Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowego zwiazku przeciwbakiteiryjinego MB 123 na drodze fermentacji.Nowy ziwiajzek MB 123, stanowiacy mieszanine trzech czynników przeciwbakteryjnych, oznaczo¬ nych symbolami BM 123 a, BM123jl, i BM 123 y tworzy sie w czasie hodowli, w kontrolowanych warunkach, nowego szczepu, niezidentyfikowanego gaitumku Nocardia. Ten nowy szczep, wytwarzaja¬ cy antybiotyk, izolowano z próbki ziemi ogrodowej, pobranej w Oceo/la, w stanie Iowa. Jest on przecho¬ wywany w zbiorze hodowli firmy Lederle (Lederle Laboratories Division, American Cyanamid Com¬ pany, Pearl River, New York), jako hodowla ozna¬ czona numerem BM 123. Zywa hodowla tego nowe¬ go drobnoustroju zostala zdeponowana w Culture Colleotion Laboratory, Northern Utilization Rese¬ arch and Development Divisions, Umited States Department of Agriculture, Peoria, Illinois i dola¬ czona do stalych zbiorów. Jest ona tam dostepna dla wszystkich pod numerem akcesji NIRiRiL 5646.Badania, dotyczace okreslenia cech hodowlanych, fizjologicznych i morfologicznych drobnoustroju Nocardia sp. przeprowadzono zgodnie z metodami, przedstawionymi szczególowo w pracy: Shirling i Gottlieb, Internat. Journ. of Syst., Bacteriol. 16:313-240 (1966). Sklad chemiczny hodowli okreslo¬ no metodami, podanymi przez Lechevalier i wsp.Advan, Appl. Microbiol. 14:47-72 (1971). Podstawo¬ we bairwy opisowa jak i okreslenie odmian barw oparto o prace Jacobson i wisp. Color Harmony Manual, trzecie wydanie (1948) Container Corpor. of. America', Chicago, Illinois. Szczególy opisowe, zebrane w tabelach 1 do 5, podane sa ponizej.Obfitosc wzrostu: mierny wzrost na agarze z wy¬ ciagiem drozdzowym, z asparagina i dekstroza, na agarze Benedicta i Bennetta, na agarze ziemniacza¬ nym z dekstroza i na agarze WeinSteina. Lekki wzrost na agarze Hickeya i Tresnera,, na agarze z pasta pomidorowa, maka owsiana i agarze odzyw¬ czym. Na agarze z nieorganicznymi solami i skro¬ bia, na agarze Kustera z plytkami owsianymi, na agarze z roztworem Czapka i agarze ryzowym stwierdza sie jedynie slady wzrostu.Grzybnia powietrzna: jezeli grzybnia powietrzna jest obecna ma ona barwe bialawa. Wytwarza sie ona jedynie na agarze z wyciagiem drozdzowym, na agarze z asparagina i dekstroza, na agarze Be¬ nedicta* na agarze Bennetta oraz na agarze ziem¬ niaczanym z dekstroza.Rozpuszczalne bairwoiki: rozpuszczalne barwniki nie wytwarzaja sie.Barwa dolnej powierzchni: Bezbarwna lub odcie¬ nie zóltawe.Róznorodne reakcje fizjologiczne: brak rozpu¬ szczania zelatyny, w ciagu 7 dni azotany sa reduko¬ wane do azotynów: na agarze peptonowo-zelazowym brak wytwarzania pigmentu melanoidowego, brak peptonizacji i scinania na mleku purpurowym; to¬ lerancja NaCl na agarze z wyciagiem drozdzowym 85 81485 814.; J ;•- [ 3 V ,;-; r f ¦;' ' {'¦ '; 4%, lecz <7%, optymalna temperatura dla wzro¬ stu 32°C.Wykorzystanie zródla wegla, zgodnie z metoda: Pridham i Gottlieb (J. Bacteriol. 56:107-114 (1948) przedistawia sie nastepujaco: dobrze wykorzysty¬ wane, sa nastepujace zwiazki: glicerol, salicyma, d-trehaloza i dekstroza, i-inozytol jest srednio wy¬ korzystywany. Natomiast slabo, luib wcale nie sa wykorzystywane nastepujace zwiazki: d-fruktoza, maltoza, adonitol, 1-arabinoza, laktoza, d-mannitol, d-melibioza, d-rafinoza, 1-ramtioza, sacharoza i d-ksyloza.Sklad chemiczny: drobnoustrój nalezy do typu IV sciany komórkowej, to znaczy zawiera kwas mezo^6^dwuaminopimelinowy, a sklad cukrowco- wyj (jalefkomórki jest typu A—to znaczy w jego sklad wchodzi arabinoza i galaktoza. Metylowane wyciagi calych komórek, poddane chromatografii -. * «g«£o^fej; wykazuja sklad kwasów tluszczowych, po- "dobny ófo wytwarzanego przez Nocardia, asteroides ATGC 3308.Mikromorfologia: grzybnia powietrzna wyrasta z grzybni podstawowej w postaci slabo rozgalezio¬ nych, miernie dlugich falistych elementów, które zwykle koncza sie wydluzona, podstawowa spira¬ la. Faliste (krete) elementy sa nieregularnie podzie¬ lone na krótkie eliptyczne do cylindrycznych od¬ cinków (zarodniki), które latwo ulegaja rozczlon¬ kowaniu. Koncowe odcinki spiralne sa mniej wy- Tablica 1 Charakterystyka hodowlana szczepu Nocardia sp.NRRL 5646 Czas inkubacji: 14 dni Temperatura: 32°C [Podloze 1 agar z wyciagiem drozdzowym agar Hickeya i Tresnera agar z asparagina i dekstroza agar Benedicta agar Bennetta agar skrobiowy z solami nieorga¬ nicznymi Obfitosc wzrostu 2 mierny wzrost lekki mierny mierny mierny slad Grzybnia po¬ wietrzna i/lub zarodniki '3 grzybnia powie¬ trzna bialawa, lekka brak grzyibni powietrznej slad grzybni powietrznej o barwie biala¬ wej grzybnia powie¬ trzna bialawa, lekka slad grzyibni po¬ wietrznej o bar¬ wie bialawej brak grzybni powietrznej Rozpuszczal¬ ny barwnik 4 brak brak brak brak brak brak Barwa spodniej powierzchni musztardow0 (31e) bezbarwna do zóltawo zielonej bursztynowa (3 Ic) naturalnej opalenizny 4gc wielbladzia (3ie) bezbarwna Uwagi: 6 ciemniejace Obszary w grzy¬ bni podstawo¬ wej na powierz¬ chni grzybni utworzone owo¬ cnie obwodowe od¬ cinki kolonii * staja sie oliw¬ kowo zielone powierzchnia lekko pofaldo¬ wana obfite owocnie na powierzchni grzybni powierzchnia lekko pofaldo¬ wana raznie podzielone. Segmenty czy odcinki na ogól maja wymiary 0,8—1,7 \vm X 0,3—0,5 pim, srednio 0,4 urn X 1,2\tm. ; Rozpoznanie: charakterystyczne cechy morfolo- giczne hodowli No BiM 123 sa trudne do zaobserwo¬ wania i interpretacji, poniewaz na wiekszosci po¬ dlóz grzybnia powietrzna rozwija se bardzo slabo.Wobec tego, poza niezbedna koniecznoscia, przy¬ wiazuje isie szczegódna wage do analizy chemicznej i* w okreslaniu rodzajowych zaleznosci drobnoustro¬ ju. Na podistawie systemu, zaproponowanego przez Lechevalier*a i wsp. hodowla BM123 zawiera w pelnych komórkach kwas mezo-2,6-dwuaminopime- limowy, a analiza cukrów wykazuje obecnosc ara- binozy i galaktozy. Wobec tego hodowla nalezy do IV typu sciany komórkowej. Porównanie wyników chromatografii gazowej hodowli BM 123 z takimi hodowli Nocardia asteróides ATCC 3308 wykazuje uderzajace podobienstwo. Inne cechy charaktery- styczne hodowli BM 123, które sa zgodne z pogla¬ dem, ze jest to Nocardia, to fragmentaryczny wzrost powietrzny na niektórych podlozach i calkowity brak wzrostu powietrznego na wiekszosci podlóz.W swietle braku dostatecznych kryteriów dla scha- rakteryzowania Nocardia na poziomie gatunku, nie podjeto dalszych prób dla dokonania tego ustale¬ nia. Tak wiec hodowle BM 123 nalezy uznawac za niezdefiniowany gatunek Nocardia, dopóki takie rozpoznanie nie bedzie mozliwe do przeprowadze- nia.85 814 6 ciag dalszy taibiMcy 1 I 1 agar Kustera z platkami owsia¬ nymi agar z roztworem Czapka agar ziemniacza¬ ny z dekstroza agar* z pasta po¬ midorowa i ma¬ ka owsiana agar odzywczy agar ryzowy agar Weinsteina agar Kustera z platkami ow¬ sianymi 1 2 slad slad mierny lekki lekki slad mierny slad ,3 braik grzybni powietrznej brak grzybni powietrznej grzybnia powie¬ trzna bialawa, lekka , brak grzybni powietrznej brak grzybni powietrznej brak grzybni powietrznej brak grzybni powietrznej brak grzybni powietrznej 4 5 brak brak brak brak brak brak brak brak bezbarwna bezbarwna wielbladzi 3 ie bezbarwna bezbarwna bezbarwna bezbarwna do zóltawej bezbarwna 6 Tablica2 Tablica 3 Mikromorfologia szczepu Nocardia sp NRRL 5646 Róznorodne reakcje fizjologiczne Nocairdia tap. NRRL 5646 i Podloze agar z wy¬ ciagiem drozdzo¬ wym Grzybnia powietrzna i/lub sporopodobne struktury grzybnia powietrzna wyrasta z grzybni podstawowej w postaci slabo rozgalezionych, kretych (fa¬ listych) elementów, które zwykle koncza sie wydluzona podstawo¬ wa spirala. Krete (faliste) ele¬ menty sa nieregularnie podzielo¬ ne na krótkie odcinki (zarodni¬ ki), które latwo ulegaja rozczlon¬ kowaniu. Koncowe odcinki spi¬ ralne sa mniej wyraznie podzie¬ lone. Segmenty czy odcinki na ogól maja wymiary 0,8—1,7 |umX X0,3—'0,5 utiri srednio 0,4 \\mX Xl,2 jun.Podloze zelaltyna zelatyna bulion z organicz¬ nym azo¬ tanem agar pep- tonowo- -zelazo- wy mleko purpuro¬ we wyciag drozdzo¬ wy i agar z dodat¬ kiem NaCl 4, 7, 10 i 13% Okres inku¬ bacji 7 dni 14 dni 7 dni 24^8 godzin 7 dni 7 dni ' Obfitosc wzrostu lekki wzrost dobry wzrost dobry wzrost dobry wzrost dobry wzrost mierny wzrost Reakcje fizjologiczne brak roz¬ puszczania brak roz¬ puszczania azotany re¬ dukowanie do azoty¬ nów brak wytwa¬ rzania pig¬ mentu mela- niinowego brak pepto- nizacji lub scinania Tolerancja NaCl: 54% lecz <7% |85 814 T a fb 1 i o a 4 Wykorzystanie zródel wegla przez Nocardia sp. NRRL 5646 Okres hodowli: 10 dni Zródlo wegla adoniitol 1-arabinoza gliieeiroil d-fruktoza i-inozytol . laktoza„ d-mannitol salicyma dnmelibioza d-rafinoza , ramnoza mialltoza saiahiaroiza d-itrehialozia d-ksyloza dleksitiroiza ujelmna koptiriola Temperatura: 32°C Wykorzystanie 0 0 . 3 1 2 0 0 2 0 0 0 1 0 3 0 3 0 3 — dobre wykorzystanie 2 — mierne wykorzystanie 1 — slabe wykorzystanie 0 — brak wykorzystania Tablica 5 sklad chemiczny Nocardia sp. NRRL 5646 Typ sciany komórkowej: typ IV Glówne skladniki: mezonDAP, aralbinoza galakitoza Tablica 5 sklad chemiczny szczepu Nocardia sp. NRRL 5646.Typ sciany komórkowej: typ IV Glówne skladniki: mezo-iDAP, arabinoza galaktoza Wstepne wyodrebnianie, badania .za pomoca chro-. matografii cienkowarstwowej i chromatografii bi¬ bulkowej wykazaly, ze w czasie powietrznej fer¬ mentacji szczepu Nocardia sp. NRRL 5646 wytwa¬ rzaja sie co najmniej trzy antybiotyki. Badania podlozy odzywczych wykazaly, ze powstaja dwa typy brzeczki, typ gamma — wytwarzajacy glów¬ nie BM 123 y obok mniejszych ilosci BM 123 a i BM 123 y oraz typ alfa — wytwarzajacy glównie BM 123 a.Proces fermentacyjny, wyselekcjonowany dla wy¬ twarzania glównie BM 123 hodowle szczepu Nocar¬ dia sp. mozna przeprowadzac na licznych odmia¬ nach plynnych podlóz hodowlanych. Podloza, przy¬ datne dla wytwarzania tego nowego zwiazku prze- ciiwbafcteryijnego, zawieraja przyswajalne zródlo wegla takie, jak skrobia, cukier, melase, glicerol itp. przyswajalne zródlo azotu takie, jak bialko, hy¬ drolizat bialkowy, poiipeptydy, aminokwasy, wy¬ ciag namokowy kukurydzy iltp. nieorganiczne anio¬ ny i kationy takie, jak potas, sód, wapn, siarcza¬ ny, fosforany, chlorki itd. Zródlem elementów sla¬ dowych takich, jak bor, molibden, miedz itd. sa za¬ nieczyszczenia innych skladników podloza. Tanki i kolby napowietrza sie, wprowadzajac jalowe po¬ wietrze do podloza fermentacyjnego lub na jego powierzchnie. Dalsze mieszanie zabezpiecza mie¬ szadlo mechaniczne (wirnik). W razie potrzeby — 40 50 66 60 65 jako srodka przeciwpiennego — mozna uzyc oleju smalcowego.Przygotowanie inoculum dla BM123a: inoculum szczepu Nocardia sp. NRRL 5646 przygotowuje sie w kolbie trzesawkowej, zaszczepiajac 100 ml jalo¬ wego plynnego podloza w 500 ml kolbie ze skroba¬ nymi lub splukanymi zarodnikami z hodowli na agarze skosnym. Ponizej podano przyklad odpo¬ wiedniego podloza: wyciag wolowy 3,0 g BactcHtryptone 5,0 g wyciag drozdzowy 5,0 g skrobia ' 24,0 g dekstroza 1,0 g woda do 1000 ml pH podloza doprowadza sie do 7,0 za pomoca NaOH.Kolby inkubuje sie w temperaturze od 25°C do 29°C, najlepiej jednak w temperaturze 28°C przy energicznym wytrzasaniu na trzesawce obrotowej przez 30—48 godzin. Te 100 mililitrowe porcje ino¬ culum sluza do zaszczepiania jednolitoowych i 12-li- trowych porcji tego samego podloza, znajdujacych sie — odpowiednio — w 2-litrowych i 20-litrowych saklanych fermentorach. Zaszczepiona brzeczke na¬ powietrza sie jalowym powietrzem w czasie wzro¬ stu, trwajacego 40—55 godzin. Tymi porcjami ino¬ culum zaszczepia sie tamki fermentory.Fermentacja w tanku dla BM 1£3 a: Dla wytwa¬ rzania BM 123 a w tanku fermentacyjnym uzywa sie stale nastepujacego podloza: BactOHpeptone 10,0 g dekstroza 10,0 g melas 20,0 g cytrynian amonowo-zelazowy 0,1 g weglan wapniowy 1,0 g woda do 1000 ml Kazdy tank zaszczepia sie 3 do 10% inoculum, przy¬ gotowanym w sposób, podany wyzej. Napowietrza¬ nie przeprowadza sie w ilosci 0,2—0,8 litra jalowe¬ go powietrza na litr brzeczki na minute, a miesza¬ nine fermentujaca miesza wirnik (mieszadlo), obra¬ cajacy sie z szybkoscia 50—200 obrotów na minute.Temperature utrzymuje sie w granicach 25°C—29°C, zwykle 28°C. Zazwyczaj fermentacje przerywa sie po uplywie 240 godzin i zbiera brzeczke.Izolowanie BM123a: po zakonczeniu fermentacji brzeczke, zawierajaca BIMll23ia przesacza sie, naj¬ lepiej, przy pomocy ziemi okrzemkowej,, lub in¬ nych konwencj analnych srodków, wspomagajacych saczenie. Normalnie ciasto grzybniowe przemywa sie woda, a popluczyny laczy z przesaczem. Prze¬ cietnie przesacz wynosi 310 litrów. pH oprowadza sie do 6A dodaje fluorku sadowego li mieszanine miesza przez okres okolo jednej godziny. Uzyska¬ na zawiesine saczy sie przez ziemie okrzemkowa- Przesacz przesacza sie przez kolumne z IRCR -n50(N.al+) (50—MW) mesh) (lekko kwasna zywica, produkowana przez firme Rohim and Haas Co., Pihiladelphiia, Peninsylviandia) o objetosci zloza 1 litr. Kolumne z zywica przemywa sie 4 litramli wody. BMl'23ia wypalikuje sie, przeipusizcaajac przez kolumne 0,3 NH^S04. Eluat — lacznie 500 ml — zbiera sie w odpowiednich frakcjach. Frakcje od85 814 1 do 7 wlacznie, zawierajace aktywny skladnik BM123a, laczy sie razem i doprowadza pH do 7,2 przy pomocy Bai(OH)2. Powstaly siarczan barowy usu¬ wa sie saczeniem, uzyskujac klarowny przesacz. Kla¬ rowny przesacz przepuszcza sie przez kolumne 5 IRCR -^50(H+) o objetosci zloza 650 ml. Koiumne przemywa sie woda i eluuje0,3 N H2S04 jak opi¬ sano wylzej. Aiktywine frakcje (1 do 7) laczy sie i podobnie doprowadza pH do 7.0 za pomoca Ba(OH)2 i saczy, uzyskujac klarciwny przesacz. 10 Przesacz ten zageszczav sie pad zmniejszanyim cis¬ nieniem i poddaje chromatografii na weglu. Ziar¬ nisty (preparat DarcoR G^60 (20—40 mesh) zawie¬ sza sie w wodnie, wypelnia sie zawiesina kolumne szklana i pozostawia do ulozenia na zloza. Nad- is miar wody odciaga sie i naklada na kolumne kon¬ centrat BM123a, poizosltawiaijac do swobodnego wnikniecia na kolumne. Naladowana kolumne przemywa sie woda, a nastepnie eluulje 90% wod¬ nym roztworem metanolu, zbierajac firakcje o ob- 20 jetosci 90 ml. Aktywne firialkcje (18 do 08) laczy sie, zageszcza pod 'zmniejszonym diisniemiem do wodnej warstwy i liofilizuje, otrzymujac BMj123g w po¬ staci stalej, bialej substancji. Dalsza czesc prepara¬ tu BM123a otrzymuje sie, eluujac w dalszym cia- 25 gu kolumne 50% zakwaszonym wodnym roztwo¬ rem metanolu (pH = l.fy H4SO4), az do uzyskania 16 dodatkowych frakcji. Zakwaszone frakcje laczy sie razem i zageszcza pod zmniejszonym cisnieniem do wodnej fazy, doprowadza pH do 7,2 za ipomoca 30 Ba(OH)2, saczy i liofilizuje. Charakterystyke wla¬ sciwosci fizycznych preparaltu BM123a podlano ruizej w przyfclaioMe UH.Proces farmerotacyjny wyselekcjcynowany dla wyltwarzania przede wszysltkiim BM123B i BM12Qy- 35 Dane, jak dla BM123fc. Przygotowanie iinoculum dla BMJ123B i BMiafy: itakie jak dla BM123a.FermenJtacja w tanku dla BM123B i BM1!23y: Ce¬ lem wytworzenia BM123y w tanku fermentacyj¬ nym uzywa sie stale nastepujacego podloza: 40 dekstroza 10.0 g wyciag wolowy 4.0 g Bacto-paptone 4.0 g chlorek sodowy 2.5 g wyciag drozdzowy 1.0 g 45 woda do 1000 ml pH podloza doprowadza siie do 7.0 za pomoca NaOH. Katady tank zaszczepia sie 3 do 10% ino- culum, przygotowanym w sposób opisany wyzej.Napowietrza sie jalowym powietrzem w ilosci 53 0.2—0.8 litra na litr brzeczki na minute. Miesza¬ nine fermenltuijaca miesza wirnik (mieszadlo),ob¬ racajacy isie z szybkoscia 50—'200 obroitów na mi¬ nute. Temperature utrzymuje , sie w granicach °C—29°C, zwykle 28°C. Fermentacje prowadzi 55 sie zazwyczaj przez 45—85 godzin, po czym brze¬ czke zbiera sie.IzOlowanlie BM123B i BM123y: przefermentowa- na brzeczke zawieraijaca BM123B i BM123y prze¬ sacza siie, uzywajac jako czynnika wspomagaja- e5 cego saczenie 1% zawiesiny ziemi okrzemkowej.Ciasto przemywa sie nastepnie woda. Polaczone przesacze i popluczyny przepuszcza sie przez zy¬ wice IRC1* 50(^8^) o objetosci zloza 10 litrów, Szyfckosc przeplywu przez kolumne, pod wplywem ^ sily ciezkosci, wynosi 330 ml na mflnute. Nalado¬ wana kolumne przemywa sie woda. Aktywny zwiazek eluutfe sie z kofcumrmy przy pomocy 0.3 N H2SO4. Eluat zbiera sie w dwóch porcjach.Pierwsza porcje, skladajaca sie z. eluaitów od pierwszego ca sie z powodu duzej zawartosci soli. pH dlrugiej porcji wynosi okolo 1.4. Te porcje, o kwasnym odczynie, doprowadza sie do pH = 6.0 przy pomo¬ cy Bai(OH)2. Wyftworzony siarczan barowy usuwa sie saczeniem przez ziemie okrzemkowa. Osad przemywa sie woda. Polaczone przesacz i poplu¬ czyny zageszcza sie pod zmniejszonym cisnieniem.Koncentrat ogrzewa sie na lazni parowej do 50°C, a do goracego roztworu idodaje sie sól Reineckego (150 g na 15O0 ml przy temperaturze 75°). Goracy roztwór odstawia siie na okolo 48 godzin, a naste¬ pnie przesacza, uzyskujac czerwono-purpurowy osad, który przemywa sie woda. Wilgotny osad miesiza sie z mieszanina wody i l- i doprowadza do pH = 1.5 przy pomocy O.25NH2SO4 Mieszanine saczy sie, a pH wodnej fazy.przesaczu doprowadza do 6 do 8 i saczy. Drugi przesacz za¬ geszcza sie pod zmniejszonym cilsndeniem. Koncen¬ trat przepuszcza sie prizez 100 ml kolumne Do- wexR l-x4(01—) i liofilizuje.Rozdzial sklaidndków BM123B i BM123y P?2? P°"~ mocy chromatografii iproszek celulozowy miesza sie dokladnie z górna faza mieszaniny 9*0'% fenol: chloroform: piiirydyna: kwas octowy: woda zmie¬ szanych w stosunkach 1500:300:45:45:7150. SzMana kolumne napelnia sie proszkiem celulozowymi.Na wierzch kalumny naklada sie próbke w po¬ staci mieszaniny wyzej opisanej, .zliofillizowanej, zlozonej mieszaniny, rozpuszczonej w górnej fa¬ zie i proszku celulozowego w stosunku 1:2 v(W).Kolumne rozwija sie, uzywajac cisnienia powie¬ trza ze zbiornika, dolaczonego do wierzcholka ko¬ lumny szklanej. Lacznie zbiera sie 75 frakcji,, o objetosci 25 ml kazda, przy pomocy automatycz¬ nego kolektora frakcji. Aktywnosc lokalizuje sie przy pomocy bioautografii. Zanurzone w poszcze¬ gólnych frakcjach krazki bibuly suszy siie na po¬ wietrzu, przemywa eterem i naklada na duze plyltki zasiane K. pneumomiae, szczep AD. Stwier¬ dza sie dwa odrebne pasma aktywnosci. Jedno z nich (BM123y) sklada sie z frakcji 3 do 18 i dru¬ gie (BM123B) — skladajace sie z frakcji od 3*1 do 52. Erekcje 3 do 18 laczy sie razem i dodaje chlo¬ roformu, uzyskujac system 'dwufazowy. Dolna faze odrzuca sie. Górna, wodna faze (pH = 4.5) ekstra¬ huje sie dwukrotnie jednakowa objetoscia eteru celem usuniecia pozostalych resztek fenolu. pH wodnej fazy doprowadza sie do 6.5 przy pomocy IRR 45 podobny sposób postepuje sie z polaczonymi frak¬ cjami 31 do 52, uzyskujac BM123B.Stosujac standardowa metode rozcienczen aga¬ rowych, porównuje sie aktywnosc tych trzech zwiazków w sltosunku do róznych drobnoustrojów Gram dodaltnich, Gram ujemnych, jak równiez do M. smegmaltis. Wyniki, wyrazone jako minimalne stezenia hamujace (mcg/ml), zestawiono w tabeli 6.Dla celów porównawczych badano 'wrazliwosc tych drobnoustrojów w stosunku do gentamycyny.11 85 814 Tablica 6 12 Drobnoustrój Mycobacterium smegmuatis No. 607 Staphylococcus aureus Rose ATCC 14154 Staphylococcus aureus Smith ATCC 13709 Staphylococeus aureus No 340I50B122-3 Bacillus cereus ATCC 9634 Bacillus globi^ii Bacillus subtdildis No. Stansly R-78 Biacillu® subltilis No. 18 Stansly R-76 Ooiryimebaictieiriium xeax:isis NRRL B-I1I397 Enterococcus CK Sarcima lutea ATCC 9341 Enterobacter aerogenes No. 75 Esichertichiia coli U311 Escherlichia coli No. 29 Klelbsieflila pneumoniae, typ A szczep D IProleuis miiirabiilis ATCC 4671 Proteuis morgami ATCC 8019 Proteus vulgaris ATCC 9484 Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 Pseudomonas aeruginosa PA7 Sailimonel'1/a galiinarum Lederle 605 Salmonella tyiphosa ATCC 6539 Shigella shiga Mininimalne stezenie hamujace siarczan giemtamy- cyny 0.1 0.1 0jO5 0.25 0.25 0.025 0.025 0.1 0.025 2^ 0.25 0.1 0.105 0j05 0.05 0.25 0.1 0.1 2.5 0:05 0.1 0.25 BM123 V 0.25 0.25 0.25 0.25 1 0.25 0.25 0.6 0.25 1 0.25 0.25 0.25 0.1 0.25 0.25 0.25 0.1 0.1 0.25 BM123 6 2.5 1 2.5 0.25 0.25 1'00 0.5 . 0.5 0,5 0.25 2.5 1 0,5 50 ioo 0.5 0,5 2J5 rmcg/ml) BM123 a 100 100 100 200 50 50 200 20O 50 Te trzy zwiaztai przeciw/bakteryjne BMli23a, BM123B i BM123y sa aktywnie in vivo w stosunku do iróznych droibnousittrojów. Te nowe zwiazibi pirzeciwfoailqteryjine sa wiec potencjiaJlniie przydatne jako czynniki terapeutycznie w leczeniu bakteryj¬ nych zakazen ssaków. Mozna sie spodziewac przy¬ datnosci tych nowych zwiazków przeciwifoakteryj- nych w leczeniiiu lub zapobieganiu (zakazeniom bakteryjnym parzy stosowaniu pozajelitowym.Przydatnosc tych nowych zwiazków przeciwbak- teryjnych wykazano w zdolnosci hiamowania syste¬ mowych letalnych zakazen myszek. Te nowe zwiazki wykazuja antybakteryjna aktywnosc in viivio w stosunku do myszek, zakazonych drobnoustrojami Proteus mirabilis ATCC 4671, Klebsielja pneumo¬ niae AD i Escheriichia -coli UC311. Przydatnosc te stwierdzono po izastcsowamiu jednej, podskórnej dawlkd grupom mysizek Cafrtiworth Farims CF-1, wi2igi okolo 20 g, zakazanych sródoltirizawncwo le- talnymi dawkami tych drobnoustrojów, stsincwia- cymi odpowiednio rozcienczenia 10^1»6,, 10—* i 10—3' TSP hodowli krwawej wymienianych drobnoustro- jcw w bulionie sojowym TSP.Podane w tablicy 7 wyniki ilustruja przeciw- bakteryjma aktywnosc in vivo zwiazków BM123a, BM12i313 i BM123y w stosunku do tych trzech drobinoustrojów.Zlwiiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalaz¬ ku, mozna stosowac pod róznymi formami farma¬ ceutycznymi, jak wstrzykniecia, tabletki, kapsulki, pigulki itp,, pod postacia zwiazków o natychmia¬ stowym dzialaniu lub o dzialaniu przedluzonym, po polaczeniu z ódpowliedniimi nosnikami. Moga byc orne pod postacia gotowych porcji dla jedinej dawki terapeutycznej lub pod postacia mailych 40 45 50 55 ©0 65 jednostek dla wielokrotnego dawkowania,, lub w wiekszych porcjach dflja podzialu na pojedyncze dawki. Oczywiscie jako dodatki do zwiazków te¬ rapeutycznych mozna stosowac zarobki, spoiwa/ nosniki i inne, terapeutycznie obojetne skladniki, dla wytworzenia odpowiednich preparatów farma¬ ceutycznych.Przy/kjlad I. Przygotowanie inoculuim Typowe podloze, uzywane do wzrostu pierwot¬ nego inoculum, przygotowuje sie wedlug nastepu¬ jacego przepisu: wyciag wolowy Bacto^tryptone Wyciag drozdzowy Skrobia Dekstroza woda do 3.0 g .0 g .0 g 24:0 g 1.0 g 1000 ml pH podloza doprowadza sie do 7.0 za pomoca NaOH. Splukanymi lub zdrapanymi z agaru skos¬ nego zarodnikami Nocardia sp. NRRL 5646 zaszcze¬ pia sie dwie kolby o objetosci 500 ml, zawierajace po 100 ml wyzej podanego jalowego podloza. Kol¬ by umieszcza sie na trzesiawce obrotowej i wy¬ trzasa energicznie przez 48 godzin w temperatu¬ rze 28°C. Wytworzone w kolibie inoculum przenosi sie do okolo 21 litrowego szklanego fermentora, za¬ wierajacego 12 litrów jalowego podloza. Brzeczke napowietrza sie w czasie wzrostu, trwajacego oko¬ lo 48 godzin po czym zawartoscia fermentora za¬ szczepia sile 30O-litrowy tank fermenter, zawiera¬ jacy 150 litrów jalowego podloza inokulacyjnego.To ostatnie stadium brzeczki inokuilacyjnej napo¬ wietrza sie jalowym powietrzem w ilosci 1 litra powietrza na libr brzeczki na'minute, wprowadza-13 85 814 14 Tablica 7 Pogedyncza dawka podiskónna mgylkg 512 128 32 1)6 8 4 2 1 1 ¦0J5 zakazone, nieleczone kontrolne myszki 512 128 64 32 116 8 4 2 1 0.5 zakazone, nieleczone konitiroflme myszki 512 128 32 8 4 2 ' 1 0.5 0.25 0j12 zakazone, nieleczone kontrolne mysizki Liczba myszek, które przezyly/ liczba myszek badanych 7 dni po zakazeniu | BM123u | BM123B | HM123y Próteuis miiralbiliis /5 3/5 2/5 0/5 /5 /5 3/5 1/5 0/5 | 1 lin 68/70 myszek padlo w ciajgu jed¬ nego dnia po zakazeniu KletosiedUa pneumonaae AD 4/5 0/5 0/5 7/10 /10 8/10 0/10 5/5 8/10 4/10 0/10 /20 myszek padlo w ciagu dwóch doi po zakazeniu Escheodhda coli 3/11 /5 /5 1/5 9/10 /10 3/10 1/10 0/5 /10 9/10 /10 4/10 3/10 1/5 18/120 myszek padlo w ciagu 3 dni po zakazaniu jac powietrze do dba fermentora. Nie stosowano dodatkowego mieszania. ^Temperature brzeczki utrzymywano na poziomie 28°C. Jako srodka prze- ciwpiennego uzywano oleju smalcowego. Po 53 go¬ dzinach wzrostu ta brzeczka inokuilacyjna zaszcze¬ piono fermentor o pojemnosci 2000 litrów, zawie¬ rajacy 1350 litrów jalowego podloza fermenta¬ cyjnego.F orizy ki lad1 II. Fermentacja przy uzyciu szcze¬ pu Nocairdia sp NRRL 5646 i podloza, sprzyjaja¬ cego wytwarzaniu BM123 Podloze fermentacyjne przygotowuje sie wedlug nastepujacego przepisu: Bac1x-peptone 10.0 g Dekstroza 10.0 g Melas 20,0 g - Cytrynian amonowo-zelazowy 0.1 g weglan wapniowy 1.0 g woda do 1000 ml Podloze fermentacyjne wyjalawia sie w tempe¬ raturze 120°C para pod cisnieniem 20 funtów przez 60 minut. jp(H podloza po wylowieniu wy¬ nosi 6.7. 1360 litrów Jalowego podiloza znajduja¬ cego sie w tanku fermentorze, o pojemnosci 2000 litrów, zaszczepia sie inocuilium przygotowanym wedlug przepisu, podanego w przylkladzie I. Brze- czke napowietrza stie jalowym powdetazem w 'ilos¬ ci 0.6^0.7 litra ma litr brzeczki na miinulte. Brze¬ czke miesza sie mieszadlem, odbracajacyim sie z szybkoscia 50 obrotów na minute. Po uplywie mniej wiecej 230 godzdln. fermentacji brzeczke sie zbiera.Plnzykladl III. Izolowanie BMill23a.Fermentacje przeprowladza sie, jak podano w przylkladzie II. 30-Mtrowa porcje przefermento- wanej brzeczki o pH = 7,7 saczy sie, uzywajac ziemi okrzemkowej, jaJko srodka wspomagajacego saczenie. Ciasto przemywa sie woda dla uzyska¬ nia, lacznie z przesaczem, 31 litrów i dopirowaiefca pH do 6.5 za pomoca kwasu solnego. Pio dodaniu fluorku sodowego (012 g) mieszanine miesza sie przez 1 gjadiziine. Powstala zawiesine saczy sie, uzy¬ wajac 310 g ziemi okrzemkowej jako srodka wspomagajacego, saczenie i otrzymuje si£ 31 litrów przesaczu. Przesacz saczy sie przez kolumne IRjCr 50(Nai+) 50^100 mesch o objetosci zloza 1 litr. Zy¬ wice przemywa sie 4 litrami wody BM123a eluuje sie, przepuszczajac przez kolumne 0.3 N H2S04 i zbierajac frakcje o objetosci 500 ml. Frakcje od ^ 1 do 7 wlacznie zawierajace akltywny zwiazek,, la¬ czy sie razem, doprowadza pH do 7.2 przy pomo¬ cy Ba(OH)2 in substantia. Siarczan barowy usu- wia sie saczeniem, uzyskujac przejrzysty przesacz.Klarowny przesacz przepuszcza sie przez noc przez kolumne IRC1* 50 ml. Kolumne przepftulkuije sie 4 litrami wody i elu¬ uje 0.3 N H2S04, jak opisano wyzej. Aktywne frak¬ cje (1 do 7) podobnie laczy sie razem, doprowadza pH do 7.0 przy pomocy Ba (OH)2 i saczy, uzysku¬ jac 2.9 litra przejrzystego roztworu. Roztwór ten zageszcza sie ipod zmniejszonym cisnieniem do ob¬ jetosci 75 ml celem dalszej chromatagraflii na we¬ glu.Jeden litr ziarnistego DarcoR G^60 (20—40 mesh) zawiesza sie w wioidzie, przenosi do szklanej ko¬ lumny i pozostawia do ulozenia sie zloza. Nad¬ miar wody odsacza sie i naklada sie 75 ml kon¬ centratu, pozwalajac nia powolne jego wnikniecie w kolumne. Naladowana kolumne przemywa sie 4 litrami wody i rozwija 3.5 litrami 50% wodnego metanolu, zbierajac frakcje o objetosci 50 ml.Aktywne frakcje (18 do 68) laczy sie razem, za¬ geszcza do wodnej fazy pod zmniejszonym cisnie¬ niem i liofilizuje, uzyskujac 6,4 g bialego stalego 65 preparatu BM123 przepuszczajac 90% zakwaszany wodny metanol (pH="l,8 uzyskane za pomoca H^S04) dla uzyska- niia dalszych 16 frakcji. Zakwaszone frakcje laczy sie, zageszcza pod zmniejszonym cisnieniem do wodnej fazy, doprowadza pH do 7,2 za pomoca Ba(OH)2, saczy i liofilizuje, uzyskujac dodatkowo 1,5 g BM123a. Za pomoca chiromialtograiffii cienko¬ warstwowej stwierdzono, ze oba preparaty sa tntieszattiiina ai i a* Ten preparat HM123a suszy sóe w aparacie do suszenia Ablderhaldena nad wrzacym etanolem przez 16 godzin przed podda¬ niem mlikroanalizie.BM<123)a nie posiada okreslonego punktu top¬ nienia, stopniowy rozklad rozpoczyna sie w pobli¬ zu temperatury 200°C. WymlM miikiroanaflizy tego anftyfbioltylkiu przedstawiaja sie nastepujaco: C, 33.89; H, 5.711; N, 11.88; O (bezposrednio) 35.40; popiól O. Preparat BM123a badany w 90% meta¬ nolu w stezeniu 200 mcg/ml jest przejrzysty do jasnego w zakresie od 220 do 340 mm. Skrecalhosc optycizna tego preparatu [a]25°D = 32-0 (ChLjOO w H^O).BM123a wykazuje charakterystyiczna absorpcje w podozerwóinym zakresiie widma przy nastepuja* cych dlugosciach M: 700, 815, 960, 1050, lllilO, 1250, 1340, 1305, 15160, 1(670, 17105, 2950, i 33QiO cm-1. Stan¬ dardowe widimo w podczerwieni .preparatu BMlf23a w KBir tabletce pokazano na fig. 1. zalaczonych - rysunków.Pr^yMad IV. Fermentacja przy uzyciu szcze¬ pu Nocardda sip. i podloza, sprzyjajacego wytwa¬ rzaniu BM123a i BMli23y.Podloze fermentacyjne przygotowuje sie wedlug nastepujacego przepisu: Dekstroza 10.0 g wyciag wolowy 4.0 g Baoto-peptone 4.0 g chlorek sadowy 2.5 g wyciag drozdzowy 1.0 g woda do 10O0 mi pH podloza doprowadza sie do 7.0 przy pomocy NaOH. Podloze fermentiacyjne wyjialawia sie para w temperaturze 120°C, pod cisnieniem 20 funtów przez 60 miiniuit. pH wyjalowionego podloza wynosi 6.7. Tank fermentom o pojemnosci 2000 litrów, za¬ wierajacy 1350 litrów jalowego podloza zaszczepia sie 150 litrami inoculum, przygotowanego wedilug przepisu, podanego w przykladzie I. Fermentacje przeprowadza sie w temperaturze 28°C, uzywajac oleju smalcowego, jako srodka przeciwpiennego.Brzeczke napowietrza sie z szylbkoscia 0.4 litra po¬ wietrza na litr brzeczki na minute i miesza mie¬ szadlem, obracajacym sie z szyibkoscia 50 obrotów na minute. Po okolo 85 godzinach fermemtacji zbie¬ ra sie brzeczke.Przyklad V. Izolowanie BM123B & BMi123y 1350 litrowa porcje brzeczki fermentacyjnej, przy¬ gotowanej, jak podano w przykladzie IV, saczy sie przy pomocy 1% ziemi ofcrtzemkowej,, jako srodka wspomagajacego saczenie. Ciasto przemy¬ wa sie 50 litrami wody i odrzuca. Polaczone prze¬ sacz i popluczyny przepuszcza sie pod wplywem sily idiezkosci przez IRCR t90(Na+) o objetosci zlo¬ za 10 liitrów i szybkosci przeplywu 3&0 md/mdinute.Naladowana kolumne przemywa sie 30 litrami IG wody. Aktywna frakcje wyplukuje sie z kolumny za pomoca 170 litrów 0.3 N H2S04. Eluaty zbiera sie w dwóch porcjach. Pierwsza porcje stanowia elu- aty od pierwszego (pH = 7j0) do eluentu o plH=6.0.Pierwsza 46-litrowa porcje odrzuca sie z powodu wysokiej zawartosci soli. Druga porcje (1120 Ett- rów) o pH = 1,4 doprowadza sie do pH = 6.0 pnzy pomocy Ba(OH)2 in suibsttantia. Wytworzony siar¬ czan barowy odsacza sie przy pomocy 1 kg iziemi io Okrzemkowej,, jako srodka wspomagajacego sa¬ czenie.Ciasto przemywa sie 5 litrami wody, popluczy¬ ny laczy sie z przesaczem i zageszcza pod zmniej¬ szonym cisnieniem do 2 litrów. Uzyskany koncen- trat ogrzewa sie na lazni parowej do temperatury 50°C i do goracego roztworu dodaje sie soli Rei- neckego (150 g w 11500 mi wody o temperaturze 7i5^C). Goracy roztwór odstawia sie w temperatu¬ rze ipokojowej na 46 godzin i nastepnie saczy, uzyskujac czerwon©purpurowy staly preparat, który przemywa sie 600 ml wody. Wilgotny pre¬ parat miesza sie z 2 literami wody i 5 litrami lnbutanolu i doprowadza pH do 1.5 przy pomocy 0.25 N H4SO4. Mieszanine saczy sie, a pH wodnej fazy przesaczu doprowadza do 6.6 przy .pomocy Ba(OH)2 in substantia. Mieszanine przesacza sie i zageszcza pod zmniejszonym cisnieniem do 3$0 ml. Koncentrat przepuszcza sie przez kolumne Do- wexR l-x4(iCr—) o objetosci zloza 100 mml, a na- stepnie liofilizuje, otrzymujac 50 g produktu. 250 g proszku celulozowego miesza sie z górna faza .mieszaniny 90% fenol: chloroform: pirydyna: kwas octowy: woda (zmieszanych w stosunkach objetosciowych 11500:300:45:45:75i0). Szklana kolum- 33 ne o srednicy 3.81 cm (ly5 cala) wypelnia sie wil¬ gotnym proszkiem celulozowym. Próbke naklada sie na wierzch kolumny w postaci mieszaniny g wyzej lopisanego ^liofilizowanego produktu w 16 ml górnej fazy i 20 g proszku celulozowego. Ko- * lumne irozwija sie, stosujac powietrze o cisnieniu 3 funtów/cal2 ze izbiorndka, idolaczonego w sposób bezpieczny do wierzcholka szklanej kolumny. Zbie¬ ra sie 75 frakcji o objetosci 25 ml kazda przy po¬ mocy automatycznego kolektora frakcji. Afctyw- 45 nosc lckalizuje prizy pomocy bi©autografii. Krazki bibuly nasycone poszczególnymi frakcjami suszy na powietrzu i przemywa eterem, a nastepnie na¬ klada na duiza plytke agaru, zasianego K. pneu- moniae szczep AD. Obserwuje sie dwa oddzielone 50 pasma aktywnosci. Jedno z tych pasm (BMI123«y) sklada sie z frakcji 3 do 18, a drugie pasmo (BM123B) — z frakcji 31 do 92. Frakcje 3 do 18 laczy sie i dodaje do nich 1400 ml chloroformiu, uzyskujac system dwufazowy. Po oddzieleniu gór- 55 nej wodnej fazy (pH = 4J5) ekstrahuje sie ja dwu¬ krotnie jednakowa objetoscia eteru dla usuniecia resztek fenolu. Wodna faze doprowadza do pH = 6.5 przy pomocy IRR 45 (OH—) i liofilizuje, uzyskujac BM123y (1J62 g). Frakcje 31 do 52 laczy w sie razem i postepuje z nimi w sposób, opisany wyzej, uzyskujac BM123B (1.-06 g).BM123y (1 g) miesza sie z 20 ml absolutnego metanolu przez 15 minut. Zawiesine saczy sie, uzy¬ skujac 350 mg osadu i przesaczu. Do przesaczu 85 dodaje sie 60 ml eteru* uzyskujac biala klaczko-17 85 814 18 wata sulbstan.cje w imieszaniinie elter-metanol. Po przesaczeniu otrzymuje sie bialy osad ii bialawy przesacz.Osad przemywa sie na lejku eterem i susizy na powieltrzu, uzyskujac ©02 mg BM123y. BM12I3 su¬ szy pod zmniejszonym cisnieniem w aparacie-do suszenia Abderhaldena nad wrzacylm etanolem przez 16 godzdin, zandim przeprowadzi sie oznacze¬ nia milkroanaliltyczne i spektrofotometrycme.BM123:y mie posiada okreslonego punktu topnie¬ nia, stopniowy rozklad zaczyna sie przy tempe¬ raturze 200°C. MikroanaMza wykazuje nastepujace wartosci: C 46.13; H 6.G5; N 17.00; O (bezposred¬ nio) 24.96; popiól 0.00. W 90% metanolu zwiazek wykazuje kamsimum absoripcji w ultrafiolecie przy 286 nm E1%lcm = 200. Skrecalnosc optyczna — = [a]25°D = + S3,8 c= 1.004 w H^O.BM12&Y wykazuje charakterystyczna absorpcje w podczerwonym zakresie * widma przy nastepu¬ jacych dlugosciach fal: 765, 870, 980, 1045, 1112, 1175,, 123K), 1340, 1400,, 1466, 1510, 1570, 16110, 1660,, 2910 i 3333 cm—1. Standardowe widmo w podczer¬ wieni preparatu BM123, przygotowanego w tab¬ letce KBr, pokazano na rycinie 3 zalaczonych ry¬ sunków. 670 mg preparatu BMH23B miesza sie z 12 ml metanolu przez 15 minut i saczy* Do przesaczu do¬ daje sie 36 ml eteru, uzyskujac bialy osad. Osad zbiera sie na saczku, przemywa eterem, suszy na powietrzu, uzyskujac 466 mg preparatu BM123I3.Preparat ten suszy sie nastepnie pod zmniejszo¬ nym cisnieniem nad wrzacym etanolem przez 4 godziny, zanim podlda sie go mikroanalizie.BM123B nie posiada okreslcnego punktu topnie¬ nia, a stopniowy rozklad zaozyttita sie w poblizu temperatury 200°C. Mikroanaliza wykazuje naste¬ pujace wartosci: C 47.53; H 7.39; N 1(6.54; popiól 1.'04. W 98% metanolu preparat " BM123B daje maksimum absorpcji w ultrafiolecie przy 286 nm zE11%cm = 200. Polozenie tego maximum nie zmie¬ nia sie przy zmianie pH. Skrecalnosc optyczna BM123B wynosi [ BM123B wykazuje charaklteryistyczna absorpcje w podczerwonym zakresie wiidma przy nastepujacych dlugosciach fal: 826, 87Q, 922, 980, 1035, 1105, 1170, 1220, il340, 1390, 1510^, 15160, 1600, 1070, 2950, 3080 i 3350 om—1. Standardowe Widmo w podczerwieni preparatu . BM1123B, przygotowanego w tabletce KBr pokaizano ina fig. 2 zalaczonych rysunków.Przyklad VI. Rozdzial aktywnych zwiazków na foiJbulle i za pomoca chromatografii cienkowar¬ stwowej.Zwiazki przeciwibalklteryjne mozna odróznic za pomoca chromatografii bibulkowej. W tym celu na paski bibuly Whaitman No 1 nakrapla sie wodne lub metanolowe rozitwory badanych substancji i równowazy przez 1 lub 2 godziny w obecnosci górnej i dolnej fazy. Paski rozwija sie przez noc dolna (organiczna) faza otrzymana przez zmie¬ szanie nastepujacych zwiazków 90% fenol: m- nkrezol: kwas octowy: nrtrydyma: woda (w sitosun- kach objetosciowych 100:125:4:4:^5). Po wyjeciu z komory chromatograficznej paski suszy sie na powietrzu przez 1 do 2 godzin, przemywa eterem dla usuniecia resztek fenolu i poddaje bioauito- grafii na duzych plytkach agarowych, zasianych szczepem K. pmeumoniae. Reprezentatywne war¬ tosci Rf zestawiono w tablicy 8.Tablica 8 40 Skladnik BM123y BM123B BM123« M 0.88 0.62, 0.20, 0,71 0.47 Zarówno zwiazek a, jak i B, skladaja sie z dwóch antybiotyków, ^wiazek Q sklada sie z wiek¬ szego antybiotyku BM 123BJ (Rf = 0,62) mniejszego zwanego BM123jJ2 (Rf = 0.71). Najibardziej -polar¬ ny skladnik BM123& (RiH = 0.20) nazwano BM123ai, a mniej polarny skladnik BM123a2.Alternatywnie BMT23a mozna roadizielic na dwa skladniki, stosujac metode chromaltografii cienko¬ warstwowej na cienkowarstwowej celulozie Poly- gramR. Cel Uv254,, postaci cienkowarstwoweij ce¬ lulozy, sprzedawanej przez firme Brinkmann In¬ struments LAdi, Wesitbury, New York. Po nakrop- leniu platki cienkowarsltwowej rozwija sie woda, zawierajaca 1% cytrynian trójsodowy. Strefy stwierdza sie za pomoca bioautografiii ina plytkach agarowych, jak opisano wyzej. Stwierdza sie dwie sitrefy BMH23 Rf = 0.615.Zastrzezienie patentowe Sposób wytwarzania nowego przeciwibafcteryj- nego zwiazku MB 123, znamienny tym, ze hoduje 45 sie drobnoustrój, posiadajacy cechy charaktery¬ styczne Nocardlia sp. NRRL 564)6 w wodnym pod¬ lozu odzywczym, zawierajacy przyswajalne, zródla weglowodanów azotu i soli nieorganicznych, w podpowierzohniowych warunkach powietrznych, 50 az do uzyskania istotnej alktywtnosci przeciwbakte- ryjnej w wyzej wyimienionym podlozu, a nastep¬ nie tak oitrzyimany zwiazek przeciwtoakteryóny BM123 odzyskuje sie ze srodowiska fermentacyj¬ nego. 40 4585 814 ANTYBIOTYK BU/23' xxx u3 100 o <* X) N 0.N o cv c/ i 0 4C ""V 9 XX) \ \ \ 3000 21 t \f \ \ T 3 / / ! 4 fOO s i 00 IdOO ¦ 1 —* \ \ l t MSOO i • < A. / / i f 400 ^ 7 i r 1200 IIOO 1000950 900 \ \ 8 \ \ \ A / 9 / / / rw ( h f 950 800 12 750 13 7O0 14 65i DLUGOSC FALI (MIKRONY) SI^.l ANTYBIOTYK BMI23C £ 5OOO4OOO3CC0 2500 200C ISOO t€00 /4O0 IZOO f/00 000950 900 8SO 800 790 700 650 Ul O O TO O N fOO 00 o ^ 1 1 Y \\y r J L \ \ \ l . l_ /vj pi r f f J— * r V , i , / ' , L. \f U (\ \ J f\ l / rJ I \l J i \J .J ^ 1 /\ N\s* X '— . l_ 6 7 8 9/0 DLUGOSC FALI (MIKRONY) J-j^.S PZGraf. Koszalin Zam. D-1243. Nakl. 105 egz.Cen* 10 zl PL PL PL