oberfläche schwach
		chem Luftmycel		(3 ie)	gerunzelt
anorganische Salze Stärke- Agar	Spur	kein Luftmycel	keines	farblos

Tabelle I (Forts.)

	Medium	Wachsturns- stärke	Lüftmycel und/ oder Sporen	lösliches Pigment	Rückseiten farbe	Bemerkungen	•
	Kusters-Hafer- flocken-Agar	Spur	kein Lüftmycel	keines	farblos
	Czapeks Lösungs- Agar	Spur	kein Lüftmycel	keines	farblos
O CO	Kartoffeldex trose -Agar	mäßig	Lüftmycel weiß lich, schwach	keines	Camel (3 ie)
OO «J	Tomatenmark- Hafermehl-Agar	schwach	kein Lüftmycel	keines	farblos
1130	Pablum-Agar	schwach	kein Lüftmycel	keines	farblos·
	Reis-Agar	Spur	kein Lüftmycel	keines	farblos
	Weinsteins- Agar	mäßig	kein Lüftmycel		farblos bis gelblich
Küsters Hafer- flocken-Agar	Spur	kein Lüftmycel	keines	farblos

Tabelle II

Mikromorphologie von Nocardia sp. NRRL 5646

Medium

Luftmycel und/oder sporentragende Strukturen

Hefeextrakt-Agar

Luftmycel wächst aus Substratmycel als spärlich verzweigte biegsame Elemente, die in der Regel in verlängerten primitiven Spiralen enden. Die biegsamen Elemente sind unregelmäßig zu kurzen Abschnitten (Sporen?) segmentiert, die ihre Gestalt leicht verlieren. Die spiralförmigen Endabschnitte sind weniger auffällig segmentiert. Die Segmentgröße beträgt im allgemeinen 0,8 · bis 1,7 y
tel 0,4 ^um χ 1,2 λ

χ 0,3 bis 0,5 ,um und im Mit

/Um.

0 9 8 1 7 / 1 1 3 0

Tabelle III Verschiedene physiologische Reaktionen von Nocardia sp. NRRL 5646

Medium	Inkubations- zeit	Wachstums- stärke
Gelatine	7 Tage	schwach
Gelatine	14 Tage	gut
**" Organische Nitrat- , ° brühe	7 Tage	gut
co _^ Organische Nitrat- -j brühe	14 Tage	gut
-^ Pepton-Eisen-	24-48 Stunden	gut

Physiologische Reaktion keine Verflüssigung keine Verflüssigung

Reduktion von Nitraten zu Nitriten

CO

cn

keine Bildung von Melaninpigmenten

Purpurmilch

7 Tage

gut keine Peptonisierung oder Klumpenbildung

Hefeextrakt-Agar plus (4, 7,
10 und 13 %) NaCl

7 Tage

mäßig NaCl-Toleranz > 45 % aber ^. 7%

Tabelle IV

Kohlenstoffguellen-Verwertungsbild von Nocardia sp. NRRL 5646

Inkubation: 10 Tage Temperatur: 32 C

Kohlenstoffquelle

Adonit 1-Arabinose Glycerin d-Pructose i-Inosit Lactose d-Mannit Salicin d-Melibiose d-Raffinose Rhamnose Maltose Saccharose d-Trehalose d-Xylose Dextrose Blindprobe

Verwertung

0 0 3 1 2 0 0 2 0 0 0 1 0 3 0 3 0

3-gute Verwertung 2-mäßige Verwertung 1-schlechte Verwertung 0-keine Verwertung

Λ0 98 1 77 1 1 3 0

Tabelle V

Chemische Zusammensetzung von Nocardia sp. NRRL 5646 Zellwand-Typ . Hauptbe s t andte jIe

Typus IV meso-DÄP, Arabinose,

Galactose

Es sei ausdrücklich darauf hingewiesen, daß die Erzeugung dieser neuen antibakteriellen Mittel nicht auf diesen besonderen Organismus oder auf Organismen beschränkt ist_r die im vollen Umfang den oben angegebenen Wachstums- und mikroskopischen Eigenschaften entsprechen, die lediglich zur besseren Veranschaulichung angegeben werden. Vielmehr ist es beabsichtigt, auch die Verwendung von Mutanten, die aus diesem Organismus durch verschiedene Mittel, wie Bestrahlung mit Röntgenstrahlen oder ultraviolettem Licht, Behandlung mit Stickstofflost oder Aktinophagen erzeugt worden sind, einzuschließen.

Vorläufige Isolierung, Dünnschichtchromatographie und papierchromatographische Untersuchungen haben gezeigt, daß wenigstens drei Antibiotica bei der aeroben Fermentation von Nocardia sp. NRRL 5646 (wie oben bezeichnet) erzeugt werden. Durch Nährmedienprüflingen wurden zwei Arten von Maischen gefunden, ein gamma-Typus, worin hauptsächlich BM123gamma neben geringeren Mengen von BM123alpha und BM123B erzeugt wird, und eine Maische vom alpha-Typus, worin hauptsächlich BM123alpha erzeugt wird.

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Fermentationsverfahren, das so geführt wird_r daß hauptsächlich BM123alpha erzeugt wird

Die Züchtung von Nocardia sp. NRRL 5646 kann in einer großen Zahl verschiedener flüssiger Kulturmedien durchgeführt werden. Medien, die sich für die Erzeugung dieses neuen antibakteriell len Mittels eignen, enthalten eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, zum Beispiel Stärke, Zucker, Melasse oder Glycerin, eine assimilierbare Stickstoffquelle, z.B. Protein, Proteinhydrolysat, Polypeptide, Aminosäuren oder Maisquellwasser sowie anorganische Anionen und Kationen, wie Kalium, Natrium, Calcium, Sulfat, Phosphat und Chlorid. Spurenelemente wie Bor, Molybdän und Kupfer liegen als Verunreinigungen anderer Bestandteile des Mediums vor. Die belüftung in Tanks und Flaschen erfolgt durch Durchleiten von steriler Luft durch das gärende Medium oder Aufblasen von steriler Luft auf die Oberfläche des Mediums. Außerdem wird in Tanks durch mecha'-nische Mittel für Bewegung gesorgt. Je nach Bedarf kann ein Entschäumer wie Specköl zugesetzt werden.

Inokulumherstellung für BM123alpha

Ein Schüttelkolbeninokulum von Nocardia sp.. NRRL 5646 wird durch Beimpfen von 100 ml sterilem flüssigem Medium in 5OO ml-Kolben mit abgeschabten oder abgewaschenen Sporen . einer Schrägagarkultur hergestellt. Ein geeignetes Medium ist beispielsweise folgendes:

Rindfleischextrakt 3,0 g

Bacto-trypton 5 »0 g

Hefeextrakt 5,0 g

Stärke 24,0 g

Dextrose 1,0g

Wasser auf 1000 ml

Medium wird mit NaOH auf 7,0 pH eingestellt.

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Die Kolben werden bei einer Temperatur von 25 bis 29 ⁰C, vorzugsweise 28 ⁰C, unter kräftiger Bewegung auf einer Drehschüttelvorrichtung 30 bis 48 Stunden inkubiert. Diese 100 ml Anteile des Inokulums werden dann zum Beimpfen von 1-Liter- und von 12 Liter-Ansätzen des gleichen Mediums in 2 Liter- bzw. 20 Liter-Glasfermentationsgefäßen verwendet. Die beimpfte Maische wird mit steriler Luft belüftet, und die Züchtung wird 40 bis 55 Stunden fortgesetzt. Diese Inokulumansätze werden zur Beimpfung von Fermentationstanks verwendet.

Tankfermentation zur Erzeugung von BM123alpha

Zur Erzeugung von BM123alpha in Fermentationstanks wird in der Regel folgendes Medium verwendet:

Bacto-pepton 10,0 g

Dextrose 10,0 g

Melasse 20,0 g

Ferriammoniumcitrat 0,1 g

Calciumcarbonat 1,0 g

Wasser auf 1000 ml

Jeder Tank wird mit 3 bis 10 % des wie oben beschrieben hergestellten Inokulums beimpft. Die Belüftung wird durch Zufuhr von 0,2 bis 0,8 Liter sterile Luft je Liter Maische und Minute bewirkt, und die Gärmischung wird durch einen mit 50 bis 200 UpM betriebenen Rührer bewegt. Die Temperatur wird bei 25 bis 29 ⁰C, gewöhnlich bei 28 ⁰C, gehalten. Die Fermentation wird gewöhnlich 180 bis 240 Stunden fortgesetzt, wonach die Maische aufgearbeitet wird.

Isolierung von BM123alpha

Nach dem Ende der Fermentation wird die BM123alpha enthaltende Gärmaische filtriert, vorzugsweise unter Verwendung von

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Diatomeenerde oder einer anderen üblichen Filterhilfe. Gewöhnlich wird der Mycelfilterkuchen mit Wasser gewaschen und Filtrat und Waschflüssigkeiten werden vereinigt. Im Durchschnitt kann das Filtrat etwa 30 Liter ausmachen. Der pH-Wert wird.auf 6,5 eingestellt. Nach Zugabe von Natriumfluorid wird das Gemisch etwa eine Stunde gerührt.' Die gebildete Suspension wird durch eine Filterhilfe wie Diatomenerde filtriert. Dann läßt man das Filtrat durch eine Säule aus IRC*^R* - 50(Na⁺) (Korngröße 0,297 - 0,149 mm, 50 bis 100 mesh), einem schwach-saurem Harz (hergestellt von Rohm und Haas Co., Philadelphia, Pennsylvania, mit einem Bettvolumen von 1 Liter, percolieren. Die Harzsäule wird mit 4 Liter Wasser gewaschen. Das BM123alpha wird mit Hilfe von 0,3n H₃SO₄ aus der Säule eluiert. Das Eluat wird in insgesamt 500 ml ausmachenden Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen 1 bis 7, die den wirksamen Bestandteil BMl23alpha enthalten, werden vereinigt und mit Ba(OH)₂ auf pH 7,2 eingestellt. Das gebildete Bariumsulfat wird abfiltriert, und das klare Filtrat wird durch eine Säule aus IRC¹ ' -50(H ) mit einem Bettvolumen von 650 ml geleitet. Die Säule wird mit Wasser gewaschen und wie oben beschrieben mit 0,3 η H₂SO. eluiert. Die wirkstoffhaltigen Fraktionen (1 bis 7) werden wiederum mit Ba(OH)₂ auf pH 7,0 eingestellt und filtriert, wodurch.eine klare Lösung erhalten wird. Diese Lösung wird im Vakuum eingeengt und dann an Kohle chromatographiert. Darco¹ ' G-60 in Granulatform mit einer Korngröße von 0,84 bis 0,42 mm (20-40 mesh) wird in Wasser suspendiert, in eine Glaskolonne eingebracht und absitzen gelassen, überschüssiges Wasser wird ablaufen gelassen, und das BM123alpha-Kon-. zentrat läßt man langsam in die Säule einsickern. Dann wird die Säule mit Wasser gewaschen und mit 50-prozentigem wässrigem Methanol entwickelt, wobei Fraktionen von jeweils 50 ml aufgefangen werden. Die wirkstoffhaltigen Fraktionen (18 bis 68) werden vereinigt, im Vakuum zu einem wässrigem Gemisch eingeengt und schließlich lyöphilisiert, wodurch weißes festes BM123alpha erhalten wird. Weiteres BM123alpha kann

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durch anschließende Entwicklung der Kohlesäule mit saurem 50-prozentigem wässrigem Methanol (pH 1,8, H₃SO₄) unter Auffangen von zusätzlichen 16 Fraktionen gewonnen werden. Die sauren Fraktionen werden vereinigt, im Vakuum zu einer wässrigen Phase eingeengt, mit Ba(OH)₂ auf pH 7,2 eingestellt, filtriert und lyophilisiert. Die physikalischen Kennzahlen von BMl23alpha sind im weiter unten folgenden Beispiel 3 angegeben.

Zur vorwiegenden Erzeugung von BM123B und BMl23gamma angelegtes Fermentationsverfahren

Genauso wie für BM123alpha.

Impfstoffbereitung für BM123B und 3M123gamma Genauso wie für BM123alpha.

Tankfermentation zur Herstellung von BM123ß und BM123gamma

Für die Herstellung von BM123gamma in Fermentationstanks wird in der Regel das.folgende Gärmedium verwendet:

Dextrose	10,0	g
Rindfleischextrakt	4,0	g
Bacto-pepton	4,0	g
Natriumchlorid	2,5	g
Hefeextrakt	1,0	g
Wasser auf	lOOO	ml

Medium wird mit NaOH auf 7,0 pH eingestellt.

Jeder Tank wird mit 3 bis 10 % des wie oben beschrieben hergestellten Inokulums beimpft. Die Belüftung erfolgt durch Einleiten von 0,2 bis 0,8 Liter steriler Luft je Liter Medium und Minute, und das Gärgemisch wird mit Hilfe eines mit 50 bis 2OO Umdrehungen/Minute betriebenen Rührers bewegt,

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Die Temperatur wird bei 25 bis 29 ⁰C, gewöhnlich bei 28 ⁰C, gehalten. Die Fermentation wird gewöhnlich 45 bis 85 Stunden fortgesetzt, worauf die Maische aufgearbeitet wird.

Isolierung von BM123ß und BM123gamma

Die vergorene Maische, die BM123ß und BM123gamma enthält, wird unter Verwendung von 1 % Diatomeenerde als Filterhilfe filtriert. Der Filterrückstand wird mit Wasser gewaschen. Filtrat und Waschflüssigkeit werden vereinigt und durch ein Bett mit einem Volumen von 10 Litern IRC^v ' 50 (Na )-Harz allein durch die Schwerkraft mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 330 ml/Minute geleitet. Die beladene Säule wird dann mit Wasser gewaschen. Die Elution der Aktivität aus der Säule erfolgt mit 0,3 η H₃SO₄. Das Eluat wird in zwei Anteilen aufgefangen. Der erste Anteil besteht aus dem Eluat vom Beginn (pH 7,O) bis zu dem Eluat bei pH 5,0. Dieser erste Anteil wird wegen seines hohen Salzgehaltes verworfen. Der zweite Anteil hat einen pH-Wert von etwa 1,4. Dieser saure Anteil wird mit Ba(OH)₂ auf pH 6,0 eingestellt. Das gebildete Bariumsulfat wird durch Diatomeenerde abfiltriert. Der Rückstand wird mit Wasser gewaschen, und Filtrat und Waschflüssigkeiten werden vereinigt und im Vakuum eingeengt. Das Konzentrat wird auf einem Dampfbad auf 50 ⁰C erwärmt und zu einer warmen Lösung von Reinecke-Salz (150 g/1500 ml bei 75 ⁰C) gegeben. Die warme Lösung wird etwa 48 Stunden stehengelassen und dann filtriert, wodurch man eine rot-purpurne Festsubstanz erhält, die mit Wasser gewaschen wird. Der feuchte Feststoff wird dann mit einer Mischung aus Wasser und 1-Butanol (2:5) gerührt und mit O,25n H₃SO₄ auf pH 1,5 eingestellt. Die Mischung wird filtriert, und die wässrige Phase des Filtrats wird auf pH 6 bis 8 eingestellt und filtriert, und das zweite Filtrat wird im Vakuum eingeengt. Das Konzentrat wird durch eine 100 ml-Säule aus Dowex*^R* l-x4(Cl") geleitet und lyophilisiert.

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Chromatographische Trennung der Bestandteile vom BM123B und BMl23gamma

Pulverförmig© Cellulose wird gründlich mit der oberen Phase vermischt, die durch Vermischen von 90 % Phenol : Chloroform : Pyridin : Essigsäure : Wasser (1500 : 300 : 45 : 45 : 750) erhalten worden ist, vermischt. Das benetzte Cellulosepulver wird in Anteilen in eine Glassäule eingefüllt. Die zu trennende Mischungwird auf die Säule als Lösung des oben beschriebenen lyophilisierten Substanzgemische in der oberen Phase in Gemisch mit pulverförmiger Cellulose (1:2 Vol./Gew.) aufgegeben. Die Säule wird dann entwickelt, wobei Luftdruck auf einen Vorrat im oberen Ende der Glassäule angewandt wird. Unter Verwendung eines automatischen Fraktionssammlers werden insgesamt 75 Fraktionen (25 ml/Fraktion) aufgefangen. Die Aktivität wird durch Bioautographie festgestellt, wobei eingetauchte Papierscheiben luftgetrocknet und mit Äther gewaschen und schließlich auf eine große Agarplatte aufgebracht werden, die mit K. pneumoniae, Stamm AD, besamt ist. Es werden zwei getrennte aktive Banden beobachtet. Eine dieser Banden (BM123gamma) stammt aus den Fraktionen 3 bis 18 und die zweite (BM123ß) aus den Fraktionen 31 bis 52. Die Fraktionen 3 bis 18 werden vereinigt und zu Chloroform gegeben, wobei sich zwei Phasen bilden. Die untere Phase wird verworfen. Die obere wässrige Phase (pH 4,5) wird zur Entfernung von etwa noch vorhandenem Phenol zweimal mit einem gleichen Volumen A'ther extrahiert. Die wässrige Phase wird unter Verwendung von IR^R 45(OH~) auf pH 6,5 eingestellt und lyophilisiert, wodurch BM123gamma erhalten wird. Die Fraktionen 31 bis 52 werden vereinigt und in gleicher Weise behandelt, wodurch BM123ß erhalten wird.

Die drei antibakteriellen Substanzen werden in vitro unter Verwendung verschiedener gram-positiver und gram-negativer Bakterien sowie von M. smegmatis nach der Standard-Agarverdünnungsmethode verglichen. Die Ergebnisse sind als minimale Hemmkonzentrationen (mgc/ml) in Tabelle VI zusammengestellt. Gentamicinsulfat diente als Vergleich.

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Tabelle

VI

, Organismus

Mycobaeterium smegmatis Nr, 607 Staphylococcus aureus Rqs£ ATCC 14154 Staphylococcus aureus Smith ATCC 1.3709 ^ Staphylococcus aureus Nr, 34O.5QB12 2 ^ 3

co Bacillus cereus ATCC 9634 co

·*-* Bacillus globigii
-■j

> Bacillus subtilis Nr. 17 Stansly R-7S _M Bacillus subtilis Nr. 18 Stansly R^.76 Corynebacterium xerosis NRRL B-1397 Enterococcus GK

Sarcinä lutea ATCC 9341 Enterobacter aerogenes Nr. 75 Escherichia coli U311

Minimale	Hemmkonzentration	5 '	(mcg/ml)	cn
sulfat	BM123cramma BMl 2 3ß	2,5	BMl23alpha	CO
0,1	0,25 -	I	5 .
0,1	0,25	2,5	100
0,05	0,25	25	20
0,25	0,25	0,25	100
0,25	1	0,25	100 . .
0,025	0,25	5	10 *h. 10
0,025	0,25	5	20
0,1	0,5	>100	10
0,025	0,25	10	>200
2,5	5	0,5	50
0,25	1	0,5	10
0,1	0,25
0,05	0,25

T a b e lie VX (Forts.)

Minimale Hemmkonzentration (mcg/ml)

Organismus

Gentamicinsulfat

BM123gamma

BM123ß

BMl23alpha

CD
CC-

Escherichia poli Nr, 29 Klebsieila pneumoniae, Typ A, stamm D Proteus mirabilis ATCC 4671 Proteus morganii ATCC 8019 Proteus vulgaris ATCC 9494 Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 Pseudomonas aeruginosa PA7 Salmonella gallinarum Lederle Salmonella typhosa ATCC 6539 Shigella shiga

0,05

0,25

0,1

2,5

0,05

0,1

0,25

0,25
0,1
0,25
0,25
0,25
5

10
0,1
0,1
0,25

0,5 0,25 2,5 1

0,5 50

>100 0,5 0,5 2,5

5 5

50

• ' 5 5

200

>200

50

ro co cn

Die drei antibakteriellen Bestandteile BM123alpha, BM123B und BM123gamma sind in vivo gegen die verschiedensten Organismen aktiv. Diese neuen antibakteriellen Stoffe sind deshalb als therapeutische Mittel zur Behandlung von bakteriellen Infektionen von Säugern brauchbar. Es kann damit gerechnet werden, daß diese neuen antibakteriellen Stoffe mit Vorteil zur Behandlung oder Bekämpfung von bakteriellen Infektionen durch parenterale Verabreichung verwendet werden können.

Die guten Eigenschaften dieser neuen antibakteriellen Mittel werden durch ihre Fähigkeit, letale systemische Infektionen von Mäusen zu bekämpfen, nachgewiesen. Diese neuen Substanzen zeigen bei Mäusen eine hohe in vivo antibakterielle Aktivität gegen Proteus mirabilis ATCC 4671, Klebsieila pneumoniae AD und Escherichia coli UC311, wenn sie in einet subkutanen Einzeldosis an Gruppen von Carworth Farms CF-I-Mäuse mit einem Gewicht von etwa 20 g verabreicht werden, die intraperitoneal mit einer letalen Dosis dieser Bakterien in Trypticase-Sojabrühe TSP mit einer Verdünnung von 10" ' , io~ bzw. 10 infiziert worden sind, wobei eine 5-stündige.TSP-Blutkultur verwendet wird.

In der folgenden Tabelle VII wird die antibakterielle Aktivität von BM123alpha, BM123B und BM123gamma in vivo gegen diese drei Bakterien veranschaulicht.

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Tabelle

VII

	Überlebende/Gesamtzahl der Prüfmäuse, 7 Tage	nach der Infektion	BMl2 3 gamma
subkutane Einzel		BM123ß
dosis, mg/kg	BMl23alpha	Proteus mirabilis

512	5/5
128	3/5	5/5
32	2/5	5/5
16		3/5	20/20
8	0/5	1/5	9/25
4		0/5	2/20
2			0/25
1
0,5

infizierte, unbehandelte Kontrollen

68/70 Mäuse starben innerhalb 1 Tages nach der Infektion

Klebsiella pneumoniae AD

512	4/5	7/10	5/5
128	0/5	10/ IO	8/10
64		8/10	4/10
32	0/5	0/10	0/10
16
8
4
2
1
0,5

infizierte unbehan-: delte Kontrollen

2O/2O Mäuse starben innerhalb von 2 Tagen nach der Infektion

U 0 9 ö 1 7 /^! 1 1 3

T abelle VII (Forts.)

351344

	Übe r lebende/Ge s aitit ζ ah 1	der Prüfmause, 7 Tage	Eseherichia	BMl 2 3 gamma	10/10
subkutane Einzel- .		nach der Infektion		coli 311	9/10
dosis, mg/kg	BM123alpha BMl23ß			5/10
				4/10
512	5/5	9/10		3/10
128	5/5	5/10		1/5
32	1/5	3/10
8		1/10
4		0/5
2
1
0,5
0,25
0,12

infizierte unbehan- 18/20 Mäuse starben innerhalb von 3 Tagen delte Kontrollen nach der Infektion

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Die erfindungsgemäßen Produkte können durch Vereinigen mitgeeigneten Trägern in die verschiedensten pharmazeutischen Formen gebracht werden, zum Beispiel injizierbare Präparate, Tabletten, Kapseln, Pillen und dergleichen, aus denen sie sofort oder mit verzögerter Wirkung freigesetzt werden. Sie können in der Form von Dosierungseinheiten für therapeutische Einzeldosen oder in kleinen Einheiten für Mehrfachdosierungen oder in größeren Einheiten zur Unterteilung in einzelnen Dosen vorliegen«, Selbstverständlich können außer der therapeutisch wirksamen Verbindung Träger, Bindemittel, Füllstoffe und andere therapeutisch inerte Bestandteile vorliegen, die zur Ausbildung des gewünschten pharmazeutischen. Präparats erforderlich sind.

Durch die folgenden Beispiele wird die Erfindung näher erläutert .

Bei s"p IeIl
Bereitung des Inokulums

Ein beispielhaftes Medium, das zur Züchtung des Primär-Inokulums verwendet wird, wird nach folgender Vorschrift hergestellt:

Rindfleischextrakt 3,0 g

Bacto-trypton 5,0 g

Hefeextrakt 5,0 g

Stärke 24,Og

Dextrose 1,0 g

Wasser auf 1000 ml

Medium wird mit NaOH auf 7,0 pH eingestellt.

Von einem Schrägagar von Nocardia sp. NRRL 5646 abgewaschene oder abgeschabte Sporen werden zum Beimpfen von zwei 500 ml-Kolben, die jeweils 1OO ml des oben angegebenen sterilen

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Mediums enthalten, verwendet. Die Kolben werden auf eine Drehschütte!vorrichtung aufgebracht und 48 Stunden bei 28 ⁰C kräftig bewegt. Das so erhaltene Kolben-Inokulum wird in ein Glasfermentationsgefäß mit einem Fassungsvermögen von 19 Liter (5 gallon) überführt, das 12 Liter steriles Medium enthält. Die Maische wird mit steriler Luft belüftet. Die Züchtung wird etwa 48 Stunden geführt, wonach der Gefäßinhalt zum Besamen eines 300 Liter Fermentationstanks mit 150 Liter sterilem Impfstoffmedium verwendet wird. In diesem Zustand wird die Inokulum-Maische mit steriler Luft in einem Verhältnis von 1 Liter Luft je Liter Maische und Minute durch Einführung am Boden des Fermentationsgefäßes belüftet. Zusätzliche Bewegung ist nicht vorgesehen. Die Maische wird bei 28 ⁰C gehalten. Als Entschäumungssmittel wird Specköl verwendet. Nach 53—stündigem Wachstum wird diese Inokulum-Maische zum Beimpfen von 1350 Liter sterilem Fermentationsmedium in einem 2000 Liter fassenden Fermentationsgefäß verwendet.

Beispiel 2 Fermentation unter Verwendung von Nocardia sp. NRRL 5646

und eines die Erzeugung von BM123alpha begünstigenden Mediums

Ein Fermentationsmedium wird nach folgender Vorschrift hergestellt:

Bacto-pepton	10,0 g
Dextrose	10,0 g
Melasse	20,0 g
Ferriammoniumcitrat	0,1 g
Calciumcarbonat	1,0 g
Wasser auf	1000 ml

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Das Fermentationsmedium wird bei 120 °C mit Dampf von 1,4 atü (20 lbs.) Druck 60 Minuten sterilisiert. Nach der Sterilisation liegt der pH-Wert des Mediums bei 6,7. 1350 Liter steriles Medium werden in einem 2000 Liter fassenden Fermentationstank mit 150 Liter des wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellten Inokulums beimpft. Die Fermentation wird bei 28 ⁰C unter Verwendung von Specköl als Entschäumer durchgeführt. Die Belüftung erfolgt durch Einführung von 0,6 bis 0,7 Liter steriler Luft je Liter Maische und Minute. Die Maische wird durch einen mit 50 UpM angetriebenen Rührer bewegt. Nach einer Fermentationsdauer von etwa 230 Stunden wird die Maische aufgearbeitet.

Beispiel 3 Isolierung von BM123alpha

Es wird eine Fermentation wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Ein 30 Liter ausmachender Anteil der vergorenen Maische mit einem pH-Wert von 7,7 wird unter Verwendung von 300 g Diatomeenerde als Filterhilfe filtriert. Der Filterrückstand wird mit Wasser gewaschen. Filtrat und Waschflüssigkeit werden vereinigt (31 Liter), und der pH-Wert wird mit Salzsäure auf 6,5 eingestellt. Nach Zugabe von 62 g Natriumfluorid wird die Mischung eine" Stunde gerührt. Die gefilterte Suspension wird mit Hilfe von 310 g Diatomeenerde als Filterhilfe filtriert, wodurch ein Filtrat von 31 Liter erhalten wird. Dieses Filtrat wird langsam durch eine Säule aus IRC*^R) 5O (Na⁺) (Korngröße 297 - 149 Mikron, 50 bis 100 mesh) mit einem Bettvolumen von 1 Liter laufen gelassen. Die Harzsäule wird mit 4 Liter Wasser gewaschen. Das BM 123alpha wird durch Durchleiten von 0,3 η H₂SO^ durch die Säule und Auffangen von Fraktionen mit einem Volumen von 5OO ml eluiert. Die Fraktionen 1 bis 7,

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die die aktive Komponente enthalten, werden vereinigt und mit festem Ba<OH)₂ auf pH 7,2 eingestellt. Durch Abfiltrieren des Bariumsulfats wird ein klares Filtrat erhalten. Dieses klare Filtrat wird über Nacht durch eine Säule aus IRC ^K ' 50 (H ) mit einem Bettvolumen von 650 ml laufen gelassen. Die Säule wird mit 4 Litern Wasser gewaschen und mit 0,3 η H₃SO₄, wie oben beschrieben, eluiert. Die wirksamen Fraktionen (1 bis 7) werden wiederum mit Ba(OH)₀ auf pH 7,0 eingestellt und filtriert, wodurch 2,9 Liter einer klaren Lösung erhalten werden. Diese Lösung wird im Vakuum zur nachfolgenden Chromatographie an Kohle auf 75 ml eingeengt.

1 Liter granuliertes Darco^v ' G-60 (Korngröße 0,84 - 0,42 mm 20 - 40 mesh) wird in Wasser suspendiert, in eine Glaskolonne eingebracht und absitzen gelassen. Das überschüssige Wasser wird abtropfen gelassen, und das 75 ml Konzentrat wird langsam in die Säule einsickern gelassen. Die beladene Säule wird mit 4 Litern Wasser gewaschen und dann mit 3,5 Litern 50-prozentigem wässrigem Methanol entwickelt, wobei Fraktionen mit einem Volumen von jeweils 50 ml aufgefangen werden. Die wirksamen Fraktionen (18 bis 68) werden vereinigt, im Vakuum zu einer wässrigen Phase eingeengt und lyophilisiert, wodurch 6,4 g weißes festes BM123alpha erhalten werden. Die Kohlesäule wird dann mit 50-prozentigem saurem wässrigem Methanol (pH 1,8 mit H₃SO₄) zur Erzielung von weiteren 16 Fraktionen entwickelt. Die sauren Fraktionen werden vereinigt, im Vakuum zu einer wässrigen Phase eingeengt, mit Ba(OH)₂ auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt, filtriert und lyophilisiert. Man erhält so weitere 1,5 g BM123alpha. Die Dünnschichtchromatographie zeigt, daß beide Feststoffe ein Gemisch aus alphaj^ und alpha₂ darstellen. Dieses BMl23alpha wird vor der Mikroanalyse 16 Stunden in einem Abderhalden-Trockner über siedendem Äthanol getrocknet.

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Das BM123alpha hat keinen definierten Schmelzpunkt; allmähliche Zersetzung beginnt im Bereich von 2OO ⁰C. Die Mikroanalyse des Antibiotikums ergibt folgende Werte: C 33,89; H 5,71; N 11,88; O(direkt) 35,40; Asche Das BM123alpha ist durchsichtig bis hell im Bereich von 220 bis 340 nm, wenn es in 90-prozentigem Methanol mit 200 mcg/ml geprüft wird. BM123alpha hat eine spezifische Drehung von /alpha/ = +52,O (c 1_rOO in H₃O).

Das BM123alpha hat eine charakteristische Adsorption im Infrarotbereich des Spektrums bei folgenden Wellenlängen: 780, 815, 950, 1050, 1110, 1250, 1340, 1395, 1560, 1670, 1705, 2950 und 3330 cm . Ein Standard-Infrarot-Absorptionsspektrum von BM123alpha in einsEi Kaliumbromid-Preßling ist in Figur 1 der beigefügten Zeichnungen wiedergegeben:

Beispiel 4

Fermentation unter Verwendung von Nocardia sp. NRRL 5646 und eines die Erzeugung von BM123alpha und BM123gamma begünstigenden Mediums

Ein Fermentationsmedium wird nach folgender Vorschrift hergestellt :

Dextrose 1O,O g

Rindfleischextrakt 4,0 g

Bacto-pepton 4,0 g

Natriumchlorid , 2,5g

Hefeextrakt 1,0 g

Wasser auf 1000 ml

Medium wird mit NaOH auf 7,O pH eingestellt.

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Das Fermentationsmedium wird bei 120 C mit Dampf von 1,4 atü (20 lbs.) Druck 60 Minuten sterilisiert. Der pH-Wert des sterilisierten Mediums beträgt 6,7. 1350 Liter sterilem Mediums in einem Fermentationstank mit einem Fassungsvermögen von 2000 Liter werden mit 150 Litern des wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellten Impfstoffs beimpft. Die Fermentation wird bei 28 ⁰C unter Verwendung von Specköl als Entschaumungsmittel durchgeführt. Die Belüftung erfolgt durch Zufuhr von 0,4 Liter Luft je Liter Maische und Minute. Die Maische wird mit einem mit 50 UpM betriebenen Rührer bewegt. Nach einer Fermentationsdauer von etwa 85 Stunden wird die Maische aufgearbeitet.

Beispiel 5 Isolierung von BM123B und BM123gamina

1350 Liter wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellte Gärmaische werden unter Verwendung von 1 % Diatomeenerde als Filterhilfe filtriert. Der Filterrückstand wird mit 50 Liter Wasser gewaschen und verworfen. Filtrat und Waschflüssigkeit werden vereinigt und durch ein Bett mit einem Volumen von 10 Liter von IRC^l ' 50 (Na ) mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 330 ml/Minute lediglich durch die Schwerkraft strömen gelassen» Die beladene Säule wird dann mit 30 Liter Wasser gewaschen. Die Aktivität wird unter Verwendung von 170 Liter 0,3 η H₃SO₄ aus der Säule eluiert. Das Eluat wird in 2 Anteilen aufgefangen. Das erste Eluat besteht aus dem Eluat von Beginn (pH 7,0) bis zu einem austretenden Gut mit einem pH-Wert von 5,0. Diese ersten 45 Liter werden wegen ihres hohen Salzgehalts verworfen. Der zweite Anteil (120 Liter) hat einen pH-Wert von 1,4. Dieser saure Anteil wird mit festem Ba(OH)₂ auf pH 6,0 eingestellt. Das gebildete Bariumsulfat

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wird unter Verwendung von 1 kg Diatomesnerde als Filterhilf® abfiltriert» Der Fllterrttckstand wird mit 5 Liter Wasser gewaschen, und Piltrat und Waschflüssigkeit werden vereinigt und dann im Vakuum auf 2 Liter eingeengt. Dieses Konzentrat wird auf eias@sa Dampfbad auf- 50 .C erwärmt und su einer warmen Lösung won Rsinecke-Salss (150 g In 1500 ml Wasser von 75 ⁰C) gegebhn. Di® warme Lösung wird bei Zimmertemperatur 48 Stunden stehengelassen und dann filtriert, wodurch eine rot-purpurfarbea© fest© Substanz erhalten wird.

Diese fest© Substanz wikä alt SOO .sal-Wasser gewaschen. Der noch feuchte Feststoff wird Mt 2 !alter Wasser xmä 5 Liter 1-Butanoi gerührt und mit Q₁ 25» H₀SO₄ auf einem pH-Wert von 1,5 eingestellt. Die Mischung wird filtriert, und die wässrige Phase des Filtrats wird mater. Verwendung von Ba(OH)₂ auf pH 6,5 eingestellt. Di© Mischung wird filtriert raid im Vakuum auf 35O !al eingeengt. Das Koasentrafe wird durch eine 100 ml-Säule aus Dowex^ l-s4(Cl~) geleitet und lyophilisiert, wodurch- 5O g Prcäukt. erhalten

25Ο g Cellulosepulver warden salt 200""ial der oberen Phase" einer" Mischung aus 90 S Pii@nol s Chloroform : Pyridin, s Essigsäure s Wasser (250© s 300 s 45 s 45 s 750, jeweils Volraaen)" vsraiiseht „ Das' b®n@tst© Cellalosepulver wird in Anteilen in eisie Glaskolosae Mit einem Durchmesser von etwa 3,3 mm eingefüllte» Ein® SSisehtang aus IO g des oben beschriebenen Produkts, 26 sal ä®% oberen Phase tmd 2O g C@llul©eepialver wird auf äas ©bar© Ende -der Säule aufgegeibea _s Die Säule wisü άύ,ηη Mater Anwendung von Luftdruck, ven Of-21 atü- aiaf @ia©n atife dasi ©beren BnSe äex Glaskolomae dicht ^erbimd©aQiä ¥©2ffatsb3lillter-entwickelt. 'Unter laiwendimg eines automatisches Frsktlonssaimnelvorrichtung werden insgesamt 75 Fraktionen vosi jetfeils"25 ml aufgefangen. Die Aktivität wird durch Bloautographie festgestellt/ wobei eingetauchte Papiersch@ib@n luftgetroc'knet und mit Äther

0981 // 1130

O Q Γ 1 Q / /

gewaschen werden _t ehe man sie auf eine große Agarplatte aufbringt, die mit K.. pneumonia©, Stamm M), beimpft ist. Es werden zwei gesonderte aktiv© Banden beobachtet» Eine dieser Banden (BM123gamma) besteht aus Fraktionen 3 bis 18, und die zweite Bande (BM123S) aus den Fraktionen 31 bis 52.. Die Fraktionen 3 bis 18 v/erden vereinigt und. mit 1400 ml Chloroform versetzt, wodurch man ein Iweiphasensystem erhält. Nach der Abtrennung wird die obere wässrige Phase (pH 4,5) zweimal mit einem gleichen Volumen Äther extrahiert, um noch vorhaßd©n@s Phenol zu entfernen«, Die wässrige Phase-wird mit IR^ 45(OH)""auf pH 6*5 eingestellt und lyophilisiert, wodurch 1,62 g BMl23gamma erhalten werden. Die Fraktionen 32 bis 52 werden ebenfalls vereinigt und wie oben bescnrisbaa aufgearbeitet„ wodurch mast 1 ,05 g BM123ß erhält.

1 g BM123gamma wird 15. Minuten mit 20 ml" absoXistesa Methanol gerührt. Di© Suspension wird fll'tri©rt_p wdUireh man 305

Feststoff «rad @in Filtrat ©rhält» Das Fiitrafe wlzä irait 60 ml^Äther .^©ss©tsfcff tioäuzch maa ©1b® p ßen flockig@ji Stoffe ia Sfeher/&J@^haaol ©shSl-t* Dies® ■

si on wird filtriert und ergibt ©ia© %-miBm F@sta«bstaag m&ä ein weißliches Filtrafc. Bi© Fsststsbstans vrlzä auf a®m Tzlch,

ter mit Äfch@E gewagcheia. mad, le,f tf ©trocknet. _β - rad so 602 mg lMI23gaasma. Das BM123g®®Ma vizü im"¥@liwim In einem■■Abd©rh©ld©a~S^oeka®E' - üb©s ©i©d©sid©a? !.ta-ajaol IS d@n getroefeie-fef. @h© ®m

mstrischeß

Das BM123gaHEua hat: iseiaeis d®fini®rfe©i3 Schatalspisiakfe, seine allmähliche Sers®ts«ag bsgiimt. bsgi 200 ⁰C. Di© E-äikro analyse ©rgab folgend© Wertes C 4S_P13? H 6^651. M 17^00? O (direkt)-24_FSS? Äsch© 0_r90. In 90~pros©ntig©m Methaaol zeigt die Verbindung ein UV-Absos^tionsmaKimum hai 2Si sin

epeaifische-Drehung

Cc s l j,004 in

k ö S 8 I / / Ί I

BMl23gamma zeigt charakteristische Absorption im Infrarotbereich des Spektrums bei folgenden Wellenlängen: 765, 87O, 980, 1045, 1112, 1175, 1230, 1340, 1400, 1465, 1510, 1570, 161O, 1660, 2910 und 3333 cm"¹. Ein Standard-Infrarot-Äbsorptionsspektrum von BM123gamma in einem Kaliumbromidpreßling ist in Figur 3 der beigefügten Zeichnungen dargestellt .

670 mg BM123B werden mit 12ml Methanol 15 Minuten lang gerührt und filtriert. Durch Zugabe von 36 ml Äther zu dem Filtrat bildet sich ein weißer Niederschlag. Dieser Niederschlag wird auf einem Filter gesammelt, mit Äther gewaschen und luftgetrocknet, wodurch 466 mg BM123B erhalten werden, die dann im Vakuum über siedendem Äthanol 4 Stunden getrocknet werden, ehe eine Mikroanalyse durchgeführt wird.

BM123ß hat keinen definierten Schmelzpunkt, aber seine allmähliche Zersetzung beginnt hei etwa 200 ⁰C₀ Di© Mikroanalyse gibt folgend© Wertes C 47_?53i H 7,39? ti 164,54? Asche l,O4. In 98-prozenfcigem Methanol seigt BM123B ein üV-Äbsorptionsmaximuni bei 286 mm CE. - 200) » Die Lage dieses Maximums ändert sich mit dem pH-Wgrt nicht* B!*U23ß zeigt eine spezifische Drehimg /alpha/^ - +53_ff2^o (e = 1,250 in H₂O).

BM123B zeigt, charakteristisch© Absorption im XnSieasot,^ bereich des Spektrums bsi folgenden Wollenlängens 826_f 870,. 922, 98O, 1035, 1105, 1170, 1220, 1340, 1390, ISIO, 1560, 1600, 1670, 2950, 3080 und 3350 cm""¹. Ein Infrarot~Absorptionsspektrmn \mn BMI23B in ©insm ling ist in Figur 2 der _fb3ig@fügt@n- Zeichnungen geben.

■■ ■ ■ - - 31 -

Beispiel β

Papierverteilungg- und Dünnschiehtchromatographie von

aktiven Komponenten

Die antibakteriell®» Mittel können durch Papierchromatographie voneinander unterschieden w©Ed@n ο Zn diesem Zweck x^erden auf Streifen aus Whatman No» IHPapier Flecken von wässrigen. ©d©r msthanoIisehen Lösungen. der Sufoatansen aufgebracht, worauf 1 bis 2 Stunden In Gegenwart der ©b@ren und untarsa Phasen @quilifori<srt wird« Di® Streifen werden über Nacht mit'der unteren Corganischen) Phase ent- \-?lekelt, die aus einer Misehuag von 90-proaentigem Phenol s a=Cr@sol s Essigsäur® % Pyeldizi s Wasser (100 : 25 s 4 ! 4 : 75_f jeweils Volusa^a) erhalten wird. Die Str@if©n werden aus ü%t Chromatographierkararasr entfernt ', 1 bis 2 Stunden" asa ά®τ Luft g@troeka@t„ sur Entfernung iFon noch vorhandenem Phenol mit üth@r gewaschen und auf großen &ga£plaitt©si „. dl© mit ICo pn@umosiia@" besamt sind, bioautographi©rt <. K@ang©iclin©ad© Ef-=W©rt© siiad in dsr Tabelle VIII

T a b © S. 1 e

Komponente Rf

BM123gammä" . 0,88

BM123B . 0,62, 0,71

ia ■".-.■ .' 0^20, 0,47

Sowohl di@ alpha- als auch d£© Ε-Komponente sind Gemische aus zwei Antibiotica. Die B-Komponente besteht vorwiegend aus einem Antibioticum (Rf - Ό«62)', das als BM123ß₁ bezeichnet wird, und daneben einer geringeren Komponente BM123B, (Rf=0,71)

4.0981-7/1 130 .

™ f3 ÄS °™

Die am stärksten polare Komponente von BM123alpha (Rf = 0_?20) wird als BM123alpha. bezeichnet, und die weniger stark polare Komponente (Rf - 0,47) wird als BM123alpha₂ bezeichnet.

BM123alpha wird unter Anwendung einer auf der Dünnschichtchromatographis beruhenden Methode in zwei

(Rl Komponenten zerlegt, ^obei Polygram ' CeI UV 254 eine von Brinkmann Instruments Ltd., Westbury, ■ New York,. verkaufte Form vois. DÜnzischichtcellulose verwendet wird.' Die Dünnschichtplatten, auf die Flecken aufgetragen worden sind, werden mit wasser', das. 1 % Trinatriumcitrat enthält, entwickelt. Die Zonen werden wie oben beschrieben durch Bioa^tographie auf Agarplatten festgestellt. Zwei Zonen werden gefunden, BM123aipha- mit einem Hf = O,9O nnä BM123alpha₂ mit. einem Ef =_O,65.

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Claims

1. Antibakterielles BM123alpha<, eine -Verbindung die "(a) das Wachstum von Bakterien wirksam inhibiert und in ihrer praktisch reinen kristallinen Form Cb) eine optische Drehung

/alpha/p - +52/0 (c = 1,00 in Wasser), zeigt„ CcI folgende Elementaranaiyse C 33,89,. H 5,71, E 11,88, 035,40 % aufweist und (d) das in Figur 1 der beigefügten Zeichnongen wiedergegebene charakteristische Infrarotabsorptionsspektrum aufweist.

2. .Verbindung nach Anspruch 1, antibakterielles BM123alpha in seiner praktisch ■-reinen Form»

3. Antibakterielles. BM132ß, eine Verbindung die (a) das Wachstum von Bakterien wirksam inhibiert und in ihrer praktisch reinen kristallinen Form Cb) eine optische Drehung /alpha/^⁵ = +53,2°'(c = 1,250 in Wasser) aufweist, (c) folgende Elementaranalyse (in %) hats. C 47*53, H 7*39, M 16,54, Asche 1,04 seigt und (d) das in Figur .2 der beigefügten Zeichnungen dargestellte charakteristische 'Znfrarotabsorptios&s*- spektrum hat.

4. Verbindung nach Anspruch 3, äntibakterielles BM123ß in seiner praktisch reinen Form»

5. Antibakterielles BM123gainma, eine Verbindung, die (a) das Wachstum von Bakterien-wirksam Inhibiert.und in ihrer praktisch reinen kristallinen Form (b) eine optische Drehung

4 098 17/1IJO

/alpha/r³ = +53,8 (c = 1,004 in Wasser) aufweist, (c) folgende elementaranalytischen Werte (in %) hat: C 46 ,-13, H 6,65, N 17,00, 0 24,96, Asche 0,90 und (d) das in Figur 3 in den beigefügten Zeichnungen wiedergegebene charakteristische Infrarotabsorptionsspektrum aufweist.

6. Verbindung nach Anspruch 5_r antibakterielles BM123gamma in seiner praktisch reinen Form.

7. Verfahren zur Herstellung von antibakteriellem BM123alpha, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus mit den Charakteristika von Nocardia sp. NRRL 5β4β oder Mutanten davon in einem wässrigen Nährmedium, das assimilierbare Quellen eines Kohlehydrats, von Stickstoff und anorganischen Salzen enthält,unter submers aeroben Bedingungen züchtet, bis "diesem Medium eine beträchtliche antibakterielle Aktivität erteilt worden ist und dann antibakterielles BM123alpha aus diesem Medium gewinnt.

8. Verfahren zur Herstellung von antibakteriellem BM123S _f dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus mit, den Charakteristika von Nocardia sp. NRlL 5646 oder Mutanten davon in einem wässrigen Nähraedium, das assimilierbar© Quellen von Kohlehydrat, Stickstoff und anorganischen Salzen enthält:, unter submersen aeroben Bedingungen züchtet, bis- diesem Medium eine beträchtlich antibakterielle Aktivität erteilt worden ist und dann antibakterielles BM123B aus diesem Medium gewinnt.

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9. Verfahren zur Herstellung von antifoakterieilem BM123gamma, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus mit den Charakteristiken von Nocardia sp. NRRL 564S oder Mutanten davon in einem wässrigen Nährmedium, daß assimilierbare Quellen von Kohlehydrat, Stickstoff und anorganischen Salzen enthält, unter subntersen aeroben Bedingungen züchtet bis diesem Medium eine beträchtliche antibakterielle Aktivität erteilt worden ist und dann antibakterielles BM123gamma aus diesem Medium gewinnt.

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